JP6831813B2 - デコリン組成物およびその使用 - Google Patents
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Description
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
本発明は、改良されたデコリン組成物およびそれらの製造方法、ならびに患者の治療のためのデコリンの使用に関する。
天然のデコリンは、添付のグリコサミノグリカンおよび90〜140kDの平均分子量を有する糖タンパク質である。本発明は、組換えデコリンの生成を企図する。いくつかの好ましい実施形態では、デコリンは、デコリンコアタンパク質、すなわち、実質的非GAG化デコリンである。いくつかの実施形態では、デコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の4番目のアミノ酸(すなわち、N末端から4番目のアミノ酸)に変異を含む。いくつかの実施形態では、この変異は、セリンからアラニンへの変異である。いくつかの実施形態では、このデコリンコアタンパク質は、配列番号1(成熟デコリンコアタンパク質)と少なくとも90%、95%、99%または100%同一であるが、ただし、このデコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の4番目のアミノ酸(すなわち、N末端から4番目のアミノ酸)に変異を含む。
実施例1
ヒトデコリンの変異型の発現および生成の最適化
デコリンの変異型用の発現コンストラクトを製造した。セリンからアラニンへの変更を、成熟デコリンの4番目のアミノ酸の位置で行った。この変異は、GAGがデコリン分子に結合するのを防ぐ。この発現コンストラクトは、タンパク質生成および分泌のための内因性シグナルペプチドの代わりに、ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドを使用する。この構築物を、図7および図8に示す。
Asp−Glu−Ala−Ala−Gly−Ile−Gly−Pro−Glu−Val−Pro−Asp−Asp−Arg−Asp−Phe−Glu−Pro−Ser−Leu(配列番号9)
この配列は、成熟タンパク質の予想される配列に対応している。アラニン変異を、期待どおりに組み込み、シグナルペプチドおよびプロタンパク質を切断して、正しい成熟デコリンN−末端配列を得た。
デコリンコアタンパク質の精製
1.0概要
精製の工程を小規模で行い、精製物を200Lの1バッチに添加し、流加供給方式を用いてGMPスイートで生成した。このバッチを、14日目に約50%の生存率レベルで収集した。バイオリアクターの14日目(収集日)のタンパク質濃度のレベルは、1.240g/Lであった。
全培養ステップのために用いられる細胞培養培地は、L−グルタミンおよび0.1%プルロニックF68を有するハイクローン(HyClone)(ローガン、ユタ州、米国)HYQ PF−CHO液体大豆(Liquid Soy)(LS)であった。この培地を、完全無菌の液体として受け取った。HyQ PF−CHO LSは、専売のタンパク質を含まないハイクローンの培養培地製剤である。正確な成分は知られていないが、ハイクローンは、HyQ PF−CHO LS(参照番号BBMF8302)についてのFDAと共に、無血清培地用のタイプIIデバイスファイル(Type II Device File
)を保持する。HyQ CellBoost R15.4は、生産培養で使用されるハイクローンの専売培地補充製剤である。
各継代培養ステップの詳細を、以下の接種培養スケールアップの処理ステップの表に示す。製造ロット09018は、ロット番号06005(バイアル#182)のMCBバイアルを37℃の水浴で解凍することによって開始した。MCB凍結バイアルを解凍した後、これらの細胞を、HYQ PF−CHO LS細胞培養培地35mLを含む単一振とうフラスコ(250mL)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)に添加した。血球計を用いて決定した初期細胞数は2.25×105細胞/mLであり、生存率は90.4%であった。次いで、培養物を、加湿、5%CO2環境中37℃に維持したインキュベーター内のオービタルシェーカー(90rpm)上に置いた。継代培養ステップは、約2.0×105細胞/mlの接種密度を目標とした。フラスコ中の3日目の細胞数および生存率(%)は、14.24×105細胞/mL、95.8%生存率であり、このフラスコを1Lフラスコに継代した。1Lフラスコの3日目の平均生存細胞数は23.43×105細胞/mLであり、生存率は98.1%であった。この1Lフラスコを、初期培養液量および初期標的細胞密度がそれぞれ1000mLおよび2.0×105細胞/mLで、10Lの使い捨てウェーブバッグを有するウェーブバイオリアクターシステム20EH(GEヘルスケアバイオサイエンスバイオプロセス社、サマセット、ニュージャージー州)に継代培養した。ウェーブバイオリアクターの動作設定は、インキュベーション温度が37.0℃、ロッカー速度が15.0cpm、ロッキング角度が11.0°、および通気ガス中のCO2濃度が5.0%、ガス流速は0.25L/分であった。2日後、ウェーブバッグ中の生存細胞密度は10.28×105細胞/mlであり、新鮮なHYQ PF−CHO LSを、培養液量が4992mLになるまで添加した。3日後、生存細胞密度は18.37×105細胞/mLであり、ウェーブバッグ中の内容物を、30Lのバイオリアクターに移した。温度、pH、溶存酸素、圧力および撹拌速度についてのこの30Lのバイオリアクターの動作設定点は、それぞれ37℃、空気飽和40%、圧力1psig、および50rpm攪拌速度であった。pH調節器を稼働せず、細胞がpH7に向かって自然に漂うのを可能にさせた。
最初に、HyQ PF−CHO LS細胞培養培地137KgおよびHyQ Cell Boost R15.4の12%(w/v)溶液4.3Kgを、200Lのバイオリアクターに添加した。生産培養の「0日目」は、200Lのバイオリアクターに接種した日と考えた。
から31℃に下げた。収集までの6日間、グルコース値を毎日チェックし、グルコース値が5g/L以下に低下した任意の日に、グルコースを3g/L増加させるために、20%グルコース溶液を添加した。8日目および12日目に、グルコース値は、それぞれ4.84g/Lおよび4.98g/Lに低下した。8日目および12日目に、20%グルコース溶液2.9kg(L)および3.0kg(L)をこのバイオリアクターに添加した。
このロットを14日目に収集し、生存率は50.2%、力価は1.240g/Lであった。このバッチを下流に移し、終了時点のバッチ処理レコード(downstreambatch processing record)ごとに精製した。
1.3 概要
以下で概説するとおり、200Lバッチからの収集物を精製し、最終体積42L中211g(5mg/mL時)が得られた。最終バルク製剤原料は、このバッチについて以前に承認された仕様を満たした。特に明記しない限り、全ての濃度を吸光度によって測定した。
収集物(189L)を、体積/面積が5.9L/ft2であり、初期流速3L/分で、Cuno 60M02マキシマイザーフィルター(Maximizer filter)(2×16ft2)を通して濾過し、かつ0.22μm 10”ミリポア社のオプティキャップフィルター(Opticap filter)を通して濾過した。フィルターハウジングに圧縮窒素を吹きつけて、生成物の回収を最大限にした。
清澄化培地からタンパク質を捕捉するためにSP−セファロースFF(GEヘルスケア社)を用いた。カラム上で捕捉する前に、この清澄化培地を希釈して、伝導率を下げた。この稼働条件を、様々な画分の分析と共に以下に示す。この清澄化培地を、2つのサブバッチとして処理した。
2つのSP−セファロースサブロットを、それぞれ、1%の濃度まで希釈した11%(w/v)のトリトンX−100を用いてウイルスを不活化した。これらのロットを、CHTクロマトグラフィーの前に60〜90分間、穏やかに混合しながら室温でインキュベートした。ウイルスの不活化物質のその後の処理を、ISO7スイートで行った。
CHTタイプI(バイオラッド社)を用いて、SPセファロースプール中の残留CHOタンパク質からDCPをさらに精製し、不活化ステップからのトリトンを除去した。この稼働条件を、種々の画分の分析と共に以下に示す。SP−セファロースプールを、上記のとおり2つのサブバッチとして処理した。
2つのCHTプール(47.8L)を合わせ、等量の水で希釈し、総体積95.6Lを得た。これを、0.6m2 Prep/スケールTFFカートリッジ(ミリポア社)、10KMWCOを用いて、約45Lおよび約6.57mg/mLまで約2倍濃縮した。再循環流速は5L/分であり、約20psiの背圧を維持した。
ムスタングQ(Pall社)ステップをフロースルーモードで行い、全ての結合物質を塩化ナトリウムストリップで溶出した。緩衝液交換をしたプールを、調整済みのムスタングQ膜上に直接添加した。
ムスタングQプールを、Virosartフィルターを用いてウイルス濾過した。
ウイルス濾液(48.0L)を、2×0.6m2 Prep/Scale TFFカートリッジ(ミリポア社)、10KMWCOを用いて濃縮し、緩衝液交換をした。再循環流速は5L/分であり、20psiの供給圧力を維持した。
以下の表は、このバッチの精製に用いたステップのそれぞれのステップ回収率を示す。注釈:これらの値は、ウイルスバリデーションサンプリングを考慮しない。
Claims (1)
- デコリンコアタンパク質の4位に変異を含む精製されたデコリンコアタンパク質を含む組成物であって、
前記精製されたデコリンコアタンパク質は、レトロウイルスベクターから発現されたものであり、
前記デコリンコアタンパク質が実質的にGAG化されておらず、前記組成物中にデコリンコアタンパク質1mgあたり5ng未満の残留宿主細胞タンパク質およびデコリンコアタンパク質1mgあたり5pg未満の残留宿主細胞DNAを含み、
前記デコリンコアタンパク質が水溶液として製剤化されており、
前記水溶液が、6.5〜7.5のpHを有するリン酸緩衝液を含む組成物。
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