CN104388410B - F175‑3蛋白及其编码基因及水解纤维素的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了F175‑3蛋白及其编码基因及水解纤维素的应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现新的纤维素酶F175‑3，在以纤维素为底物，pH 5.0条件下，最适温度为60℃，在60℃温育2小时后，仍能保留88.5％的活力；在4℃下，不同pH缓冲液中孵育24小时后，在pH 3.5‑8.0范围内均能保留超过80％的剩余活力。

Description

F175-3蛋白及其编码基因及水解纤维素的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及F175-3蛋白及其编码基因及水解纤维素的应用。
背景技术
据统计，每年全球植物通过光合作用合成纤维类物质达到50亿吨。纤维素(Cellulose)是植物细胞壁的重要组分，是自然界中最丰富的可再生资源。纤维素酶(Cellulase)是一类能将纤维素水解为低聚葡萄糖及葡萄糖的酶，很多自然界微生物均含有纤维素酶。由于纤维素酶可以广泛应用于纺织、造纸、食品及生物燃料等工业，近年来吸引了越来越多学者的研究兴趣。为了使酶达到较高的耐热性及热稳定性，很多学者从嗜热微生物中筛选新酶，但是它们很少可以适用在工业条件中。在生物燃料，即水解生物质生产生物乙醇的工业中，很少有酶可以高效的在50℃的工业条件下保持良好的稳定性。这就限制了生物燃料工业的高效发展，也是制约生物燃料降低生产成本的重要因素。
自然界中，不可培养微生物约占所有微生物的99％。大部分筛选纤维素酶的研究仍然禁锢在可培养的1％的微生物中。近10年来，随着测序技术与高通量筛选技术的发展，人们逐渐开始研究不可培养微生物中蕴含的资源，采用的是日臻成熟的宏基因组技术，并发现了大量具有优秀性质的酶，说明了宏基因组技术发掘新酶的广阔前景。
在宏基因组技术筛选新酶的研究中，筛选效率从土壤等自然环境到动物消化道，再到人工驯化的反应器依次递增。这与驯化的强度及选择压力是相关的。在自然环境中，比如森林土壤，需要若干年，微生物才能将生物质降解，在动物消化道中，这种反应需要若干天，但是水解效率依旧不高，这就是食草动物食量大的原因；而对于人工驯化的反应器，三天即可达到90％的转化率。本研究从人工驯化反应器中筛选纤维素酶，保证了其高效性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白。
本发明提供的蛋白，F175-3，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1；
2)编码区为序列表中序列1自5’末端第7-1293位核苷酸；
3)编码区为序列表中序列1自5’末端第11-1293位核苷酸；
4)在严格条件下与1)或2)或3)杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)具有90％以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。
上述方法中，所述表达载体为pET-28a载体，所述重组载体在本发明的实施例为将序列表中序列1自5’末端第11-1293位核苷酸插入pET-28a载体的Nco I与Hind III酶切位点间得到的载体；
上述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
所述目的菌为大肠杆菌，具体为Rosetta DE3。
上述蛋白在作为纤维素酶或β-葡萄糖苷酶中的应用也是本发明保护的范围。
所述纤维素酶具体为内切纤维素酶或外切纤维素酶；
所述内切纤维素酶酶学特征具体为：最适pH值为5.0，最适温度为60℃。
上述的蛋白或上述DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制备纤维素酶或β-葡萄糖苷酶)中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备纤维素酶或β-葡萄糖苷酶的方法。
本发明的方法，为发酵上述的重组菌，即得到纤维素酶或β-葡萄糖苷酶。
上述方法中，所述发酵为在IPTG诱导下发酵培养。
上述的蛋白在降解生物质中的应用也是本发明保护的范围，所述生物质为玉米芯。
本发明的实验证明，本发明发现新的纤维素酶F175-3，在以纤维素为底物，pH 5.0条件下，最适温度为60℃，在60℃温育2小时后，仍能保留88.5％的活力；在4℃下，不同pH缓冲液中孵育24小时后，在pH 3.5-8.0范围内均能保留超过80％的剩余活力。
附图说明
图1为对F175-3三维结构及活性位点的预测
图2为F175-3诱导表达SDS-PAGE图谱
图3为温度对F175-3活性的影响
图4为F175-3的温度稳定性
图5为F175-3的最适pH及pH稳定性
图6为F175-3及F85-20对纤维素的水解产物研究
图7为F175-3及F85-20与F175-3对玉米芯的水解产物曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、F175-3基因的克隆
前期研究中，利用Fosmid载体构建了干式发酵污泥系统的宏基因组文库。利用刚果红-纤维素平板，筛选得到了一个含有纤维素酶活性的大肠杆菌宿主克隆。Fosmid中含有的插入片段为37655bp，采用softberry预测ORF，并用NCBI及Pfam数据库注释。得到F175-3基因，该基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第7-1293位核苷酸，其编码的蛋白命名为F175-3，其氨基酸序列为序列表中序列2自N’末端第1-429位氨基酸。经过比对，F175-3蛋白与来自uncultured bacterium的纤维素酶有最高的59％相似性，预测其为纤维素酶。
实施例2、F175-3作为纤维素酶的应用
1、重组载体的构建
以人工合成的序列1为模板，用F175-3F与F175-3R为引物，采用TAKARA公司的PrimeStar高保真酶进行PCR扩增，得到1302bp的PCR产物，其核苷酸序列为序列1。
F175-3F:5’-CATGCCATGGCGAAAACCGGCGATCAG-3’包含Nco I酶切位点
F175-3R:5’-CCCAAGCTTCTGGGCATATCTGATCATCG-3’包含Hind III酶切位点
上述PCR扩增的体系如下：
PCR程序如下：
94℃ 1min预变性
98℃ 10s
68℃ 80s
回到2，24个循环
72℃ 5min
End
将上述PCR产物用Nco I与Hind III双酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的pET-28a载体(Novagen pET-28a DNA Cat.No.69864-3)连接，得到重组载体。
经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5’末端第11-1293位核苷酸插入pET-28a载体的Nco I与Hind III酶切位点间得到的载体，表达序列2所示的蛋白，将该重组载体命名为pET-28a-F175-3。
序列表中序列1所示的DNA分子中自5’末端第7-1293位核苷酸为F175-3基因序列表中序列2所示蛋白中自1-429位氨基酸为F175-3蛋白。
2、蛋白的表达与纯化
1)表达
将上述重组载体pET-28a-F175-3转化至Rosseta DE3感受态细胞中，在含有50μg/mL卡那霉素和12.5μg/mL氯霉素的LB平板中37℃培养过夜，得到单菌落，菌落PCR鉴定，引物为F175-3F和F175-3R，得到1302bp的为阳性重组菌，命名为DE3/pET-28a-F175-3。
采用同样的方法将空载体pET-28a转入Rosseta DE3感受态细胞，得到DE3/pET-28a。
将DE3/pET-28a-F175-3单菌落接种至100mL含有50μg/mL卡那霉素和12.5μg/mL氯霉素的LB培养基中37℃培养过夜，当OD600nm达到0.4时，加入终浓度为1mM的IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)诱导四小时。取1mL菌液，离心后收集菌体，悬于200μL 1×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸10min，25℃高速离心1min，取上清液，上样量20μL。以DE3/pET-28a为对照。
10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达，结果如图2所示，1为DE3/pET-28a、2-3均为DE3/pET-28a-F175-3，从图中可以看出，DE3/pET-28a-F175-3经过四小时的诱导，F175-3成功诱导表达，目的蛋白大小为51.7KD。
2)、纯化
收集DE3/pET-28a-F175-3菌体，用PBS缓冲液(NaCl 137mM,KCl 2.7mM,Na2HPO410mM,KH2PO42mM,pH 7.4)洗涤菌体三次，重悬，反复冻融三次破壁。离心，收取上清，采用镍柱填料纯化蛋白。首先洗涤液(NaH2PO450mM,NaCl 300mM,imidazole20mM,pH 8.0)洗三次，然后洗脱液(NaH2PO450mM,NaCl 300mM,imidazole 250mM,pH 8.0)洗脱三次，洗涤及洗脱条件均为500g，2min，收集三倍柱体积的洗脱液为目的蛋白F175-3。
将目的蛋白F175-3进行SDS-PAGE检测，得到大小为51.7KD，说明纯化得到目的蛋白F175-3。
3、目的蛋白F175-3的功能验证及酶特性检测
纤维素酶活性的测定：反应体系：100μL 1％羧甲基纤维素钠(CMC)溶液+100μL100mM醋酸钠缓冲液。5μL酶液加入50℃预热的反应体系中，温育15min，随后加入500μL DNS试剂。沸水浴5min后，于540nm处测定吸光值。
一个单位的酶活(U)定义为一个酶分子每分钟水解纤维素释放出还原糖的量(μmol)。
1)最适pH的测定条件：
将缓冲液更换为不同pH，测定酶活。缓冲液的配制：磷酸氢二钠-柠檬酸(3.5-8.0)，Tris-HCl(8.0-10.0)，磷酸氢二钠-氢氧化钠(10.0-12.0)。
结果如图5所示，目的蛋白F175-3能够降解纤维素，为纤维素酶，且其最适pH为5.0。
2)最适温度的测定：
将酶反应体系预先在20-90℃预热5min，再加入酶进行反应。反应为pH 5.0。
结果如图3所示，目的蛋白F175-3能够降解纤维素，为纤维素酶，且其最适温度为60℃。
3)温度稳定性测定条件：
将酶在各个温度下分别温育20min，40min，60min，80min，100min以及120min，随后在60℃，pH 5.0测定剩余酶活；
结果如图4所示，目的蛋白F175-3能够降解纤维素，为纤维素酶，且其在60℃温育2小时后，仍保留有88.5％的活性。
4)pH稳定性测定：
将酶加入对应pH的缓冲液中，于4℃放置24h，最后在60℃，pH 5.0条件下测定剩余活性。
结果如图5所示，目的蛋白F175-3能够降解纤维素，为纤维素酶，且其在4℃下，不同pH缓冲液中孵育24小时后，在pH 3.5-8.0范围内均能保留超过80％的剩余活力。
5)米氏常数的测定：
准备0-45mg/mL的CMC溶液，测定酶的反应动力学参数(Lineweaver-Burk plot)。
酶解产物的研究采用薄层层析的方法，酶在50℃与底物反应4h后，取样点在硅胶板上，层析后染色观察降解产物。
结果如图6所示，标品为葡萄糖G1，纤维二糖G2，纤维三糖G3以及纤维四糖G4。泳道1：阴性对照；泳道2：F85-20水解结果；泳道三：F175-3水解结果；泳道四：F85-20+F175-3水解结果，结果表明，当F85-20单独作用CMC时，基本没有水解产物；当F175-3单独作用时，产物为葡萄糖、纤维二糖以及大量寡糖；当两者合并使用时，纤维二糖的量明显减少，葡萄糖的量增多，说明两种酶的共同作用可以提高葡萄糖的产量。
4、F175-3对玉米芯降解实验
500U/g生物质的比例加入上述2纯化的F175-3，50℃温育72h，液相测定糖含量。
分离条件：
分析柱：Shim-pack ISA-07(4.0mm×25cm)
流动相：A液0.1M硼酸(用氢氧化钾调节至pH＝8)
B液0.4M硼酸(用氢氧化钾调节至pH＝9)
梯度：A液100％-B液100％，2％/min直线梯度洗脱
流量：0.6mL/min
温度：65℃
衍生条件：
衍生液：1％L-精氨酸，3％硼酸
流速：0.5mL/min
反应温度：150℃
结果见图7，该酶的水解效率为11.7％，加入50U/g生物质的F85-20后，水解效率增加至52.3％。
5、三维结构的模拟
在swiss-model中搜寻最适模板，最后采用pymol软件对图像进行修饰。采用Cluster W进行多序列比对，得到活性位点，见图1。
6、金属离子(5mM)对酶活性的影响
方法：100μL 1％CMC溶液(溶剂为100mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0))+100μL100mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，其中加入终浓度为5mM的各种金属离子。5μL上述2纯化的F175-3加入60℃预热的反应体系中，温育15min，随后加入500μL DNS试剂。沸水浴5min后，于540nm处测定吸光值。
表1为金属离子(5mM)对酶活性的影响
结果如表1所示，可以看出，大部分金属离子对F175-3的活性影响不大，许多离子对其酶活有促进作用，包括钙离子，锶离子，钴离子以及锰离子。然而汞离子对酶活有比较强烈的抑制作用。
7、F175-3的酶反应动力学参数
准备0-45mg/mL的CMC溶液，100μL不同浓度的纤维素溶液+100μL 100mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)。5μL上述2纯化的F175-3加入60℃预热的反应体系中，温育15min，随后加入500μL DNS试剂。沸水浴5min后，于540nm处测定吸光值。
结果如表2所示，可以看出，F175-3更亲和于CMC，每秒可以转化70个底物分子，且比MIC的水解效率高。
表2为F175-3的酶反应动力学参数
8、F175-3的底物特异性
100μL不同的底物溶液+100μL 100mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)。5μL上述2纯化的F175-3加入60℃预热的反应体系中，温育30min，随后加入500μL DNS试剂。沸水浴5min后，于540nm处测定吸光值。底物包括榉木木聚糖，CMC(羧甲基纤维素钠)，pNPX(对硝基苯酚木糖苷)，pNPG(对硝基苯酚葡萄糖苷)，pNPA(对硝基苯酚阿拉伯糖苷)，MIC(微晶纤维素)和滤纸(50mg)。
结果如表3所示，表明F175-3有比较广泛的底物作用谱，对CMC的活性最高，表示其是一种内切纤维素酶；此外还有一定的外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的活性，极少量的木聚糖酶活性也可以检测到。其中外切纤维素酶占内切纤维素酶的比例为21.8％，在已知研究中，这种比例较高。说明F175-3是一个双功能纤维素酶。此外，F175-3也可以单独降解滤纸产生还原糖。
表3为F175-3的底物特异性

Claims (10)

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为序列表中序列1自5’末端第7-1293位核苷酸。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
7.权利要求1所述的蛋白在作为纤维素酶或β-葡萄糖苷酶中的应用；
所述纤维素酶具体为内切纤维素酶或外切纤维素酶；
所述内切纤维素酶酶学特征具体为：最适pH值为5.0，最适温度为60℃。
8.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的DNA分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在制备纤维素酶或β-葡萄糖苷酶中的应用。
9.一种制备纤维素酶或β-葡萄糖苷酶的方法，为发酵权利要求6所述的重组菌，即得到纤维素酶或β-葡萄糖苷酶。
10.权利要求1所述的蛋白在降解生物质中的应用，所述生物质为玉米芯。
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