KR100781066B1 - 가지과 작물 세균성 풋마름병의 기주특이성에 관여하는ｒｓａ1 유전자 - Google Patents

가지과 작물 세균성 풋마름병의 기주특이성에 관여하는ｒｓａ1 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가지과 작물 세균성 풋마름병에 관여하는 rsa1 유전자에 관한 것으로서, 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)의 기주 특이성에 관련된 유전자를 밝히기 위해서 고추에 병을 일으키고 감자에 일으키지 않은 race 1(SL341)균주와 감자에만 병을 일으키고 고추에 병을 일으키지 않는 race 3 (SL2029)균주를 이용하여 pRS13을 확보한 후, rsa1 유전자를 포함하는 pRS13이 형질전환된 SL341 균주가 감염된 고추에서 비병원성을 나타내고, rsa1 유전자가 파쇄된 SL2029 균주가 감염된 고추에서 병원성을 나타내다가 pRS13을 형질전환 시키자 비병원성으로 회복함을 확인함으로써, 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 rsa1 유전자를 알아내었다.
본 발명은 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸의 기주 특이성에 관련된 rsa1 유전자의 특성을 밝힘으로써, 이 병원균에 대한 복잡한 병발생 기작에 대한 이해는 물론 나아가서는 저항성 식물의 육성 등을 통한 이 병원균에 대한 차별적인 방제 방안을 제시할 수 있어 효과 없는 약제 방제를 지양하고 풋마름병의 발생을 효율적으로 경감시킴으로써 안정적인 가지과 작물 생산 체계를 확보할 수 있다.
세균성 풋마름병, 랄스토니아 솔라나세아룸, rsa1, SL341, SL2029, 고추

Description

가지과 작물 세균성 풋마름병의 기주특이성에 관여하는 ｒｓａ1 유전자{rsa1 gene involving in host specificity of bacterial wilt in many solanaceous plants}
도 1은 세균성 풋마름병원균 랄스토니아 솔라나세아룸 race 1 (SL341)과 race 3 (SL2029)의 병원성 검정 결과(A; 고추, B; 감자, 1; Control, 2; SL341, 3; SL2029, 접종 후 21일째의 풋마름 증상)를 나타내는 그림이며,
도 2는 랄스토니아 솔라나세아룸 SL341 (race 1, A)와 SL2029 (race 3, B)의 게노믹 라이브러리 클론(genomic library clone)들(1-16)을 EcoRⅠ제한효소로 처리한 결과를 나타내는 그림이며(M; lambda-HindIII marker.),
도 3은 랄스토니아 솔라나세아룸 SL341(race 1)과 SL2029 (race 3) 게노믹 라이브러리(genomic library)를 교배(mating)하여 나온 클론(transconjugant)들을 (1-16) EcoRⅠ제한효소로 처리한 결과를 나타내는 그림이며(M; Kb marker.),
도 4는 SL2029 라이브러리 클론(SL2029 library clone)의 제한효소 지도 (restriction map)를 나타내는 그림이며(상기의 알파벳은 다음의 제한효소를 나타낸다, H; HindIII, E; EcoRⅠ, P; Pst I),
도 5A는 고추에서 병원성 검정 결과 (1; Control, 2; SL341, 3; SL2029, 4;SL341(pRS1), 5; SL341(pRS13), 접종 후 21일째의 풋마름 증상)를 나타내는 그림이고, 5B는 병원균 접종 후 고추에 나타나는 병 진전도(disease progression curves)를 나타내는 그림이고,
도 6은 rsa1 유전자를 가지는 각 플라스미드의 제한 효소 지도 (상기의 알파벳은 다음의 제한효소를 나타낸다, H; HindIII, E; EcoRⅠ, P; Pst I)를 나타내는 그림이고,
도 7A는 고추에서 병원성 검정 결과 (1; Control, 2; SL341, 3; SL2029, 4; SL341(pRS1), 5; SL2029 rsa1::Tn3 - gusA200(pRS13), 6; SL2029 rsa1::Tn3 -gusA200, 접종 후 21일째의 풋마름 증상)를 나타내는 그림이고,
7B는 병원균 접종 후 고추에 나타나는 병 진전도(disease progression curves)를 나타내는 그림이고,
도 8A는 감자에서의 병원성 검정 결과 [1; control, 2; SL341, 3; SL2029, 4; SL341(pRS13), 5; SL2029 rsa1::Tn3 - gusA200, 6; SL2029 rsa1::Tn3 -gusA200(pRS13), 접종 후 15일째의 풋마름 증상]를 나타내는 그림이고, 8B는 병원균 접종 후 고추에 나타나는 병 진전도(disease progression curves)를 나타내는 그림이고
도 9A는 병원균 접종 후 고추 줄기내의 세포(cell) 수의 변화도, 9B는 병원균 접종 후 감자 줄기내의 세포(cell) 수의 변화도를 나타내는 그림이다.
본 발명은 가지과 작물 세균성 풋마름병에 관여하는 rsa1 유전자에 관한 것으로서, 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸의 기주 특이성에 관련된 유전자를 밝히기 위해서 고추에 병을 일으키고 감자에 일으키지 않은 race 1(SL341)균주와 감자에만 병을 일으키고 고추에 병을 일으키지 않는 race 3 (SL2029)균주를 이용하여 pRS13을 확보한 후, rsa1 유전자를 포함하는 pRS13이 형질전환된 SL341 균주가 감염된 고추에서 비병원성을 나타내고, rsa1 유전자가 파쇄된 SL2029 균주가 감염된 고추에서 병원성을 나타내다가 pRS13을 형질전환 시키자 비병원성으로 회복함을 확인함으로써, 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 rsa1 유전자를 알아내었다.
현재 국내에서 재배되고 있는 밭작물로는 배추, 무를 비롯한 십자화과 작물, 고추, 가지, 토마토 등이 포함된 가지과 작물, 오이, 참외, 수박 등이 포함된 외과 작물 과 참깨, 들깨, 양파, 파, 마늘, 생강 등이 재배되고 있다. 그 중에서 고추, 가지, 토마토, 담배를 비롯한 가지과 작물은 여러 밭작물 중에서 높은 비율을 차지하고 있다. 이러한 동일 작물의 광범위한 재배와 동일 장소에서 연작은 여러 가지 식물병을 유발해 왔다. 이전에는 곰팡이병이 주로 나타났으나 홍수, 고온 등의 기후변화는 세균병의 발달을 가져왔고, 가장 피해를 주는 세균병은 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 세균성 풋마름병이다. 가지과 작물과 들깨, 참깨, 생강 등에 발생하는 세균성 풋마름병은 Fusarium, Verticillium 등의 곰팡이에 의한 시들음병과 그 증상이 유사하나 고온 다습의 환경 조건 하에서는 오히려 곰팡이에 의한 시들음병보다 병발생율이 훨씬 더 높고 짧은 시간 안에 광범위하게 발생하는 것으로 실제 재배상에서 나타나고 있다.
랄스토니아 솔라나세아룸은 균주간의 상동성이 낮고 복잡하기 때문에 두 가지 분류체계로 균을 분류시키는데 그 중 첫 번째는 자연상태의 기주 범위를 이용한 분류로 최초 감염된 기주에 따라 5가지 race로 나뉘고 있으며 두 번째는 세 가지 이당류와 세가지 6탄당의 이용여부에 따라 분류하는 것으로 5가지의 biovar로 나뉘게 된다. 그리고 이들 race과 biovar간의 관계는 race 3과 biovar 2간의 관계를 제외하고는 그다지 유사하지 않기 때문에 서로간의 변이점도 있다. 국외에서는 이렇게 다양한 균을 좀더 근원적인 유전적 분석으로 group화하고 있다. 국내에서는 이러한 유전적 분석을 통한 분류가 제대로 되어 있지 않고 있기 때문에 우리나라 지리적 분포에 따른 균주간의 특징, race와 biovar간의 관계, 상동성, 차이점 등을 몇 가지 유전 적 분석으로 모니터링(monitoring)해야 할 필요성이 대두되고 있다.
특히 랄스토니아 솔라나세아룸은 race간의 차이가 기주범위로 분명하게 드러나는데 다른 식물 세균병원균과는 달리 기주범위로 race이 달라지는 원인을 찾고자 한다. 랄스토니아 솔라나세아룸의 기주인식 기작에 대한 연구는 1970년대 말을 시작으로 많은 연구가 이루어져 왔으나 본 병원균의 복잡한 병발생 기작으로 인하여 많은 가능성만 제시되어 있는 상황이다. 이 병원균의 기주인식에 대한 연구가 진행되면 우선 이 병원균에 대한 복잡한 병발생 기작에 대한 이해는 물론 나아가서는 저항성 식물의 육성 등을 통한 이 병원균에 대한 차별적인 방제 방안을 제시할 수 있을 것으로 생각한다.
가지과 작물 재배 농가에서 발생하고 있는 세균성 풋마름병은 약제 방제가 불가능하기 때문에 점차 그 발생이 심각할 정도로 높아지고 있다. 특히 토마토 양액재배상이나 가지, 파프리카재배지 상에서의 피해는 심한 경우에 몇 년간의 노력을 수포로 돌아가게 할 정도로 발생하고 있지만 효율적인 방제 전략이 아직까지 제시되지 못하고 있을 뿐만 아니라 그 병원균에 대한 근본적인 연구조차도 아직 제대로 실시되고 있지 않다. 강원도, 경기도, 충청도, 전라도, 경상도, 제주도에 이르기까지 전국적으로 고루 분포하는 현 시점에서 세균성 풋마름병원균에 대한 근본적인 이해를 도울 수 있는 유전적 다양성 및 기주특이성 모니터링(monitoring) 연구는 지역적인 차이, 기주에 따른 차이를 해석하여 새로운 race의 확산을 미리 예방하고 기 주인식에 대한 연구로 race 간의 차별적인 점을 이용하여 광범위한 병 발생을 미리 차단하여 세균성 풋마름병의 발생을 효율적으로 경감시킬 수 있을 것이다.
본 발명자들은 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 rsa1 유전자의 특성을 밝힘으로써, 이 병원균에 대한 복잡한 병발생 기작에 대한 이해는 물론 나아가서는 저항성 식물의 육성 등을 통한 이 병원균에 대한 차별적인 방제 방안을 제시할 수 있어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 rsa1를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 rsa1 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 rsa1 유전자가 포함된 플라스미드 pRS13를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 Rsa1 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Rsa1 단백질을 암호화하는 펩타이드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환 또는 결실시키거나, 상기 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 삽입함으로써, 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성이 유지되는 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호1의 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 rsa1를 암호화하는 DNA을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호2의 아미노산 서열을 포함하는 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 rsa1 유전자를 암호화하는 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열과 50%이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 분리된 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산서열과 50%이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 분리된 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명은 가지과 작물 세균성 풋마름병에 관여하는 rsa1 유전자에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 rsa1를 포함한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 rsa1 유전자를 포함한다.
본 발명은 상기 rsa1 유전자가 포함된 플라스미드 pRS13를 포함한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 Rsa1 단백질을 포함한다.
본 발명은 상기 Rsa1 단백질을 암호화하는 펩타이드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환 또는 결실시키거나, 상기 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 삽입함으로써, 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성이 유지되는 단백질을 포함한다.
본 발명은 서열번호1의 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 rsa1를 암호화하는 DNA를 포함한다.
본 발명은 서열번호2의 아미노산 서열을 포함하는 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 rsa1을 암호화하는 단백질을 포함한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열과 50%이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 분리된 DNA를 포함한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산서열과 50%이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 분리된 단백질을 포함한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
1997년부터 2004년까지 전국적으로 가지과 작물에서 채집된 총 469개의 세균성풋마름병원균들 중에서 race 1과 race 3의 대표 균주를 선발하기 위해 채집된 모든 세균성풋마름병원균을 조사한 결과, 고추에서 100% 발병도를 일으키고 감자에서 병을 전혀 일으키지 않는(0% 발병도) SL341 균주를 race 1의 대표균주로 선발하였고 감 자에서 100% 발병도를 일으키고 고추에서 병을 일으키지 않는(0% 발병도) SL2029균주를 race 3균주의 대표균주로 선발하였다. 이 내용을 표 1과 도 1에 요약하였다.
표 1. 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 1과 race 3 대표 균주의 특징
균주 지역 기주 병원성 검정 Biovar Race
토마토 고추 감자
SL341 경상도 토마토 +++ +++ - 3 1
SL2029 제주도 감자 +++ - +++ 2 3
상기 표 1에서 - 표시는 무병징을 나타낸 것이고 + 표시는 25% 풋마름 증상, ++ 표시는 50% 풋마름 증상, +++ 표시는 75% 이상의 풋마름 증상을 나타냄을 가리킨다.
대표 균주로 선발된 race 1균주인 SL341과 race 3균주인 SL2029 균주의 게노믹 라이브러리(genomic library)를 제작하여 이 게노믹 라이브러리의 다양성 확인을 한 결과, 도 2와 같이 제작된 라이브러리의 다양성을 확인할 수 있었다(도2).
SL341(race 1) 균주와 SL2029 라이브러리의 교배(mating)을 통해 약 1000여개의 2배합체(transconjugant)들을 획득하였고, 획득된 다양한 플라스미드(SL2029의 DNA)의 존재를 확인 한 결과, 도 3처럼 다양한 2배합체(transconjugant)들이 확보되었음을 확인 할 수 있었다.
SL341(race 1) 균주와 SL2029 라이브러리를 교배해서 나온 1000여개의 2배합체(transconjugant)들 중에서 SL341(pJ372)이 접종된 고추에서는 접종한지 30일이 지나도록 풋마름 증상을 일으키지 않았으며, 이는 고추에 병을 일으키지 않는 SL2029와 동일한 증상이었다. 이 SL2029 라이브러리 클론(SL2029 library clone)을 가진 SL341의 병원성 검정 결과를 하기 표 2에 요약하였고, 이 표에서와 같이 이 클론(pJ372)이 랄스토니아 솔라나세아룸의 고추에 대한 기주 인식에 중요한 역할을 할 것으로 생각되어 pRS1으로 재 명명 하였다. 이 플라스미드의 제한효소 지도(도4)에 따른 서브클론(subclone)들은 다시 SL341에 넣은 후, 고추에 상기와 같은 동일한 방법으로 접종하여 고추에 풋마름증상을 일으키지 않는 서브클론(subclone)인 pRS13을 확보하였는데 도5의 사진과 같으며 이 내용에 대한 실험결과를 하기 표 3에 요약하였다.
표 2. SL2029 library clone을 가진 SL341의 병원성 검정
Strain 병원성 검정* Strain 병원성 검정* Strain 병원성 검정*
Control - SL341(pJ357) +++ SL341(pJ627) +++
SL341 +++ SL341(pJ372) - SL341(pJ634) +++
SLL2029 - SL341(pJ391) +++ SL341(pJ647) +++
SL341(pJ1) +++ SL341(pJ402) +++ SL341(pJ658) +++
SL341(pJ16) +++ SL341(pJ422) ++ SL341(pJ662) +++
SL341(pJ21) +++ SL341(pJ438) +++ SL341(pJ675) +++
SL341(pJ34) +++ SL341(pJ447) ++ SL341(pJ688) +++
SL341(pJ45) +++ SL341(pJ462) +++ SL341(pJ699) +++
SL341(pJ78) ++ SL341(pJ478) +++ SL341(pJ708) +++
SL341(pJ100) +++ SL341(pJ485) +++ SL341(pJ714) +++
SL341(pJ125) +++ SL341(pJ492) +++ SL341(pJ728) +++
SL341(pJ134) +++ SL341(pJ501) +++ SL341(pJ734) +++
SL341(pJ156) ++ SL341(pJ511) +++ SL341(pJ746) ++
SL341(pJ187) +++ SL341(pJ524) +++ SL341(pJ759) ++
SL341(pJ200) +++ SL341(pJ538) +++ SL341(pJ777) +++
SL341(pJ213) +++ SL341(pJ555) +++ SL341(pJ783) +++
SL341(pJ224) +++ SL341(pJ567) +++ SL341(pJ792) +++
SL341(pJ246) +++ SL341(pJ578) +++ SL341(pJ801) +++
SL341(pJ289) +++ SL341(pJ588) +++ SL341(pJ812) +++
SL341(pJ301) +++ SL341(pJ595) +++ SL341(pJ834) +++
SL341(pJ328) ++ SL341(pJ602) +++ SL341(pJ858) ++
SL341(pJ333) +++ SL341(pJ618) ++ SL341(pJ862) +++
상기 표 2에서 - 표시는 무병징을 나타낸 것이고 + 표시는 25% 풋마름 증상, ++ 표시는 50% 풋마름 증상, +++ 표시는 75% 이상의 풋마름 증상을 나타냄을 가리킨다.
표 3. SL2029라이브러리 클론(SL2029 library clone) 및 서브클론(subclone)을 가진 SL341의 병원성 검정
Strain 병원성 검정*
Control -
SL341 +++
SL2029 -
SL341(pRS1) -
SL341(pRS3) +++
SL341(pRS4) -
SL341(pRS5) -
SL341(pRS13) -
상기 표 3에서 - 표시는 무병징을 나타낸 것이고 + 표시는 25% 풋마름 증상, ++ 표시는 50% 풋마름 증상, +++ 표시는 75% 이상의 풋마름 증상을 나타냄을 가리킨다.
세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸의 기주 특이성에 관련된 유전자를 밝히기 위해서 상기의 방법들로 pRS13을 확보한 후 이 pRS13에서 기주특이성에 관련된 유전자가 존재하는지 알아보기 위해 이 pRS13의 전체 시퀀스인 0.9kb의 염기 서열을 확보한 후 이 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 사용하여 유전자를 검색한 결과 도 6과 같이 1개의 유전자를 찾을 수 있었다. 이 유전자는 모든 게놈 시퀀스(full genome sequence)가 밝혀진 GMI1000 균주의 시퀀스를 비교한 결과 막통과 단백질(putative transmembrane protein), 신호 펩타이드 단백질(probable signal peptide protein)등으로 검색되었는데 유사도가 높지 않아 위에서 언급한 유전자로는 생각되지 않으며 기존의 알려진 유전자보다는 새로운 유전자일 가능성이 클 것으로 생각되었다.
따라서 새로운 유전자의 가능성이 있는 기주 특이성에 관련된 이 rsa1 유전자의 기능을 밝히기 위해 이 rsa1 유전자를 Tn3gus 돌연변이(Tn3gus mutation) 시킨 후, 이 돌연변이 된 것을 다시 고추에서 병원성 검정을 한 결과 도 5 에서와 보는 바와 같이 약 25%의 발병도를 보이는 것으로 관찰되는 것을 확인함으로써 이 rsa1 유전자가 랄스토니아 솔라나세아룸의 기주 특이성에 관련이 있음을 알 수 있었다.
따라서 이 유전자의 기능을 좀 더 명확하게 규명하기 위해서 돌연변이가 된 유전자를 다시 회복시켰을 경우 그 유전자의 기능이 다시 회복되는지 알아보았다. 돌연변이시킨 rsa1 유전자에 다시 rsa1 유전자를 가진 pRS13을 상보(complementation) 시킨 후 고추와 감자에 병원성 검정을 하였더니 고추에 접종한 결과로는 원래 rsa1 유전자를 가지는 pRS13을 접종 하였을 때와 마찬가지로 0%의 풋마름 증상을 보이는 것을 알 수 있었으며, 감자에서는 고추 접종 결과와는 반대로 감자에 100% 발병도를 일으키는 SL2029 균주의 병원성 검정 결과와 동일하였다. 이 결과는 도 7, 8의 사진으로 정확히 알 수 있다.
이 돌연변이 된 균과 상보(complementation)된 균들의 실제 고추와 감자 내에서의 세포 생장을 살펴보게 되면 도 9의 그래프 상에서와 마찬가지로 고추에 100%풋마름 증상을 일으키는 SL341은 실제 고추 내에서 세균 수가 105에서 109이상으로 증가한 반면 감자에서는 105에서 103으로 감소됨을 알 수 있었으며, 고추에 풋마름 증상을 일으키지 않는 SL2029는 고추에서는 105에서 104 으로 오히려 세균 수가 감소된 반면 감자에서는 105에서 1011 으로 세균 수가 증가됨을 알 수 있었는데 이것은 실제 외견상 드러나는 풋마름 증상의 발병도와 일치하는 결과를 보였다. 그리고 돌연변이 된 균주인 SL2029, rsa1::Tn3gusA200 균주는 고추에서는 세균 수가 105에서 107 으로 증가되었고 감자에서는 105에서 105 으로 세균 수가 거의 변화가 없는 것으로 관찰되었는데 이는 실제 고추에서 약 25%의 풋마름 증상을 보이는 것과 일치되는 결과를 보였으며 rsa1 돌연변이체에서 상보(complementation) 된 균주인 SL2029, rsa1::Tn3gusA200(pRS13)균주는 고추에서 105에서 105 으로 세균 수가 증가도 감소도 되지 않았고 감자에서는 105에서 109 으로 증가되었음을 관찰할 수 있었다.
위의 결과들을 종합해 볼 때 이 rsa1 유전자는 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 즉, 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 것으로 사료된다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예1:세균성 풋마름병원균의 각 race의 대표 균주 선발방법>
전국적으로 가지과 작물에서 채집된 총 469개의 세균성풋마름병원균들 중에서 race 1과 race 3의 대표 균주를 선발하기 위해 28℃, TZC 배지(펩톤 10g, 글루코오즈 5g, 카자미노산(Casamino acid) 1g, 트리페닐테트라졸리움 클로라이드(Triphenyl tetrazolium chloride) 50mg, 아가(Agar) 17g, DW 1L)에서 약 48시간 배양시킨 후에 살균수로 108농도의 균 현탁액을 만든 후 생육중인 7-8본엽기의 토마토, 감자, 고추 뿌리 근처에 20㎖씩 분주한 후 온실에서 (온도; 20∼30℃, 빛; 자연광) 재배하면서 30일간 매일 조사하였으며 병 발생정도는 다음과 같이 표시하였다; 0% 발병도, 25% 발병도, 50% 발병도, 75% 이상의 발병도.
<실시예 2: 대표 race 균주의 라이브러리(library) 제작>
대표 균주로 선발된 race 1 균주인 SL341과 race 3 균주인 SL2029 균주의 게노믹 라이브러리(genomic library)를 제작하기 위하여 SL341과 SL2029 균주를 B broth (펩톤 10g, 카자미노산 1g, 이스트 익스트렉트 1g, DW 1L)에서 28℃, 20시간 배양한 후 세포를 수거하여(한일 high speed centrifuge, 8000rpm, 20분, 4℃) 다음과 같은 방법으로 DNA를 추출하였다; 수거된 세포를 0.9% NaCl로 2회 세척하고 GTE(50mM Glucose, 25mM Tris-Cl(pH 8), 10mM EDTA (pH 8)에 현탁 시킨 후 라이소자임(Lysozyme, 2㎎/㎖)을 상온에서 30분간 처리 하고 10% SDS를 넣고 전체 내용물 을 고루 잘 섞고 37℃에서 20분간 처리한다. 처리된 내용물에 RNase A를 다시 처리하여 37℃에서 1시간 둔 후 0.5M EDTA를 10분간 37℃에서 처리하고 Proteinase K를 37℃, 1시간 처리한다. 이후에 새 튜브에 위의 내용물을 옮긴 후 세슘 클로라이드(Cesium Chloride, CsCl)를 동일 양으로 넣은 후 천천히 세슘 클로라이드(Cesium Chloride)를 녹인다. 다 녹으면 호일로 튜브를 잘 감싼 다음 에시디움 브로마이드(Ethidium Bromide, EtBr)을 첨가하고 원심분리 (40000rpm, 20℃, 48시간) 하였다. 원신분리가 끝난 후 UV lamp로 DNA층을 확인하여 주사기로 분리한 다음 이소아밀 알콜(Isoamyl alcohol)를 사용하여 EtBr를 제거 한 후 TE 버퍼 (10mM Tris-Cl (pH 8), 1mM EDTA (pH 8)에 투석하여 순수 DNA를 확보하였다.
확보된 순수한 DNA를 Sau3AI 제한효소를 처리하여 20∼25kb 절편을 확보한 후 이를 pLAFR3(broad host range vector)와 결합(ligation) 시켜 펙커진 익스트렉트(packagene extracts)와 잘 혼합하고, E. coli HB101과 잘 섞은 후 약 12시간동안 37℃에서 진탕 배양하여 각 대표균주의 라이브러리를 총 10㎖(1.2 × 107 /㎖) 제작하였다. 제작된 라이브러리는 -70℃에 보관하여 필요할 때마다 녹여서 사용하였고 다양한 유전자 클론 확보를 위한 DNA 패턴을 관찰하기 위해 EcoRⅠ 제한효소를 처리하여 제작된 라이브러리의 다양성을 확인하였다.
<실시예3: 교배(mating)을 통한 많은 수의 이배합체(transconjugants)의 확보>
SL341(race 1)에 리팜피신 마커(Rifamficin marker)를 붙인 후 B 액체배 지(rifampicin 50㎎/㎖ 첨가) 에서 20시간 28℃에서 12시간 배양하고 다음날 이 배양액 중 일부를 다시 새 B 액체배지 (rifampicin 50㎎/㎖ 첨가) 에 섞은 후 3∼4시간(28℃) 배양한 것(recipient, OD=0.8)과 제작된 SL2029(race 3) 라이브러리 중 100∼200㎕를 LB 액체 배지 (tetracycline 10㎎/㎖ 첨가)에 잘 혼합한 후 8∼9시간 (37℃) 배양한 배양액(donor, OD=0.6)을 동일한 하나의 튜브에 넣어 함께 세포를 수거한 후에 0.9% NaCl로 2회 세척한 후 BG 배지(Peptone 10g, Casamino acid 1g, Yease extract 1g, Glucose 5g, Agar 15g, DW 1L)에서 교배한 세포들을 24시간(28℃) 배양한다. 24시간 배양한 후 배양된 세포들은 리팜피신과 테트라사이클린이 함유된 선택배지에 도말하여 3∼4일간 28℃에서 배양하였고 확보한 이배합체(transconjugant)들이 다양한 유전자를 가졌는지 알아보기 위해 이들 중에서 일부를 선발해서 DNA를 EcoRⅠ 제한효소를 처리하였다.
<실시예4: 기주 특이성 관련 유전자를 가진 클론 확보>
SL341(race 1) 균주와 SL2029 라이브러리를 교배해서 나온 1000여개의 이배합체(transconjugant)들을 각각 TZC 배지에서 28℃, 48시간 배양시킨 후에 살균수로 108농도의 균 현탁액을 만든 후 생육중인 7-8 본엽기의 고추 뿌리 근처에 20㎖씩 분주한 후 병원균이 접종된 식물을 온실에서 (온도; 20∼30℃, 빛; 자연광) 재배하면서 병원성 검정 결과를 30일간 관찰하였다. 그리고 확보된 클론에서 기주특이성에 관련된 유전자를 찾기 위해서 여러 가지 제한효소(EcoRⅠ, PstⅠ, HindⅢ)들을 사 용하여 제한효소 지도(restriction map)를 작성하였고 각각의 제한효소로 해당 클론을 작은 크기의 플라스미드로 서브클론(subcloning)하였으며 이 서브클론(subclone)들은 pLAFR3(broad host range vector)와 결합(ligation) 시켜 다시 SL341에 넣은 후 고추와 감자에 상기의 병원성 검정방법으로 실시하였다.
<실시예5: 기주특이성 관련 유전자의 동정 및 기능 규명>
세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸의 기주 특이성에 관련된 유전자를 밝히기 위해서 상기의 방법(실시예 1∼5)들로 pRS13을 확보한 후 이 pRS13에서 기주특이성에 관련된 유전자가 존재하는지 알아보기 위해 이 pRS13을 전체 시퀀싱하여 0.9kb의 염기 서열을 확보한 후 이 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 사용하여 유전자를 검색하였다.
그리고 검색된 유전자, 즉, 기주 특이성에 관련된 이 rsa1 유전자의 기능을 밝히기 위해 이 rsa1 유전자를 Tn3gus 돌연변이(Tn3gus mutation) 시키고. 이 돌연변이 시킨 유전자를 다시 고추 병원성 검정을 실시하였다. 이 해당 유전자의 기능을 좀 더 명확하게 규명하기 위해서 돌연변이가 된 유전자에 해당 유전자를 다시 회복시켰을 경우 그 유전자의 기능이 다시 회복되는지 알아보기 위해 돌연변이 된 rsa1 유전자에 다시 rsa1 유전자를 가진 pRS13을 상보(complementation) 시킨 후 상기된 동일 병원성 검정 방법으로 고추와 감자에 병원성 검정을 실시하였다. 그리고 각 균주들의 기주 내에서의 세포 변화를 살펴보기 위해 각 균주들을 28℃, 48시간 배 양시킨 후 105으로 세균수를 맞춘 후 상기 병원성 검정 방법으로 고추와 감자에 각 균주들을 접종한 후 2일 간격으로 접종된 고추와 감자 줄기내의 세균수를 측정하였다. 측정한 방법으로는 우선 접종된 감자와 줄기를 1g 으로 절단한 후 살균수 1㎖이 담긴 1.5㎖ 튜브에 넣고 고르게 분쇄하여 나온 즙액을 희석하여 배지에 도말한 후 28℃, 48시간 배양시킨 후 나오는 세균수를 계수하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸의 기주 특이성에 관련된 유전자 rsa1의 특성을 밝힘으로써, 이 병원균에 대한 복잡한 병발생 기작에 대한 이해는 물론 나아가서는 저항성 식물의 육성 등을 통한 이 병원균에 대한 차별적인 방제 방안을 제시할 수 있어 효과 없는 약제 방제를 지양하고 풋마름병의 발생을 효율적으로 경감시킴으로써 안정적인 가지과 작물 생산 체계를 확보할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 rsa1 .
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 rsa1 유전자.
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 Rsa1 단백질.
  4. 서열번호1의 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 rsa1를 암호화하는 DNA.
  5. 서열번호2의 아미노산 서열을 포함하는 세균성 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아룸 race 3 균주에서 기주를 인식하는 기주 특이성에 중요한 작용을 하는 유전자 Rsa1를 암호화하는 단백질.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 2항에 따른 rsa1 유전자가 포함된 플라스미드 pRS13.
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US7098014B2 (en) 2002-01-23 2006-08-29 Lian Hui Zhang Ralstonia ahl-acylase gene

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Non-Patent Citations (2)

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Title
NCBI sequence database
논문2002.10

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