CN103205408A - 一种极耐SDS木聚糖酶XynII及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种极耐SDS木聚糖酶XynII及其编码基因和应用，木聚糖酶XynII，的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的极耐SDS木聚糖酶XynII是从食用菌草菇中克隆得到的新的木聚糖酶，其最适温度为60℃，最适pH为7.0，具有良好的温度和pH稳定性，并且对蛋白酶K和SDS具有较强的耐受性，因此其在工业化应用中具有良好的应用前景。另外其来源为食用菌因此安全性可靠，可广泛应用于食品，饲料以及医药等行业。

Description

一种极耐SDS木聚糖酶XynII及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及蛋白质技术领域，尤其涉及一种极耐SDS木聚糖酶XynII及其编码基因和应用。

背景技术

木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，是自然界中继纤维素之后含量第二丰富的可再生物质资源。它是高度分支的多糖，是一个以β-1,4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基，由乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的。由于木聚糖组成的复杂性，其完全降解需要木聚糖酶，β-木糖苷酶及一些列相关的侧链降解酶酶共同作用，如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，α-葡萄糖醛酸酶，乙酰木聚糖酯酶以及阿魏酸酯酶等。在木聚糖降解的酶系中，木聚糖酶起着最重要的作用，它水解木聚糖主链骨架的β-1,4-糖苷键，产生低聚木糖或带有侧链的寡聚木糖，从而实现木聚糖的降解。根据木聚糖酶基因的同源性和疏水基团簇，木聚糖酶主要分为两个家族：第10家族木聚糖酶分子量多在35kDa左右，由纤维素结合域及其间的连接区域组成，第11家族主要包括一些高度特异的低分子量内切木聚糖酶，大多分子量较小，在20kDa左右。另外还有少数的木糖酶被分在糖苷水解酶家族5、7、8以及43等（GH；http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）这些不同家族来源的木聚糖酶具有不同的分子结构，分子量以及催化特性等。

木聚糖酶的商业化应用始于十九世纪80年代在饲料工业中的应用，之后又逐渐广泛应用于造纸、食品、制药等各种行业。在饲料领域，木聚糖酶可以提高低质饲料的利用率，有利于禽畜的健康生长；在食品方面木聚糖酶可以提高食品的品质，减少其它添加剂的使用；在造纸工业中，木聚糖酶可以提高木质素的溶出率，从而促进纸浆的漂白作用，减少了有毒助剂的使用。随着生物技术的不断发展，木聚糖酶的应用覆盖了工业化生产的很多领域。因此引起了人们的广泛关注。

酶的广泛工业化应用及技术升级的先决条件就是要找到合适的酶源，对酶的要求包含了以下几个方面：催化作用的特异性，较高的催化效率以及酶本身的稳定性。酶的催化效率取决于酶的柔性，使其能在催化过程中实现构像的变化，而在工业化应用中同时需要其在复杂环境下具有一定的结构稳定性。因此，木聚糖酶如具有较高的催化效率而且在苛性条件下，如极端的pH，蛋白酶或是变性剂SDS等存在的条件下仍具有较高的稳定性将是工业化应用的优良酶源。

草菇（Volvariella volvacea）是生长在热带和亚热带地区的大型真菌，与其它食用真菌相比，它具有独特的生物学特性，首先，它是一种高温型担子菌，酶稳定性好，对其天然生长底物——稻草的生物降解快速有效；其次，草菇虽为白腐菌，但它的木质素降解能力较弱，它可以在木质素未被充分降解的情况下有效的降解利用天然稻草中的纤维素和半纤维素，因此，其中性纤维素酶和半纤维素酶具有极强的降解能力，这些酶可能成为生物炼制工程中极具潜力的新酶源。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种极耐SDS木聚糖酶XynII，使其对蛋白酶K和SDS具有较强的耐受性，满足使用需求。本发明的另一目的是提供所述木聚糖酶XynII的编码基因。本发明还有一目的是提供上述木聚糖酶XynII的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种极耐SDS木聚糖酶XynII，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的极耐SDS木聚糖酶XynII的编码基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的极耐SDS木聚糖酶XynII编码基因的表达载体或表达体系。

所述的极耐SDS木聚糖酶XynII编码基因在表达木聚糖酶XynII中的应用。

所述的木聚糖酶XynII在酶解木聚糖中的应用。

所述的木聚糖酶XynII在耐受SDS中的应用。

本发明从草菇中克隆获得木聚糖酶基因，并实现了其在毕赤酵母中的高效异源表达并研究了其酶学特性，发现其对蛋白酶及SDS具有极强的耐受性，是一种工业化应用的优质酶源。

有益效果：与现有技术相比，本发明的极耐SDS木聚糖酶XynII是一种从食用菌草菇中克隆得到的新的木聚糖酶，其最适温度为60℃，最适pH为7.0，具有良好的温度和pH稳定性，并且对蛋白酶K和SDS具有较强的耐受性，因此其在工业化应用中具有良好的应用前景。另外其来源为食用菌因此安全性可靠，可广泛应用于食品，饲料以及医药等行业。

附图说明

图1是纯化得到的木聚糖酶XynII的12%SDS-PAGE电泳图；

图2是木聚糖酶XynII最适pH测定结果图；

图3是木聚糖酶XynII适温度测定结果图；

图4是木聚糖酶XynII pH耐受性测定结果图；

图5是木聚糖酶XynII温度耐受性测定结果图；

图6是木聚糖酶XynII对蛋白酶K的耐受性的12%SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的材料和试剂如下：

菌株及载体：草菇菌种Volvariella volvacea V14由香港中文大学国际菌物服务中心提供，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris KM71H）及表达载体pPiczαB购自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α及基因操作质粒pGEM-T购自Promega公司。

酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

LB培养基：Peptone10g，Yeast extract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

YPD培养基：10g Yeast Extract，20g peptone，溶于900ml水，高温高压灭菌，加入100ml灭过菌的10×D（20%的葡萄糖）。

BMGY培养基：10g Yeast Extract，20g peptone溶于700ml水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入100ml pH=6的1M的磷酸钾缓冲液（温高压灭菌），100ml10×YNB（滤膜灭菌），2ml500×B(20mg biotin溶于100ml的水，滤膜灭菌)，100ml10×GY(100ml甘油溶于900ml水高温高压灭菌)，混合均匀后4℃保存。

BMMY：10g Yeast Extract，20g peptone溶于700ml水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入，100ml pH6的1M的磷酸钾缓冲液（温高压灭菌），100ml10×YNB（滤膜灭菌），2ml500×B(20mg biotin溶于100ml的水，滤膜灭菌)，100ml10×M(5%的甲醇)，混合均匀后4℃保存。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1基因的克隆

RNA的提取及模版的制备：草菇菌种从平板接种于稻草培养基8天后收集菌丝，采用invitrogen的TRIZOL regent提取：液氮将收集的菌丝研磨成粉末，取适量粉末加入1mL TRIZOL regent，混合均匀后室温静置5min。加入氯仿，震荡混合均匀，室温静置2-3min。12000g的转速离心15min。上清液转移至干净的离心管，加入异丙醇，混合均匀后室温静置10min，用12000g的转速离心弃上清，沉淀用75%乙醇清洗，7500g的速度离心。干燥RNA，注意RNA不能完全干燥，用TE buffer溶解RNA，55-60℃保温10min。参照SMART RACEcDNA Amplification Kit（Clontech）的方法制备5’RACE及3’RACE的模版。

取草菇cDNA文库的表达序列标签（EST）（序列见SEQ ID NO.3）与Genebank中相关序列进行blastx比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），发现其与木聚糖酶具有较高的同源性，根据该EST序列设计特异性引物5’-GCGCTTGGCGAGGGCAACAATTTCGT-3’，参照SMART RACE cDNA AmplificationKit（Clontech）的说明书，以制备的5’RACE的模版首先进行5’RACE PCR。PCR反应参数为：94℃变性30sec，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性30sec，70℃退火30sec，72℃延伸3min，5个循环后94℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸3min，20个循环。获得基因片段，并将该片段回收后与载体pGEM-T相连，然后送南京思普金生物科技有限公司测序。根据测序得到的5’端序列，序列设计引物5’-GGGAGGCATCACCCAGCTTCTTCGTACC-3’，进行3’RACE PCR扩增得到一约1100bp片段，将该片段回收后与载体pGEM-T相连，测序，最后得到木聚糖酶酶XynII基因的全长。测序结果显示，该木聚糖酶基因全长1050bp，DNA序列见SEQ ID NO.2，表达的蛋白序列见SEQ ID NO.1，其阅读框包含350个氨基酸，其中前20个氨基酸为信号肽。经蛋白同源性比对发现其属于糖苷水解酶家族10，理论分子量为39kDa，理论等电点（pI）为7.67。

实施例2XynII在毕赤酵母中的表达及纯化

木聚糖酶的表达采用EasySelect Pichia Expression Kit（invitrogen）。分别设计了两条引物5’-TGCCGGAATTCCGACGCCATTCCCCCCTTTCAA-3’和5’-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGGAACCAACGCCATTTATTGA-3’，利用PCR的方法在木聚糖酶的N端和C端分别引入两个限制性酶切位点EcoR及XbaI，将其双酶切后与同样双酶切的表达载体pPICZαB利用T4DNA连接酶连接，将连接好的重组质粒pPICZαB-xynII经限制性内切酶SacI线性化后电击转入Pichia pastoris KM71H后，利用含有1M山梨醇和100μg/mL Zeocin（Invitrogen）抗生素的YPD平板进行阳性克隆的筛选。将筛选到的阳性克隆接入装有3mL YPD和3μL抗生素Zeocin的试管中28℃-30℃，250rpm摇床培养，24h后将菌液分别转接到30mL BMGY培养液中28℃-30℃，250rpm摇床培养至其OD₆₀₀达到3-4后，离心收集菌体，再转接到15mL BMMY培养液中28℃，250rpm摇床培养，每隔24h补加甲醇，甲醇浓度为0.8%（v/v），连续培养4d后离心收集酶液。将粗酶液先装入透析袋中，4℃在pH8.0的磷酸缓冲液中轻微搅拌透析24h。经透析的酶液的盐离子浓度得到调节，便于下面的亲和层析纯化过程。

酶液的纯化参照Ni-NTA Agarose（Qiagen）的方法。将纯化得到的蛋白利用SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达，经Ni-NTA Agarose纯化后为单一条带，实际分子量大小与理论分子量相符。

实施例3重组木聚糖酶XynII的活性分析

木聚糖酶酶活的测定方法采用Somogyi-Nelson法：反应体系包含1mL pH7.0的柠檬酸缓冲液，0.4mL0.5%（w/v）的榉木木聚糖以及经过适当稀释的0.1mL的纯化的木聚糖酶酶液（实施例2制备），总反应体系为1.5mL。将该反应体系在60℃条件下反应10min后添加0.5mL的Somogyi溶液，沸水煮15min，冷却至室温后添加0.5mL的Nelson溶液，室温放置20min后在520nm波长下测定OD值。1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol木糖所需的酶量。

实施例4：重组木聚糖酶XynII的性质测定

1）重组木聚糖酶XynII的最适pH和pH稳定性的测定

酶的最适pH测定：将实例2纯化得到的酶液在60℃下，利用广泛缓冲液（50mM H₃PO₄，50mM CH₃COOH，50mM H₃BO₃，利用0.2M NaOH调节到不同的pH）测定pH从3-12的活性。以榉木木聚糖为底物，反应10min测定XynII的酶活。结果如图2所示，表明XynII的最适pH为7.0。

pH的耐受性测定：将纯化好的酶液（实例2制备）在不同的pH条件下（广泛缓冲液pH3.0-11.0）室温放置1h，然后在60℃及pH7.0下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以榉木木聚糖为底物，反应10min测定XynII的酶活。经pH4.0–10.0的缓冲液处理1h，酶活剩余80%以上，如图4所示。

2）重组木聚糖酶XynII的最适温度和热稳定性的测定

酶的最适温度测定：在pH7.0的缓冲液中，于40-60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中（40℃，45℃，50℃55℃，60℃）处理0-90min后，在pH7.0及60℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以榉木木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynII的酶学性质。结果表明：XynII的最适最适温度为60℃，在55℃和65℃分别具有约90%和40%的酶活（图3），在45℃放置90min还能保持90%以上的活性（图5）。

3）重组木聚糖酶XynII的底物特异性及动力学常数的测定

重组木聚糖酶XynII的底物特异性：分别选用了榉木木聚糖，桦木木聚糖，可溶燕麦木聚糖，不溶燕麦木聚糖，羧甲基纤维素（CMC），刺槐豆胶，几丁质为底物测定重组木聚糖酶XynII的活性：分别以浓度为1%(w/v)的上述多糖（榉木木聚糖浓度为0.5%(w/v)）为底物，参照实施例三的方法测定XynII对不同底物的活性。结果表明：重组木聚糖酶XynII对榉木木聚糖和可溶燕麦木聚糖的活性最高，分别达到了67.27U mg^-1和64.27U mg^-1，而对桦木木聚糖活性最低，比酶活为37.94U mg^-1（表1）。

重组木聚糖酶XynII动力学常数测定：动力学常数（V_max和K_m）的测定分别在50℃和60℃，pH7.0的条件下，添加不同浓度的榉木木聚糖（0.1-1.5mg/mL）为底物，反应5min，测定其活性。数据利用Graphpad Prism5.0软件进行非线性回归分析计算该酶的动力学常数。结果表明：在50℃，pH7.0的条件下XynII对榉木木聚糖的V_max、K_m和Kcat分别为52.42U mg^-1、0.48mgmL^-1和33.05s^-1。在60℃下，XynII对榉木木聚糖的V_max、K_m和Kcat分别为109.89U mg^-1、0.55mg mL^-1和69.28s^-1（表1）。

表1.XynII底物特异性及动力学常数

^a未检测到活性.

实施例5XynII对蛋白酶K的耐受性分析

在0.01M Tris-HCl（pH7.8）、0.01M EDTA的缓冲液中添加纯化的XynII蛋白样品5μg（实施例2制备）以及不同量的蛋白酶K，蛋白酶K与蛋白样品的质量比(w/w)分别为1：50、1：100和1：200，终体积为20μL，然后在37℃条件下放置24h后，利用SDS-PAGE分析蛋白酶K对XynII蛋白的降解情况。

XynII对蛋白酶K的耐受性的SDS-PAGE分析结果如图6所示：M为markers，第1列为未经处理的XynII，第2-4列为XynII与蛋白酶K在37℃条件下放置24h后的蛋白样品，蛋白酶K与蛋白样品的质量比(w/w)分别为1：50、1：100和1：200。由图可以看出XynII在不同浓度的蛋白酶K处理后蛋白带型没有明显的变化，说明XynII对蛋白酶K具有较强的耐受性。

实施例6XynII对SDS的耐受性分析

在酶活测定体系（实施例3）中添加不同浓度的SDS（0.1-4%）（w/v），50℃条件下利用不同木聚糖底物测定XynII的活性。结果如表2所示。

表2.SDS对重组木聚糖酶XynII.活性的影响

^a未添加SDS的XynII.的活性为100%

^b.SDS在反应体系中的终浓度.

结果显示，XynII在反应体系中添加不同浓度的SDS后，酶活都有一定程度的提高，当SDS浓度达到4%时，其对榉木木聚糖，桦木木聚糖和可溶燕麦木聚糖分别保持了108.29%，358.55%和130.96%的活性。这是目前第一种在真菌当中克隆到的具有良好的SDS耐受性的木聚糖酶。

XynII是一种从食用菌草菇中克隆得到的新的木聚糖酶，其最适温度为60℃，最适pH为7.0，具有良好的温度和pH稳定性，并且对蛋白酶K和SDS具有较强的耐受性，因此其在工业化应用中具有良好的应用前景。另外其来源为食用菌因此安全性可靠，可广泛应用于食品，饲料以及医药等行业。

Claims (6)

1.一种极耐SDS木聚糖酶XynII，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的极耐SDS木聚糖酶XynII的编码基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述的极耐SDS木聚糖酶XynII编码基因的表达载体或表达体系。

4.权利要求2所述的极耐SDS木聚糖酶XynII编码基因在表达木聚糖酶XynII中的应用。

5.权利要求1所述的木聚糖酶XynII在酶解木聚糖中的应用。

6.权利要求1所述的木聚糖酶XynII在耐受SDS中的应用。

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