CN112626093B

CN112626093B - 番茄青枯病抗性基因Slα-KGDH E2及其应用

Info

Publication number: CN112626093B
Application number: CN202011563738.0A
Authority: CN
Inventors: 卢钢; 刘红燕; 徐成翠; 刘悦; 宋建伟; 余小林
Original assignee: Wuxi Dimode Biological Seed Industry Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Wuxi Dimode Biological Seed Industry Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112626093A

Abstract

本发明公开了一种番茄青枯病抗性基因Slα‑KGDH E2及其应用。Slα‑KGDH E2编码α‑酮戊二酸脱氢酶E2亚基，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。该基因的表达量下降或部分碱基突变均可使番茄植株丧失对番茄青枯病的抗性。抗病植株中接种青枯菌后，Slα‑KGDH E2基因表达量较对照显著提高；功能验证表明Slα‑KGDH E2基因在番茄对青枯菌抗性中具有关键的正向调控作用，可以通过超量表达Slα‑KGDH E2基因提高番茄对青枯病抗性，其为番茄抗病新品种的选育提供了新途径，因而有良好的应用价值。

Description

番茄青枯病抗性基因Slα-KGDH E2及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及番茄抗青枯病基因Slα-KGDH E2及其应用。

背景技术

青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的细菌性维管束组织病害，主要通过土壤传播，通过根系侵染植株从而进入木质部，造成叶片萎蔫乃至整株死亡。青枯菌是世界上最具破坏性的植物致病菌之一，主要发生于热带、亚热带和一些暖温带地区，其地理分布广、生理小种多且致病力极强，能感染包括番茄、马铃薯、烟等主要农作物在内的50多科200多种植物，导致蔬菜作物严重减产甚至绝收，堪称“植物癌症”。此外，由于全球气候变化引起气温升高，植物细菌性、真菌性、病毒性病害的严重程度将会大大增加，同时将对我国农业生产造成巨大威胁。

番茄(Solanum lycopersicum L.)是茄科番茄属一年生或多年生植物，是世界上栽培最普遍、消费量最大的蔬菜作物之一。近年来，随着设施蔬菜的种植面积不断扩大，茄科青枯病在我国南方设施栽培生产中常见、易发且传播迅速，长期、高密度重茬连作为该病原菌的积累、生长、繁殖和传播提供了有利条件，严重影响了茄科蔬菜的产量和品质。青枯病已成为番茄生产的重要限制因素，造成严重的经济损失。

目前，防治青枯病的主要途径包括选育抗病品种、田间管理、作物轮作，生物防治、抗病基因修饰和化学防治等。然而，迄今为止尚未研发出可应用于生产的高效、低毒且无污染的化学或生物杀菌剂，一些方法例如水旱轮作等虽然可以有效控制青枯病发展，但大多因费时费力成本高，难以大规模推广应用。目前预防和控制青枯病最有效的方法是利用现代分子技术加快选育和推广抗病品种，而在我国番茄抗青枯病分子育种进展十分有限。

植物中存在一些具有天然青枯病抗性的种质资源，随着转基因育种、分子标记辅助育种等生物技术抗病育种的应用越来越广泛，挖掘天然抗病资源中的抗性基因对抗病育种具有重要作用。随着高通量测序技术、现代分子生物学和生物信息学的快速发展，越来越多的植物基因组测序完成，大大推动了抗病基因的定位与功能研究进程，让大规模筛选、快速定位青枯病抗性基因成为可能。受植物品种和菌种多态性影响，在番茄抗青枯病研究中尚未鉴定出具有明确青枯病抗性的基因，因此挖掘、鉴定抗性基因将丰富抗病基因资源，同时为利用遗传工程技术结合传统育种技术培育番茄抗青枯病优良新品种提供基础。

发明内容

本发明的目的是针对上述青枯病抗性基因资源和抗病分子机理研究的不足，提供番茄青枯病抗性相关基因Slα-KGDH E2，以及该基因在番茄抗青枯病反应中的关键作用与应用潜力，为青枯病抗病机理研究和抗病品种选育提供新的思路和方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

1.首先利用BSA-Seq和RNA-seq技术进行主效抗性基因的遗传定位和转录组分析，鉴定得到可能参与抗病过程的差异表达基因。进一步通过荧光定量PCR进行病原菌接种前后的基因表达分析，筛选得到候选基因Slα-KGDH E2，所述Slα-KGDH E2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.采用基于农杆菌介导的转化方法的基因沉默技术在抗病番茄植株中沉默Slα-KGDH E2基因表达，并对沉默植株进行抗病性分析以验证该基因功能。结果发现，与对照相比，Slα-KGDH E2沉默植株丧失原有的抗病能力，发病率和病情指数大幅提升，并且出现叶片萎蔫，不定根增生、木质部变褐等明显的感病症状，这表明Slα-KGDH E2基因在抗病植株诱导抗病性过程中具有关键作用。

3.将Slα-KGDH E2基因在感病种质中过表达，基因表达量提高，从而增加酶活性，酶活性提高有利于限制青枯病这种典型的维管组织病害在茎中的扩展，说明了Slα-KGDHE2在番茄青枯病抗性诱导方面具有正向调控作用。

本发明的优点在于：

本发明以高抗青枯病番茄高代自交系‘ZRS_7’和感病自交系‘HTY_9’为亲本材料，其抗感性极端且能够稳定遗传，为其中潜在的新的青枯病抗性基因的挖掘提供可能。前期研究中建立的优化的青枯菌接种、接种后植株管理和抗性评价标准的体系，能够准确鉴定并明显区分本研究中所用番茄植株材料的青枯病抗感性。在此基础上，本发明通过综合利用BSA-seq和分子遗传学、基因转化技术对青枯病抗病基因进行遗传定位、基因分离以及功能验证，首次发现基因Slα-KGDH E2在番茄抗青枯病反应中存在关键性的正向调控作用，即抗病植株接种青枯菌后，Slα-KGDH E2基因表达量较对照显著提高；而沉默该基因后，植株接种后出现明显感病症状且PAL酶活性显著降低。这些结果表明Slα-KGDH E2基因在植物抗病机理研究和抗病育种方面具有重要的研究价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为优化的番茄青枯病抗性分级标准示意图。(a-e)0-4级整体植株图；(f-j)0-4级植株局部图。

图2为结合BSA测序结果筛选得到的12个候选基因在转录组测序中的表达分析。(A)候选基因在转录组测序中的表达量柱形图。FPKM为每千个碱基的转录每百万映射读取的片段。(B)候选基因在接种前后表达量差异柱形图；其中，ZRS_7、HTY_9为接种植株，ZRS_7_CK、HTY_9_CK为未接种病原菌的对照植株。

图3为Slα-KGDH E2基因在番茄不同抗性品种中接种青枯菌后的表达模式分析。(A)‘ZRS-7’、‘HTY-9’植株接种病原菌3天后Slα-KGDH E2基因的表达情况。(B)接种后5天内Slα-KGDH E2基因的动态表达情况。

图4为番茄‘ZRS_7’沉默Slα-KGDH E2基因后植株表型观察。(a)Slα-KGDH E2沉默植株的表型。从左到右分别为：Slα-KGDH E2沉默的植株在接种青枯菌5d后的植株发病情况；野生型接种5d后的植株；野生型植株未接种植株。(b)Slα-KGDH E2沉默植株接种青枯菌后茎干产生不定根。(c)‘ZRS_7’野生型植株接种后无不定根产生。

图5过表达番茄植株的表型观察。(a)接种青枯病菌后植株形态。左边为HTY_9野生型植株；右边为转基因植株。(b)野生型(左)与转基因(右)植株接种后不定根比较。

图6为Slα-KGDH E2沉默植株青枯菌接种前和接种7天后PAL酶活性测定结果柱状图。CK为对照植株，SlGDH E-4为沉默株系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中供试番茄抗病高代自交系‘ZRS-7’和感病高代自交系‘HTY-9’。其中抗病品系‘ZRS-7’是来自于美国番茄种质资源库(TGRC)的品种“CLN2413”经多代自交获得。而感病品系“HTY-9”是来自美国番茄种质资源库(TGRC)的品种“LA3847”多代自交获得。这两个亲本材料抗感性极端且均经过田间抗病性鉴定，通过前期研究中的杂交组合比较筛选，确定其表现优良适宜后续试验分析。

下述实施例中供试病原菌为番茄青枯病致病菌——茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum E.F Smith)，可从田间发病植株中分离。田间发病茎秆经酒精与次氯酸钠消毒后获取组织液，在TTC平板(见表1)上涂布30℃恒温培养，划线分离纯化，鉴定保存。经致病性检测为强致病性青枯菌。

表1 TTC(红四氮唑)培养基(1L)。

Tryptone(胰蛋白胨)	10g
		Casamino Acid(酪蛋白水解物)	1g
Glucose(葡萄糖)	5g
		Agar(琼脂粉)	17g

*pH＝7.0；121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至55℃左右，加入5mL过滤灭菌的1％TTC溶液，使得最终浓度为0.005WT％。

植物材料培养：番茄种子55℃温汤浸种15min，置于培养皿中28℃保湿催芽2-3d，之后播于15孔育苗穴盘中(基质配比为泥炭：蛭石：珍珠岩＝3:2:1)，光照培养箱(光周期16h光照/8h黑暗，温度白天26℃/晚上23℃，相对湿度70％-80％)中培养至苗龄30天，约5-6片真叶。

青枯菌的活化及培养：取出-70℃保存的菌种，TTC培养基平板上划线并置于28℃恒温暗培养48h活化。挑选培养基上带有白色粘性分泌物且具有流动性的粉色菌落，于NA液体培养基中28℃、200rpm摇床振荡培养扩繁至菌液浓度约为1×10⁸cfu/ml，OD600＝1.0。所用培养基配方如表2。

表2 NA液体培养基(1L)

Tryptone(胰蛋白胨)	10g
		Yeast extract(酵母提取物)	3g
Glucose(葡萄糖)	2.5g
		NaCl(氯化钠)	5g

*pH＝7.0；121℃高压蒸汽灭菌20min。

关于番茄抗青枯病的抗性水平分级标准尚未统一，常用的幼苗青枯病抗性分级主要以叶片萎蔫数为指标，本发明在此基础上进行改进，采用优化的分级标准(具体见表3和图1)进行分级，结合植株的顶芽、茎干的萎蔫程度以及叶色的变化等多个指标，具有区别度更大，更准确的特点。

表3番茄青枯病优化的病级标准

番茄青枯病病级	番茄青枯病病症
		0级	无症状
1级	有叶片萎蔫，但顶芽直立
		2级	顶芽萎蔫，部分叶片蜷缩
3级	全部叶片失水干枯蜷缩且有轻微变色，但茎干直立饱满
		4级	叶片枯萎变色，茎干失水褶皱，植株接近死亡或已经死亡

病情指数(DI，％)＝[(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×发病最高级数值)]×100。

其中，DI＝0代表免疫、0-12.5代表高抗、12.5-25代表抗病、25-50代表中抗、50-75代表感病、75-100代表高感。

实施例一 ‘ZRS-7’番茄青枯病抗性的遗传分析

以抗感病性状稳定而且极端的抗病品种‘ZRS-7’与感病品种‘HTY-9’为亲本杂交获得F1代，F1代自交获得F2代，利用F2代分离群体进行遗传分析。结果表明，F1代表现为青枯病感病，但与感病亲本相比病情指数较低；F₂代共统计156棵植株，出现抗、感病性状分离，伤根接种法接种后11dpi感病率为72.22％，病情指数为58.8％。其中大部分F2代感病植株的发病时间较感病亲本迟约2天；部分F2代植株表现为耐病，发病时间推迟，在10dpi开始出现病症。由于青枯病抗性遗传规律的复杂性，确定‘ZRS_7’番茄青枯病抗性为隐性遗传，由不完全显性或隐性基因起主导作用寡基因控制。

实施例二 ‘ZRS-7’番茄青枯病抗性的主效抗性基因定位

在F2代分离群体中各选择25株高度抗病与高度感病植株，提取基因组DNA、等量混合后分别构建抗病池(R-pool)及感病池(S-pool)，以‘ZRS-7’、‘HTY-9’为两亲本池加上抗病池与感病池共四个样品进行全基因组测序。通过BSA-seq分析比较子代与参考亲本SNP-index和Indel-index的差异及两子代间ΔSNP/Indel-index分布，基于SNP和Indel标记进行目标性状的区域定位，综合考虑差异位点分布与Δindex差异程度将主效抗性基因定位于12号染色体的候选区间内。

实施例三候选基因的筛选、预测及验证

根据初步定位结果，结合转录组测序对抗性基因做进一步筛选。对两亲本及F2代中的高抗、感植株茎部分别取样并提取RNA，进行文库构建及转录组测序。筛选获得的12个基因在转录组测序中表达情况(如图2A，B所示)，进一步利用荧光定量PCR对候选基因进行验证，结合SNP突变类型、基因功能注释和KEGG途径分析，将目标锁定于其中一个候选基因Slα-KGDH E2(Solyc12g005080)，该基因参与多种次生代谢物的合成和代谢途径，在三羧酸循环中有关键作用。Slα-KGDH E2在启动子区发生C→T的突变，预测形成MIKC-type MADS转录因子结合位点。

以‘ZRS-7’和‘HTY-9’植株茎部cDNA为模板，检测Slα-KGDH E2基因在青枯菌接种前后的表达情况。选取SlUbi3(Solyc01g056940.2.1)为内参基因，引物序列为SlUbi3-F：5’-TGGTCGGAATGGGACAGAAG-3’(SEQ ID NO:3)；SlUbi3-R：5’-CTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3’(SEQ ID NO:4)。目的基因Slα-KGDH E2特异性引物为qSlα-KGDH E2-F：5’-GCTCAGATTGAAACAGACAAGG-3’(SEQ ID NO:5)；qSlα-KGDH E2-R：5’-CCCTCACCGGATTTTGAAATG-3’(SEQ ID NO:6)，设置3次技术重复和3次生物学重复，通过2^-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。如图3A所示，Slα-KGDH E2在‘ZRS-7’和‘HTY-9’植株接种青枯菌后表达量均显著提高，说明青枯菌侵染能诱导植株中的Slα-KGDH E2基因表达。而在接种后0、1dpi、3dpi、5dpi的表达变化趋势却存在一定差异(图3B)，Slα-KGDH E2在‘ZRS_7’高抗材料中的表达量动态变化相似，在1dpi表达量上升，随后下降，而在感病材料‘HTY-9’中其表达量在3dpi和5dpi显著上升，说明在抗感材料的病程发展过程中，该基因表达量存在差异。

实施例四 ‘ZRS-7’Slα-KGDH E2转基因植株的获得

(1)Slα-KGDH E2基因敲除表达载体的构建

通过CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计Slα-KGDHE2基因的sgRNA靶序列sgkgdh，该靶序列全长为20bp，位于Slα-KGDH E2基因CDNA序列上游，靶序列具体序列为5’-CGAGCATGACCGCATTGTAT-3’。根据选择的靶序列，合成一对序列互补的DNA Oligos，上游引物为sgkgdh-F:5’-GATTGCGAGCATGACCGCATTGTAT-3’(SEQ ID NO:7)，下游引物为sgkgdh-R:5’-AAACATACAATGCGGTCATGCTCGC-3’(SEQ ID NO:8)。

将sgRNA模板序列的引物稀释成100μM，并通过退火形成双链。反应体系为10μL，其中sgkgdh-F 1μL，sgkgdh-R 1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，T4 PNK 1μL，ddH2O 6μL。使用PCR仪先37℃保温30min，之后95℃5min，并以每分钟5℃的速度缓慢降温到25℃。将AtU6-26载体使用Bbs I酶切后，与退火后形成的双链sgRNA连接，反应体系为10μL，其中T4DNA Ligase 0.5μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，AtU6-26载体酶切后回收产物1μL，稀释100倍的退火后形成的双链sgRNA1μL，ddH2O 5.5μL。将反应液于16℃连接2h或4℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，AtU6-26 SK载体为Amp抗性。待长出单菌落后，挑取单菌落送测序，扩繁后提取质粒。使用Kpn I和Sal I进行双酶切，反应体系为40μL，其中质粒4μL，Fast Digest Kpn I 2μL，Fast Digest Sal I 2μL，ddH₂O 28μL，37℃酶切1h。酶切产物回收之后使用T4DNA Ligase连接，反应体系为10μL，其中T4 DNA Ligase 0.5μL，10×T4DNA Ligase Buffer 1μL，35S-Cas9 SK载体酶切回收质粒5μL。将反应液于16℃连接4h，之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，长出单菌落后送测序，扩繁后提取质粒。使用Kpn I和XbaI进行双酶切，酶切产物回收之后使用T4 DNA Ligase连接至经酶切的pCAMBIA1301载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，待长出单菌落后，挑取单菌落送测序，测序正确的菌液扩繁后提取质粒，即为基因敲除载体，命名为pCAMBIA1301-CR-sgkgdh。

(2)Slα-KGDH E2基因过表达载体构建

Slα-KGDH E2基因CDS序列的扩增：利用Trizol试剂从抗病番茄‘ZRS-7’4片真叶的幼苗中提取总RNA,再利用高保真酶KOD-plus-Neo(TOYOBO公司)从叶片的cDNA模板中扩增Slα-KGDH E2基因序列。扩增Slα-KGDH E2上游引物：5’-CACCTGTACGAT GCTGGGCGT-3’(SEQID NO:9)下游引物：5’-TAAATCGGACACACGTATAGC-3’(SEQ ID NO:10)，PCR扩增程序参照KOD-plus-Neo说明书。得到的PCR产物纯化利用BamH I和Xba I与pCAMBIA1301载体一起进行双酶切，将酶切的PCR产物和酶切后的载体纯化后，16℃连接12h。将构建的融合表达载体质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化的细菌涂布于含有50mg·L^-1Spec和50mg·L^-1Str的筛选平板上。待长出菌斑后，挑取单克隆进行PCR验证，并送公司测序验证正确后获得过表达载体，命名为pCAMBIA1301-35S::Slα-KGDH E2。

(3)转基因植株的获得

将目的载体转化农杆菌GV1301，利用农杆菌介导法分别将pCAMBIA1301-CR-sgkgdh与pCAMBIA1301-35S::Slα-KGDH E2分别转入番茄抗病品种“ZRS-7”和感病品种“TYZ-9”中，通过PCR和GUS检测，鉴定单拷贝插入的纯合过量表达转基因番茄。

实施例五 Slα-KGDH E2转基因植株抗病性分析

(1)Slα-KGDH E2植株接种青枯菌后的表型观察

挑选长势一致、五叶一心的‘ZRS-7’、‘HTY-9’野生型植株、对照组空白载体转化植株和转基因纯合株系的实验组番茄幼苗作为实验材料，采用伤根灌注法接种OD₆₀₀＝1.0的青枯菌液，对植株形态及发病情况等性状进行观察统计。结果表明，Slα-KGDH E2基因沉默植株接种后5天出现感病症状，茎干中部出现不定根(图4)。接种后第7天沉默植株发病率达81.82％，病情指数达38.64％，进一步对沉默植株茎干切面进行观察发现，Slα-KGDH E2沉默植株茎干内出现较多较大的褐色斑块，而对照组和‘ZRS_7’野生型植株中褐色斑块较少，说明Slα-KGDH E2沉默后，入侵植株茎干的青枯菌较未沉默植株中更多(图4)。接种14后对‘ZRS_7’、‘HTY_9’、Slα-KGDH E2沉默植株去除表皮的茎基部和茎中部进行观察发现，Slα-KGDH E2沉默植株和‘HTY_9’植株木质部几乎全部出现褐色，而对照组植株青枯菌仅侵染到根基部。综上可见基因Slα-KGDH E2在‘ZRS-7’番茄抵御青枯菌的入侵、扩散和定殖的过程起关键作用。‘HTY_9’的过表达植株的发病率显著下降，接种后茎基部也没有不定根的发生，说明其获得了抗青枯病特性(图5)。

(2)转基因植株生理指标测定

提取与测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的步骤与方法参照薛应龙等(1983)的方法。

酶液提取。分别取对照组及实验组番茄植株叶片0.1g于2mL离心管中，加入大钢珠并于液氮中预冷，转至液氮预冷的磨样机中研磨(45hz，60s)。常温放置2min后加入0.5ml的硼酸缓冲液(0.1mol/L硼酸缓冲液，含巯基乙醇2mmol/L和EDTA 1mmol/L)，混合均匀后4℃12000rpm离心10min。取上清液用于测定酶活力。

PAL酶活性测定。按下表加入试剂，30℃水浴反应1h后加入0.2ml 6mol/L盐酸终止反应。以2号试管为对照，测定290nm处的吸光值。以OD₂₉₀值变化0.01为一个酶活力单位(U)。

试剂	1	2(CK)
			0.01mol/L硼酸缓冲液	2.0ml	2.0ml
0.02mol/L苯丙氨酸	1.0ml	1.0ml
			蒸馏水	1.0ml	1.2ml
酶液	0.2ml	0.0ml

由图6可知，病原菌接种前后对照组植株与沉默植株中PAL酶活性变化存在差异。接种前沉默植株的PAL酶活性高于对照；7dpi对照组植株中PAL酶活性上升，而Slα-KGDH E2沉默植株酶活性则显著下降，结果表明青枯菌侵染后，抗病番茄免疫过程中PAL酶活性提高，且反向证明了Slα-KGDH E2基因在这过程中存在积极作用。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

无锡迪茉得生物种业科技有限公司

<120> 番茄青枯病抗性基因Slα-KGDH E2及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum L.

<400> 1

atgctgggcg ttttaaggcg caaggttgct tctgcttcgg gtttagggaa atctatgtat 60

gcagttcgac ctacctctag aatttcatct actgcaactg aagagatatt acttcttcct 120

atacaatgcg gtcatgctcg gcaattcagt catcttgttt tacctggatg ctcagtgaac 180

atgaggccag ataggggagc tgtggttaat tttcactcaa gtctatcaca acagatttgc 240

atcaggcctt tttgttcaaa tagtggtgat ctggtcgatg ctgttgttcc ttatatgggc 300

gaatccataa gcgatggcac actggctaaa ttgctgaaga atcctggtga caaagtagaa 360

gttgatgagc caattgctca gattgaaaca gacaaggtaa caattgatgt aaccagtcct 420

gaggccggtg taatccaaaa gtttgtagct aaggaaggag atactgtgga accaggcttc 480

aaggttgcta tcatttcaaa atccggtgag ggtgtggaga gtgtagatca tgttgctcct 540

tctgagaagc catctgaaaa agaagctcta aagccaactt ctcccattca agagaaaaag 600

gtggaagagg tgaaatccaa acttgaggtg gctcctgtga aggagaattc taaggcaact 660

tcaccgcccc ctaaacggtc tgctacagaa ccccaacttc cacccaaaga acgggaaaga 720

cgagttccca tgactaggct caggaaaaga gttgccactc gattgaaaga ttctcagaac 780

accttcgcat tgttgactac attcaatgaa gttgatatga caaatttgat gaagctccga 840

tctgagtaca aagacacgtt tgttgaaaag cacggtgtga agttaggact catgtccgga 900

tttgtgaagg cagctgttag tgcactccag aatcaaccta tagtaaatgc agttattgat 960

ggtgatgaca tcatatatcg ggactatgta gacatcagta tagctgttgg caccccaaag 1020

ggtctggttg tacctgttct ccgcgacgtt gaccggatga attttgctga gatagaaaag 1080

acaataaacg agcttgctaa gaaggcaact aatggaacca tctctattga tgaaatggct 1140

ggaggatcgt ttacaatatc caatggtggt gtgtatggaa gtcttctaag tactcccatc 1200

ataaatcctc ctcagtctgc tatcttggga atgcattcaa tagtgaatcg cccaatggtt 1260

gttggaggcg tcattgtctc aagaccaatg atgtacattg cgctgacata tgatcatagg 1320

ctgattgatg gaagagaggc agtttacttt ttgagaagga ttaaagatgt ggtagaagat 1380

ccacgccgcc tactccttga tgtttga 1407

<210> 3

<211> 468

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum L.

<400> 3

Met Leu Gly Val Leu Arg Arg Lys Val Ala Ser Ala Ser Gly Leu Gly

1 5 10 15

Lys Ser Met Tyr Ala Val Arg Pro Thr Ser Arg Ile Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Thr Glu Glu Ile Leu Leu Leu Pro Ile Gln Cys Gly His Ala Arg Gln

35 40 45

Phe Ser His Leu Val Leu Pro Gly Cys Ser Val Asn Met Arg Pro Asp

50 55 60

Arg Gly Ala Val Val Asn Phe His Ser Ser Leu Ser Gln Gln Ile Cys

65 70 75 80

Ile Arg Pro Phe Cys Ser Asn Ser Gly Asp Leu Val Asp Ala Val Val

85 90 95

Pro Tyr Met Gly Glu Ser Ile Ser Asp Gly Thr Leu Ala Lys Leu Leu

100 105 110

Lys Asn Pro Gly Asp Lys Val Glu Val Asp Glu Pro Ile Ala Gln Ile

115 120 125

Glu Thr Asp Lys Val Thr Ile Asp Val Thr Ser Pro Glu Ala Gly Val

130 135 140

Ile Gln Lys Phe Val Ala Lys Glu Gly Asp Thr Val Glu Pro Gly Phe

145 150 155 160

Lys Val Ala Ile Ile Ser Lys Ser Gly Glu Gly Val Glu Ser Val Asp

165 170 175

His Val Ala Pro Ser Glu Lys Pro Ser Glu Lys Glu Ala Leu Lys Pro

180 185 190

Thr Ser Pro Ile Gln Glu Lys Lys Val Glu Glu Val Lys Ser Lys Leu

195 200 205

Glu Val Ala Pro Val Lys Glu Asn Ser Lys Ala Thr Ser Pro Pro Pro

210 215 220

Lys Arg Ser Ala Thr Glu Pro Gln Leu Pro Pro Lys Glu Arg Glu Arg

225 230 235 240

Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Thr Arg Leu Lys

245 250 255

Asp Ser Gln Asn Thr Phe Ala Leu Leu Thr Thr Phe Asn Glu Val Asp

260 265 270

Met Thr Asn Leu Met Lys Leu Arg Ser Glu Tyr Lys Asp Thr Phe Val

275 280 285

Glu Lys His Gly Val Lys Leu Gly Leu Met Ser Gly Phe Val Lys Ala

290 295 300

Ala Val Ser Ala Leu Gln Asn Gln Pro Ile Val Asn Ala Val Ile Asp

305 310 315 320

Gly Asp Asp Ile Ile Tyr Arg Asp Tyr Val Asp Ile Ser Ile Ala Val

325 330 335

Gly Thr Pro Lys Gly Leu Val Val Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Arg

340 345 350

Met Asn Phe Ala Glu Ile Glu Lys Thr Ile Asn Glu Leu Ala Lys Lys

355 360 365

Ala Thr Asn Gly Thr Ile Ser Ile Asp Glu Met Ala Gly Gly Ser Phe

370 375 380

Thr Ile Ser Asn Gly Gly Val Tyr Gly Ser Leu Leu Ser Thr Pro Ile

385 390 395 400

Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ser Ile Val Asn

405 410 415

Arg Pro Met Val Val Gly Gly Val Ile Val Ser Arg Pro Met Met Tyr

420 425 430

Ile Ala Leu Thr Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ala Val

435 440 445

Tyr Phe Leu Arg Arg Ile Lys Asp Val Val Glu Asp Pro Arg Arg Leu

450 455 460

Leu Leu Asp Val

465

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtcggaat gggacagaag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcagtcagg agaacagggt 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctcagattg aaacagacaa gg 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctcaccgg attttgaaat g 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gattgcgagc atgaccgcat tgtat 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacatacaa tgcggtcatg ctcgc 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacctgtacg atgctgggcg t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taaatcggac acacgtatag c 21

Claims

1.番茄青枯病抗性基因Slα-KGDH E2基因在增强番茄对青枯病抗性能力中的应用，所述Slα-KGDH E2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：在番茄中超量表达Slα-KGDH E2基因增强番茄对青枯病抗性能力。

3.番茄青枯病抗性基因Slα-KGDH E2基因编码的蛋白质在增强番茄对青枯病抗性能力中的应用，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：提高番茄中所述蛋白质的表达量，增强番茄对青枯病抗性能力，获得抗病植物。