PT92107A - Isolamento de clonagem de dna complementar do gene codificador da proteina-1 de trofoblastos bovina - Google Patents

Description

REFERÊNCIA AO FINANCIAMENTO O invento aqui descrito foi suportado por uma bolsa do National Institutes of Health, Grant NS HD 21896.

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado com campo da tecnologia de DNA recombinante e com meios e métodos que usam tal tecnologia na descoberta da sequência de DNA e sequência de aminoácidos deduzida para a proteína de trofoblastos bovina (bTP-1) das proteínas de embriões bovinos o qual é um interferão dentro da família alfa dos interferões de leucócitos (interferão ou IFN- K.).

Mais particularmente, o presente invento está relacionado com sequências de DNA codificado ras de bTP-1, seu isolamento e identificação e com a constru ção de veículos de expressão de DNA recombinante particularmente DNA complementar (cDNA) contendo tais sequências de DNA ligadas operacionalmente a sequência promotoras efectoras da expressão e com os veículos de expressão assim construidos Num outro aspecto, o presente invento está relacionado com cDNA para bTP-1 e seu isolamento. Ainda noutros aspectos o invento relaciona-se com proteína-1 de trofoblastos bovina essencialmente para emm meios e métodos para obtenção desta proteina por tecnologia de DNA recombinante e de conversão de bTP-1 em novas entidades, como sejam composições farmacêu ticas, úteis no tratamento profiláctico ou terapêutico de ou -4-

tras espécies de animais de sangue quente, incluindo humanos. Nas realizações preferidas, este invento proporciona veículos de expressão particulares que asseguram que bTP-1 seja produzido e secretado pela célula hospedeira. Em adição, este invento está relacionado com vários processos úteis para a produção das referidas sequências de DNA, veículos de expressão, sistemas de cultura de célula hospedeiras e produtos finais e entidades deles derivadas e suas realizações especificas e associadas. O presente invento surge da de^s coberta da sequência de DNA e da sequência de aminoáeidos deduzida codificadora de bTP-1. Em adição, o presente invento proporciona a informação de que bTP-1 pertence à familia de interferão- A disponibilidade de grandes quantidades de proteina permitirá a sua utilização nas seguintes aplicações: (1) Aumento do êxito da transferência de embriões em gado vacum e outros animais quando a proteina bTP-1 é introduzida no útero do animal recipiente ou injectada parenteralmente de preferência intramuscularmente ou subcutâneamente, na mesma altura ou após a transferência. (2) Promover a fertilidade em gado vacum através da injecção com a proteína bTP-1 na altura do reconhecimento maternal da gravidez (e.g. dias 15-25 no gado vacum) pois geralmen te nesta altura ocorrem números elevados de perdas de embriões. Estas perdas, pensa-se serem devidas ao embrião não produzir a proteína suficientemente cedo ou em quanti dades suficientes. Esta incapacidade normalmente conduz à perda de função do corpus luteum, uma terminação da prc> dução de progesterona e uma perda de gravidez.

(3) Tratamento de outras causas de infertilidade em gado vacum tais como "ciclos curtos", (4) 0 gene para esta proteína pode ser introduzido nos ovos fertilizados para produzir animais transgénicos com cópias extra do gene, proporcionadoassim maior fertilidade. (5) A proteína ê útil no tratamento de doenças virais em anilhais de quinta.

I

As publicações usadas para ilus trar o fundamento tecnológico do presente invento são por conveniência numericamente referenciadas pelo texto que se segue e grupos respectivos na bibliografia apensa.

FUNDAMENTO DQ INVENTO A proteína-1 de trofoblastos bovina (bTP-1) é um dos principais produtos do conceptus bovino que é secretado numa altura que coincide com o reconheci mento maternal da gravidez na vaca (1,2), Ela tem sido conside rada como hormona paracrina dirigida para o útero maternal que interfere com a síntese e libertação da prostaglandina F2 a presumível luteolisina (3,4). Os métodos anteriores para a produção de bTP-1 envolviam a colheita de embriões das vacas cultura destes embriões e purificação das proteínas a partir do meio de culturas através de uma variedade de «étodos demo rados (2) os quais até agora não permitiram com êxito a obten ção de meios de algumas ug de bTP-1, Os processos são também muito dispendiosos, requerendo grandes números de animais. Os custos da gravidez são elevados pois os animais têm de ser cruzados em condições controladas, os embriões obtidos após o abate, estabelecidas as culturas e a proteína purificada. A quantidade de bTP-1 até agora obtida tem sido insuficiente para realizar experiências de caracterização das propriedades biológicas do componente purificado. Desde há muito que se sentia a necessidade da aplicação da tecnologia de DNA recom binante como uma maneira eficaz de proporcionar grandes quan tidades de bTP-1.

De acordo com o presente inven to, encontrou-se que bTP-1 apresenta cerca de 50Y, de identi dade na sequência de aminoácidos com os interferões de mand feros e cerca de 70% de identidade com um IFN-fiCjj bovino.

De acordo com o presente invento pTP-1 proporciona activida-de antiviral e inibe a incorporação de H-timidina por linfó eitos obovinos estimulados com nitrogénios. A sua actividade antiviral aproxima-se da do IFN de leucócitos humanos e de IFN-<X^ recorabinante.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento compreende o cDNA da proteína bTP-1. O presente invento é ainda dirigido a veículos de expressão de DNA replicáveis portadores de sequências de genes codificadores de bTP-1 na forma expre^ sável. O presente invento compreende ainda a proteína bTP-1 essencialmente pura e meios e métodos pBHa a sua produção, incluindo proteína-1 de trofoblastos bo

vina preparada através de tecnologia de DNA recombinante, ten do substânciaimente as propriedades da proteína natural alta*-mento purificada. 0 presente invento é ainda dirigido a veículos de expressão de DNA replicáveis portadores de sequências de genes codificadores de bTP-1 na forma expreí3 sável, de preferência a vectores recombinantes adaptados à transfarmação de uma célula hospedeira adequada, especialmente plasmídeos adaptados à transformação de células de bactérjL as, mamíferos e/ou leveduras. O processo para a preparação da proteína-1 de trofoblastos bovina caracteriza-se por compreen der os passos de (a) introdução de um vector recombinante com preendendo uma sequência de DNA capaz de expressar a proteína de trofoblastos bovina numa célula hospedeira adequada, (b) cultura da célula hospedeira transformada resultante num meio de cultura adequado e (c) isolamento da proteína-1 de trofoblastos bovina recombinante a partir das células em cultura. 0 presente invento é ainda d_i rigido a uma sequência de DNA recombinante capaz de expressar uma proteína-1 de trofoblastos bovina numa célula hospedeira adequada e uma sequência de DNA codificadora de uma proteina-1 de trofoblastos bovina. 0 presente invento está ainda relacioi nado com uma sequência de DNA e polipeptídeo apresentado na Figura 1 ou com uma sua variante funcional.

Ainda, o presente invento é di^ rigido a culturas de microorganismos e células transformados com os veículos de expressão descritos e estirpes microbianos ou culturas de células de mamíferos ou de leveduras capazes de produzirem bTP-1. A produção de bTP-1 baseia-se nos métodos das técnicas de DNA recombinante. As realizações particulares incluem o seguinte: -β- α) Ο cDNA é modificado através da inserção de um codão de "iniciação" ATG a montante do codão TGT para a cisteína na posição 1 da proteína madura. A sequência sinal dos mamíferos de bTP-1 não é expressa no sistema bacteriano. 0 cDNA de bTP-1 pode ser modificado através da inclusão de uma sequên cia sinal para E.coli e/ou ajustado a sequência 5' a montante para os coddes preferidos de E.coli (2) Tais construções de cDNA modificadas são introduzidas num vector recombinante adaptado a transformação de uma célula hospedeira adequada. Os vectores adequados incluem uma se quência reguladora, de preferências promotores fortes, ca pazes de dirigir a expressão de genes estranhos no hospe*· deiro quando ligados operacionalmente ao gene estrutural. São escolhidos como vectores recombinantes plasmídeos adaptados à transformação de um hospedeiro bacteriano, um hospedeiro mamífero ou uma célula. Por exemplo podem ser construídos vectores pBR com promotores Trp ou' lac tendo sitios de restrição adequados para permitir a inscrição da construção de cDNA particular. (3) 0 vector pBR com o cDNA inserido é introduzido numa célula microbiana por exemplo E.coli DH1 ou um dos seus derivados por processos de transformação convencionais, e.g. pelo método do cloreto de cálcio descrito por Maniatis et al (21). -9- (4) Os transformantes obtidos são isolados e a sequênciação de DNA estabelecida usada para confirmar que a construção está na orientação e alinhamento correcto, (5) Os plasmídeos pBR recombinantes com a inserção orientada correctamente são isolados a partir de células transformadas e introduzidos noutras células microbianas particularmente úteis para a produção dé proteína, por exemplo nas estirpes de E.coli correspondentes, as quais expressam a proteína em grandes quantidades após indução, e.g. D112, JM10 3, (6) Uma linha celular adequada é usada para a síntese de bTP-1. No caso dos vectores com a construção Trp, as células crescerão na ausência de L-triptofano* No caso do promotor lac, as células são induzidas com isoprofiltio-galactosido (IPTG), (7) As células são lisadas para recuperar bTP-1 recombinante que é solubilizada e cuidadosamente renaturada antes da purificação. De preferência o processo explorará o isola mento de corpos de inclusão a partir das células. As proteínas recombinantes são frequentemente conseguidas como produtos quase puros nestas estruturas e podem ser renafcu radas após solubilização e reenrolamento. Estas técnicas de ranaturação são bem conhecidas.

Como alternativa a processo atrás descrito usando células microbianas, podem ser prepara das construções adequadas para transferência para uma célula de mamífero em cultura, como seja a linha Kl de células CHO.

Neste caso o DNA codificador da sequência sinal de mamífero é mantido. As construções contêm, de preferência',’ uma marca se-leccionável adequada de modo a reconhecer os transformantes♦

As linhas que expressam bTP-1 são isoladas e usadas para a pre paração em larga escala da proteína que é isolada do meio. 0 presente invento é ainda dirji gido a um método para aumentar a fertilidade em mamíferos com preendendo a administração aos referidos mamíferos de umà quan tidade eficaz para o aumento da fertilidade de mamíferos, de uma proteína-1 de trofoblastos bovina, por exemplo a dosagem diária de 0,5 a 50 mg/animal e uma composição para aumentar a fertilidade em mamíferos compreendendo uma quantidade eficaz P$ra o aumento da fertilidade em mamíferos da proteína-1 de trofoblastos bovina ou uma proteína tendo substancialmente a actividade potenciadora da fertilidade em mamíferos da proteá na-1 de trofoblastos bovina juntamente com veículos ou adjuvantes não tóxicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig.l. mostra a sequência de cDNA codificadora de bTP-1

Fig.2, comparação das sequências de bases de cDNA alinhadas representando três cDNAs de bTP-1. A primeira das três sequências de nucleotídeos (sequência 1) deriva de dois clones, pbP 159 representando as bases 1-677 e lbTP3 representando as bases 678-973. A segunda sequência (sequência 2) deriva de lbTP509.A terceira das três sequências de nucleotídeos (sequência 3) deriva de lbTP517. Este clone representa um rear-ranjo em que o extremo 3' do cDNA das bases 702 a 979 com uma sequência de 24Ab no extremo 5'do clone. Estas sequências estão realinhadas na sequência 3, Isto resulta ça geração de um

pequeno biato de 6 nucleotídeos (bases 756-761). Os asteriscos acima de cada linha marcam diferenças nos nucleotídeos entre as sequências 1 e 2. Os asteriscos apresentados abaixo das sequências marcam as diferenças nos nucleotídeos entre as sequên cias 2 e 3.

Fig.3. Analise bidimensional em SDÂ-PAGE e fluorografia de pro temas de secreção do conceptus ovino e bovino marcadas em / H/-leucina.

Conceptus ovino do dia 16 e con ceptus bovino do dia 18 foram incubados durante 24 h com f H/-leucina e o meio de cultura colhido para análise por SDS-PAGE bidimensional (géis de 12,5%) e fluorografia. TP-1 ovino (painel superior) surge com uma das principais proteínas de se ereção com uma Mu de 17000 e consiste em três isoformas (pl's 5,4 a 5,7/. TP-1 bovina (painel inferior) surge como duas formas de Mr (22000 e 24000) e consiste em pelo menos oito isofor mas (pi 6',3 a 6,8). Estão apresentadas apenas as partes dos fluorogramas que descrevem OTP-1 e bTP-1.

Fig.4. SDS-PAGE bidimensional e artorradiografia de proteínas 35 marcadas com L SJ-metionina sintetizadas na presença de RNA de conceptus bovino.

Os produtos da tradução in vi- tro sintetizados com um liáado de germen de trigo na presença de RNA poliadenilado de conceptus bovino do dia 18 e /^Sj-me-tionina foram analisadas por SDS-PAGE bidimensional (géis de 12,5%) e antorradiografia. Elas foram analisados como produtos totais da tradução (painel superior) ou após imunoprecipitação com anti-soro anti-oTP-1 (painel inferior). -12-

Fig.5. Comparação dos cDNAs de bTP-1 e de ôTP-l e das suas sequências polipeptídicas deduzidas. A sequência de aminocidos deduzida de bTP-1 está apresentada acima da sequência de nucleotí-deos. Os resíduos de aminoácidos que diferem em o TP-1 estão indicados abaixo da sequência de nucleotídeos. Os asteriscos marcam diferenças entre as sequências de nucleotídeos que não resultam na alteração de um resíduo de aminoácidos.

Fig.6. Comparação dos cDNAs de bTP-1 e de IFN-tf-j bovino e das suas sequências de nucleotídeos deduzidas. A sequência de qminoácidos dedu zida de bTP-1 está apresentada por cima da sequência de núcleo tídeos. Os resíduos de aminoácidos diferentes no IFN-^^ bovino estão indicados por debaixo da sequência de nucleotídeos.Os asteriscos marcam diferenças entre as sequências de nucleotíde^ os que não resultam numa alteração de um resíduo de aminoáci-do.

Fig.7. Estratégia de sequenciação para os cDNAs cujas sequências estão representadas na Fig.3. A escala superior representa o numero e posições relativas dos nucleotídeos. 0 clone bTP 3 foi isolado por despiste imunológico da biblioteca em gtll. A linha a ponteado (.....) mostra o grau de prolongamento a partir do iniciador a partir de um oligonucleotídeo complementar de uma região (bases 260-280) perto do extremo 5' de bTP-3 O clone pbTP 159 representa um clone isolado a partir de uma biblioteca de prolongamento de um iniciador (em pBR322).Os -13-

clones bTP 50 9 e bTP 517 foram isolados a. pattir da biblioteca original em gtll por despiste com um fragmento pst-1 de 264pb do extremo 5' de pbTP 159. As setas indicam a direcção e o grau de seguenciação, a linha vertical (1) é o sítio de clivagem por Pst-1, pontos a cheio (*) são os sítios a partir dos quais se iniciou a sequenciação usando oligonucleotídeos sintéticos como iniciadores. Os números mostram as posições das bases. Note-se que o clone bTP517 representa um rearranjo. O extremo 3' do mRNA das bases 762 a 979 com a sua cauda poli(A) encontra-se no extremo 5' do clone. Após um segmento de 24A se gue-se uma sequência representando as bases 58 a 755.

Fig.8. Modificação e subclonagem do clone 509 de bTP-Ι para dar uma construção que não possui os codões para a sequência sinal de bTP-Ι mas que contem um codão de iniciação ATG antes do codão TGT(Cisl). 0 diagrama indica os sítios Cia I e Ban I nos quais foi inserido o oligonucleotídeo mostrado na parte inferior. 0 clone foi ainda modificado criando um extremo 3' cerse Ssp I antes da inserção no plasmídeo de èxpressão.

Fig.9. A sequência do promotor p Lac sintético. Sintetizaram--se três pares de oligonucleotídeos complementares, emparelharam-se e ligaram-se com base na complementariadade dos seus ex tremos. O fragmento resultante de cadeia dupla e 177 pares de bases foi então ligado do pBR 322 entre os sítios de restrição EcoRIe Bam Hl para gerar o vector de expressão designado pLac. Estaõ apresentados sítios de restrição adicionais, incluindo os sítios Cia I e Sma I usados para a inserção do clone de expressão de bTP-Ι modificado (Fig.8). Para detalhes do promotor Lac ver Referência 39.

Fig.10. Diagrama mostrando a inserção do bTP-ΊΑ (clone bTP-509 -14- modifiçado) no vector de expressão pTrp-2 nos sítios Clal/Bam Hl. Este vector do expressão contem um promotor-operador Trp modificado em que os sítios de ligação ao ribossoma estão enrjL quecidos com A e T (para detalhes ver Referencia 40).

Fig.ll. Expressão de bTP-1 pela estirpe D-112 de E.coli sob o controlo do promotor pTrp-2. As células E.coli no final do pe-riodo de indução foram semeadas, lavadas e dissolvidas em tampão de electroforese com SDS (32) antes da análise electroforé tica em géis de 12,5% de poliacrilamida. Por faixa analisou-se um total de cerca de 20 ug de proteína e os géis foram corados com prata antes da fotografia. Os géis superiores B e C representam indução da expressão da proteína-1 de trofoblastos ovina clones ο TP-1A e oTP-lD. A parte inferior da figura mostra transferências Western coradas com um anticorpo monoclonal an-ti-oTP-1. O gem A representa células com o vector plasmídeo mas sem inserção. O gel D representa indução da expressão de bTP-1. A faixa 1 é a testemunha não induzida (i.e. com tripto fano no meio), a faixa 2 é céleulas sem triptofano crescidas na presença de 0,1% de etanol (o veículo para IAA); a faixa 3 mostra as células crescidas na ausência de triptofano; a faixa 4 mostra células induzidas por IAA (dissolvido em etanol). Note-se o aparecimento de uma banda de 20KDa nas faixas induzidas. No entanto, esta banda , ao contrário de oTP-1 (B e C) não cora mas transferências Western com o anticorpo anti-oTP-1. Note-se também a indução relativamente fraca de oTP-1 (que pode ser detectado com o anticorpo). Em D, faixa, o bTP-1 repr£ sentava mais de 28% da proteína celular. DESCRIÇÃO DETALHADA.

Usou-se a nomenclatura e abreviaturas convencionais para as bases de nucleotídeos das sequências de DNA aqui descritas. A é para adessina; T para timi -15- na, G para guanina; e C para citosina. Quando se apresenta um DNA de cadeia simples ou de cadeia dupla, como sejam sequências de cDNA, deve-se entender que a complementariadade específica que adenina se liga a timina e guanina a citosina: A-T (ou T-A) e G-C (ou C-G).

Características das sequências de bases do cDNA de bTP-1 O clone bTP50 9 (Fig.l) tem 10 35 bases de comprimento até ao começo da cauda poli(A). Ele po£ sui uma grelha de leitura aberta de 195 codões começando no codão ATG na posição 79 e terminando num codão de terminação TGA, na posição 665. O codão de iniciação ATG, deste cDNA de bTP-1 é imediatamente precedido pela sequência TCCCC que não é típica da sequência consensus (CCGCC) para a iniciação da tradução em eucarióticas (5) tal como acontece com os mRNAs da proteina relacionada proteína-1 de trofoblastos bovina (oTP-1) (6), o hexanucleotídeo ATTAAA (bases 957-962, 993-998 e 1018-1023 da sequência 2) é o sinal mais provável para a adi ção de poli(A) ao extremo 3' da molécula. Cada um dos cDNAs na Fig.2.contem um destas sequências a 20 bases do sítio de poliadenilação. A comparação das sequências de bases de cDNA alinhadas para diferentes cDNAs apresentada na Fig.2 indica, que são diferentes derivando de mRNAs distin tos. A principal região de diferença é nos extremos 5' das mo léculas. Os restantes extremos 5', as regiões codificadoras e as regiões não codificadoras 3' são altamente conservadas.

Se se iniciar as comparações na posição 58 (o início de bTP 517-sequência 3) um total de apenas 31 bases diferentes distingue a sequência 1 ( bTP3/phTP159) e a sequência 2 ( bTP509] e apenas 13 diferenças distingue as sequências 2 e 3. Estas alterações de bases estão espalhadas ao acaso ar longo das -16- moléculas. A comparação das sequências de três cDNAs na Fig.2 também revela que elas diferem significativamente nos comprimentos das suas regiões 3' não traduzidas.

Características das sequências de aminoácidos deduzidos para bTP-1

As várias diferenças nas sequências de bases entre os três clones de cDNA para bTP-1 apresentadas na Fig.2 representam, na maioria dos casos, substitui ções conservativas. Na totalidade as diferenças nas sequências nucleotídicas alterarão dois resíduos de aminoácidos dentro do peptídeo sinal para as proteínas codificadoras pelos três mRNAs e proporcionam apenas três diferentes de aminoácidos (nas posições 5, 65 e 146) entre as sequências 1 e2 e apenas três diferenças entre 2 e 3 (nas posições 56, 65 e 146). Estas substituições, se bem que pequenas, proporcionam diferenças na carga total dos três polipeptídeos e explicam a presença de vá rias isoformas. A sequência sinal de bTp-1 tem 23 aminoácidos de comprimento (Fig.l) O primeiro aminoácido da proteína madura foi assinalado como o resíduo cisteina codi ficado pelos nucleotídeos 149-151. 0 resíduo é precedido por uma glicina na posição 523. A serina na posição 521, torna-se então no pequeno aminoácido neutro preferido conforme previsto pela análise de von Heijne (7).

Esta sequência sinal contem num núcleo de resíduos hidrofóbicos (57 a 514) e está de acordo com o comprimento habitual (15 a 25 resíduos) dos peptídeos t lider de outras proteínas secretadas (8). Os três cDNAs apre- -17-

sentados na Fig.2 proporcianam polipeptídeos maduros comecandc na posição lis 1 com 172 aminoácidos de comprimento. A sequer cia 2 dá origem a uma proteína madura de peso molecular 19701. Cada uma das sequências de bTP-1 contem apenas ilma única sequência de potencial glicosilação, Asn-Tre-Tre, nas posições 78-80 .

Comparação das sequências de bTP-1 e oTP-1

Na Fig.5. as sequências de bja ses e a sequência de aminoácidos para um único clone de cDNA de tamanho completo codificador de oTP-1 (6, clone Kazo) foi alinhado com o clone de cDNA de bTP-1 ( bTP-509) da Fig.l. As sequências de bases dos cDNAs de bTP-1 e de oTP-1 são muito semelhantes ( 85% de identidade) com um elevado grau de con servação presente ao longo das moléculas. É particularmente notável o elevado grau de identidade de sequências (92%) den tro das regiões 31. As únicas regiões que são marcadamente djL ferentes são as sequências 5' mais distantes.

As sequências de aminoácidos deduzidas apresentam uma identidade global de 80-%. Existem três substituições dentro da sequência sinal. A maior parte das outras alterações estão espalhadas mais ou menos unifor-mamente ao longo das moléculas. As maiores frequências de subs tituiçõês encontram-se perto do extremo Ní^ (resíduos 5-10) e nas três regiões (resíduos 95-102, 107-115, 128-135) nas meta des COOH-terminais dos dois polipeptídeos. Ao contrário de bTP-1, oTP-1 não possui um potencial sítio de glixosilação. Esta última característica foi confirmada para pelo menos três cDNAs de oTP-1 (6). -18

Semelhança das sequências de bTP-1 e oTP-1 com as dos IFN-ty.

Uma pesquisa inicial por compu tador mostrou que toda a região codificadora do cDNA de bTP-1 partilha cerca de 65% de identidade da sequência de bases com uma série de cDNAs humanos clonados representando IFN- 's de leucócitos humanos (9,10). O maior grau de semelhança de sequência de nucleotídeos de bTP-1 (85% de identidade) é com o gene bovino. No entanto, há muito menos conservação das sequências de nucleotídeos (69,7%) dentro das regiões 3' não traduzidas. Esta caracteristica está ilustrada na Fig.6 em que a sequência de bases do cDNA para bTP-1 está alinhada com uma correspondente sequência genómica de um IFN-0(^ bovino (11). Claramente a maior diferença nãs duas estruturas, além dos ex tremos 5' imediatos das moléculas, fica dentro de uma região extremamente rica em T entre as bases 885- e 955. A maioria da região 51 não traduzida está bem conservada e a sequência

habitual TCCCC imediatamente atrás do codão de iniciação ATG parece ser também uma caracteristica do gene bovino. O sã. nal de poliadenilação ATTAAA é observado não só em IFN- ^ bovino como também em vários genes IFN-c^.

Uma comparação do grau global de identidade da sequência de aminoácidos entre bTP-1, oTP-1 e uma série de IFNs seleccionados de várias espécies de mamíferos (11-15) ilustra a grande diversidade nas sequências de aminoácidos entre IFN de diferentes espécies. Por exemplo, IFN-0*. de porco e de ratinho diferem aproximadamente no mesmo grau que bTP-1 e IFN-ftj humano. No entanto, bTP-1 e oTP-1 asse melham-se mais a IFN-^j bovino e diferem do IFN-^'s humanos de roedores e de porco (11-15). É também significativo que as sequências de bTP-1, oTP-1 e as proteínas da família de IFN-Kjj têm 172 aminoácidos de comprimento, enquanto que as -19-

dos IFN-O^jS têm geralmente 166 resíduos de comprimento (11). Claramente bTP-1 está apenas relacionado de modo distante com IFN-£ (15).

As semelhanças das sequências de bTP-1 com IFN-^j bovino ocorre ao longo de todo o comprimento dos polipeptídeos (ver Fig.6.). Vários resíduos de ami-noácidos que se encontram na maior parte ou em todos os IFN-^s até agora caracterizados são conservados em bTP-1. Estes incluem as cisteinas nas posições 1,29,99 e 139 as quais participam nas pontes dissulfureto dentro de uma cadeia (16) e a sequência Cis-Ala-Trp-Glu-Ile-Val-Arg (resíduos 139-145) que são altamente conservados nos IFN-^s (17). bTP-1 tem actividade antiviral bTP-1 purificada pelos passos sucessivos de cromatografia de permuta iónica filtração em gel e cromatografia de afinidade com lectinas (em Concanava-linA-Sepharose) tem uma actividade específica de aproximada- g mente 0,3 X 10 unidades antivirais/mg de proteína quando tes tado num ensaio de inibição de efeito citopático (ver Tabela 1). Este valor aproxima-se do de IFN-a purificado (18). -20- TABELA 1

Passo de Purificação

Unidades relativas/mg de proteínas 0 ,54 x 104 0 ,11 x 106 0,38 x 106

Meio de cultura

Conjunto de fracções de DEAE-celulose Conjunto de fracções de Sephacryl S-200

Embriões bovinos com 19 dias foram cultivados em meio MEM (1). Após 24 h o meio foi diali-sado (1) e testado quanto à actividade antiviral num ensaio de redução do efeito citopático que utiliza células GBK-2 e o v_í rus das estomatitevesicular (35, 36). O meio reunido foi sujei to a cromatografia de permuta iónica em DEAE e cromatografia de permuta iónica em Sephacryl S-200 como descrito por Godkin et al. (26) para purificação de oTP-1. No entanto todos os tam pões continham 33% por volume de etilenoglicol para reduzir a agregação de bTP-1 (ver 1).

I

Descrição do cDNA modificado codificador de bTP-1

Uma sequência de cDNA ligeira mente modificada da Fig.l. foi incluida num plasmídeo derivado do pBR 322 (fornecido pela Pharmacia). Na Figura 1, a sequência sublinhada é necessária para codificar a produção de bTP-1 numa célula bacteriana viva. Quando incorporada em certo plasmídeos bacterianos, como seja pBR322 e deixado entrar numa célula bacteriana, o DNA proporciona um molde para a produ ção de RNA mensageiro de bTP-1 que, por sua vez, pode ser traduzido para produzir genuina em grandes quantidades. METODOLOGIA DETALHADA PARA OBTENÇÃO E SEQUÈNCIAÇÃO DE cDNAs

Materiais

As enzimas de modificação e restrição foram adquiridas a Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD), Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), New England Biolabs (Beverly, MA) e Seikagaku America Inc. o o (St. Petersburg, FL) [<λ>- Vj NTOs foram adquiridos à DuPont NEN Research Products (Boston, MA). Em todos os processos de transferência de DNA e RNA foram usadas membranas de nitroce-lulose (Schleicher & Schuell, Keene, NA). As estirpes competen tes para transformação de Escherichia coli, JM101 e de E.coli Y1088 , Y1084 e Y1090 o vector de clonagem bacteriofágico ygtll e os extractos de empacotamento (Kit" de clonagem Lambda gtll Gigapack) foram adquiridos à Stratagene (La Jolla, CA).

Os vectores de clonagem tipo plasmídeo (pUC13, pBR322), adaptadores, dNTPs e ddNTPs foram adquiridos à Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ). Oligo-dT celulo se e oligo-dT foram adquiridos à Boechringer Mannheim. Os"Kitâ' para imunodespiste (Proto Blot) e de "nick-translation" foram adquiridos à Promega Biotec (Madison, WI) e Amersham Corporation (Arlintoh Heights, IL), respectivamente. Os oligonucleo-tídeos foram sintetizados na Oligonucleotide Synthesis Facili_ ty, Universidade de Missonri pelo Dr. J.Forrester. Os referidos materiais assim como outros materiais foram adquiridos co mercialmente e existem portanto disponíveis ao público. -22-

Animais e colecção de conceptus

Vacas e vitelas de Holstein,

Jersey e híbridos cruzados para produção de carne foram inse-midados artificialmente 12 h após a observação do estrus (dia 0 ) e os conceptus recuperados no dia 18 e 19 da gravidz (1,2).

Isolamento tradução e análise Northern de mRNA de conceptus 0 isolamento e tradução in vi tro de RNA poli(A+) de conceptus bovino estão descritas nas re ferências 2, 19 e 20.

Para a análise por hibridação de transferências Northern, o RNA poli(A+) (2 ug) foi separadc por electroforese em gel de formaldeído-agarose e transferido para um filtro de nitrocelulose (21). Antes da hibridação com 32 a sonda de cDNA de bTP-1 ( bTP3 marcado com P) o filtro foi incubado a 42°C durante 3 horas numa solução contendo 50% (v/v) de formamida, ( 5 x SS C) (1 x SSC é 0,15 M NaCl; 0,915 M citrato de sódio); 0,0 5% de polivinilpirrolidona, 0,0 5% de ficoll; 0,05 % de albumina de soro bovina; fosfato de sódio 50 mM (pH 5,5); 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS) e 0,5 mg/ml de DNA de esperma de salmão. O filtro foi então hi- bridado a 42°C durante 24 h no tampão atrás descrito que con- 32 5 tem bTP3 marcado com P (2 x 10 cpm/ml). A actividade espe 8 cífica da sonda de cDNA é de 2 x 10 cpm/jug. Após hibridação o filtro foi lavado duas vezes à temperatura ambiente em 5 x SSC e 0,1% SDS durante 15 min. cada. 0 filtro foi seco rá pidamente à temperatura ambiente e exposto a filme de raios X (Kodak, XAR) na presença de um écran intensidicador a -80°C, -23-

Construçao , Despiste e Sequenciação da biblioteca em ggtll. Os cDNAs complementares foram sintetizados in vitro usando o método de Gubler e Hoffman (22) como modificado por Polites e Marotti (23). 0 RNA poli (A+) foi emparelhado com um inicia dor oligo (dT) e usando para construir um cDNA de cadeia dupla. 0 cDNA foi então fraccionado numa coluna (1 x 30 cm) de agarose A-50M. Os polímeros de tamanho superior a 350 pb foram metilados para proteger sítios de restrição Eco RI intejr nos e adicionou-se adaptadores Eco RI ao cDNA antes da clona-gem no sítio Eco RI do bacteriofago lambda gtll (24). Os fra£ mentos de DNA ligados foram empacotadas in vitro para produzir partículas fágicas infecciosas. As bibliotecas fágicas foram amplificadas em E. coli Y1088 depois despistadas em E. coli Y10 90 (24, 25).

Cerca de 28000 fagos recombi-nantes foram semeados com E.coli Y1090 a uma densidade de cer ca de 9 500 placas por caixa de 1500 mm. Após um período de crescimento de 3,5 h a 42°C, as placas foram cobertas com fil tros de nitrocelulose saturados com 10mM isopropiltiogalacto-sido (IPTG) e incubados durante mais 3,5 horas a 37°C. Os fil tros foram removidos das placas e bloqueados por incubação em 10 mM TrisHcl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 e 20% (v/v) soro fetal de vitela. Os filtros foram então incubados com o anticorpo primário (diluído 1:2000) contra o TP-1 (26) o qual foi passado através de uma coluna com lisado de E.coli Y1090 (24). As placas contendo cDNA de bTP-1 foram identificadas usando o segundo anticorpo, uma IgG de carneiro anti--coelho conjugada com fosfato alealina e substiractos corados 5 bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e nitroblue tetrazo-lium" (NBT). -24-

Para determinar a sensibilida de do método de imunodetecção atrás referido, várias concentrações de oTP-1 purificada (26) foram colocadas directamente sobre um filtro de nitrocelulose. O anti-soro anti-oTP-1 pode detectar 50 pg de oTP-1 purificado nestas condições. A sensibilidade contra bTP-1 I de aproximadamente 5 a 10 vezes menos. O anti-soro empregue foi o descrito por Godkin et al.(27) para imunolocalização de oTP-1 em células de trofoblastos e sue esi pecificamente imunoprecipita oTP-1 a partir de uma mistura de proteínas de conceptus.

Identificaram-se vinte e três placas positivas bTP-1 e seis destas foram sujeitas a purificação por placas nas condições usadas para a identificação de placas positivas com anti-soro snti-oPT-1 (6). O maior cDNA de bTP-1 encontrado no imunodespiste da biblioteca em gtll foi ptP3 (350 ph), o qual foi ligado ao sítio Eco RI do pla£ mídeo pUCl4 digerido e desfosforilado e foi então usado para transformar E. coli JM 101 pelo método do cloreto de cálcio (21). As sequências de nucleotídeos foram determinadas directa mente a partir do plasmídeo (28) usando o método de terminação de cadeia didesoxi (29).

Prolongamento do iniciador e despiste da biblioteca em pBR322

Para determinar o comprimento do mRNA de bTP-1 e para se obter as regiões 5' do cDNA de bTP-i construiu-se uma nova biblioteca de cDNA usando o método de prolongamento do iniciador e um oligonucleotídèo sintético. Usou-se oligonucleotídèo 51 d(GGG TGT AGG AGG AGT TGG)31 cujas bases são complementares de uma região de 20 bases, bases 260-280 desde o começo da cauda poli(A+) de bTP3. O cDNA de -25-

cadeia dupla, sintetizado pelo método anteriormente descrito (22,23) foi dotado de caudas dCTP, emparelhado com pBR322 pro vido de caudas dG no sítio de restrição pstl e usado para trans formar células E.coli DHl pelo método do cloreto de cálcio (21) A segunda biblioteca de cDNA 32 foi despistada com oTP-1 marcado com P (Kaz 2; ref-6:activi- g dade específica: 0,5-1 x 10 cpm/ug DNA). Uma vez que o prolon gamento do iniciador é efectuado a partir do extremo 51 do bTP3 e devido a pTP-1 ser muito homólogo de oTP-1, usou-se Kaz2 (550 bases de comprimento a partir do extremo 3' de oTP-1 para identificar clones positivos que continham as regiões 5' do cDNA de bTP-1. Cerca de 24000 colónias (3000 colónias/pla ca de 150 mm) foram semeadas e os filtros réplicas feitos de acordo com um método convencional (21). Os filtros foram pré--hibridados a 42°C durante 2 h em 5 x SSC, 50% (v/v) de forma mida, 0,6% (p/v) SDS, 0,5% (p/v) de leite em pó desnatado, 20 mM Tris Hcl (ph 7,5), 4 mM EDTA e 0,5 mg/ml de DNA de cadeia simples de esperma de salmão e hibridados a 42^C durante 18 h no tampão atrás descrito que contem o cDNA de oTP-1 marcado com P (2 x 10 cpm/ml). Os filtros lavados duas vezes duraii te 15 mm a 42°C com 5 x SSC, 0,1% (p/v) SDS e uma vez durante 15 min a 42°C com 2 x SSC, 0,1% (p/v) SDS. De entre aproxima-damente 200 clones positivos identificados, isolaram-se plas-mídeos com cDNA de bTP-1 inserido a partir de 60 colónias (21). Estes plasmídeos foram digeridos com a endonuclease de restrição Pstl e sujeitos a electroforese em gel de agarose para determinar os tamanhos dos cDNAs de bTP-1. O maior cDNA de bTP-1 isolado a partir de uma biblioteca em pBR322 tinha 677 ph de comprimento (pbTP 159). A sequenciação foi efectua-da como atrás (28, 29) -25-

Despiste da biblioteca em gtll com cDNA de bTP-1

Uma vez que o prolongamento do iniciador é efectuado a partir de um ponto a 300 nucleotídeos da cauda poli(A+) não existe nesta fase cDNA de bTP-1 de tamanho completo representado por um único clone na biblioteca do plasmídeo pBR322. Para se obter cDNA de bTP-1 de tamanho completo a partir da biblioteca em gtll, preparou-se uma sonda sujeita a "nick-translation" a partir do extremo 5' de pbTP159 (phTP 159-5': posições de bases 1-264) para fazer novo despiste da biblioteca em gtll. Cerca de 7500 fagos recombinantea foram semeados com E.coli Y1090 (2500 placas/caixa) e mantidas a 37°C durante a noite. As placas foram cobertas com filtros em duplicado e incubados com pbTP 159-5' marcado com P. Iden tificaram-se cerca de 30 placas como clones positivos contendo cDNA de bTP-1, Isolou-se DNA fágico a partir de 18 placas posi tivas, digeriu-se com a ondonuclease de restrição Eco RI e sujeitou-se a híbridação Southern (30) com uma sonda específica do extremo 3' ( bTP3 marcada com P) para identificar qual dos cDNAs de bTP-1 identificada pelo pbTP159-S' contem também uma região correspondendo ao extremo 3' do mRNA de bTP-1. Encontraram-se dois isolados frágicos ( bTP 50 9 e bTP 517, 10 35 e 950 bases de comprimento, respectivamente) tendo 5 extremos 3' do cDNA de bTP-Ι. Prepararam-se partículas fágicas pelo mé todo do lisado de plsaas e os DNAs fágicos foram purificados pelo método descrito por Reddy et al.) (31). O DNA do clone gtll foi digerido com EcoRI e as inserções de cDNA subclona das no vector plasmídeo pUC13. A estratégia de sequenciação de nucleotídeos para as três sequências descritas na Fig.2. está apresentada na Fig.7.

Análise por transferências Western das proteínas de fusão Células de E. coli Y1090 foram infectadas com fago tipo selvagem ou recombinante de gtll que contêm as inserções de cDNA de bTP3 ou Kaz2 (6) (um cDNA de oTP-1) a 37°C e semeados em agarose de topo contendo isopro piltiogalactosido lOmM. Quando do aparecimento de placas, repi cam-se quinze de cada caixa, ressuspendem-se em tampão de amos tra com SDS (32) e aquece-se a 100°C durante 5 min. As proteínas bacterianas e fágicas são separadas por electroforese em qel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) em géis de 7,5¾ (p/o)(32) e transferidas electroforêticamente para papel de nitrocelul£ se (33). Após transferência, os filtros de nitrocelulose, são incubados com 5¾ (p/o/ de leite em pó desnatado ("blottd') em tampão fo3fato de sódio lOmM, pH7,2 contendo 0,15M NaCl e 0,05¾ (v/v) Tween 20 (PBST) durante 2 h a 37°C. As transferên cias são rápidamente lavadas com PBST e incubadas com anti-so ro de coelho indàzido contra oTP-1 (1:250) (27) durante 2 H a 37°C. Os filtros foram lavados três vezes com PBST e as pro teínas fusão visualizadas com anti-soro de cabra anti IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábamo silvestre como descrito por Kazami et al (24).

Expressão de bTP-1 em Escherichia coli sob o controle de pLac

Um clone de cDNA de bTP-1 A (Piç 3) foi obtido a partir de bTP-509 (apresentado na Fig.2, mas também representado nas figs.5 e 6 ) pela ligação de: i) Um fragmento de 36 pares de bases (ver Fig.8) que foi sin tetizado por emparelhamento de dois oiligonucleotídeos compl^ -28-

mentares codificadores de uãia metionina s dos aminoacidos 1—10 da proteína madura. Este oligonucleotxdeo possui extre mos 5' (ClaX) e 3* (Ban I) coesivos. ii) Um fragmento de 730 pb de bTP-50 9 que foi isolado por du pia digestão com Ban 1 /Ssp I e que codifica os aminoacidos 11-172 da proteína madura. Ele possui, portanto, um extremo 5' coesivo (Ban X) e um extremo cerse (Ssp I). iii) O vector, pLac (Fig.9), do qual foi removida uma região no sítio de multiclonagem de um promotor Lac sintético por du pia digestão com Cia I /Sma I (ver Fig.3). fefcoli estirpe JM-101 foi trans formada com o plasmídeo pBR-322 que contem os produtos de ligação atrás descritos. A selecção dos transformantes foi feita em placas de Luria Broth/Ampicillin,. O alinhamento correcto dos frag mentos ligados foi confirmado por análise de restrição do DMA de plasmídeo e depois por sequenciação de toda a inserção. A construção de expressão assim obtida foi designada: pLac/bTP-ΙΑ. A sua expressão foi examinada em E.coli (estirpes JM-101, JM-1Q3, D-112, K-12) em Luria Broth suplementado com isopropil-tio-B-D-galactosidase (IPTG) (0,5, 1,5 e 10 mM) como indutor do promotor Lac (39). Testemunhas sem indntor ou estirpes de E.coli sem o vector pLac/bTP-ΙΑ foram processadas paralelamente. Os resultados ' -29- deste ensaio mostram que foTP-1 ê induzido por IPTG mas a ex**> pressão é relativamente baixa (resultados não apresentados). Assim, foi tentada a expressão sob o controle do promotor pTrp 2.

Expressão de bTP-1 em Escherichia coli sob o controle de Trp2 i) Todo o cDNA de bTP-1A como se mostra na Big.8 foi removido cortando com as endonucleases de restrição Cia I e Ban Hl. Isto foi ligado ao vector pTrp 2 que foi descrito detalhadamente por Olsen et al (40) e que deriva do operador do operão Trp de E. coli (41). Esta inserção foi conseguida por remoção de um segmento Cia Ι/Ban Hl do sítio de muiticlonagem no vector (Fig.10) ii) E.coli estirpe DH-1 foi transformada com os produtos de li. gação. A selecção decorre em placas de luria Broth (LB)/Ampici llin qua são suplementadas com triptofano (100 mg/ml) para reprimir a expressão. O DNA em colónias seleccionadas foi despijs tado por análise de restrição. A integridade das sequências foi ainda confirmada por sequenciação de toda a inserção de DNA, iii) A expressão foi examinada em E.coli estirpes JM-103, D-112 e K-12 em meio M9 suplementado com caseína hidrolizada por alcalinos como fonte de aminoácidos (meio m9/CA) na presença e ausência de Trp e após adição de ácido indolacético (IAA; lmM que actua como indutor) (41). As testemunhas incluem estirpes transfectadas com vector sem inserção (pTrp 2). O crescimento celular foi iniciado a 37°C a uma densidade óptica de 0,02. O crescimento terminou quando a densidade celular atingiu apro-ximadamente 0,8 unidades de densidade óptica. -30-

As bactérias foram centrifuga-das, lavadas em meio e solubilizadas directamente em tampão de electroforese com SDS (32), A análise foi efectuada em géis de 12,5% de poliacrilamida. As proteínas foram coradas com prata por processos convencionais. Observaram-se níveis elevados de expressão para bTP-1 (Fig.ll) na estirpe D-112. Os varrimentos densitometricôs (não apresentados) indicam que aproximadamente 28% da proteína total expressa na estirpe D-112 corresponde a uma banda de Mr 20 000 que ©prece ser induzida especificamente pela ausência de triptofano ou presença de IAA. As transferências Western (33) expostas ao anticorpo aminoclonal contra a proteína-1 de trofoblastos ovina não coram positivamente. No entanto quando um anticorpo policlonal preparado contra um pe|> tídeo dos 20 aminnácidos terminais de bTP-1 foi usado para cor rar as transferências Western obteve-se uma forte reacção posjL tiva (resultados não apresentados). Assim, a expressão de bTP--1 foi conseguida em E.coli estirpe D-112 com níveis eleaados sob o controle do promotor pTrp-2. Isto permitirá a produção de grandes quantidades da proteína bTP-1 necessária ao aumento da fortilidade em mamíferos.

Purificação de bTP-1 recombinante E.coli D-112 portadora do plajs mídeo pTrp-2/foTP-lA foi cultivada durante a noite em meio LB contendo ampicilina e 0,1 mg/ml de triptofano. Na manhã seguin te quantidades desta cultura "stock" foram inoculadas em volumes de um litro de meio fresco sem triptofano mas contendo lmM IAA. A densidade óptica inicial da cultura,foi de 0,02. As culturas foram agitadas rápidamente a 37°C durante 4h altura em que a D.O. do meio atingiu 0,8·' As células foram colhidas por centrifugação a o sedimento de células resultante foi resu.s penso em 20 rui de tampão Tris-HCl (0 ,01M, pLT 8,0). A suspensão foi passada duas vezes através de uma prensa Francesa (1500 -31-

psi). As células rebentadas foram centrifugadas (10000 xg; 30 min) para isolar os detritos maiores. A camada membranosa solta sobre o pedimetro duro foi removida. O sedimento foi en tão ressuspenso em tampão 0,01 M Tris-HCl contendo ImM EDTA e fluoreto de fenilmetano-sulfonilo ImM e o passo de centrífuga cão repetido. O sedimento enriquecido em cor pos de inclusão foi dissolvido em 25 ml de AM guanidinio-HCl em tampão 0,01 M Tris-HCl (pH8 ,0 ) contendo 2,25% de 2-merca£ toetanol por volume.

Esta solução foi agitada duran te a noite a 4°C. Nesta fase 25 ml de tampão Tris-Hcl 0,02 M foi adicionado gota a gota e a solução dialisada contra 4 mudas (cada uma de 2 litros) de tampão Tris-HCl 0,02 M (pH 8,0) durante 16 h. As pequenas quantidades de proteína que precipjl taãam foram colhidas por centrifugação. A solução sobrenadan-te contem predominantemente bTP-1 resaturada solubilizada. Pa ra avaliar a pureza da bTP-1, as amostras de proteína foram analisadas por electroforese em cada um dos passos da purif jÍ cação. Cada fracção foi também testada quanto à actividade an tiviral (Tabela 2). O processo proporciona um total de cerca de 10 mg de bTP-1 altamente purificada a partir de aproximadamente 280 mg de proteína de partida. É provável que os rendimentos possam ser melhorados pela optiamização do rebentamento das células e dos processos de centrifugação. A bTP-1 assim produzida tem uma actividade específica de 4,1 x *7 10 unidades laboratoriais /mg que é muito semelhante do de um IPN- ^-1 recombinante bovino. Também astá na gama de -32-

actividades observadas para outros IFNs recombinantes derivados de fontes nurinas ou humanas (42), ApeHae do facto deste bTP-1 não ser glicosilado, parece ser relativamente estável em solução, se bem que estejam ainda a ser conduzidas experi. ências para caracterizar as suas propriedades. Surpreendente mente, a actividade antiviral do produto recombinante é mais de 10 vezes superior à de bTP-1 purificado a partir de meio de cultura de conceptus (Tabela 1),

Assim, provou-se claramente possível expressar bTP-1 num hospedeiro bacteriano, por exam dIo em E. coli empregando o clone de cDNA de bTP-1 modificado apresentado na Fig.8. Este cDNA foi colocado sob o controle do promotor pTrp-2, O produto resultante foi purificado e apre senta a actividade anti-viral esperada de uma IFN- recombinante, B.coli (estirpe DH-1) contendo o plasmídeo de expressão pTrp-2/bTP-lA foi depositada na American Type Tissue Culture Collection. -33-

Tabsla 2;

Recuperação da actividade de bTP-1 a partir de Ξ. coli D-112

Actividade Actividade Volume Proteína Tbtal Específica

Fracção Células* (ml) (mg) (U) (U/mg) Células Testemunha 27 158 0 rebentadas ^ + Trp-2 29 282 2.1 x 107 7.4 x 10 4 Fracção de y sobrenadante Testemunha 31 163 0 - + Trp-2 30 255 2.2 xlD7 8.6 xlO4 Corpos de Testemunha 35 4.2 — inclusão + Trp-2 50 24 1.5 x 106 6 x 104 solubilizados' Proteína 3 Testemunha 35 5.6 renaturada4 + Trp-2 50 10 4.2 x 108 4.2 x 10 7 Proteína Testemunha 35 0.4 _ 5 precipitada + Trp-2 50 5 1.4 x 1Q6 2.8 x 105 -34-

As unidades de laboratório onde 1 unidade equivale a 8,3 Unidades de referência Internacional (IR7) quando comparado com o padrão de referência de IFN (leu cócitos) fornecido pelo National Institute of Allergy and In- fections Disease, Bethersda, M.D* Assim, a actividade específi. 0 ca da pro-Bença final seria de aproximadamente 3,0 x 10 IRU/rng 1 Após rebentamento s suspensão foi testada directamente quanto à actiaidade antiviral (35,36). 2 Sobrenadante gue ficou após centrifugação. Note-se que todo o IFN activo nas células estava na fracção solúvel. 3 Corpos de inclusão levados foram solubilizados em guanidinio-HC1 mais mercaptoetanol. A actividade foi relativamente baixa, mas estava presente alguma proteína activa. 4 Proteína solubilizada em corpos de inclusão após remoção do guanidinio-HCl e mercaptoetanol por diálise. Grandes quanti, dades de IFN activo foram agora detectadas, 5 Esta é a fracção que precipitou após diálise.

As testemunhas representam recuperação de proteína e actividade de IFN de E.coli D-112 que não contêm o plasmídeo de expressão pTrp-2. Nenhuma actividade estava presente nas células rebentadas e na fracção do sobrenadante. Actividade não foi seguida durante o restante protocolo.

Claims (1)

1. -35- REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de uma sequência de DNA recombinante adaptada para a tranfe-rência de um DNA que codifica uma proteína-1 de trofoblastos bovina numa célula hospedeira adequada, caracterizado por com preender: a) a ligação, de modo operável, do referido DNA a um promotor forte, capaz de expressar uma proteína-1 de trofoblastos bovina na célula hospedeira adequada; b) introdução, por um procedimento de transformação padrão, do referido vector numa célula microbiana; c) rastreio das células microbianas transformadas relativamente a transformantes bem sucedidos; d) utilização de um método de sequenciação de DNA estabelecido para confirmar que a construção está na orienta ção e alinhamento correctos; e) isolamento, por um método padrão, do vector recombinan te com a inserção orientada correctamente, a partir das células transformadas. -36- 2â, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o DNA ser capaz de expressar a proteína-1 de trofoblastos bovina a seguir apresentada na Figura 1, ou uma sua variação funcional.

   bT P-1 GATCCCCGGAAACTAGAATTCACCTGAAGGTTCACCCAGACCCCATCTCAGCCAGCCCACCAGCAGCCACATCTTCCCC s1 s23 1 2 ?>δ *δ o>o 3 O O μ- I- O μμ- O (_) «H- ?5 «O o dtj c o r- < σ>υ >iU I- O o>o i-u £8 «< >- o 2δ pu •II-I- U o <0 ►— > o p o «μ-»- o β o 58se E< ao o μ->- uss t— o V O v> ' 3 P " P es e < C CJ 1Λ «C 10 c 4) O l< ?5 (D CJ β u I- O β CJ 3 O Φ r- O 3 O 5 b CJ)CJ I- o e < 3 υ o i- CJ C o £S a CJ 5.3 0.0 L- O β < β CJ — o β o í*o oicj 3< 5υ *4 CJ *>U |A|_ p O «- o »- O <0 μ- > o Ι αμ βο 58 4J O SS «υ f CJ clCJ £5 30 o>5 feo M (· 3 o V H-i i“ CJ Ol £ o CL O η c ο m >“ < ο>ο r» αο μ- μ ο *ιμ- 102 pro CCA r» eu ΓΜ r- μ— »-—< 152 leu CTC o 3 h αι_ £5 «υ CJ βο 5*8 Ο) Ο ίδ 0)0 β o 58 U <J O Η χ< ·-< β t— r- CJ «Ο ρ ο β μ. >- Ο 5)5 ?5 e< Ο H* O s c ο rr< 0)0 ser TCT 5.S Ο μ- e ο 4) O βμ-E < o *- 5 ? CJ >- Ο ser TCC β ο 5a μ ο χ< *»μ- *4 O «μ E < ?5 4) μ- CO r— C σ>ο tfl o T- < XCJ αο £3 ΑΟ χ< >-< 30 5.5 172 leu CTT c ο a o r-< 0)0 ? u ο μ- >- ο ΙΑ Ο χ< 1— < r— u <0 f— > (3 f- < a> o o H- £8 0)0 4> < αο £3 r-O β μ* > ο ?5 β < c o «ft < ÍO < 3 Ο ι- C 0)0 L O >1< *j μ- 3 Ο 0)5 μ μ- χ ο *>< 0) O 1 μ-— < DO ft> H* 1*0 >- Ο β μ-> Ο 4)0 X t- αμ- 30 ν μ-»- Ο 30 ν μ— r-O 4) O r- μ-— < ακ £5 ϊ£ Ε < 30 ο» μ— r— O c ο ο>δ β μ-r-μ-— < 3< 5.5 '£5 0)0 D Ο 5)3 asn AAC c ο τ,< σ>ο ο ο μ Ο 0.0 ao μ o *4 μ- xt- r- O 0)0 C ο ·“ < σι ο 30 β μ— ι-Ο c< 0.3 5*8 0)0 • o 58 440 S5 Pi ão βο XO ομ- ? ο β μ-·- Ο •Ο Ο x8 OH MO >*< r· < St ι-Ο CO ο>δ χο 5.8 σιΟ μ Ο β < ao £5 D>< i. O <0 < •—Ο 0>0 5¾ 0)0 χδ *·< 5*5 0)0 £δ Λ C 3 < 4) H* »- »— β μ- α- 3 0 β μ— r- Ο xS υ ι- 4JO 15 μ o x< 0)0 t- o o < 0.0 £3 *»ρ «Η Ε< 30 βμί >- Ο 0.0 Μ< βΟ 3< o>5 R5 r- < «< ίί 30 ο>3 C ο ·-< Ο>ο ser TCT M< 0)0 ?3 β < ηΟ — < j: ο 30 0)5 0.0 £5 3< 0)0 30 β μ— μ- μ- 0-0 £5 Teu CTC β μ-»- ο 5,$ r- < «< x< >- < μΟ χο 4J < 0)0 .-ο β μ-> ο 3θ *> μ-- ο ρο 5.5 3 CJ OH CJ 1.0 χο 4-> < 3ο β μ-»- ο l μ- 8ϋ L ο χ Ο ·μ^< 5*5 0)0 μ o x< k < l)U Μ Η 5)5 Ο μ- —< fco χ ο *>< 4)0 15 - o 5G S3 β Η Οο ο to ν αο| «μ «ο »-ο V) βο 78 asn AAC 103 vai GTG e «h txS m μ μ-ΙΛ 4) Ο *- «μ— CJ t-< < t s o μ o o CJ § o o 5 δ < 5 < *-Ο μι- O 5 5 < δ < o < o O O O H· CJ o < CJ o o 5 3 s s CJ < μ- o o o £ S 5 μ- < δ δ δ δ 8 μ-< ι— CJ < < δ CJ < μ- Ê s *I o $ < < »- Η· < J— Ο Η- δ < μ— ο < ο δ < μ- δ < 5 δ CJ < < μ- < 5 < υ < c < CJ ο CJ CJ < δ < μ- CJ ο CJ $ ο μ— ο -38

   3§. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o DNA ter a fórmula apresentada na Figura 1, 4â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a célula hospedeira adequa da ser uma célula bacteriana, uma célula de mamífero ou uma célula de levedura. 5§. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a célula microbiana do pa£ so b ser E, coli. 6i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o vector recombinante ser um plasmideo adaptado para a transformação de uma célula bacte riana. 7â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o plasmideo ser um plasmí-deo pBR tendo incorporado o gene estrutural ligado de modo operável ao promotor. 8 i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o promotor ser promotor trip ou lac. -39- 9â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a estirpe de E. coli ser D112 ou JM10 3. 10â. - Processo de preparação da proteína-1 de trofoblastos bovina, caracterizado pelos passos de: a) introdução de um vector recombinante compreendendo uma sequência de DNA capaz de expressar uma proteína-1 de trofoblastos bovina, numa célula hospedeira adequada; b) cultura da célula hospedeira resultante num meio de cultura adequado, e c) isolamento da proteína-1 de trofoblastos recombinantes a partir das células em cultura. llã. - Processo para a preparação de uma proteína-1 de trofoblastos bovina essencialmente pura sem as contaminações da proteína-1 de trofoblastos bovina, caracterizado por a referida proteína ser isolada a partir de fontes naturais. 12â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a referida proteína ser preparada por meios de tecnologia de DNA recombinante. -40-

   13 ã. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida proteína ser produzida por uma bactéria. 14i. - Processo para a preparação de uma proteína recombinante do tipo proteína-1 de trofoblas-tos bovina de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por incluir na referida proteína substâncialmente as propriedades potenciadoras da fertilidade em mamíferos de proteína-1 de trofoblastos bovina natural. 15â, - Método para aumentar a fertilidade em mamíferos caracterizado pela administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz potenciadora da fertilidade em mamíferos de uma proteína-1 de trofoblastos bo vina. 16 ã. - Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por a proteína-1 de trofoblají tos bovina ser uma proteína recombinante. 17ã» - Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por a proteína-1 de trofoblasi tos bovina ser recombinante numa dosagem diária de 0,5 a 50 mg/animal. -41·

   18ã. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para aumentar a fertilida de em mamíferos caracterizado por se incluir uma quantidade eficaz potenciadora de fertilidade em mamíferos de proteina--1 de trofoblastos bovina ou de uma proteína tendo substancialmente a actividade potenciadora da fertilidade em mamífe ros da proteína-1 de trofoblastos bovina juntamente com veículos ou adjuvantes não tóxicos. Lisboa, 25 de Outubro de 1989

   Aganís Gílslá da Preprteáe Industrial RUA ViCTOR CORD®N, 10-A, 1/ 1200 LISBOA