KR101745479B1 - 재조합 섬유소 당화효소 칵테일 및 재조합 효모 복합 균주 및 이의 용도 - Google Patents

재조합 섬유소 당화효소 칵테일 및 재조합 효모 복합 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 TrXynII, TrBxl, TrEGL2, PaCEL1, PaCel2, TeCBH1, NfCBH1, HgCBH1, CtCBH1, ClCBH2, CfCex1으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모에서 야생형에 비해 단백질의 분비능이 증가된 발현카세트, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 2 이상 포함하는 복합 균주에 관한 것이다. 또한, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 또는 엑소글루카나제 생산방법 및 바이오 에탄올의 생산방법에 관한 것이다. 아울러, 베타글루코시다제와 상기 방법에 의해서 생산된 엔도글루카나제, 엑소글루카나제를 포함하는, 셀룰라제 칵테일, 및 상기 칵테일을 이용하여 바이오매스를 당화하는 방법에 관한 것이다. 또한 상기 셀룰라제를 생산하는 균주를 단일 사용 또는 2개 이상을 복합적으로 사용하여 섬유소 바이오매스로부터 바이오에너지 또는 유용 바이오케미컬 생산에 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 셀룰라제 발현벡터를 이용하면 효모 사카로마이세스 세레비지아에서 셀룰라제의 대량생산이 가능하며 상기균주는 기존 당화와 발효 2단계에 의해 수행되는 공정을 동시당화 또는 생물통합공정에 적용하여 효소비용을 80% 이상 절감할 수 있는 단일단계로 수행이 가능하기 때문에 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올 및 바이오케미컬 제조 등의 다양한 산업공정에 널리 활용될 수 있다.

Description

재조합 섬유소 당화효소 칵테일 및 재조합 효모 복합 균주 및 이의 용도{Recombinant cellulase cocktails, recombinant yeast complex strains, and use thereof}
본 발명은 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 TrXynII, TrBxl, TrEGL2, PaCEL1, PaCel2, TeCBH1, NfCBH1, HgCBH1, CtCBH1, ClCBH2, CfCex1으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모에서 야생형 단백질에 비해 분비능이 증가된 단백질 발현용 발현카세트, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 2 이상 포함하는 복합 균주에 관한 것이다. 또한, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 또는 엑소글루카나제 생산방법 및 바이오 에탄올의 생산방법에 관한 것이다. 아울러, 베타글루코시다제와 상기 방법에 의해서 생산된 엔도글루카나제, 엑소글루카나제를 포함하는, 재조합 셀룰라제 칵테일, 및 상기 칵테일을 이용하여 바이오매스를 당화하는 방법에 관한 것이다. 또한 상기 셀룰라제를 생산하는 균주를 단일 사용 또는 2개 이상을 복합적으로 사용하여 섬유소 바이오매스로부터 당화 및 발효 2단계 공정을 단일단계로 단순화하여 저렴한 비용으로 바이오에너지 또는 유용 바이오케미컬을 생산하는 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 원유고갈 및 지구온난화 문제로 인해 값싸고 재생 가능한 바이오매스로부터 바이오에너지를 용이하게 얻기 위한 노력이 진행되고 있다. 섬유소 바이오매스는 지구상 가장 풍부한 유기물로서 기존 석유기반으로 생산되던 다양한 에너지 및 원료 플랫폼화합물을 생산할 수 있는 재생 가능한 원료이다(Hoffert 등, 2002, Science, 298, 981). 현재 이러한 섬유소 바이오매스를 이용하여 바이오에너지, 특히 바이오에탄올을 얻는 과정은 기술적으로 가능하지만 고가의 공정이며 현재 원유가와 대비하여 경제성이 결여된 문제가 있다(Zaldivar 등, 2001, Appl. Microbiol. Biotechnol., 56, 17).
섬유소 바이오매스로부터 바이오에탄올을 얻기 위해서는 바이오매스를 분해하고 분해된 당(sugar)을 발효하여 바이오에탄올을 얻게 되는데 자연계에 존재하는 미생물은 바이오매스의 분해와 발효를 동시에 고효율로 수행할 수 없기 때문에 현재의 기술은 바이오매스의 분해 및 발효 2단계로 나누어 진행하여 비효율적이다(Lynd 등 2002, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 506). 특히, 섬유소 바이오매스는 매우 단단한 구조로서 자연적으로 분해하는 과정이 매우 느리기 때문에 인위적으로 분해속도를 빨리 하기 위해서는 고비용의 전처리 과정과 고가의 섬유소분해효소 처리과정을 반드시 필요로 한다(Lynd 등, 1999, Biotechnol. Prog. 15,777, Himmel 등, 2007, Science, 315, 804).
따라서, 섬유소 바이오매스를 이용한 바이오 에너지 및 플랫폼 화합물 생산의 경제성을 확보하기 위해서는 섬유소 바이오매스를 효율적으로 분해할 수 있는 섬유소 분해효소(셀룰라제)의 저가 생산 기술이 필요하며 특히 이러한 효소 생산 재조합 균주를 바이오 에너지 생산기술에 직접 활용할 수 있는 통합공정(Consolidated bioprocessing) 기술 개발이 요구된다(Hahn-Hagerdal 등, 2006, Trends Biotechnol., 24, 549, Lynd 등, 2008, Nat. Biotechnol., 26, 169).
섬유소 바이오매스는 글루코스 폴리머인 셀룰로스, 자일로스 폴리머인 헤미셀룰로스, 그리고 리그닌(lignin)이 결합하여 매우 단단하고 안정적인 구조를 가지고 있다. 효소를 이용하여 이를 효과적으로 분해하기 위해서는 먼저 물리화학적인 전처리를 통해 식물체의 안정적인 구조를 와해시키고 효소가 기질에 접근할 수 있어야 하며 기질의 종류에 따라 다양한 섬유소 분해효소가 필요하다. 글루코스 폴리머인 섬유소의 분해를 위해서는 엔도셀룰라제(endo-1,4-β-D-glucanase), 엑소셀룰라제(exo-1,4-β-D-glucanase 또는 cellobiohydrolase)및 베타-글루코시다제(β-glucosidase 또는 cellobiase)가 필수적으로 필요하다(Kubicek 등, 1992, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 45,1). 또한, 자일로스 폴리머인 헤미셀룰로스의 분해를 위해서는 엔도자일라나제(endo-1,4-β-xylanase)및 베타자이로시다제(β-xylosidase)가 대표적으로 필요하며 완전분해를 위해서는 다양한 디브랜칭(de-branching)효소가 필요하다. 이러한 효소들은 자연적으로 식물체를 부식시키는 미생물, 특히 곰팡이에서 발견되며 상업적으로 생산되는 섬유소분해효소 복합체는 곰팡이 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei) 유래의 효소복합체를 노보자임스(Novozymes)사, 다니스코(Danisco)사에서 시판하고 있다.
현재 전 세계적으로 바이오에너지 생산용 바이오매스 분해효소는 상기한 2개의 다국적 기업에서 독점적으로 생산 판매하고 있으나 상당히 고가이며 바이오매스에 따라 최적화된 상태가 아니므로 경우에 따라서 과잉의 효소를 사용해야 하는 문제점이 있다(Merino and Cherry, 2007, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 108, 95, Kabel 등, 2006, Bioeng. Biotechnol. 93, 56).
따라서, 각각의 효소를 박테리아나 효모(yeast)와 같은 재조합 숙주시스템을 이용하여 재조합 생산하고 생산된 각각의 재조합 효소를 조합하여 바이오매스의 종류에 따라 최적화하면 효소의 사용량을 줄일 수 있는 장점이 있다. 이와 같은 재조합 효소 생산을 위한 숙주세포로서 효모(yeast) 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 에탄올 발효능이 뛰어나 에탄올 생산균주로서 많이 이용되고 있으며 이 균주에 섬유소 분해능 도입을 위한 시도와 재조합 섬유소분해효소 생산을 위한 많은 연구가 진행되어 왔으나 (Lynd 등, 2002, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66, 506) 곰팡이에 비해 섬유소 분해효소 분비 생산성이 낮아 재조합 효소 대량생산 목적으로는 활용 가능성이 낮았다.
이와 같이, 종래의 효모는 바이오에탄올 발효능은 매우 우수하지만 섬유소 바이오매스의 분해능이 전혀 없어 비식량자원인 섬유소 바이오매스를 원료로 바이오에너지 생산시 고가의 섬유소 분해효소의 사용이 불가피한 문제점이 있으며, 또한 이를 해결하기 위하여 외래의 섬유소 분해효소유전자를 도입한 재조합 균주의 개발을 무수히 진행하였으나 효소의 분비 생산성이 낮아 생산된 효소가 효율적으로 배지 내 섬유소 기질을 분해하기 힘든 문제가 있었다. 이로 인해 생산된 당(sugar)을 이용한 바이오 에탄올의 생산에 한계가 있었다.
최근 몇 종의 곰팡이로부터 발굴된 섬유소 당화효소 유전자를 효모 사카로마이세스 세레비지에에서 발현하여 Avicel을 이용하여 바이오에탄올을 생성을 확인한 보고가 있었으나 분비효소의 양이 충분하지 못하며 에탄올 생성 효율이 낮고 외부효소를 공급해야 하는 문제가 여전히 존재하였다(M. Ilmen 등, 2011, Biotechnol Biofuels. 4: 30, 2011).
이에, 본 발명자들은 섬유소 분해효소를 효모를 이용하여 대량 분비 생산하기 위하여 본 발명자들이 보유한 기술인 효모 단백질 맞춤형 고분비 생산기술인 TFP(Translational fusion partner) 기술(대한민국 등록특허 제10-0626753호, 제10-0798894호, 제10-0975596호)를 이용하여 각 효소를 고분비 생산할 수 있는 기술을 개발하였다. 즉, 다수의 곰팡이 유전자로부터 효모에서 대량 분비가 가능한 섬유소 분해효소 단백질을 발굴하고 최적의 TFP를 이용하여 생산하고 섬유소 분해에 필수적인 효소군을 확보하였다. 상기 섬유소 분해에 필수적인 효소군으로 헤미셀룰라제(hemicellulase)로는 TrXynII ( Trichoderma reesei xylanase II), TrBxl (Trichoderma reesei beta- xylosidase )와 엑소글루카나제(exoglucanase)로는 PaCel1(Polyporus acularius Cel1 ), PaCel2 ( Polyporus acularius Cel2 ), TeCBH1(Talaromyces emersonii CBH1 ), NfCBH1 ( Neosartorya fischeri CBH1 ), HgCBH1(Humicola grisea CBH1 ), CtCBH1 ( Chaetomium thermophilum CBH1 ), ClCBH2 (Chrysosporium lucknowense CBH2 ), CfCex1 ( Cellulomonas fimi ), 엔도글루카나제(endo-glucanase)로는 TrEGL2 ( Trichoderma reesei EGL2 ), 그리고 베타글루코시다제(β-glucosidase)로는 개량된 SfBGL2 ( Saccharomycopsis fibuligera BGL2 )(대한민국 공개특허 제10-2013-0027984호)를 확보하였으며, 각 단백질을 인위적으로 혼합하여 섬유소 바이오매스 당화효소 칵테일인 KCC(KRIBB Cellulase cocktail) 시리즈를 제조하여 섬유소 바이오매스 당화의 효율을 높이고 최적의 맞춤형 당화효소를 제조함으로서 섬유소 당화 비용을 절감할 수 있게 하였다. 또한 섬유소 분해효소를 분비생산하는 각각의 재조합 효모를 복합적으로 사용하여 바이오매스 동시당화 바이오에탄올 생산공정에 적용함으로써 섬유소 바이오매스 당화 및 발효를 동시에 수행함으로써 섬유소 바이오에탄올 생산 공정비용을 절감할 수 있도록 하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 헤미셀룰라제 TrXynII , TrBxl와 엔도글루카나제 TrEGL2 , 베타글루코시다제 SfBGL2, 엑소글루카나제 PaCel1 , PaCel2 , TeCBH1 , NfCBH1 , HgCBH1, CtCBH1 , CfCex1 그리고 ClCBH2를 효모에서 대량생산하기 위한 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양상등액으로부터 헤미셀룰라제 TrXynII , TrBxl와 엔도글루카나제 TrEGL2, 엑소글루카나제 PaCel1 , PaCel2 , TeCBH1 , NfCBH1 , HgCBH1 , CtCBH1 , ClCBH2 , CfCex1 , 베타글루코시다제 SfBGL2를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 셀룰라제의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자일란(xylan) 분해능을 갖는 생산된 헤미셀룰라제를 생산균주를 복합배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생산된 셀룰라제를 적절한 비율로 혼합하여 바이오매스 맞춤형 셀룰라제 칵테일을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체들을 혼합한 복합균주를 이용하는 동시당화(SSF, simulatneous saccharification and fermentation) 또는 생물통합공정(CBP, consolidated bioprocessing) 바이오에탄올 발효 공정을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서, 본 발명은 재조합 헤미셀룰라제 TrXynII , TrBxl와 재조합 엑소글루카나제 PaCel1 , PaCel2 , TeCBH1 , NfCBH1 , HgCBH1, CtCBH1 , ClCBH2 , CfCex1와 재조합 엔도글루카나제 TrEGL2 , 재조합 베타글루코시다제 SfBGL2를 제공한다.
바람직하게, 본 발명의 헤미셀룰라제 TrXynII , TrBxl와 엔도글루카나제 TrEGL2는 트리코덜마 리세이(Trichoderma reesei)로부터 유래한 것일 수 있고, 엑소글루카나제 PaCel1, PaCel2는 폴리포루스 아르쿠라리우스(Polyporus arcularius)로부터 유래한 것일 수 있으며, 베타글루코시다제 SfBGL2 는 사카로마이콥스 피부리제라(Saccharomycopsis fibuligera)로부터 유래한 것일 수 있다. 또한, 엑소글루카나제 HgCBH1 , TeCBH1 , NfCBH1 , CtCBH1 , ClCBH2 , CfCex1은 각 순서대로 휴미콜라 그리세아(Humicola grisea), 탈라로미세스 이멀소니(Talaromyces emersonii), 네오살토르야 피쉐리(Neosartorya fischeri), 캐토미움 털모필리움(Chaetomium thermophilum), 크리소스포리움 룩노우웬세(Chrysosporium lucknowense), 그리고 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 트리코덜마 리세이(Trichoderma reesei)로부터 TrXynII, TrBxl , TrEGL2 서열정보를 바탕으로 유전자를 증폭하였고(실시예 1), 폴리포루스 아르쿠라리우스(Polyporus arcularius)의 2종의 엑소셀룰레이즈 유전자 Cel1 및 Cel2를 함유한 plasmid pCEL1 및 pCEL2로부터 엑소글루카나제 PaCel1 , PaCel2 유전자를 증폭하였으며 휴미콜라 그리세아(Humicola grisea), 탈라로미세스 이멀소니(Talaromyces emersonii), 네오살토르야 피쉐리(Neosartorya fischeri), 캐토미움 털모필리움(Chaetomium thermophilum), 그리고 크리소스포리움 룩노우웬세(Chrysosporium lucknowense)로부터 엑소글루카나제 HgCBH1 , TeCBH1 , NfCBH1 , CtCBH1, ClCBH2의 서열정보를 코돈 최적화(codon optimization)하여 유전자 합성을 통해 유전자를 확보하였다(실시예 1). KCTC 1436 균주로부터 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 유래의 CfCex1 유전자를 증폭하였다(실시예 1). 서열번호 1, 2로 표시되는 TrXynII , 서열번호 3, 4로 표시되는 TrBxl, 서열번호 5, 6으로 표시되는 TrEGL2 , 서열번호 7, 8로 표시되는 PaCel1 , 서열번호 9, 10으로 표시되는 PaCel2, 서열번호 11, 12로 표시되는 TeCBH1 , 서열번호 13, 14로 표시되는 NfCBH1, 서열번호 15, 16으로 표시되는 HgCBH1, 서열번호 17, 18로 표시되는 CtCBH1 , 서열번호 19, 20으로 표시되는 ClCBH2 , 서열번호 21, 22로 표시되는 CfCex1을 코딩하는 유전자를 클로닝 하였고(실시예 2), 상기 헤미셀룰라제와 엔도글루카나제, 엑소글루카나제를 코딩하는 유전자를 사카로마이세스 세레비지에에 균주를 도입하여 발현 시킨 결과, 각각의 효소가 세포 밖으로 분비됨을 확인하였다(실시예 2).
또 하나의 실시양태로서, 본 발명은 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 TrXynII, TrBxl, TrEGL2, PaCEL1, PaCel2, TeCBH1, NfCBH1, HgCBH1, CtCBH1, ClCBH2, CfCex1으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모에서 야생형 단백질에 비해 분비능이 증가된 단백질 발현용 발현카세트를 제공한다.
본 발명의 발현카세트에서
i) 상기 단백질로 TrXynII를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 53의 아미노산 서열을 가지는 TFP5, 서열번호 57의 아미노산 서열을 가지는 TFP9, 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 TFP13 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지는 TFP19로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
ii) 상기 단백질로 TrBxl를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 TFP4이며;
iii) 상기 단백질로 TrEGL2를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지는 TFP19이고;
iv) 상기 단백질로 PaCEL1를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 TFP13이며;
v) 상기 단백질로 PaCel2를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 TFP13이고;
vi) 상기 단백질로 TeCBH1를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 TFP4, 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 TFP6, 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 TFP7 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 가지는 TFP8로 이루어진 군에서 선택된 것이며;
vii) 상기 단백질로 NfCBH1를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 TFP13이고;
viii) 상기 단백질로 HgCBH1를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 TFP13이며;
ix) 상기 단백질로 CtCBH1를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 TFP7, 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지는 TFP19, 서열번호 47의 염기 서열을 가지는 자체 시그널 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지는 자체 시그널로 이루어진 군에서 선택된 것이고;
x) 상기 단백질로 ClCBH를 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 56의 아미노산 서열을 가지는 TFP8 또는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 TFP13 중 하나이며,
xi) 상기 단백질로 CfCex1을 선택한 경우, 상기 단백질 융합인자는 서열번호 56의 아미노산 서열을 가지는 TFP8, 서열번호 59의 아미노산 서열을 가지는 TFP11, 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 TFP13 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지는 TFP19 중 하나인 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, 단백질 융합인자란 발현율이 낮은 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 발현율이 낮은 단백질의 분비생산을 유도하는 펩타이드 및 이를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 본 발명에서 사용가능한 단백질 융합인자는 대한민국 등록특허 제10-0626753호, 제10-0798894호, 제10-0975596호에 개시되어 있다.
구체적으로는, 서열번호 49 내지 72로 이루어진 군에서 선택된 하나의 단백질 융합인자일 수 있으며, 이는 본 발명내에서 TFP1 내지 TFP24로 표현될 수 있다(표 3).
본 발명의 구체적 실시예에서는, 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 베타글루코시다제를 발현시키기 위하여 GAL10 프로모터 및 GAL7 터미네이터를 가지는 일반적 효모 발현 벡터인 YEp352 유래의 벡터에서 상기한 24개 TFP를 이용하여, 각 효소의 발현을 비교, 분석하였다. 그 결과, 각각의 융합인자로서 TrXynII의 경우 TFP5, TFP9, TFP13 및 TFP19, Bxl의 경우 TFP4, TrEGL2의 경우 TFP19, PaCel1의 경우 TFP13, PaCel2의 경우 TFP13, TeCBH1의 경우 TFP4, TFP6, TFP7 및 TFP8, NfCBH1의 경우 TFP13, HgCBH1의 경우 TFP13, CtCBH1의 경우 TFP19 및 자체 시그널 펩타이드, ClCBH2의 경우 TFP8 및 TFP13, CfCex1의 경우 TFP8, TFP11, TFP13 및 TFP19를 선택한 경우에 과량의 효소가 분비발현됨을 확인하였다(실시예 2, 3). 이를 반영하여 각각의 대표적 융합인자로 TrXynII의 경우 TFP5, Bxl의 경우 TFP4, TrEGL2의 경우 TFP19, PaCel1의 경우 TFP13, PaCel2의 경우 TFP13, TeCBH1의 경우 TFP8, NfCBH1의 경우 TFP13, HgCBH1의 경우 TFP13, CtCBH1의 경우 자체 시그널 펩타이드, ClCBH2의 경우 TFP13, CfCex1의 경우 TFP13을 선택하여 발현카세트를 제작하였으며, 이를 이용하여 발현벡터를 제작하였다.
또 하나의 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현카세트를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, 벡터란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산분자를 의미한다. 벡터의 하나의 유형인 플라스미드는 그 안에 추가적으로 DNA조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중가닥 DNA 루프를 의미한다.
본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 발현 벡터라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.
상기 발현벡터는 숙주세포에 따라, 사용가능한 발현벡터의 종류가 결정될 수 있는데, 효모를 숙주로서 사용하는 경우는 발현 벡터로서, 예를 들면 YEpl3, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등을 이용할 수 있다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다.
효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol ., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc . Natl . Acad . Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol ., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.
아울러, 상기 발현벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수도 있다. 특히, 상기 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자로서, 단백질융합인자(translational fusion partner : TFP)를 사용함이 바람직하다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 헤미셀룰라제, 셀룰라제, 베타글루코시다제 유전자의 도입효율과 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 세포를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 에탄올 발효능을 가지는 세포는 자이모모나스, 효모, 바실러스 일 수 있다. 보다 더 바람직하게 상기 에탄올 발효능을 가지는 세포는 Y2805(Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52) 균주일 수 있다.
상기 효모는 특별히 이에 제한되지 않으나, 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 아르술라(Arxula) 종을 포함하고, 보다 바람직하게는 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans) 등을 사용하며, 가장 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces maxianus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 효모 사카로마이세스 세레비지에를 본 발명의 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 사용하여 Y2805(Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52) 균주를 형질전환한 후, 상기 형질전환체로부터 각각의 효소가 생산되었음을 확인하였다(실시예 2).
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 또는 베타글루코시다제 생산방법을 제공한다. 바람직하게는 상기의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 또는 엑소글루카나제 생산방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환체를 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신)등을 포함할 수 있다. 배양 시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명의 일실시예는 상기 형질전환체를 30 YPDG(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 포도당, 1% 갈락토오스) 조건에서 배양하였다. 상기 형질전환체의 단백질 확인은 SDS-PAGE (Sodium Dodesys Sulfate Polyacryl Amide Gel Electrophoresis) 방법을 이용하여 수행하였다(도 2).
상기 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 베타글루코시다제를 회수하는 단계는 통상적인 생화학 분리 기술에 의하거나 단백질의 한 부분 또는 다른 부분에 대한 항체를 사용하는 면역친화적인 방법으로 분리, 정제할 수 있다. 또 다른 방법은 단백질 서열에 태그(tag)를 가하여, 항체 또는 이러한 태그에 대하여 적절하게 높은 친화성을 갖는 기타 물질을 이용하는 친화 방법에 의해 정제할 수도 있다. 통상적인 생화학 분리 기술로는 단백질 침전제의 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 있고, 통상적으로 이들을 조합, 사용하여 순도가 높은 단백질을 분리할 수 있다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 단계에서 수득한 배양물 또는 배양 상등액으로부터 바이오에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법을 제공한다. 본 발명에서 형질전환체를 배양하는 단계는 상기 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, "바이오 에탄올"이란 바이오매스 안에 있는 탄수화물을 포도당(glucose, 글루코스)로 전환한 후, 이에 발효를 통해 수득하는 에탄올을 의미한다. 화석연료와달리 환경오염물질이 전혀 없고, 식물로부터 연료를 얻기 때문에 재생이 가능한 에너지원이다. 차량 등의 연료 첨가제로 바이오 디젤과 함께 일찍부터 널리 사용되어 왔으며, 현재도 계속적으로 대량 생산에 대한 연구가 계속되고 있다.
본 발명에서 바이오에탄올을 회수하는 단계는 당업계에서 널리 쓰이는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 증류 등의 방법이 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 2 종 이상 포함하는 복합 균주를 제공한다. 상기 2종 이상은 각기 상이한 단백질을 암호화하는 발현벡터를 포함하는 형질전환체 2종 이상을 포함하는 것을 의미한다.
특히, 상기 복합 균주는 헤미셀룰라제 효소를 분비하는 균주를 하나 이상 포함하는 것일 수 있다. 상기 헤미셀룰라제 효소는 엔도자일라나제와 베타자일로시다제일 수 있다. 특히, 엔도자일라나제는 TrXynII일 수 있으며, 베타자일로시다제는 TrBxl일 수 있다. 본 발명의 복합 균주는자일란 분해능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 엔도자일라나제와 베타자일로시다제를 생산하는 효모 균주를 복합 배양 시 자일란(xylan)을 탄소원으로 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 TrXynII를 발현하는 균주와 TrBxl를 발현하는 균주, 두 가지 균주를 복합 배양하였다. 그 결과 두 균주의 복합배양을 통해 생산된 두 가지 효소의 단계적인 작용을 통해 자일란으로부터 자일로스를 확보할 수 있음을 확인하였다(실시예 5).
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 베타글루코시다제와 회수한 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제를 포함하는, 셀룰라제 칵테일(KCC)을 제공한다. 특히 상기 엔도글루카나제는 엔도셀룰라제일 수 있으며, 상기 엑소글루카나제는 엑소셀룰라제일 수 있다.
또한, 상기 베타글루코시다제는 서열번호 74의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 특히, 서열번호 73의 염기서열로부터 암호화되는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명에서 개발된 엑소셀룰라제 분비생산 효모를 이용하여 엑소셀룰라제를 발효농축 후 셀룰로스 기질을 탄소원으로 사용하여 각 기질의 분해능을 비교하였다. 활성 개량에 사용한 모든 셀룰라제 칵테일은 엑소셀룰라제 타입1 (CBH1), 엑소셀룰라제 타입2 (CBH2), 엔도셀룰라제 (EGL), 베타글루코시다제 (BGL)의 비율을 3.5 : 3.5 : 2 : 1로 고정하여 분석에 이용하였고, 칵테일에 사용한 EGL은 ST19-TrEGL2 효소이며, BGL은 ST19-SfBGL2 효소를 사용하였다. EGL, BGL에 비수용성 셀룰로스 조건에서 활성이 좋았던 ST13-PaCel1과 ST13-PaCel2를 상기의 비율로 섞어서 KCC-1으로 정하고, EGL, BGL에 ST13-HgCBH1과 ST13-ClCBH2를 상기의 비율로 섞어서 KCC-2로 정하고, EGL, BGL에 self signal-CtCBH1과 ST13-ClCBH2를 상기의 비율로 섞어서 KCC-3로 정하였으며, EGL, BGL에 ST13-CfCex1과 ST13-ClCBH2를 상기의 비율로 섞어서 KCC-4로 명명하여 셀룰라제 칵테일을 제조하였다.
본 발명에 따른 발현벡터로 형질전환된 효모 형질 전환체를 복합배양하여 동시당화 또는 생물통합공정에 적용하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 헤미셀룰라제를 포함하는, 셀룰라제 칵테일을 제공한다. 상기 칵테일은, 엔도자일라나제와 베타자일로시다제를 포함하는 것일 수 있으며, 특히, 상기 엔도자일라나제는 TrXynII 단백질이고, 상기 베타자일로시다제는 TrBxl일 수 있다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 셀룰라제 칵테일을 이용하여 바이오매스를 당화하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 바이오매스는 셀룰로스일 수 있으며, 자일란일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 베타글루코시다제와 회수한 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제를 포함하는, 셀룰라제 칵테일을 이용하여 셀룰로스를 당화할 수 있음을 확인하였다(실시예 6).
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 균주를 복합배양하여 동시당화 또는 생물통합공정에 적용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 4종의 재조합 셀룰라제 분비생산 효모 균주 복합체 KCC-1과 KCC-2를 이용하여 바이오매스로부터 직접 바이오에탄올을 생산할 수 있는 복합 균주로 사용될 수 있음을 확인하였으며(실시예 7), KCC3의 복합 균주를 에탄올 생산에 적용할 경우 최소량의 상용화된 셀룰라제를 이용하여 바이오매스로부터 동시당화공정으로 에탄올 생산이 가능함을 확인하였다(실시예 8).
본 발명은 재조합 생산된 헤미셀룰라제와 셀룰라제를 이용하여 섬유소 당화효소 칵테일을 제조하고 각 효소를 생산하는 재조합 효모 복합 균주를 활용하여 동시당화를 수행하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 상기 헤미셀룰라제로는 TrXynII ( Trichoderma reesei xylanase II), TrBxl ( Trichoderma reesei beta-xylosidase)와 엑소글루카나제로는 PaCel1 ( Polyporus acularius Cel1), PaCel2(Polyporus acularius Cel2 ), TeCBH1 ( Talaromyces emersonii CBH1 ), NfCBH1(Neosartorya fischeri CBH1 ), HgCBH1 ( Humicola grisea CBH1 ), CtCBH1(Chaetomium thermophilum CBH1 ), ClCBH2 ( Chrysosporium lucknowense CBH2 ), CfCex1(Cellulomonas fimi CBH1 ), 엔도글루카나제로는 TrEGL2( Trichoderma reesei EGL2), 그리고 베타글루코시다제로 개량된 SfBGL2 ( Saccharomycopsis fibuligera BGL2)를 효모를 이용하여 각각 재조합 분비생산하고 분비된 각 단백질을 인위적으로 혼합하여 섬유소 바이오매스 맞춤형 당화효소 칵테일을 제조하여 섬유소 바이오매스 당화의 효율을 높이고 최적의 당화효소를 제조함으로서 섬유소 당화 비용을 절감할 수 있다. 또한 섬유소 분해효소를 분비생산하는 상기 재조합 효모 균주를 복합 균주로 활용하여 바이오매스 동시당화 바이오에탄올 생산공정에 적용하여 바이오매스 당화 및 발효 효율을 높이고 섬유소 바이오에탄올 생산 공정비용을 절감하는 내용이다.
본 발명에서 제공하는 셀룰라제 발현벡터를 이용하면 효모 사카로마이세스 세레비지아에서 셀룰라제의 대량생산이 가능하며 상기균주는 동시당화 또는 생물통합공정에 적용이 가능하기 때문에 목질계 바이오매스로부터 바이오 에탄올 제조 등의 산업공정에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 트리코덜마 리제이 유래의 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제 유전자 와 폴리포루스 아르쿠라리우스, 탈라로미세스 이멀소니, 네오살토르야 피쉐리, 휴미콜라 그리세아, 캐토미움 털모필리움, 크리소스포리움 룩노우웬세, 셀룰로모나스 피미 유래의 엑소셀룰라제 유전자의 효모 TFP 벡터 도입을 위한 중합효소 연쇄반응(PCR) 및 세포 내 재조합과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 효모 Y2805균주에 TrXynII(A), TrBxl(B)(도 2a), TrEGL2(C), PaCel1(D)(도 2b), PaCel2(E), TeCBH1(F)(도 2c), NfCBH1(G), HgCBH1(H)(도 2d), CtCBH1(I), ClCBH2(J) 또는 CfCex1(K)(도 2e)가 도입되어 형성된 24개 형질전환체들의 배양 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 3은 선별된 형질전환체에서 발현된 TrXynII(A), TrBxl(B), TrEGL2(C), PaCel1(D)(도 3a), PaCel2(E), TeCBH1(F), NfCBH1(G), HgCBH1(H)(도 3b), CtCBH1(I), ClCBH2(J) 또는 CfCex1(K)(도 3c) 단백질의 당쇄를 제거하기 위해 당쇄제거효소인 엔도-에이치(Endo-H) 처리 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4는 선별된 형질전환체에서 발현된 TrXynII(A)와 TrBxl(B)를 MF 또는 자체시그널을 이용하여 발현한 경우와 상대적인 단백질 발현량과 활성을 비교하기 위해 SDS-PAGE 분석과 활성 분석한 결과이다.
도 5는 TrEGL2 발현 형질전환체를 카르복시메틸 셀룰로즈(carboxymethyl cellulose, CMC)가 포함된 YP(2% yeast extract+2% peptone)배지에서 콩고 레드(congo-red)로 염색하여 환의 크기로 엔도글루카나제 활성을 비교한 결과이다.
도 6은 최종 선별한 ST13-PaCel1, ST19-TrEGL2, ST13-PaCel1, ST8-TeCBH1, ST13-NfCBH1, ST13-HgCBH1, 자체시그널-CtCBH1, ST13-ClCBH2 각 형질전환체를 MF 또는 자체시그널을 가지는 형질전환체의 상대적인 단백질 발현량을 비교해보고(도 6a의 A, B), ST8-TeCBH1, ST13-NfCBH1, ST13-HgCBH1, 자체시그널-CtCBH1, ST13-ClCBH2 각 형질전환체를 MF 또는 자체시그널을 가지는 형질전환체의 상대적인 활성을 비교하기 위해 pNPC, pNPL, Avicel 활성 분석한 결과이다(도 6b의 C, D).
도 7은 ST5-TrXynII(A), ST4-TrBxl(B), ST19-TrEGL2(C), ST13-PaCel1(D)(도 7a), ST13-PaCel2(E), ST8- TeCBH(F), ST13-NfCBH1(G), ST13-HgCBH1(H)(도 7b), self-signal-CtCBH1(I), ST13-ClCBH2(J), CfCex1(K)(도 7c) 유전자의 발현 벡터를 나타내는 모식도이다.
도 8는 ST5-TrXynII(A), ST4-TrBxl(B)(도 8a), ST19-TrEGL2(C), ST13-PaCel1(D)(도 8b), ST13-PaCel2(E), ST8 - TeCBH(F)(도 8c), ST13-NfCBH1(G), ST13-HgCBH1(H)(도 8d), self-signal-CtCBH1(I), ST13-ClCBH2(J), ST19-SfBGL2(K), CfCex1(L)(도 8e) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효하여 시간별로 취한 배지를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진 및 각 시간별 세포 농도 및 효소활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 최종 선별한 ST5-TrXynII, ST4-TrBxl 각 형질전환체를 복합배양 시 세포 성장 및 효소활성(도 9a의 A)과 각 형질전환체를 단일 배양 및 복합 배양 시 세포의 성장을 비교하고, 자일라나제 생산 균주의 배양배지와 복합 배양 시의 배양배지 내 물질을 HPLC로 분석한 결과(도 9b의 B)이다.
도 10는 탄소원에 따른 재조합 복합 균주 KCC-1과 KCC-2의 성장을 비교(A)하고, 복합균주 배양 후의 분비 단백질을 SDS-PAGE(B)로 분석한 결과이다.
도 11은 복합균주 KCC-1과 KCC-2를 50℃에서 당화 효율 비교해 보기 위하여 144시간 반응하여 HPLC 분석을 통해 생성된 포도당을 확인한 결과이다.
도 12은 전처리한 볏짚 10%를 기질로 사용하고 2, 5, 10 FPU/g mass의 셀룰라아제로 당화 후 복합균주 KCC-2와 대조구 균주(Y2805△gal80/CYH)를 첨가하여 에탄올 발효를 수행한 결과이다.
도 13는 전처리한 볏짚 3, 5%를 기질로 사용하고 2, 5 FPU/g mass의 셀룰라아제에 복합균주 KCC-3와 대조구 균주(Y2805△gal80/CYH)를 첨가하여 에탄올 발효를 수행한 결과이다.
도 14는 5L 발효조를 이용하여 전처리한 볏짚 6 %를 기질로 사용하고 2 FPU/g cellulose의 셀룰라아제에 복합균주 KCC-3(Y2805△gal80에 ST19-BGL, ST19-EGL2, self signal-CtCBH1, ST13-ClCBH2)와 대조구 균주(Y2805△gal80/CYH)를 첨가하여 에탄올 발효를 수행한 결과이다.
이하 본 발명은 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 사용 균주 및 실험 재료
효모 기반 헤미셀룰라제 , 엔도글루카나제 , 엑소글루카나제와 베타글루코시다 제 유전자 확보
Trichoderma reesei 유래의 엔도자일라나제(endo-xylanase) TrXynII(서열번호 1, 2)와 베타자일로시다제(beta-xylosidase) TrBxl (서열번호 3, 4), 엔도글루카나제(endo-glucanase) TrEGL2 (서열번호 5, 6) 유전자를 활용하기 위하여 미국국립생물정보센터(NCBI)의 염기서열 정보를 이용하였다. 트리코덜마 리제이는 생물자원센터로부터 분양받은 균주(KCTC 6968)를 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, Difco)에서 5일간 25℃에서 배양하였고, 배양을 마친 곰팡이 균사체만을 필터하여 회수한 후 T.H. Al-Samarrai의 곰팡이 지놈 DNA 추출방법(T.H. Al-Sammarrai 등, 2000, Letters in Applied Microbiology, 30, 53-56)을 사용하였다.
TrXynII 유전자를 클로닝하기 위해 추출된 지놈 DNA 시료 1를 주형으로 센스 프라이머 Trxyn_F(서열번호 23)와 안티센스 프라이머 Trxyn_R(서열번호 24)을 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 3분간 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였고, TrBxl 유전자를 클로닝하기 위해 추출된 지놈 DNA 시료 1를 주형으로 센스 프라이머 Trbxl_F(서열번호 25)와 안티센스 프라이머 Trbxl_R(서열번호 26)을 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간, 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였으며, 아가로스젤 전기영동을 통해 약 2.4kb, 600bp의 절편을 회수하였다.
TrEGL2 유전자를 클로닝하기 위해 분양받은 트리코덜마 리제이 균주를 YM(Difco)에 1% 카르복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose, CMC)를 첨가한 배지에서 3일간 150rpm으로 25℃에서 배양하였고, 배양을 마친 곰팡이 균사체만을 필터하여 회수한 후 Total RNA 추출 kit (RNeasy Plant Mini kit, Qiagen)를 사용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA로부터 mRNA 정제 kit (Oligotex mRNA Mini Kit, Qiagen)를 사용하여 폴리아데닐화된 mRNA를 분리하였다. 상기 분리한 mRNA는 SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit (Clontech)를 사용하여 RACE 법에 의해 cDNA를 증폭하였다. 합성된 cDNA 시료 1를 주형으로 센스 프라이머 TrEGL2_F(서열번호 27)와 안티센스 프라이머 TrEGL2_R(서열번호 28)을 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분 30초간, 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였고, 아가로스젤 전기영동을 통해 약 1200bp의 절편을 회수하였다. 중합효소연쇄반응 산물을 pGEM-T Easy vector(Promega)에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 TrXynII과 TrBxl , TrEGL2 유전자 서열(각각 서열번호 1, 3, 5)을 확인하였다.
프라이머 서열 서열번호
Trxyn_F 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGATCTTGCCGTCCCGCCGCC-3' 23
Trxyn_R 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTAGCTGACGGTGATGGA-3' 24
Trbxl_F 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGACAGAACAATCAAACATAC-3' 25
Trbxl_R 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTATGCGTCAGGTGTAGC-3' 26
TrEGL2_F 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGACAGCAGACTGTCTGGGGC-3' 27
TrEGL2_R 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACCTTTCTTGCGAGACACGAG-3' 28
NCBI 염기 서열 정보를 이용하여 Polyporus arcularius 유래의 PaCel1(서열번호 7, 8)과 PaCel2(서열번호 9, 10) 유전자를 활용하기 위하여 벡터 pCEL1 및 pCEL2 1μL를 주형으로 각각 센스/안티센스 프라이머 Cel1_F(서열번호 29)/Cel1_R(서열번호 30), Cel2_F(서열번호 31)/Cel2_R(서열번호 32)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분 30초간, 72℃ 1분 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였고, 아가로스젤 전기영동을 통해 각각 약 1.3kb, 1.3kb의 절편을 확보하였다.
곰팡이 Talaromyces emersonii , Neosartorya fischeri , Humicola grisea , Chaetomium thermophilum 유래의 각 CBH1인 TeCBH1(서열번호 11, 12), NfCBH1(서열번호 13, 14), HgCBH1(서열번호 15, 16), CtCBH1(서열번호 17, 18)과 Chrysosporium lucknowense 유래 CBH2인 ClCBH2(서열번호 19, 20) 유전자를 활용하기 위하여 NCBI의 염기서열 정보를 이용하였다. 각 다섯 종류의 엑소글루카나제 유전자는 바이오니어(Bioneer)사를 통하여 효모의 코돈 최적화 과정을 거쳐 인공적으로 합성하였다. pGEM-T Easy 벡터에 들어있는 각 TeCBH1, NfCBH1, HgCBH1, CtCBH1, ClCBH2 합성 유전자 시료를 주형으로 각각 센스/안티센스 프라이머 CR244(서열번호 33)/ CR246(서열번호 34), CR247(서열번호 35)/CR249(서열번호 36), CR250(서열번호 37)/CR252(서열번호 38), CR253(서열번호 39)/CR255(서열번호 40), CR256(서열번호 41)/CR258(서열번호 42)을 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였고, 아가로스젤 전기영동을 통해 각각 약 1.3kb, 1.5kb, 1.5kb, 1.5kb, 1.4kb의 절편을 확보하였다. Cellulomonas fimi 유래 CBH1인 CfCex1(서열번호 21. 22) 유전자를 이용하기 위하여 NCBI 연기 서열을 토대로 KCTC 1436 균주의 genomic DNA를 주형으로 센스/안티센스 프라이머 CR158(서열번호 43)/CR159(서열번호 44)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였고, 아가로스젤 전기영동을 통해 약 1.3kb의 절편을 확보하였다.
사카로마이콥스 피부리제라(Saccharomycopsis fibuligera) 유래의 베타글루코시다제는 기존 유전자를 개량하여 Y2805△gal80 균주에 도입된 ST19-SfBGL2(대한민국 공개특허; 제10-2013-0027984호) 균주를 그대로 발현하여 사용하였다.
목적
단백질		 프라이머 서열 서열번호
PaCel1 Cel1_F 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGACAGCAAGTGGGCACGCTC-3' 29
Cel1_R 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTAGGAGGTGAAGGAGG-3' 30
PaCel2 Cel2_F 5'-CAGGCTCCCGTGTACGGCTCGCCTTAGATAAAAGA-3' 31
Cel2_R 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTACAGCGGCGGGTTCG-3' 32
TeCBH1 CR244 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGACAACAAGCAGGCACTGCAACG-3' 33
CR246 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTACGAAGCGGTAAAGGTCG-3' 34
NfCBH1 CR247 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGACAACAGGTCGGTACTTCC-3' 35
CR249 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTACAGGCATTGAGAGTAAAAG-3' 36
HgCBH1 CR250 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGACAGCAAGCGTGTAGTCTCACC-3' 37
CR252 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTACAAACATTGAGAGTACC-3' 38
CtCBH1 CR253 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGACAACAAGCGTGTTCCCTC-3' 39
CR255 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTACAGACACTGAGAATACC-3' 40
ClCBH2 CR256 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGAGCACCAGTAATAGAAGAAAGAC-3' 41
CR258 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTTAGAATGGTGGATTTGCG-3' 42
CfCex1 CR158 5'-CTCGCCTTAGATAAAAGAGCGACCACGCTCAAGGAG-3' 43
CR159 5'-CACTCCGTTCAAGTCGACTCAGCCGACCGTGCAGG-3' 44
실시예 2: 단백질 융합인자 ( TFP ) 도입을 통한 헤미셀룰라제 , 엔도글루카나제 , 엑소 글루카나제의 분비 생산
실시예 1에서 확보한 두 종류의 헤미셀룰라제와 한 종류의 엔도글루카나제, 일곱 종류의 엑소글루카나제 유전자를 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 발현하기 위하여 각각의 유전자로부터 프라이머 LNK39(서열번호 45)와 GT50R(서열번호 46)로 증폭한 후 단백질 분비발현을 도와주는 24종의 단백질 분비 융합인자(대한민국 등록특허 제10-0975596호, TFP1 내지 TFP24)벡터에 in vivo recombination을 통하여 Y2805(Mat a pep4 :: HIS3 prb1 can1 his3 -200 ura3 -52)균주에 도입하였다. TFP1 내지 TFP24의 서열은 하기와 표 3과 같다.
TFP
No.		 서열 서열번호
1 MFNRFNKFQAAVALALLSRGALGDSYTNATSSADLSSITSVSSASASATASDSLSSSDGTVYLPSTTISGDLTVTGKVIATEAVEVAAGGKLTLLDGEKYVFSSD 49
2 MTPYAVAITVALLIVTVSALQVNNSCVAFPPSNLRGKNGDGTNEQYATALLSIPWNGPPESLRDINLIELEPQVALYLLENYINHYYNTTRDNKCPNNHYMGGQLGSSSDNRSLND 50
3 MQFKNVALAASVAALSATASAEGYTPGEPWSTLTPTGSISCGAAEYTTTFGIAVQAITSSKAKRDVISQIGDGQVQATSAATAQATDSQAQATTTATPTSSEKI 51
4 MRFAEFLVVFATLGGGMAAPVESLAGTQRYLVQMKERFTTEKLCALDDKI 52
5 MFNRFNKFQAAVALALLSRGALGAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVAASA 53
6 MTPYAVAITVALLIVTVSAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVAASA 54
7 MQFKNVALAASVAALSATASAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVAASA 55
8 MRFAEFLVVFATLGGGMAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLSFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVAASA 56
9 MVFGQLYALFIFTLSCCISKTVQADSSKESSSFISFDKESNWDTISTISSTADVISSVDSAIAVFEFDNFSLLDNLMIDEEYPFFNRFFANDVSLTVHDDSPLNISQSLSPIMEQFTVDELPESASDLLYEYSLDDKSIVLFKFTSDAYDLKKLDEFIDSCLSFLEDKSGDNLTVVINSLGWAFEDEDGDDEYATEETLSHHDNNKGKEGDDLAASA 57
10 MNWLFLVSLVFFCGVSTHPALAMSSNRLLKLANKSPKKIIPLKDSSFENILAPPHENAYIVALFTATAPEIGCSLCLELESEYDTIVASWFDDHPDAKSSNSDTSIFFTKVNLEDPSKTIPKAFQFFQLNNVPRLFIFKLNSPSILDHSVISISTDTGSERMKQIIQAIKQFSQVNDFSLHLPVGLAASA 58
11 MKLSTVLLSAGLASTTLAQFSNSTSASSTDVTSSSSISTSSGSVTITSSEAPESDNGTSTAAPTETSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTALPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTGLPTNGTTSAFPPTTSLPPSNTTTTPPYNPSTDYTTDYTVVTEYTTYCPEPLAASA 59
12 MASFATKFVIACFLFFSASAHNVLLPAYGRRCFFEDLSKGDELSISFQFGDRNPQSSSQLTGDFIIYGPERHEVLKTVRELAASA 60
13 MKFSTAVTTLISSGAIVSALPHVDVHQEDAHQHKRAVAYKYVYETVVVDSDGHTVTPAASEVATAATSAIITTSVLAPTSSAAAGIAASIAVSSAALAKNEKISDAAASATASTSQGASSSSLAASA 61
14 MQFKNALTATAILSASALAANSTTSIPSSCSIGTSATATAQATDSQAQATTTAPLAASA 62
15 MVSKTWICGFISIITVVQALSCEKHDVLKKYQVGKFSSLTSTERDTPPSTTIEKWWINVCEEHNVEPPEECKKNDMLCGLTDVILPGKDAITTQIIDFDKNIGFNVEETESALTLTLNGATWGANSFDAKLEFQCNDNMKQDELAASA 63
16 MKLSALLALSASTAVLAAPAVHHSDNHHHNDKRAVVTVTQYVNADGAVVIPAATTATSAAADGKVESVAAATTTLSSTAAAATTLAASA 64
17 MKFSSVTAITLATVATVATAKKGEHDFTTTLTLSSDGSLTTTTSTHTTHKYGKFNKTSKSKTPWAASA 65
18 MQFKNALTATAILSASALANSTTSIPSSCSIGTSATATAQADLDKISGCSTIVGNLTITGDLGSAALASIQEIDGSLTIFNSSSLSSFSADSIKKITGDLNMQELIILTSASFGSLQEVDSINMVTLPAISTFSTDLQNANNIIVSDTTLESVEGFSTLKKVNVFNINNNRYLNSFQSSLESVSDSLQFSSNGDLAASA 66
19 MVSKTWICGFISIITVVQALSCEKHDVLKKYQVGKFSSLTSTERDTPPSTTIEKWWINVCEEHNVEPPEECKKNDMLCGLTDVILPGKDAITTQIIDFDKNIGFNVEETESALTLTLKGATWGANSFDAKLEFQCNDNMKQDELAASA 67
20 MLFKSLSKLATAAAFFAGVATADDVPAIEVVGNKFFYSNNGSQFYIRGVAYQADTANETSGSTVNDPLANYESCSRDIPYLKKLNTNVIRVYAINTTLDHSECMKALNDADIYVIADLAAPATSINRDDPTWTVDLFNSYKTVVDTFANYTNVLGFFAGNEVTNNYTNTDASAFVKAAIRDVLAASA 68
21 MLQSVVFFALLTFASSVSAIYSNNTVSTTTTLAPSYSLVPQETTISYADDLAASA 69
22 MQYKKTLVASALAATTLAAYAPSEPWSTLTPTATYSGGVTDYASTFGIAVQPISTTSSASSAATTASSKAKRAASQIGDGQVQAATTTASVSTKSTAAAVSQIGDGQIQATTKTTAAAVSQIGDGQIQATTKTTSAKTTAAAVSQISDGQIQATTTTLAPLAASA 70
23 MRAITLLSSVVSLALLSKEVLATPPACLLACVAQVGKSSSTCDSLNQVTCYCEHENSAVKKCLDSICPNNDADAAYSAFKSSCSEQNASLGDSSGSASSSVLAASA 71
24 MKLSTVLLSAGLASTTLAQFSNSTSASSTDVTSSSSISTSSGSVTITSSEAPESDNGTSTAAPTETSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTALPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTGLPTNGTTSAFPPTTSLPPSNTTTTLAASA 72
LNK39(서열번호 45)와 GT50R(서열번호 46) 프라이머로 증폭한 중합효소 연쇄반응 산물은 40base이상의 벡터와 동일한 서열을 포함하고 있기 때문에 선형화된 벡터와 함께 효모세포로 도입하면 세포내에서 교차가 일어나서 원형의 플라스미드 벡터가 만들어지게 된다(도 1). 각각의 형질전환체는 우라실이 없는 선택배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.77% 우라실이 결핍된 영양보충물, 2% 포도당)에서 선별되고 YPDG(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 포도당, 1% 갈락토오스) 배지에서 40시간 배양 후 상등액 0.6ml을 0.4ml의 아세톤으로 2시간 동안 침전시킨 후 SDS-PAGE 분석하고 엔도자일라나제, 베타자일로시나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제의 분비량이 많은 균주를 1차 선별하였다(도 2a 내지 도 2e).
결과에서 보는 바와 같이 각각의 벡터를 함유한 균체의 배양 상등액에서 단백질의 크기가 서로 다른 강한 밴드들이 관찰되었다. 그러나 SDS-PAGE 상에서 나타난 밴드는 TrXynII, TrBxl, TrEGL2, PaCEL1, PaCel2, TeCBH1, NfCBH1, HgCBH1, CtCBH1, ClCBH2, CfCex1 유전자들의 크기로부터 유추되는 단백질 크기와 상당한 차이가 있었는데, 이는 이들 단백질 서열상에는 위의 순서대로 각 10개, 2개, 1개, 1개, 2개, 2개, 1개, 1개, 3개, 1개, 4개의 N-글리코실화 유발서열을 함유하고 있어 당쇄부가로 인한 차이일 것으로 추정된다. 24개의 형질전환체 중 각각 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 단백질로 추정되는 크기의 밴드 발현이 높은 형질전환체를 선택했고, 선택된 형질전환체를 N-글리코실화에 의해 단백질에 부가된 당을 제거하기 위해서 각 단백질에 엔도에이치(Endo-H) 효소를 처리한 후 다시 SDS-PAGE(도 3a 내지 도 3c) 분석을 하였다. 예상한 바와 같이 엔도에이치 처리 후 정상적인 크기의 분자량으로 확인된 것으로 보아, 발현된 단백질이 N-글리코실화되어 있음을 확인하였다.
실시예 3: 사카로마이세스 세레비지아에 균주에 분비발현을 통한 헤미셀룰라 제, 엔도글루카나제 , 엑소글루카나제의 활성 확인
각각의 형질전환체로부터 분비된 단백질의 활성을 확인하기 위하여 아래에 언급한 각 단백질 별 활성분석법을 이용하였다.
3-1. 분비된 TrXynII 단백질의 엔도자일라나제 활성 확인
분비된 TrXynII 단백질의 활성을 확인하기 위하여 DNS(dinitirosalicylic acid) 정량법 (Miller, G.L., Anal. Chem, 55:952-959,1959)를 사용하였다. 100㎕의 효소용액에 100㎕ 기질용액(1% opt spelt xylan이 포함된 100mM 인산칼륨용액, pH5.0)을 넣고 60℃에서 30분간 반응 후 700㎕의 DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가하여 100℃에서 5분간 처리한 뒤 찬물로 냉각시킨 후 540nm 흡광도에서 측정하였다. 엔도자일라나제 활성분석 결과(표 4), TFP5에 의하여 발현된 TrXynII 효소의 활성이 74.61 unit/㎖로 가장 높은 활성을 나타내었다. 효소의 1유닛(unit, U)은 1분 동안 1μmol의 환원당을 방출시키는 효소의 양으로 정하였다.
TFP No. Endo-xylanase activity (unit/ml)
1 58.92
5 74.61
8 65.74
9 72.63
13 73.80
19 72.56
3-2. 분비된 TrBxl 단백질의 β- 자일로시다제 활성
분비된 TrBxl 단백질의 활성을 확인하기 위하여 분비된 단백질의 활성을 확인하기 위하여 0.1mL의 효소 용액을 0.9ml의 기질용액(100mM 인산나트륨 완충용액(pH7.0), 1mM의 p-나이트로페닐 자일로피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside; pNPX)과 50℃에서 10분간 반응하였다. 반응용액과 동량의 0.4M 탄산 나트륨을 첨가해 반응을 멈추고, 405nm에서 흡광도를 측정한 결과(표 5), TFP4에 의하여 발현된 TrBxl 효소의 활성이 25.38 unit/ml으로 가장 높았다. 이때, 효소 활성은 1분에 1M의 p-나이트로페놀(p-Nitrophenol)을 생성할 수 있는 효소량을 1 유닛(unit, U)으로 정하였다.
TFP No. β-xylosidase activity (unit/ml)
4 25.38
6 10.77
8 18.46
9 11.54
13 9.23
19 11.54
단백질 발현율과 그에 따른 활성을 비교하여 각 형질전환체가 각 융합인자의 통제 하에 단백질 발현율과 활성이 가장 높은 사카로마이세스 세레비지에 균주 ST5-TrXynII, ST4-TrBxl을 최종 선택하였고, 각 형질전환체는 MF 또는 자체시그널을 가지는 형질전환체의 상대적인 단백질 발현량과 활성을 비교하기 위해 SDS-PAGE 분석과 활성 분석하였다(도 4).
3-3. 분비된 TrEGL2 단백질의 엔도글루카나제 활성
분비된 엔도글루카나제 TrEGL2 단백질의 활성을 확인하기 위하여 카르복시메틸 셀룰로즈(carboxymethyl cellulose, CMC)가 2% 포함된 YP(2% yeast extract+2% peptone)배지에 형질전환된 세포를 30℃에서 3일간 배양하고 배양 플레이트를 0.1% 콩고 레드(congo-red)로 한 시간 염색한 후 1M NaCl로 여러 차례 씻어낸 뒤 엔도글루카나제가 형질전환된 세포에서의 활성을 세포 주변의 환의 크기로 확인하였고(도 5), 정량적 확인을 위해 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)를 이용한 비색 정량 방법을 사용하였다. 100mM 포스페이트 완충용액(pH 6.0)과 1% CMC 150ul가 조합된 반응액에 50ul의 배양상층 희석액을 첨가한 후, 45℃에서 30분간 반응하고 DNS를 700ul 넣어 10분간 끓인 후 식혀 550 nm에서 흡광도를 측정하여 비색 정량하였고 그 결과는 표 6와 같다. TFP13-TrEGL2는 반응 0시간 때의 환원당 수치가 반응 이후의 환원당 값보다 높아서 활성을 측정할 수 없었고, TFP19-TrEGL2가 0.38 unit/ml로 가장 높은 활성을 나타내었다. 이때 효소 활성은 1분에 1 g의 환원당을 생성할 수 있는 효소량을 1 유닛(unit, U)으로 정하였다.
단백질 발현율과 그에 따른 활성을 비교하여 각 형질전환체가 각 융합인자의 통제 하에 단백질 발현율과 활성이 가장 높은 사카로마이세스 세레비지에 균주 ST19-TrEGL2를 최종 선택하였고, 각 형질전환체는 MF 또는 자체시그널을 가지는 형질전환체의 상대적인 단백질 발현량을 비교하였다(도 6a의 A).
TFP No. Endo-glucanase activity (unit/ml)
5 0.17
9 0.22
13 -
19 0.36
3-4. 분비된 PaCel1 과 PaCel2 단백질의 엑소글루카나제 활성
분비된 PaCel1과 PaCel2 엑소글루카나제 단백질의 활성을 확인하기 위하여 형질전환체를 3 YPDG에서 40시간 배양 후 배양 상등액을 활성 확인에 사용하였다. 50mM 아세트산 완충용액(pH 5.0)에 1 mg/ml의 pNPC (p-Nitrophenyl-beta-cellobioside)와 델타 글루코노 락톤(D-Glucono-1,5-delta-lactone)을 0.5 mg/ml로 녹인 반응액 900 ul와 배양상층 희석액 100 ul를 섞어 50℃에서 30분간 반응하였다. 반응 용액과 동량의 2% 탄산 나트륨을 첨가하고, 410 nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과, PaCel1은 pNPCdp 대한 활성이 없었고 TFP13-PaCel2의 경우에만 1.7 unit/ml의 약한 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 7). 이 때 대조구는 형질전환하지 않은 사카로마이세스 세레비지에 균주 Y2805이다. 이때 효소 활성은 1분에 1 M의 니트로페놀을 생성할 수 있는 효소량을 1 유닛(unit, U)으로 정하였다.
단백질 발현율과 그에 따른 활성을 비교하여 각 형질전환체가 각 융합인자의 통제 하에 단백질 발현율과 활성이 가장 높은 사카로마이세스 세레비지에 균주 ST13-PaCel1과 ST13-PaCel2를 최종 선택하였고, 각 형질전환체는 MF 또는 자체시그널을 가지는 형질전환체의 상대적인 단백질 발현량을 비교하였다(도 6a의 A).
PaCel2 활성분석 결과
TFP No. Exo-glucanase activity (unit/ml)
5 0.4
8 1.7
9 1.1
13 1.7
19 1.3
대조구 0
3-5. 엑소글루카나제 활성 분석
나머지 여섯 종류의 엑소글루카나제 활성을 분석하기 위하여 0.1 ml의 효소 용액을 0.9 ml의 기질용액(50 mM Sodium acetate buffer(pH 5.0), 1 mg/ml의 수용성 기질인 파라 나이트로페닐 셀로바이오사이드(p-Nitrophenyl-β-D-cellobioside; pNPC)와 50℃에서 10분간 반응하였고, 반응 용액과 동량의 2% 탄산 나트륨을 첨가해 반응을 멈추고 410 에서 흡광도를 측정하였다. 또 다른 수용성 인공합성 기질인 p-나이트로페닐 락토바이오사이스(p-Nitrophenyl-β-D-lactobioside; pNPL)도 상기 동일한 방법으로 활성 측정한 결과, STFP13-CfCex1이 pNPC와 pNPL 각각 2076.7 unit/ml, 210 unit/ml 으로 가장 높은 활성을 보였으나 나머지 엑소셀룰라제는 모두 40unit/ml 이하의 미미한 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 8). 이때 효소 활성은 1분에 1 μM의 니트로페놀을 생성할 수 있는 효소량을 1 유닛(unit, U)으로 정하였다.
TFP No. pNPC_Exo-glucanase activity (unit/ml) pNPL_Exo-glucanase activity (unit/ml)
8 1569.8 150.9
11 1183.7 86.3
13 2076.7 210.0
19 1129.1 107.6
또한, 비수용성 기질인 Avicel을 이용하여 분비된 엑소셀룰라제의 활성을 분석하기 위하여 500μL의 효소 용액을 500μL의 기질용액(2% Avicel pH-105 셀룰로스, 0.04% sodium azide, 0.3μL Novozyme-188, 50 mM Sodium acetate buffer (pH5.0))과 35℃, 1000 rpm에서 48시간 동안 반응 후 분해된 당의 양을 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Avicel 활성분석 결과(표 9), 48시간 이후 ClCBH2가 66.3 unit/ml로 가장 높은 활성을 보였고, 엑소글루카나제 1 타입 중에서는 HgCBH1이 27 unit/ml로 높은 활성을 보였다. 수용성 기질의 분해 활성이 가장 높았던 CfCex1은 1.35 unit/ml로 가장 낮은 활성을 보였다.
TFP No. exo-셀룰라제 activity (unit/ml)
TeCBH1 4 2.17
5 2.03
6 2.47
7 2.15
8 2.15
NfCBH1 4 1.96
8 1.28
9 3.60
13 4.36
19 2.35
HgCBH1 4 18.75
8 19.60
9 13.50
13 27.00
19 21.90
CtCBH1 4 3.05
7 4.87
8 4.60
9 4.43
11 3.09
19 4.73
ClCBH2 7 44.55
8 66.20
11 60.50
13 66.30
16 61.95
단백질 발현율과 그에 따른 활성을 비교하여 각 형질전환체가 각 융합인자의 통제 하에 단백질 발현율과 활성이 가장 높은 사카로마이세스 세레비지에 균주 5종류(ST8-TeCBH1, ST13-NfCBH1, ST13-HgCBH1, self signal sequence-CtCBH1, ST13-ClCBH2)를 최종 선택하였고, 각 형질전환체는 MF 또는 자체시그널을 가지는 형질전환체의 상대적인 단백질 발현량과 비교하기 위해 SDS-PAGE(도 6a의 B) 분석을, 상대적인 활성을 비교하기 위해 pNPC, pNPL, Avicel을 기질로 사용하여 활성 분석하였다(도 6b의 C, D). 그 결과 CtCBH1은 TFP보다 자체 시그널을 이용할 경우 2.5배 높은 활성을 보였다. 나머지 4종의 엑소셀룰라제는 모두 TFP 기술을 이용할 경우 높은 분비 발현율을 확인하였다.
도 7a 내지 도 7c는 각 TFP와 융합한 각 헤미셀룰라제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 유전자의 발현 벡터를 나타내는 모식도이다. 재조합 생산균주가 함유하고 있는 발현벡터는 GAL10 프로모터를 이용하여 단백질 발현을 유도하기 고가의 갈락토오스를 필요로 하지만 gal80 유전자가 결실된 균주인 Y2805△gal80를 이용하면 포도당만으로도 GAL10 프로모터의 발현유도가 가능하다. 최종 선별된 7종류의 셀룰라제 유전자를 Y2805△gal80(Mat a pep4 :: HIS3 gal80 :: Tc190 , prb1 can1 his3 -200 ura3 -52)균주에 in vivo recombination을 통하여 도입하였고, 대량생산균주로 이용하였다.
실시예 4: 셀룰라제 유전자 대량 생산
상기 Y2805△gal80에 도입한 ST5-TrXynII, ST4-TrBxl, ST19-TrEGL2, ST13-PaCel1, ST13-PaCel2, ST8-TeCBH1, ST13-NfCBH1, ST13-HgCBH1, self signal-CtCBH1, ST13-ClCBH2, ST13-CfCex1 생산균주와 ST19-SfBGL2(대한민국 공개특허; 제10-2013-0027984호)를 이용하여, 각 헤미셀룰라제와 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 베타글루코시다제를 대량생산하기 위하여 5L 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50mL YNB(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5% 카사미노산, 및 2% 글루코오스) 배지에 초기 배양한 후 다시 200mL의 YEPD 액체배지에서 배양하여 활성화하고 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
도 8a 내지 도 8f는 ST5-TrXynII, ST4-TrBxl(도 8a), ST19-TrEGL2, ST13-PaCel1(도 8b), ST13-PaCel2, ST8-TeCBH1(도 8c), ST13-NfCBH1, ST13-HgCBH1(도 8d), self signal-CtCBH1, ST13-ClCBH2(도 8e), ST19-SfBGL2, ST13-CfCex1(도 8f)를 포함한 재조합 벡터로 형질전환한 사카로마이세스 세레비지에 Y2805△gal80 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효하여 시간별로 취한 배지 10ul씩을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진 및, 각 시간별 세포 광학농도 또는 효소활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 엑소글루카나제의 분비량은 효소의 종류에 따라서 차이가 있었으나 1-2 g/L 수준으로 분비 생산됨을 확인하였다. 발효 생산된 각각의 셀룰라제는 농축, 탈염과정을 거쳐 각각의 효소활성을 분석하고 냉동 보관하여 헤미셀룰라제는 복합균주 배양 실험에 활용하고, 나머지 셀룰라제들은 칵테일 제작 후 활성 측정 실험에 활용하였다.
실시예 5: 재조합 헤미셀룰라제의 복합 균주 배양 및 자일란 분해능
엔도자일라나제와 베타자일로시다제를 생산하는 효모 균주를 복합 배양 시 자일란(xylan)을 탄소원으로 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 두 가지 균주를 복합 배양하였다. 복합배양은 3mL의 최소배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5% 카사미노에시드, 2% 포도당)에서 초기배양을 한 후 50mL의 1% 자일란이 포함된 YPD 배지에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하여 시간별로 균체량 및 효소활성을 측정하였다. 엔도자일라나제 활성은 DNS 정량법을 사용하였고, 베타자일로시다제 활성은 파라 나이트로페닐 자일로피라노시드(p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, pNPX)를 사용하였다. 도 9a의 A에서 보는 바와 같이 두 가지 균주를 복합배양할 경우에도 각각의 효소가 분비생산됨을 확인하였고 엔도자일라나제와 베타자일로시다제는 배양 48시간일 때 130 unit/mL과 100 unit/mL의 효소 활성이 나타남을 확인하였다.
재조합 균주의 자일란 분해능을 확인해보기 위해서 YPD(yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) 배지에 2%의 자일란을 첨가하여 각 균주를 따로 또는 복합 배양하여 배지 내 자일란의 분해 패턴을 분석하였다(도 9b의 B). 자일란의 분해 패턴은 시간별 샘플을 채취하여 HPLC(Agilent, RIDetector)를 이용하여 분석하였다. HPLC 고정상은 HPX-87H column(Biorad)을 사용했으며 컬럼 온도는 65℃, flow rate은 0.6mL, RID 온도는 55℃ 조건으로 분석하였다. 자일라나제 생산 효모(TrXYL)를 배양한 배지에서는 자일로바이오스(xylobiose)와 자일로트리오스(xylotriose)만 생성된 반면 복합배양한 배지(TrXYL+TrBXL)에서는 생성된 엔도자일라나제 의해 자일란으로부터 자일로올리고사카라이드(xylo-oligosaccharide)를 생성하고 생성된 자일로바이오스는 더 이상 분해되지 않는다(도 9b의 B). 이때 분해되지 않는 자일로바이오스와 자일로올리고사카라이드는 베타자일로시다제에 의해 자일로스로 전환되어 자일로스, 자일로바이오스 및 자일로트리오스가 모두 생성됨을 확인하였으며 베타자일로시다제 생산균주를 배양한 배지에서는 자일란이 거의 분해되지 않았다(도 9b의 B). 그러므로 이 두 가지 효소에 의해 자일란이 분해되어 총 2.7 g/L 자일로스와 0.9 g/L 자일로바이오스, 0.3 g/L 자일로트리오스 등이 생성됨을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 따라서 자일란을 단일 탄소원으로 사용하기 위해서는 두 균주의 복합배양을 통해 생산된 두 가지 효소의 단계적인 작용을 통해 자일란으로부터 자일로스를 확보할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 바이오매스 당화 칵테일의 제조 및 활성 개량
본 발명에서 개발된 엑소셀룰라제 분비생산 효모를 이용하여 엑소셀룰라제를 발효농축 후 셀룰로스 기질을 탄소원으로 사용하여 각 기질의 분해능을 비교하였다. 활성 개량에 사용한 모든 셀룰라제 칵테일은 엑소셀룰라제 타입1 (CBH1), 엑소셀룰라제 타입2 (CBH2), 엔도셀룰라제 (EGL), 베타글루코시다제 (BGL)의 비율을 3.5 : 3.5 : 2 : 1로 고정하여 분석에 이용하였고, 칵테일에 사용한 EGL은 ST19-TrEGL2 효소이며, BGL은 ST19-SfBGL2(대한민국 공개특허 제10-2013-0027984호) 효소를 사용하였다.
또한 효소 정제에 따르는 비용을 최소화하기 위하여 칵테일 제조에 사용한 효소들은 발효 배양을 통해 생산된 4종류의 섬유소 분해효소를 발효배지로부터 회수하여 탈염 및 10배 농축한 후 각각의 효소를 정제 과정 없이 바로 칵테일 조성에 첨가하여 사용하였다. EGL, BGL에 비수용성 셀룰로스 조건에서 활성이 좋았던 ST13-PaCel1과 ST13-PaCel2를 상기의 비율로 섞어서 KCC-1으로 정하고, EGL, BGL에 ST13-HgCBH1과 ST13-ClCBH2를 상기의 비율로 섞어서 KCC-2로 정하고, EGL, BGL에 self signal-CtCBH1과 ST13-ClCBH2를 상기의 비율로 섞어서 KCC-3로 명명하여 상용화 효소인 Celluclast에 0.5% Novozyme 188 (Sigma)을 섞은 칵테일과 활성을 비교하였다.
비수용성 셀룰로스인 필터페이퍼(filter paper)를 기질로 사용한 활성 측정 방법 (B. Adney 등, 1996)으로 각 칵테일의 활성을 비교하였는데, 필터 페이퍼 활성측정 방법은 시간당 필터 페이퍼 기질을 4% 당화하는 데 필요한 효소 활성을 FPU로 표현하였다. 아래의 표 10은 셀룰로스를 분해하는 4가지 주요 효소들로 칵테일을 제조하여 필터 페이퍼를 분해하는 활성을 단백질 g당 FPU로 나타낸 결과와 전처리한 EFB(empty fruit bunch)를 기질로 칵테일의 상대적인 활성을 비교한 것이다.
Total 셀룰라제 필터 페이퍼 활성분석 결과 EFB 활성분석 결과
Protein
(mg/mL)		 FPU/mL FPU/g Protein
(mg/mL)		 글루코스 (mM)
KCC-1 22.72 0.30 13.06 24.6 318.9
KCC-2 21.90 0.95 43.27 24.3 467.9
KCC-3 23.01 2.64 114.83 22.9 708.7
Celluclast + Novozyme 188 124.36 37.37 300.54 123.4 262.2
HgCBH1과 ClCBH2 (KCC-2) 또는 CtCBH1과 ClCBH2 (KCC-3)를 첨가했을 때 기존 버전의 KCC-1 칵테일 (Polyporus arcularius 유래의 CBH1과 CBH2)보다 활성이 개선되었음을 확인하였다. 필터 페이퍼 활성은 KCC-1 대비 KCC-3이 8.8배, KCC-2 대비 KCC-3이 2.65배 개선되었고, Novozyme사의 cellulclast에 0.5% Novozyme 188 (BGL) 첨가한 경우와의 활성은 2.62배로 이전보다 소폭 활성이 향상되었음을 확인하였다.
전처리한 EFB 활성은 KCC-3이 KCC-1보다는 약 2.2배 개선되었고 KCC-2 보다는 약 1.5배, celluclast에 0.5% Novozyme 188이 첨가된 시료보다는 약 2.7배 활성이 개선되었음을 확인하였다.
CBH1 타입 중 Avicel 기질의 분해 능력이 낮았지만, 수용성 기질에서 가장 활성이 높았던 ST13-CfCex1 발효농축액을 사용하여 EGL, BGL과 ST13-ClCBH2에 상기의 비율로 섞어서 KCC-4로 정하고 전처리한 바이오매스 EFB를 대상으로 활성을 분석하였다. 결과 KCC-4가 KCC-3보다 130% 활성 개선되었음을 확인하였는데(표 11), 이러한 효과는 KCC-4에 추가로 첨가된 효소 ST13-CfCex1이 엑소셀룰라제 활성 분 아니라 헤미셀룰로스 분해효소인 엔도자일라나제(endo-xylanase) 활성을 갖는 것으로 알려져 있으므로 전처리 바이오매스에서 KCC-3보다 높은 활성을 갖는 것이 자일라나제(xylanase) 활성과 연관이 있을 것으로 예상되었다.
Total 셀룰라제 EFB 활성분석 결과
Protein (mg/mL) 환원당 (mM)
KCC-1 9.9 1.6
KCC-2 8.8 4.8
KCC-3 8.9 12.9
KCC-4 8.7 16.8
이러한 효과를 확인하기 위하여 효모를 이용하여 재조합 대량생산된 ST5-TrXynII, ST4-TrBxl를 각 효소칵테일에 첨가하여 NaOH로 전처리된 볏짚을 대상으로 활성을 비교한 결과, KCC-3에 ST4-TrBxl,를 첨가한 경우보다 ST5-TrXynII를 첨가했을 때 약 600%의 활성이 개량되었으나, 이미 자일라나제의 활성을 함유하고 있는 KCC-4에서는 ST5-TrXynII, ST4-TrBxl,를 추가한 경우 약 130% 활성 개선에 그쳤다(표 12). 따라서 비수용성 전처리 바이오매스에서 KCC-4는 헤미셀룰로스에 의해 활성이 방해 받고 있기 때문에 셀룰라제의 활성이 낮은 것으로 추정되었으며, 효과적인 셀룰라제 칵테일 개발을 위해서는 셀룰라제 뿐만 아니라 헤미셀룰라제가 동시에 포함된 형태로 개발하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.
효소 칵테일별 전처리 볏짚 당화 활성
Total 셀룰라제 환원당 (mM)
KCC-3 + buffer 0.66
KCC-3 + TrBxl, 0.74
KCC-3 + TrXynII 4.55
KCC-4 + buffer 1.60
KCC-4 + TrBxl, 2.19
KCC-4 + TrXynII 2.21
실시예 7: 섬유소 분해/당 활용성 증진 복합균주 활용 동시당화 기술 개발
KCC-1과 KCC-2를 구성하는 4종의 재조합 셀룰라제 분비생산 효모 균주 복합체 KCC-1과 KCC-2를 이용하여 바이오매스로부터 직접 바이오에탄올을 생산할 수 있는 복합균주 개발을 위하여 배지에 소량의 1% 포도당과 1% Avicel 또는 칼복시메틸 셀룰로스 (carboxymethyl 셀룰로스 : CMC)를 공급하여 24시간 동안 배양하였다. 분비 생산된 셀룰라제가 Avicel과 CMC를 분해할 수 있도록 37℃에서 3시간 동안 효소 당화를 진행하였고 대조구 균주(Y2805△gal80/CYH)와 함께 96시간까지 세포 성장을 비교하였다(도 10 A). 포도당을 단일 탄소원으로 공급한 경우에 두 균주의 성장은 차이가 없었으나 포도당의 농도를 낮추고 CMC와 Avicel을 탄소원으로 공급한 배지에서 KCC-1과 KCC-2가 미미하지만 대조구에 비해 성장이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 KCC-1과 KCC-2 균주 복합체의 세포성장에는 큰 차이는 없었다(도 10 A).
배양 중 복합균주에서 분비되는 셀룰라제의 양상을 분석하기 위하여 96시간 배양 후 배양배지를 SDS-PAGE 분석한 결과 대조구에서는 확인되지 않는 셀룰라제 들이 복합균주 KCC-1과 KCC-2에서는 배지 중으로 분비 생산되고 있음을 알 수 있었다(도 10 B).
실시예 8: 재조합 효소 칵테일의 셀룰로스 분해능 및 에탄올 발효능 비교분석
4가지 효소를 분비 생산하는 복합균주 KCC-1과 KCC-2를 온도에 따른 효소당화효율을 비교해 보기 위하여 4가지 복합 균주를 전배양 후 Avicel이 포함된 50mL 플라스크에 각각의 균주를 Exo : EGL : BGL = 7 : 2 : 1 비율로 접종하여 24시간 동안 배양을 통해 셀룰라제가 충분히 분비 생산되도록 하였다. 분비 생산된 복합 효소를 37℃, 50℃에서 144시간 반응시켜 HPLC 분석을 통해 생성된 글루코스를 확인하였다. 37℃에서 효소반응을 한 경우 글루코스가 전혀 생성되지 않았지만 50℃에서는 당화 효율이 매우 낮았지만 KCC-2의 경우 0.54g/L의 글루코스가 생성되었다(도 11). 따라서 효소칵테일의 조성 및 당화조건 최적화를 통해 불용성 cellulose 기질인 Avicel의 당화가 가능함을 확인하였다.
본 발명에서 개발된 셀룰라제 분비생산 효모복합체를 에탄올 생산에 직접 적용하여 당화 및 발효를 수행할 경우 당화를 위해 별도로 투입해야하는 셀룰라제의 사용량을 최소화하여 저가의 에탄올 생산이 가능할 것으로 기대되므로 실제 에탄올 발효 연구를 수행하였다. 에탄올 발효는 먼저 KCC-2를 구성하는 효소를 생산하는 균주인 ST19-BGL, ST19-EGL2, ST13-HgCBH1, ST13-ClCBH2의 4가지 균주를 종균배양한 후 각 세포량을 1:1:4:4 비율로 혼합해 사용하였다. 바이오매스는 건조된 볏짚을 고액비 1:10으로 하여 2% NaOH로 120℃에서 1시간 전처리하여 사용하였다. 에탄올 발효 조건으로는 10%의 바이오매스를 에탄올 배양배지 (yeast extract 0.5%, pepton 0.5%, KH2PO4, Ammonia sulfate 0.2%, MgSO4 ·H2O 0.04%, pH5.0)와 혼합하여 발효 배지를 만들고 여기에 Novozyme사의 상용 셀룰라제 (C-Tec : H-Tec = 7 : 3)를 각각 2, 5, 10 FPU/g cellulose가 되도록 넣어준 후 50℃, 150 rpm으로 6시간 동안 초기 당화를 진행하였다. 6시간 당화 후 종균배양된 균주를 비율에 맞게 혼합(KCC-2)하여 본 배양에 접종하였다. 대조구 발효 균주로는 셀룰라제 유전자를 포함하지 않는 벡터로 형질전환된 Y2805△gal80/CYH균주(CYH)를 사용하여 시간별로 샘플링을 진행하여 HPLC로 포도당, 에탄올의 생성과 소모를 확인하여 그래프로 나타내었다(도 12).
그 결과, 외부투입 효소 10FPU의 셀룰라제를 사용한 경우에는 대조구와의 차이가 미미 하였으나 셀룰라제 5 FPU을 사용한 경우에는 대조구와 에탄올 생산성의 차이가 확인되는 정도였으며 특히 셀룰라제 2 FPU을 사용한 경우 대조구에 비해 약 3배 이상의 에탄올 생산성의 차이를 보였다(도 12 A). 일반적으로 섬유소 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산시 생산성 극대화를 위해서 외부투입 효소를 섬유소 바이오매스의 종류에 따라 차이가 있겠지만 약 10~50 FPU/g cellulose를 사용하는 경우와 비교하면 효소비용을 대폭 절감할 수 있다.
당화효소 활성이 뛰어난 KCC-3 칵테일 효소를 구성하는 효소생산 복합균주에 상용 셀룰라제를 첨가했을 때 생산되는 에탄올을 확인하기 위하여, Y2805△gal80에 ST19-BGL, ST19-EGL2, self signal-CtCBH1, ST13-ClCBH2의 4가지 균주를 1:1:4:4 비율로 혼합해 사용하였다. 볏짚과 발효배지는 상기한 내용과 동일하게 제조하여 사용하였고 바이오매스의 양은 3%와 5%를 사용하여 플라스크 배양하였다. Novozyme사의 상용 셀룰라제 (C-Tec:H-Tec=7:3)를 각각 2, 5 FPU/g(볏짚의 포도당 함량)가 되도록 넣어준 후 YPD 배지에서 초기 배양된 30%(30mL) 균주를 혼합하여 30℃, 150 rpm으로 동시당화를 진행하였다(도 13). 2 FPU의 셀룰라제와 함께 동시당화를 진행한 경우 대조구에서는 에탄올이 생성되지 않은 반면에 복합균주를 사용한 경우 첨가한 3% 볏짚(21g glucose 함유)이 모두 당화되고 95% 이상 에탄올로 전환되었음을 확인할 수 있었다(도 13의 A). 볏짚과 셀룰라제의 사용량을 증가시키면 대조구에서도 에탄올이 생산되었으나 생산량은 재조합 복합균주에 훨씬 미치지 못하였다.
실시예 9: 발효조에서의 재조합 효소 칵테일의 에탄올 발효능 비교분석
KCC-3 칵테일 효소를 생산하는 4가지 복합 균주에 상용화 효소인 C-Tec, H-Tec을 혼합하여 5L 발효조에서 동시당화발효를 진행하였다. 2% NaOH로 160℃, 1시간 처리 후 중화하여 건조, 분쇄한 볏짚을 6% 기질로 사용하고 에탄올 발효 배지(peptone 5g/L, yeast extract 5g/L, KH2PO4 5g/L, ammonium sulfate 2g/L, MgSO4 0.4g/L)를 사용하였다. KCC-3 효소를 생산하는 균주 Y2805△gal80에 ST19-BGL, ST19-EGL2, self signal-CtCBH1, ST13-ClCBH2는 1:1:4:4 비율로 혼합해 사용하였고, Novozyme사의 상용 셀룰라제 (C-Tec:H-Tec=7:3)를 2FPU/g cellulose 가 되도록 넣어주었다. 균주 접종량은 YNB (yeast nitrogen base 6.7g/L, casaminoacid 5g/L, glucose 20g/L) 배지에서 1차 배양한 균주(50mL)를 YPD에서 2차 배양(450mL) 하여 총 2L 발효액에 30% 되도록 접종하였고, 각 비율에 맞도록 혼합하여 30℃, 150~300 rpm, pH 5.3~5.5, 0~0.1vvm으로 동시 당화 발효하였다. 상기 결과로부터 대조구에서는 4g/L의 에탄올이 생성된 반면, KCC-3 균주 복합체에서는 이론 수율에 가까운 19g/L/까지 에탄올이 생성됨을 확인하였다(도 14 A). 이러한 차이가 재조합 효모세포에서 분비되는 셀룰레이즈에 의한다는 것을 확인하기 위하여 발효중 배지를 SDS-PAGE 분석한 결과 초기에 넣어준 외부효소 C-tec은 약 56시간 발효 후 더 이상 존재하지 않았으나 wild-type yeats 에서는 확인되지 않는 재조합 셀룰레이즈들이 KCC-3에서는 분비 생산이 발효중 지속되고 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 제공하는 셀룰라제 생산 균주를 혼합하여 에탄올 생산에 적용할 경우 최소량의 상용화된 셀룰라제를 이용하여 바이오매스로부터 동시당화공정으로 에탄올 생산이 가능함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Recombinant cellulase cocktails, recombinant yeast complex strains, and use thereof <130> PA130614-KR-P1-D1 <150> KR 10-2013-0077440 <151> 2013-07-02 <160> 78 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 573 <212> DNA <213> Trichoderma reesei TrXynII <400> 1 cagacgattc agcccggcac gggctacaac aacggctact tctactcgta ctggaacgat 60 ggccacggcg gcgtgacgta caccaatggt cccggcgggc agttctccgt caactggtcc 120 aactcgggca actttgtcgg cggcaaggga tggcagcccg gcaccaagaa caaggtcatc 180 aacttctcgg gcagctacaa cccaaacggc aacagctacc tctccgtgta cggctggtcc 240 cgcaaccccc tgatcgagta ctacatcgtc gagaactttg gcacctacaa cccgtccacg 300 ggcgccacca agctgggcga ggtcacctcc gacggcagcg tctacgacat ttaccgcacg 360 cagcgcgtca accagccgtc catcatcggc accgccacct tttaccagta ctggtccgtc 420 cgccgcaacc accgctcgag cggctccgtc aacacggcga accacttcaa cgcgtgggct 480 cagcaaggcc tgacgctcgg gacgatggat taccagattg ttgccgtgga gggttacttt 540 agctctggct ctgcttccat caccgtcagc taa 573 <210> 2 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Trichoderma reesei TrBxl <400> 3 cagaacaatc aaacatacgc caactactct gctcagggcc agcctgatct ctaccccgag 60 acacttgcca cgctcacact ctcgttcccc gactgcgaac atggccccct caagaacaat 120 ctcgtctgtg actcatcggc cggctatgta gagcgagccc aggccctcat ctcgctcttc 180 accctcgagg agctcattct caacacgcaa aactcgggcc ccggcgtgcc tcgcctgggt 240 cttccgaact accaagtctg gaatgaggct ctgcacggct tggaccgcgc caacttcgcc 300 accaagggcg gccagttcga atgggcgacc tcgttcccca tgcccatcct cactacggcg 360 gccctcaacc gcacattgat ccaccagatt gccgacatca tctcgaccca agctcgagca 420 ttcagcaaca gcggccgtta cggtctcgac gtctatgcgc caaacgtcaa tggcttccga 480 agccccctct ggggccgtgg ccaggagacg cccggcgaag acgccttttt cctcagctcc 540 gcctatactt acgagtacat cacgggcatc cagggtggcg tcgaccctga gcacctcaag 600 gttgccgcca cggtgaagca ctttgccgga tacgacctcg agaactggaa caaccagtcc 660 cgtctcggtt tcgacgccat cataactcag caggacctct ccgaatacta cactccccag 720 ttcctcgctg cggcccgtta tgcaaagtca cgcagcttga tgtgcgcata caactccgtc 780 aacggcgtgc ccagctgtgc caacagcttc ttcctgcaga cgcttttgcg 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actcgtggcg catgggcgac cagaccttcc tcggccctgg caagaccgtc 840 gacacctcgt ccaagttcac cgtcgtcacc cagttcatca ccgccgacaa cacgacctcg 900 ggcgacctct ccgagatccg ccgtctctac gtccagaacg gcaaggtcat cgccaactcg 960 aagacgcaaa tcgcgggcat ggacgcgtac gactccatca ccgacgactt ctgcaacgcc 1020 cagaagacca cgttcggcga caccaacacg ttcgagcaga tgggtggtct cgccaccatg 1080 ggcgacgcct tcgaaactgg catggtcctc gtcatgtcca tctgggacga ccacgaggcg 1140 aagatgctct ggctcgacag tgactacccc accgacgccg acgcgtctgc cccgggtgtc 1200 tctcgtggac cgtgcccgac gacctcgggt gatcccaccg acgtcgagtc ccagagcccc 1260 ggtgcgaccg tcatcttctc caacatcaag accggtccca tcggctccac cttcacctcc 1320 taa 1323 <210> 8 <211> 440 <212> PRT <213> Polyporus arcularius PaCel1 <400> 8 Gln Gln Val Gly Thr Leu Thr Ala Glu Thr His Pro Lys Leu Ser Val 1 5 10 15 Ser Gln Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Thr Val Gln Arg Ser Val 20 25 30 Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Leu His Asp Val Gly Gly Ser Thr 35 40 45 Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Asp Ser Leu Cys Pro Asp Pro 50 55 60 Thr 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tcgcgacctc 540 aaatttatta atggtcaagc caatgttgaa ggatggcagc cctctagtaa cgatgctaac 600 gccggtaccg gcaatcatgg ttcctgttgc gctgagatgg acatatggga agccaacagt 660 atctccacgg cttttactcc tcacccatgc gatactcccg gccaggtgat gtgcactggt 720 gatgcctgtg gtggcacgta cagctccgac agatatggcg gcacgtgtga tccagacgga 780 tgtgacttta attccttccg ccaaggaaat aagactttct atgggcctgg catgaccgtg 840 gacaccaaaa gcaagtttac agtagttacc caattcatca ccgacgatgg aacagcctca 900 ggcacgttaa aggaaattaa gcgcttctac gttcaaaacg gcaaagtgat tcctaactcg 960 gaatcaacct ggtccggcgt cggcggaaat tccattacaa acgattattg taccgcccaa 1020 aagagcttat tcaaggacca gaacgtcttt gccaagcatg gcggcatgga gggcatgggc 1080 gctgccttgg ctcaagggat ggtcttagtc atgtccctgt gggatgatca tgccgccaat 1140 atgttgtggt tggacagcaa ctacccgacg actgcctctt cctcaactcc tggtgttgct 1200 cgtggtactt gtgacatctc ctctggcgtt cctgcggatg tcgaagcaaa ccatcccgac 1260 gcctccgtcg tctattccaa cataaaggtc ggccccatag gctcaacctt caatagtggt 1320 ggctcgaacc caggcggtgg aaccaccacc accgctaagc ctacgacgac cactacaacc 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tcacgactaa cggtgattct ctgtcactca agttcgtgac caagggccaa 300 cattctacca acgtcggctc gcgtacatac ttaatggacg gcgaagataa gtatcagacg 360 ttcgaactcc tcggaaacga atttactttc gatgtagatg tttctaacat aggatgcggc 420 ttaaatggcg ccctgtactt cgtctcaatg gacgcagatg gtggtctatc aagatatcct 480 ggtaataaag ctggtgctaa atatggtaca ggatattgtg atgctcagtg tccccgtgat 540 attaaattca tcaacggtga agccaacatt gagggctgga ccgggagcac caacgatcca 600 aatgccggtg cgggtagata tggtacttgc tgctccgaaa tggatatctg ggaagcgaac 660 aacatggcta ctgcctttac tcctcatcct tgcactatca ttggccaaag ccgctgtgaa 720 ggcgactcgt gtggtggcac ctatagcaat gaacgctatg ccggcgtctg cgacccggat 780 ggctgcgact tcaacagtta tcgccaaggc aacaagacct tttacgggaa gggcatgact 840 gtcgacacca ctaagaagat tacagtcgtc acacaatttc ttaaagatgc aaacggtgat 900 ttaggagaaa ttaagagatt ttatgtccag gatggcaaaa taatcccaaa ttctgagtcc 960 actattcccg gcgtcgaagg caactccatt acccaagact ggtgcgaccg ccagaaggtt 1020 gcctttggcg acatagatga ttttaatcga aaaggcggta tgaagcaaat gggcaaggcc 1080 ctcgccggcc ccatggtctt agtcatgagt atatgggatg atcacgcatc caatatgtta 1140 tggctcgaca gtaccttccc tgtagatgcc gctggcaagc caggtgcaga gaggggtgcc 1200 tgcccaacca catcaggtgt cccagctgaa gttgaagcag aagcccccaa cagtaatgtg 1260 gtgtttagta atatcaggtt cggccccata ggctcaaccg ttgcaggtct ccccggcgca 1320 ggaaacggag gcaacaatgg cggcaaccct ccgcccccaa ccaccaccac ctcatcggct 1380 cctgctacca ccacaaccgc ctcagctgga ccaaaagcag gccgctggca gcaatgtgga 1440 ggcatcggct ttactggccc gacccaatgc gaggagcctt acatttgtac caagctcaac 1500 gattggtact ctcaatgttt gtaa 1524 <210> 16 <211> 507 <212> PRT <213> Humicola grisea HgCBH1 <400> 16 Gln Gln Ala Cys Ser Leu Thr Thr Glu Arg His Pro Ser Leu Ser Trp 1 5 10 15 Asn Lys Cys Thr Ala Gly Gly Gln Cys Gln Thr Val Gln Ala Ser Ile 20 25 30 Thr Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Thr His Gln Val Ser Gly Ser Thr 35 40 45 Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Lys Trp Asp Thr Ser Ile Cys Thr Asp Ala 50 55 60 Lys Ser Cys Ala Gln Asn Cys Cys Val Asp Gly Ala Asp Tyr Thr Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Asn Gly Asp Ser Leu Ser Leu Lys 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cagacaaggc gataaaacgt tttatggaaa gggcatgact 840 gttgatacaa acaaaaagat gaccgtcgtt acccaattcc ataaaaactc tgctggcgta 900 ttatctgaga tcaagcgctt ctacgtacaa gacggcaaaa taattgccaa cgctgagtca 960 aagattcccg gcaatcctgg aaactcaatt acacaggaat attgtgatgc tcagaaagtc 1020 gccttcagta atacagatga tttcaataga aagggcggta tggctcagat gagcaaagcc 1080 ctcgcagggc ccatggtctt ggttatgtcc gtatgggatg accattatgc caacatgctc 1140 tggcttgact cgacctatcc cattgaccag gccggcgccc ctggcgcaga acgcggtgct 1200 tgtccgacca cctctggtgt tcctgcagaa attgaagccc aagtgcccaa ttctaacgtt 1260 atattcagta acataagatt tggccccata ggttccactg tccctggcct tgatggcagc 1320 aaccccggca atccaaccac tacggtcgtc cctcccgctt ctacctccac ctcccgtccg 1380 acttcaagca cttcatctcc agtttcgacc cccactggcc aacctggcgg atgtaccacc 1440 caaaagtggg gccagtgtgg cggtatcgga tacaccggct gcaccaactg cgttgctggc 1500 actacctgca ctcaattgaa tccctggtat tctcagtgtc tgtaa 1545 <210> 18 <211> 514 <212> PRT <213> Chaetomium thermophilum CtCBH1 <400> 18 Gln Gln Ala Cys Ser Leu Thr Ala Glu Asn His 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gattaccatt gtggtttgtc cgacgcttta 1320 caacccgccc ccgaggctgg acagtggttt caggcttact ttgaacaatt gttaacgaac 1380 gcaaatccac cattctaa 1398 <210> 20 <211> 465 <212> PRT <213> Chrysosporium lucknowense ClCBH2 <400> 20 Ala Pro Val Ile Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ala Val Trp Thr Gln 1 5 10 15 Cys Gly Gly Asn Gly Trp Gln Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser 20 25 30 Thr Cys Val Ala Gln Asn Glu Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn Ser 35 40 45 Gln Val Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gln Arg 50 55 60 Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Thr Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser 65 70 75 80 Ser Ser Thr Thr Pro Pro Pro Val Ser Ser Pro Val Thr Ser Ile Pro 85 90 95 Gly Gly Ala Thr Ser Thr Ala Ser Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Ser Gly 100 105 110 Val Arg Leu Phe Ala Asn Asp Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His Asn Leu 115 120 125 Ala Ile Pro Ser Met Thr Gly Thr Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala Val 130 135 140 Ala Glu Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Val Gln Thr Leu Ser Gln Val 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ttagataaaa gagtcccaat tcaaaactat acccagtctc catcccaagg cgatgagagc 420 tcccaatggg tgagcccgca ttattatcca actccacaag gtggtaggct ccaagacgtc 480 tggcaagaag catatgctag agcaaaagcc atcgttggcc agatgactat tgttgaaaag 540 gtcaatttga ccaccggtac cggttggcaa ttagatccat gtgttggtaa taccggttct 600 gttccaagat ttggcatccc aaacctttgc ctacaagatg ggccattggg tgtccgattc 660 gctgactttg ttacaggcta tccatccggt cttgccaccg gtgcaacgtt caataaggat 720 ttgttccttc aaagaggtca agctcttggc cacgagttca acagcaaagg tgtacatatt 780 gcattgggcc ctgctgttgg cccacttggt gtcaaagcca gaggtggcag aaatttcgag 840 gcctttggtt ccgacccata tctccaaggt attgctgctg ctgcaaccat caaaggtctc 900 caagagaata atgttatggc ttgtgtcaag cactttattg gtaacgaaca agaaaagtac 960 agacaaccag atgacatgaa tcctgccacc aaccaaacta ctaaagaagc tataagtgct 1020 aatattccag acagagccat gcatgagttg tacttgtggc catttgcgga ttcggttcgg 1080 gcaggtgttg gttctgttat gtgctcttat aacagagtca acaacactta cgcttgcgaa 1140 aactcttaca tgatgaacca cttgcttaaa gaagaattgg gttttcaagg ctttgttgtt 1200 tcggactggg gtgcacaatt aagtggggtt tatagcgcta tctcgggctt agatatgtct 1260 atgcctggtg aagtgtatgg gggatggaac accggcacgt ctttctgggg tcaaaacttg 1320 acgaaagcta tttacaatga gactgtcccg attgaaagat tagatgatat ggcaaccagg 1380 atcttggctg ctttgtatgc taccaatagt ttcccaacag aagatcacct tccaaatttt 1440 tcttcatgga caacgaaaga atatggcaat aaatattatg ctgacaacac taccgagatt 1500 gtcaaagtca actacaatgt ggacccatca aatgacttta cggaggacac agctttgaag 1560 gttgctgagg aatctattgt gcttttaaaa aatgaaaaca acactttgcc aatttctccc 1620 gaaaaggcta aaagattact attgtcgggt attgctgcag gccctgatcc gataggttat 1680 cagtgtgaag atcaatcttg cacaaatggc gctttgtttc aaggttgggg ttctggcagt 1740 gttggttctc caaaatatca agtcactcca tttgaggaaa tttcttatct tgcaagaaaa 1800 agcaagatgc aatttgatta tattcgggag tcttacgact tagctcaagt tactaaagta 1860 gcttccgatg ctcatttgtc tatagttgtt gtctctgctg caagcggtga gggttatata 1920 accgttgacg gtaaccaagg tgacagaaaa aatctcactt tgtggaacaa cggtgataaa 1980 ttgattgaaa cagtcgctga aaactgtgcc aatactgttg ttgttgttac ttctactggt 2040 caaattaatt ttgaaggctt tgctgatcac ccaaatgtta ccgcaattgt ctgggctggc 2100 ccattaggtg acagatccgg gactgctatc gccaatattc tttttggtaa agcgaaccca 2160 tcaggtcatc ttccattcac tatcgctaag actgacgatg attacattcc aattgaaatc 2220 tacagtccat cgagtggtga gcctgaagac aaccacttgg ttgaaaatga cttgcttgtt 2280 gactatagat attttgaaga gaagaatatt gagccaagat acgcatttgg ctatggcttg 2340 tcttacaatg agtataaagt tagcaatgca aaggtctcgg cagccaaaaa agttgatgag 2400 gagttgcctg aaccagctac ctacttatcg gagtttagct atcaaaatgc aaaaggcagc 2460 aaaaatccaa gtgatgcttt tgctccagca gatttaaaca gagttaatga gtacctttat 2520 ccatatttag atagcaatgt taccttgaaa gacggaaact atgagtatcc tgatggctac 2580 agcactgagc aaagaacaac acctatccaa cctgggggcg gcttgggagg caacgatgct 2640 ttgtgggagg tcgcttataa agttgaagtg gacgttcaaa acttgggtaa ctccactgat 2700 aagtttgttc cacagttgta tttgaaacac cctgaagatg gcaagtttga aaccccggtt 2760 caattgagag ggttcgaaaa ggttgagttg tccccgggtg agaagaagac agttgagttt 2820 gagcttttga gaagagatct tagtgtgtgg gataccatca gacaatcctg gatcgttgaa 2880 tctggtactt atgaggcctt aattggtgtt gctgttaata atatcaagac atctgtcctg 2940 tttactattt aa 2952 <210> 74 <211> 983 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ST19-SfBGL1 <400> 74 Met Arg Leu Ser Asn Leu Ile Ala Ser Ala Ser Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Thr Leu Ala Ala Pro Ala Asn His Glu His Lys Asp Lys Arg Ala Val 20 25 30 Val Thr Thr Thr Val Gln Lys Gln Thr Thr Ile Ile Val Asn Gly Ala 35 40 45 Ala Ser Thr Pro Val Ala Ala Leu Glu Glu Asn Ala Val Val Asn Ser 50 55 60 Ala Pro Ala Ala Ala Thr Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ser Val Ala 65 70 75 80 Thr Ala Ala Ser Ser Ser Glu Asn Asn Ser Gln Val Ser Ala Ala Ala 85 90 95 Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ser Thr Gln Ser Ser Leu Ala 100 105 110 Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu Ala Leu Asp Lys Arg Val Pro Ile Gln 115 120 125 Asn Tyr Thr Gln Ser Pro Ser Gln Gly Asp Glu Ser Ser Gln Trp Val 130 135 140 Ser Pro His Tyr Tyr Pro Thr Pro Gln Gly Gly Arg Leu Gln Asp Val 145 150 155 160 Trp Gln Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Lys Ala Ile Val Gly Gln Met Thr 165 170 175 Ile Val Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly Trp Gln Leu Asp 180 185 190 Pro Cys Val Gly Asn Thr Gly Ser Val Pro Arg Phe Gly Ile Pro Asn 195 200 205 Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly Val Arg Phe Ala Asp Phe Val 210 215 220 Thr Gly Tyr Pro Ser Gly Leu Ala Thr Gly Ala Thr Phe Asn Lys Asp 225 230 235 240 Leu Phe Leu Gln Arg Gly Gln Ala Leu Gly His Glu Phe Asn Ser Lys 245 250 255 Gly Val His Ile Ala Leu Gly Pro Ala Val Gly Pro Leu Gly Val Lys 260 265 270 Ala Arg Gly Gly Arg Asn Phe Glu Ala Phe Gly Ser Asp Pro Tyr Leu 275 280 285 Gln Gly Ile Ala Ala Ala Ala Thr Ile Lys Gly Leu Gln Glu Asn Asn 290 295 300 Val Met Ala Cys Val Lys His Phe Ile Gly Asn Glu Gln Glu Lys Tyr 305 310 315 320 Arg Gln Pro Asp Asp Met Asn Pro Ala Thr Asn Gln Thr Thr Lys Glu 325 330 335 Ala Ile Ser Ala Asn Ile Pro Asp Arg Ala Met His Glu Leu Tyr Leu 340 345 350 Trp Pro Phe Ala Asp Ser Val Arg Ala Gly Val Gly Ser Val Met Cys 355 360 365 Ser Tyr Asn Arg Val Asn Asn Thr Tyr Ala Cys Glu Asn Ser Tyr Met 370 375 380 Met Asn His Leu Leu Lys Glu Glu Leu Gly Phe Gln Gly Phe Val Val 385 390 395 400 Ser Asp Trp Gly Ala Gln Leu Ser Gly Val Tyr Ser Ala Ile Ser Gly 405 410 415 Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Glu Val Tyr Gly Gly Trp Asn Thr Gly 420 425 430 Thr Ser Phe Trp Gly Gln Asn Leu Thr Lys Ala Ile Tyr Asn Glu Thr 435 440 445 Val Pro Ile Glu Arg Leu Asp Asp Met Ala Thr Arg Ile Leu Ala Ala 450 455 460 Leu Tyr Ala Thr Asn Ser Phe Pro Thr Glu Asp His Leu Pro Asn Phe 465 470 475 480 Ser Ser Trp Thr Thr Lys Glu Tyr Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Asn 485 490 495 Thr Thr Glu Ile Val Lys Val Asn Tyr Asn Val Asp Pro Ser Asn Asp 500 505 510 Phe Thr Glu Asp Thr Ala Leu Lys Val Ala Glu Glu Ser Ile Val Leu 515 520 525 Leu Lys Asn Glu Asn Asn Thr Leu Pro Ile Ser Pro Glu Lys Ala Lys 530 535 540 Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Ala Gly Pro Asp Pro Ile Gly Tyr 545 550 555 560 Gln Cys Glu Asp Gln Ser Cys Thr Asn Gly Ala Leu Phe Gln Gly Trp 565 570 575 Gly Ser Gly Ser Val Gly Ser Pro Lys Tyr Gln Val Thr Pro Phe Glu 580 585 590 Glu Ile Ser Tyr Leu Ala Arg Lys Ser Lys Met Gln Phe Asp Tyr Ile 595 600 605 Arg Glu Ser Tyr Asp Leu Ala Gln Val Thr Lys Val Ala Ser Asp Ala 610 615 620 His Leu Ser Ile Val Val Val Ser Ala Ala Ser Gly Glu Gly Tyr Ile 625 630 635 640 Thr Val Asp Gly Asn Gln Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp Asn 645 650 655 Asn Gly Asp Lys Leu Ile Glu Thr Val Ala Glu Asn Cys Ala Asn Thr 660 665 670 Val Val Val Val Thr Ser Thr Gly Gln Ile Asn Phe Glu Gly Phe Ala 675 680 685 Asp His Pro Asn Val Thr Ala Ile Val Trp Ala Gly Pro Leu Gly Asp 690 695 700 Arg Ser Gly Thr Ala Ile Ala Asn Ile Leu Phe Gly Lys Ala Asn Pro 705 710 715 720 Ser Gly His Leu Pro Phe Thr Ile Ala Lys Thr Asp Asp Asp Tyr Ile 725 730 735 Pro Ile Glu Ile Tyr Ser Pro Ser Ser Gly Glu Pro Glu Asp Asn His 740 745 750 Leu Val Glu Asn Asp Leu Leu Val Asp Tyr Arg Tyr Phe Glu Glu Lys 755 760 765 Asn Ile Glu Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Asn Glu 770 775 780 Tyr Lys Val Ser Asn Ala Lys Val Ser Ala Ala Lys Lys Val Asp Glu 785 790 795 800 Glu Leu Pro Glu Pro Ala Thr Tyr Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Gln Asn 805 810 815 Ala Lys Gly Ser Lys Asn Pro Ser Asp Ala Phe Ala Pro Ala Asp Leu 820 825 830 Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu Tyr Pro Tyr Leu Asp Ser Asn Val Thr 835 840 845 Leu Lys Asp Gly Asn Tyr Glu Tyr Pro Asp Gly Tyr Ser Thr Glu Gln 850 855 860 Arg Thr Thr Pro Ile Gln Pro Gly Gly Gly Leu Gly Gly Asn Asp Ala 865 870 875 880 Leu Trp Glu Val Ala Tyr Lys Val Glu Val Asp Val Gln Asn Leu Gly 885 890 895 Asn Ser Thr Asp Lys Phe Val Pro Gln Leu Tyr Leu Lys His Pro Glu 900 905 910 Asp Gly Lys Phe Glu Thr Pro Val Gln Leu Arg Gly Phe Glu Lys Val 915 920 925 Glu Leu Ser Pro Gly Glu Lys Lys Thr Val Glu Phe Glu Leu Leu Arg 930 935 940 Arg Asp Leu Ser Val Trp Asp Thr Ile Arg Gln Ser Trp Ile Val Glu 945 950 955 960 Ser Gly Thr Tyr Glu Ala Leu Ile Gly Val Ala Val Asn Asn Ile Lys 965 970 975 Thr Ser Val Leu Phe Thr Ile 980 <210> 75 <211> 859 <212> PRT <213> beta glucosidase SfBFL2 <400> 75 Val Pro Ile Gln Asn Tyr Thr Gln Ser Pro Ser Gln Gly Asp Glu Ser 1 5 10 15 Ser Gln Trp Val Ser Pro His Tyr Tyr Pro Thr Pro Gln Gly Gly Arg 20 25 30 Leu Gln Asp Val Trp Gln Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Lys Ala Ile Val 35 40 45 Gly Gln Met Thr Ile Val Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Trp Gln Leu Asp Pro Cys Val Gly Asn Thr Gly Ser Val Pro Arg Phe 65 70 75 80 Gly Ile Pro Asn Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly Val Arg Phe 85 90 95 Ala Asp Phe Val Thr Gly Tyr Pro Ser Gly Leu Ala Thr Gly Ala Thr 100 105 110 Phe Asn Lys Asp Leu Phe Leu Gln Arg Gly Gln Ala Leu Gly His Glu 115 120 125 Phe Asn Ser Lys Gly Val His Ile Ala Leu Gly Pro Ala Val Gly Pro 130 135 140 Leu Gly Val Lys Ala Arg Gly Gly Arg Asn Phe Glu Ala Phe Gly Ser 145 150 155 160 Asp Pro Tyr Leu Gln Gly Ile Ala Ala Ala Ala Thr Ile Lys Gly Leu 165 170 175 Gln Glu Asn Asn Val Met Ala Cys Val Lys His Phe Ile Gly Asn Glu 180 185 190 Gln Glu Lys Tyr Arg Gln Pro Asp Asp Met Asn Pro Ala Thr Asn Gln 195 200 205 Thr Thr Lys Glu Ala Ile Ser Ala Asn Ile Pro Asp Arg Ala Met His 210 215 220 Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ser Val Arg Ala Gly Val Gly 225 230 235 240 Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Arg Val Asn Asn Thr Tyr Ala Cys Glu 245 250 255 Asn Ser Tyr Met Met Asn His Leu Leu Lys Glu Glu Leu Gly Phe Gln 260 265 270 Gly Phe Val Val Ser Asp Trp Gly Ala Gln Leu Ser Gly Val Tyr Ser 275 280 285 Ala Ile Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Glu Val Tyr Gly Gly 290 295 300 Trp Asn Thr Gly Thr Ser Phe Trp Gly Gln Asn Leu Thr Lys Ala Ile 305 310 315 320 Tyr Asn Glu Thr Val Pro Ile Glu Arg Leu Asp Asp Met Ala Thr Arg 325 330 335 Ile Leu Ala Ala Leu Tyr Ala Thr Asn Ser Phe Pro Thr Glu Asp His 340 345 350 Leu Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Thr Lys Glu Tyr Gly Asn Lys Tyr 355 360 365 Tyr Ala Asp Asn Thr Thr Glu Ile Val Lys Val Asn Tyr Asn Val Asp 370 375 380 Pro Ser Asn Asp Phe Thr Glu Asp Thr Ala Leu Lys Val Ala Glu Glu 385 390 395 400 Ser Ile Val Leu Leu Lys Asn Glu Asn Asn Thr Leu Pro Ile Ser Pro 405 410 415 Glu Lys Ala Lys Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Ala Gly Pro Asp 420 425 430 Pro Ile Gly Tyr Gln Cys Glu Asp Gln Ser Cys Thr Asn Gly Ala Leu 435 440 445 Phe Gln Gly Trp Gly Ser Gly Ser Val Gly Ser Pro Lys Tyr Gln Val 450 455 460 Thr Pro Phe Glu Glu Ile Ser Tyr Leu Ala Arg Lys Ser Lys Met Gln 465 470 475 480 Phe Asp Tyr Ile Arg Glu Ser Tyr Asp Leu Ala Gln Val Thr Lys Val 485 490 495 Ala Ser Asp Ala His Leu Ser Ile Val Val Val Ser Ala Ala Ser Gly 500 505 510 Glu Gly Tyr Ile Thr Val Asp Gly Asn Gln Gly Asp Arg Lys Asn Leu 515 520 525 Thr Leu Trp Asn Asn Gly Asp Lys Leu Ile Glu Thr Val Ala Glu Asn 530 535 540 Cys Ala Asn Thr Val Val Val Val Thr Ser Thr Gly Gln Ile Asn Phe 545 550 555 560 Glu Gly Phe Ala Asp His Pro Asn Val Thr Ala Ile Val Trp Ala Gly 565 570 575 Pro Leu Gly Asp Arg Ser Gly Thr Ala Ile Ala Asn Ile Leu Phe Gly 580 585 590 Lys Ala Asn Pro Ser Gly His Leu Pro Phe Thr Ile Ala Lys Thr Asp 595 600 605 Asp Asp Tyr Ile Pro Ile Glu Ile Tyr Ser Pro Ser Ser Gly Glu Pro 610 615 620 Glu Asp Asn His Leu Val Glu Asn Asp Leu Leu Val Asp Tyr Arg Tyr 625 630 635 640 Phe Glu Glu Lys Asn Ile Glu Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Tyr Gly Leu 645 650 655 Ser Tyr Asn Glu Tyr Lys Val Ser Asn Ala Lys Val Ser Ala Ala Lys 660 665 670 Lys Val Asp Glu Glu Leu Pro Glu Pro Ala Thr Tyr Leu Ser Glu Phe 675 680 685 Ser Tyr Gln Asn Ala Lys Gly Ser Lys Asn Pro Ser Asp Ala Phe Ala 690 695 700 Pro Ala Asp Leu Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu Tyr Pro Tyr Leu Asp 705 710 715 720 Ser Asn Val Thr Leu Lys Asp Gly Asn Tyr Glu Tyr Pro Asp Gly Tyr 725 730 735 Ser Thr Glu Gln Arg Thr Thr Pro Ile Gln Pro Gly Gly Gly Leu Gly 740 745 750 Gly Asn Asp Ala Leu Trp Glu Val Ala Tyr Lys Val Glu Val Asp Val 755 760 765 Gln Asn Leu Gly Asn Ser Thr Asp Lys Phe Val Pro Gln Leu Tyr Leu 770 775 780 Lys His Pro Glu Asp Gly Lys Phe Glu Thr Pro Val Gln Leu Arg Gly 785 790 795 800 Phe Glu Lys Val Glu Leu Ser Pro Gly Glu Lys Lys Thr Val Glu Phe 805 810 815 Glu Leu Leu Arg Arg Asp Leu Ser Val Trp Asp Thr Ile Arg Gln Ser 820 825 830 Trp Ile Val Glu Ser Gly Thr Tyr Glu Ala Leu Ile Gly Val Ala Val 835 840 845 Asn Asn Ile Lys Thr Ser Val Leu Phe Thr Ile 850 855 <210> 76 <211> 2580 <212> DNA <213> beta glucosidase SfBGL2 <400> 76 gtcccaattc aaaactatac ccagtctcca tcccaaggcg atgagagctc ccaatgggtg 60 agcccgcatt attatccaac tccacaaggt ggtaggctcc aagacgtctg gcaagaagca 120 tatgctagag caaaagccat cgttggccag atgactattg ttgaaaaggt caatttgacc 180 accggtaccg gttggcaatt agatccatgt gttggtaata ccggttctgt tccaagattt 240 ggcatcccaa acctttgcct acaagatggg ccattgggtg tccgattcgc tgactttgtt 300 acaggctatc catccggtct tgccaccggt gcaacgttca ataaggattt gttccttcaa 360 agaggtcaag ctcttggcca cgagttcaac agcaaaggtg tacatattgc attgggccct 420 gctgttggcc cacttggtgt caaagccaga ggtggcagaa atttcgaggc ctttggttcc 480 gacccatatc tccaaggtat tgctgctgct gcaaccatca aaggtctcca agagaataat 540 gttatggctt gtgtcaagca ctttattggt aacgaacaag aaaagtacag acaaccagat 600 gacatgaatc ctgccaccaa ccaaactact aaagaagcta taagtgctaa tattccagac 660 agagccatgc atgagttgta cttgtggcca tttgcggatt cggttcgggc aggtgttggt 720 tctgttatgt gctcttataa cagagtcaac aacacttacg cttgcgaaaa ctcttacatg 780 atgaaccact tgcttaaaga agaattgggt tttcaaggct ttgttgtttc ggactggggt 840 gcacaattaa gtggggttta tagcgctatc tcgggcttag atatgtctat gcctggtgaa 900 gtgtatgggg gatggaacac cggcacgtct ttctggggtc aaaacttgac gaaagctatt 960 tacaatgaga ctgtcccgat tgaaagatta gatgatatgg caaccaggat cttggctgct 1020 ttgtatgcta ccaatagttt cccaacagaa gatcaccttc caaatttttc ttcatggaca 1080 acgaaagaat atggcaataa atattatgct gacaacacta ccgagattgt caaagtcaac 1140 tacaatgtgg acccatcaaa tgactttacg gaggacacag ctttgaaggt tgctgaggaa 1200 tctattgtgc ttttaaaaaa tgaaaacaac actttgccaa tttctcccga aaaggctaaa 1260 agattactat tgtcgggtat tgctgcaggc cctgatccga taggttatca gtgtgaagat 1320 caatcttgca caaatggcgc tttgtttcaa ggttggggtt ctggcagtgt tggttctcca 1380 aaatatcaag tcactccatt tgaggaaatt tcttatcttg caagaaaaag caagatgcaa 1440 tttgattata ttcgggagtc ttacgactta gctcaagtta ctaaagtagc ttccgatgct 1500 catttgtcta tagttgttgt ctctgctgca agcggtgagg gttatataac cgttgacggt 1560 aaccaaggtg acagaaaaaa tctcactttg tggaacaacg gtgataaatt gattgaaaca 1620 gtcgctgaaa actgtgccaa tactgttgtt gttgttactt ctactggtca aattaatttt 1680 gaaggctttg ctgatcaccc aaatgttacc gcaattgtct gggctggccc attaggtgac 1740 agatccggga ctgctatcgc caatattctt tttggtaaag cgaacccatc aggtcatctt 1800 ccattcacta tcgctaagac tgacgatgat tacattccaa ttgaaatcta cagtccatcg 1860 agtggtgagc ctgaagacaa ccacttggtt gaaaatgact tgcttgttga ctatagatat 1920 tttgaagaga agaatattga gccaagatac gcatttggct atggcttgtc ttacaatgag 1980 tataaagtta gcaatgcaaa ggtctcggca gccaaaaaag ttgatgagga gttgcctgaa 2040 ccagctacct acttatcgga gtttagctat caaaatgcaa aaggcagcaa aaatccaagt 2100 gatgcttttg ctccagcaga tttaaacaga gttaatgagt acctttatcc atatttagat 2160 agcaatgtta ccttgaaaga cggaaactat gagtatcctg atggctacag cactgagcaa 2220 agaacaacac ctatccaacc tgggggcggc ttgggaggca acgatgcttt gtgggaggtc 2280 gcttataaag ttgaagtgga cgttcaaaac ttgggtaact ccactgataa gtttgttcca 2340 cagttgtatt tgaaacaccc tgaagatggc aagtttgaaa ccccggttca attgagaggg 2400 ttcgaaaagg ttgagttgtc cccgggtgag aagaagacag ttgagtttga gcttttgaga 2460 agagatctta gtgtgtggga taccatcaga caatcctgga tcgttgaatc tggtacttat 2520 gaggccttaa ttggtgttgc tgttaataat atcaagacat ctgtcctgtt tactatttaa 2580 2580 <210> 77 <211> 54 <212> PRT <213> CtCBH1 self-signal 54 aa <400> 77 Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr 1 5 10 15 Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Thr Cys Gly Cys Cys Gly Cys 20 25 30 Ala Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Cys 35 40 45 Thr Cys Cys Gly Cys Cys 50 <210> 78 <211> 18 <212> PRT <213> CtCBH1 self-signal 18 aa <400> 78 Met Met Tyr Lys Lys Phe Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala

Claims (21)

  1. 서열번호 67의 아미노산 서열로 이루어진 TFP19 (Translational fusion partner 19)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 TrEGL2 (Trichoderma reesei endo-glucanase 2) 엔도글루카나제 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모에서 야생형 단백질에 비해 분비능이 증가된 단백질 발현용 발현카세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TrEGL2는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인, 발현카세트.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항의 발현카세트를 포함하는 발현벡터.
  5. 제4항의 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 세포인, 형질전환체.
  7. 제5항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, TrEGL2 (Trichoderma reesei endo-glucanase 2) 엔도글루카나제 생산방법.
  8. (i) 제5항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (ii) 상기 (i) 단계에서 수득한 배양물 또는 배양상등액으로부터 바이오에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환체는 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포로부터 만들어진 것인, 바이오 에탄올의 생산방법.
  10. (a) 제5항의 형질전환체; 및
    (b) 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 TrXynII (Trichoderma reesei xylanase II), TrBxl (Trichoderma reesei beta-xylosidase), PaCEL1 (Polyporus acularius Cel1), PaCel2 (Polyporus acularius Cel2), TeCBH1 (Talaromyces emersonii Cellobiohydrolase 1), NfCBH1 (Neosartorya fischeri Cellobiohydrolase 1), HgCBH1 (Humicola grisea Cellobiohydrolase 1), CtCBH1 (Chaetomium thermophilum Cellobiohydrolase 1), ClCBH2 (Chrysosporium lucknowense Cellobiohydrolase 2) 및 CfCex1 (Cellulomonas fimi Cex1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모에서 야생형 단백질에 비해 분비능이 증가된 단백질 발현용 발현카세트가 도입된, 형질전환체 중에서 선택되는 하나 이상의 형질전환체;
    를 포함하는, 복합 균주.
  11. (i) 제10항의 복합 균주를 배양하는 단계; 및
    (ii) 상기 (i) 단계에서 수득한 배양물 또는 배양상등액으로부터 바이오에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 복합 균주는 헤미셀룰라제 효소를 분비하는 형질전환체를 하나 이상 포함하는 것인, 복합 균주.
  13. 제10항에 있어서, 상기 복합 균주는 자일란 분해능을 갖는 것인, 복합 균주.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제7항에 의하여 생산된 엔도글루카나제, 베타글루코시다제 및 하기 (i), (ii) 및 (iii)으로 이루어진 군에서 선택되는 단백질을 포함하는 것인, 셀룰라제 칵테일;
    (i) PaCEL1 (Polyporus acularius Cel1) 및 PaCel2 (Polyporus acularius Cel2),
    (ii) HgCBH1 (Humicola grisea Cellobiohydrolase 1) 및 ClCBH2 (Chrysosporium lucknowense Cellobiohydrolase 2), 및
    (iii) CfCex1 (Cellulomonas fimi Cex1) 및 ClCBH2 (Chrysosporium lucknowense Cellobiohydrolase 2).
  17. 제16항의 셀룰라제 칵테일을 이용하여 바이오매스를 당화하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 셀룰라제 칵테일은 추가적으로 헤미셀룰라제를 포함하는 것인, 셀룰라제 칵테일.
  19. 제18항에 있어서, 상기 헤미셀룰라제는 엔도자일라나제와 베타자일로시다제를 포함하는 것인, 셀룰라제 칵테일.
  20. 제19항에 있어서, 상기 엔도자일라나제는 TrXynII (Trichoderma reesei xylanase II) 단백질이고, 상기 베타자일로시다제는 TrBxl (Trichoderma reesei beta-xylosidase)인 것인, 셀룰라제 칵테일.
  21. 제18항의 셀룰라제 칵테일을 이용하여 바이오매스를 당화하는 방법.
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