CN109234276A - 转录效率提高的Su-m1启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种转录效率提高的Su‑m1启动子及其应用。本发明将里氏木霉野生型的cbh1启动子序列中的多个区域进行突变，得到Su‑m1启动子。以红色荧光蛋白Dsred为报告基因，通过构建里氏木霉Su‑m1启动子的质粒表达载体，证明了Su‑m1启动子的转录效率比野生型的cbh1启动子强，同时该启动子可用于其他外源基因的高效表达。

Description

转录效率提高的Su-m1启动子及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种转录效率提高的Su-m1启动子及其应用。
背景技术
里氏木霉作为主要的丝状真菌之一，具有强大的分泌纤维素酶的能力，其混合发酵液中，纤维二糖水解酶的表达占胞外总分泌蛋白的50％以上，所以cbh1启动子也被公认为很强的启动子，目前常将外源基因构建在cbh1启动子和终止子之间，构成外源基因的表达盒。但是，cbh1启动子的转化效率仍不能满足生产和科研要求，需要对其进一步改造。
发明内容
为了解决现有的cbh1启动子不能满足生产科研要求的问题，本发明提供一种转化效率提高的Su-m1启动子及其应用。
本发明的目的在于提供一种转录效率提高的Su-m1启动子。
本发明的再一目的是提供一种含有此启动子的重组表达载体。
本发明的再一目的是提供一种含有此启动子的重组菌株。
本发明的再一目的是提供此启动子的应用。
根据本发明的具体实施方式，将cbh1启动子的核苷酸序列上的4处5’-AGGCA-3’位点及4处5’-TGCCT-3’位点均突变为5’-GGCTAATAA-3’，得到Su-m1启动子。
cbh1-wt(wild type，野生型)启动子，即cbh1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示：
CTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC
根据本发明的具体实施方式，所述Su-m1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示：
CTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATGGCTAATAAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTGGCTAATAAGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAAGGCTAATAAAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGCTAACAGAAGCAACGGCAAAGCCAATCTTCCAATCGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACGGCTAATAAAAAGATTGAGTTGAAACGGCTAATAAAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCGGCTAATAATTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATGGCTAATAAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTGGCTAATAAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC
本发明还提供了含有上述启动子的重组表达载体。
根据本发明的具体实施方式，本发明中涉及包含野生型cbh1启动子和Su-m1启动子的重组表达载体，其中包括表达红色荧光蛋白的质粒pPcbh1-Dsred-Tcbh1-pyr4-TEL和pSu-m1-Dsred-Tcbh1-pyr4-TEL，还包括表达甘露聚糖酶的质粒pPcbh1-AnMan5A(opt)-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL和pSu-m1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL。
根据本发明的具体实施方式，将野生型cbh1启动子、DsRed基因、cbh1终止子、TEL基因、Pyr4-AmpR-Ori通过无缝拼接方式串联拼接，得到质粒pPcbh1-Dsred-Tcbh1-pyr4-TEL。
根据本发明的具体实施方式，将Su-m1启动子、DsRed基因、cbh1终止子、TEL基因、Pyr4-AmpR-Ori通过无缝拼接方式串联拼接，得到质粒pSu-m1-Dsred-Tcbh1-pyr4-TEL。
根据本发明的具体实施方式，将野生型cbh1启动子、AnMan5A(opt)基因、cbh1终止子、TEL、Pyr4-AmpR-Ori通过无缝拼接方式串联拼接，得到质粒pPcbh1-AnMan5A(opt)-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL。
根据本发明的具体实施方式，将Su-m1启动子、AnMan5A(opt)基因、cbh1终止子、TEL基因、Pyr4-AmpR-Ori通过无缝拼接方式串联拼接，得到质粒pSu-m1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL。
根据本发明的具体实施方式，重组表达载体中还插入有端粒序列；优选的，重组表达载体的基因表达盒的下游含有15个重复序列TEL，重复序列TEL由序列TEL1和序列TEL2拼接，并在TEL1和TEL2之间加入限制性内切酶I-Ceu1。重复序列TEL以1-2拷贝的低拷贝数插入染色体末端、或以染色体外自主复制形式存在，其能够提高里氏木霉的转化效率。
序列TEL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
序列TEL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA
序列TEL的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGtaactataacggtcctaaggtagcgaaCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA
本发明还提供一种含转录效率提高的Su-m1启动子的重组菌株，其中，优选的为里氏木霉。
本发明还提供一种提高基因表达效率的方法，包括使用上述转录效率提高的Su-m1启动子启动目的基因表达的步骤，其中，所述目的基因包括纤维素酶基因、甘露聚糖酶基因、红色荧光蛋白基因等。
本发明的有益效果：
本发明将cbh1启动子改造成Su-m1启动子。试验表明，在里氏木霉中，以Su-m1启动子表达报告基因Dsred，与cbh1启动子相比，可获得红色荧光显著提高的转化子。
本发明还应用改造的Su-m1启动子在里氏木霉中表达异源甘露聚糖酶，与cbh1启动子相比，获得了甘露聚糖酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养6天后，Pcbh1-AnMan5A(opt)的甘露聚糖酶酶活为5.27U/ml，而Su-m1-AnMan5A(opt)的甘露聚糖酶酶活为18.60U/ml，较cbh1启动子的菌株提高了2.52倍。因此，本发明获得了比cbh1启动子转录效率强的Su-m1启动子。
附图说明
图1-1和1-2显示乳糖平板中里氏木霉表达红色荧光蛋白情况，其中，图1-1为cbh1启动子驱动Dsred的里氏木霉菌落，图1-2为Su-m1启动子驱动Dsred的里氏木霉菌落；
图2显示转入Dsred表达的质粒的转化子拷贝数；
图3显示AnMan5A(opt)重组质粒在里氏木霉基因组中的插入情况的PCR鉴定结果，M：DNA分子量；1-12：验证pPcbh1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL质粒在里氏木霉基因组中的插入情况，13-20验证pSu-m1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL在里氏木霉基因组中的插入情况，箭头所指为预期的目的条带；
图4为不同启动子驱动甘露聚糖酶的酶活比较图。
具体实施方式
实施例1启动子Su-m3的改造过程
将野生型cbh1启动子上的8处位点进行替换，具体如下：-147～-152位点5’-AGGCA-3’；-249～-254位点5’-AGGCA-3’；-280～-285位点5’-TGCCT-3’；-374～-379位点5’-TGCCT-3’；-396～-401位点5’-AGGCA-3’；-798～-803位点5’-TGCCT-3’；-1016～-1021位点5’-TGCCT-3’；-1218～-1223位点5’-AGGCA-3’，将上述位点全部替换为5’-GGCTAATAA-3’，即得到Su-m1启动子。
实施例2.Su-m1启动子对红色荧光蛋白基因表达效率的影响
本发明构建含Dsred基因的表达质粒，将其转入里氏木霉中，在启动子的驱动下，转录出mRNA，并翻译成红色荧光蛋白。
1.构建表达红色荧光蛋白的重组质粒：pPcbh1-Dsred-Tcbh1-pyr4-TEL、pSu-m1-Dsred-Tcbh1-pyr4-TEL
cbh1、Su-m1为启动子，Pyr4为木霉转化筛选标记基因，Tcbh1为终止子，TEL为端粒序列。
将cbh1和Su-m1启动子分别与TEL2以Overlap的方式连接；DsRed与Tcbh1以Overlap的方式连接；中间质粒载体是将片段Pcbh1-TEL2和Su-m1-TEL2分别与Dsred-Tcbh1、Pyr4-AmpR-Ori片段以无缝拼接的方式连接。测序成功后，便得到了中间质粒载体pPcbh1-Dsred-Tcbh1-Pyr4-TEL2、pSu-m1-Dsred-Tcbh1-Pyr4-TEL2。将中间质粒载体和TEL1片段用I-CeuI和SpeI双酶切，回收片段后，用T4连接酶连接两个片段。22℃连接1h，转化大肠杆菌Trans1后，挑单克隆验证阳性转化子。最终便得到了表达质粒载体pPcbh1-Dsred-Tcbh1-Pyr4-TEL、pSu-m1-Dsred-Tcbh1-Pyr4-TEL。
2.将pPcbh1-Dsred-Tcbh1-Pyr4、pSu-m1-Dsred-Tcbh1-Pyr4转化入里氏木霉
将里氏木霉TU-6接种于土豆培养基(PDA)平板上，28℃静置培养7d待其产孢，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的PDB培养基中，28℃、160rpm振摇培养过夜。200目筛过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的酵母破壁酶在30℃消化2-3小时。收集原生质体后，用上述质粒转化里氏木霉TU-6菌株。
3.筛选重组转化子
质粒载体转化里氏木霉TU-6菌株，培养5-7天。待单克隆长出后，挑取单个转化子，接种于含MM-乳糖培养基的24孔板，于28℃培养5-7天。培养期间，随时观察转化子是否显色，如图1-1和图1-2所示，培养基中可见表达红色荧光蛋白的菌落，且使用Su-m1启动子的菌落较野生型cbh1启动子的菌落表现出更深的红色，说明Su-m1启动子促使Dsred基因表达出更多的红色荧光蛋白。
4.提取代表性转化子的基因组
为了验证cbh1启动子以及改造后的Su-m1启动子在里氏木霉中的拷贝数的数目，选择代表性的转化子，提取真菌基因组。将代表性转化子接种PDA板生长、产孢7d后，接MM-glucose种子培养基2d后，收集菌丝并压干，分装于2ml EP管，迅速冻于液氮中。提取时，用机器研磨菌丝1分30s，提取方法参照真菌试剂盒Fungal DNA Kit。
5.鉴定转化子的启动子拷贝数
转化子的启动子拷贝数的鉴定采用qRT-PCR的方法，选择单一拷贝数的cbh1基因作为内参，DsRed作为检测的目标基因。各选择4株具有不同荧光强度的代表性的Pcbh1和Su-m1的转化子，基因组DNA的浓度稀释至1-2ng/μL，取1μl为模板；以引物对qcbh1F1(5'-ATTCGGCGGATCCTCTTTCTC-3')和qcbh1R1(5'-TGTGGAGGAGGTCTCGTTGTC-3')扩增cbh1基因，以引物qDsredF1(5'-GAGAAGCTGTACCCCCAGGAC-3')和qDsredR1(5'-TGCCGGGCAGCTGCACGGGCT-3')扩增Dsred基因。Dsred基因的拷贝数用法相对定量。
转化子拷贝数的鉴定结果如图2所示，可见转化子中Dsred基因均以低拷贝形式存在，由于DsRed是和启动子物理联系在一起并驱动其转录表达的，所以理论上，DsRed的拷贝数的差异可以体现不同启动子的拷贝数的差异。
实施例2.Su-m1启动子对外源基因AnMan5A(opt)表达的影响
本发明应用Su-m1启动子在里氏木霉中表达异源甘露聚糖酶，与野生型cbh1启动子相比，获得了甘露聚糖酶酶活显著提高的转化子。
1.构建pPcbh1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL、pSu-m1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL质粒
片段cbh1-TEL和Su-m1-TEL分别与AnMan5A(opt)、Tcbh1-Ori-AmpR，按照无缝拼接试剂盒的方法，将3个片段在37℃，连接30min后，转化大肠杆菌Trans1后，挑单克隆验证阳性转化子。最终便得到了表达质粒载体Pcbh1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL、Su-m1-AnMan5A(opt)-Tcbh1-TEL。提取质粒，备用于转化。
2.将Pcbh1-AnMan5A(opt)-Tcbh1、Su-m1-AnMan5A(opt)-Tcbh1转化入里氏木霉
将里氏木霉SUS1接种于土豆培养基(PDA)平板上，28℃静置培养5d待其产孢后，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的PDB培养基中，28℃、160rpm振摇培养过夜。200目筛过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的酵母破壁酶，在30℃消化2-3小时。收集原生质体后，用上述质粒转化里氏木霉SUS1菌株。
3.筛选重组转化子
在含1M山梨醇的MM-glucose琼脂培养基上培养转化子。挑取单个克隆，接种于25ml液体MM-glucose中，28℃、160rpm振摇培养2d。提取基因组DNA，提取的基因组DNA以此为模板、以Yz-pcbh1pF(5’-AAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTC-3’)和Yz-man5AR(5’-GGCCCATGACGAGGTCGACGTCCGC-3’)为引物进行PCR验证，在1％琼脂糖凝胶上验证不同启动子驱动的AnMan5A(opt)载体是否成功转入里氏木霉。将鉴定为阳性的转化子和出发菌株的孢子，接种至PDA平板上，28℃培养4～7天。
如图3所示，在1％琼脂糖胶上电泳，显示含AnMan5A(opt)质粒的阳性转化子。将这些转化子接种于PDA培养基上，30℃静置培养7d产孢，收集孢子备用。
4.测定甘露聚糖酶酶活
采用角豆胶作为底物进行甘露聚糖酶酶活的测定。称量0.5g角豆胶，用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)定容至100ml，配置0.5％角豆胶底物。取酶液100μl，加入到900μl底物中，振荡混合均匀，50℃水浴保温15min后，向各试管中加入1.5ml DNS试剂，再向空白中加酶液0.1ml，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却，测定540nm的吸光度。
在50℃、pH 5.0的条件下，将每分钟水解角豆胶底物，产生1μmol还原糖(以甘露糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)，酶活测定结果见图4，Pcbh1-AnMan5A(opt)的甘露聚糖酶酶活为5.27U/ml，而Su-m1-AnMan5A(opt)的甘露聚糖酶酶活为18.60U/ml，较野生性cbh1启动子的菌株提高了2.52倍，可见使用Su-m1启动子的转化子表达甘露聚糖酶的活性要显著高于使用cbh1启动子的转化子。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 转录效率提高的Su-m1启动子及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcattcccg aaaaaactcg gagattccta agtagcgatg gaaccggaat aatataatag 60
gcaatacatt gagttgcctc gacggttgca atgcaggggt actgagcttg gacataactg 120
ttccgtaccc cacctcttct caacctttgg cgtttccctg attcagcgta cccgtacaag 180
tcgtaatcac tattaaccca gactgaccgg acgtgttttg cccttcattt ggagaaataa 240
tgtcattgcg atgtgtaatt tgcctgcttg accgactggg gctgttcgaa gcccgaatgt 300
aggattgtta tccgaactct gctcgtagag gcatgttgtg aatctgtgtc gggcaggaca 360
cgcctcgaag gttcacggca agggaaacca ccgatagcag tgtctagtag caacctgtaa 420
agccgcaatg cagcatcact ggaaaataca aaccaatggc taaaagtaca taagttaatg 480
cctaaagaag tcatatacca gcggctaata attgtacaat caagtggcta aacgtaccgt 540
aatttgccaa cggcttgtgg ggttgcagaa gcaacggcaa agccccactt ccccacgttt 600
gtttcttcac tcagtccaat ctcagctggt gatcccccaa ttgggtcgct tgtttgttcc 660
ggtgaagtga aagaagacag aggtaagaat gtctgactcg gagcgttttg catacaacca 720
agggcagtga tggaagacag tgaaatgttg acattcaagg agtatttagc cagggatgct 780
tgagtgtatc gtgtaaggag gtttgtctgc cgatacgacg aatactgtat agtcacttct 840
gatgaagtgg tccatattga aatgtaagtc ggcactgaac aggcaaaaga ttgagttgaa 900
actgcctaag atctcgggcc ctcgggcctt cggcctttgg gtgtacatgt ttgtgctccg 960
ggcaaatgca aagtgtggta ggatcgaaca cactgctgcc tttaccaagc agctgagggt 1020
atgtgatagg caaatgttca ggggccactg catggtttcg aatagaaaga gaagcttagc 1080
caagaacaat agccgataaa gatagcctca ttaaacggaa tgagctagta ggcaaagtca 1140
gcgaatgtgt atatataaag gttcgaggtc cgtgcctccc tcatgctctc cccatctact 1200
catcaactca gatcctccag gagacttgta caccatcttt tgaggcacag aaacccaata 1260
gtcaaccgcg gactgcgcat c 1281
<210> 2
<211> 1313
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcattcccg aaaaaactcg gagattccta agtagcgatg gaaccggaat aatataatgg 60
ctaataaata cattgagttg cctcgacggt tgcaatgcag gggtactgag cttggacata 120
actgttccgt accccacctc ttctcaacct ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta 180
caagtcgtaa tcactattaa cccagactga ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa 240
ataatgtcat tgcgatgtgt aattggctaa taagcttgac cgactggggc tgttcgaagc 300
ccgaatgtag gattgttatc cgaactctgc tcgtagaggc atgttgtgaa tctgtgtcgg 360
gcaggacacg cctcgaaggt tcacggcaag ggaaaccacc gatagcagtg tctagtagca 420
acctgtaaag ccgcaatgca gcatcactgg aaaatacaaa ccaatggcta aaagtacata 480
agttaaggct aataaaaaga agtcatatac cagcggctaa taattgtaca atcaagtggc 540
taaacgtacc gtaatttgcc aacggcttgt gggctaacag aagcaacggc aaagccaatc 600
ttccaatcgt ttgtttcttc actcagtcca atctcagctg gtgatccccc aattgggtcg 660
cttgtttgtt ccggtgaagt gaaagaagac agaggtaaga atgtctgact cggagcgttt 720
tgcatacaac caagggcagt gatggaagac agtgaaatgt tgacattcaa ggagtattta 780
gccagggatg cttgagtgta tcgtgtaagg aggtttgtct gccgatacga cgaatactgt 840
atagtcactt ctgatgaagt ggtccatatt gaaatgtaag tcggcactga acggctaata 900
aaaagattga gttgaaacgg ctaataaaag atctcgggcc ctcgggcctt cggcctttgg 960
gtgtacatgt ttgtgctccg ggcaaatgca aagtgtggta ggatcgaaca cactgcggct 1020
aataattacc aagcagctga gggtatgtga tggctaataa aatgttcagg ggccactgca 1080
tggtttcgaa tagaaagaga agcttagcca agaacaatag ccgataaaga tagcctcatt 1140
aaacggaatg agctagtggc taataaaagt cagcgaatgt gtatatataa aggttcgagg 1200
tccgtgcctc cctcatgctc tccccatcta ctcatcaact cagatcctcc aggagacttg 1260
tacaccatct tttgaggcac agaaacccaa tagtcaaccg cggactgcgc atc 1313
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg 60
ttagggttag ggttagggtt agggttaggg 90
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa 60
ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa 90
<210> 5
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg 60
ttagggttag ggttagggtt agggttaggg taactataac ggtcctaagg tagcgaaccc 120
taaccctaac cctaacccta accctaaccc taaccctaac cctaacccta accctaaccc 180
taaccctaac cctaacccta accctaa 207

Claims (8)

1.转录效率提高的Su-m1启动子，其特征在于，将cbh1启动子的核苷酸序列上的4处5’-AGGCA-3’位点及4处5’-TGCCT-3’位点均突变为5’-GGCTAATAA-3’，得到所述Su-m1启动子，其中，cbh1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的转录效率提高的Su-m1启动子，其特征在于，所述Su-m1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求1或2所述的转录效率提高的Su-m1启动子的重组表达载体。
4.含有权利要求1或2所述的转录效率提高的Su-m1启动子的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为里氏木霉。
6.权利要求1所述的转录效率提高的Su-m1启动子的应用。
7.一种提高基因表达效率的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的转录效率提高的Su-m1启动子启动目的基因表达的步骤。
8.根据权利要求7所述的提高基因表达效率的方法，其特征在于，所述目的基因包括纤维素酶基因及甘露聚糖酶基因。
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