CN106676126B - 高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法 - Google Patents
高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106676126B CN106676126B CN201510741236.5A CN201510741236A CN106676126B CN 106676126 B CN106676126 B CN 106676126B CN 201510741236 A CN201510741236 A CN 201510741236A CN 106676126 B CN106676126 B CN 106676126B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- trichoderma reesei
- lvk
- xyn
- sequence
- recombinant expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 title claims abstract description 68
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 32
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 101150052795 cbh-1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 16
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000233894 Neocallimastix patriciarum Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 2
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 2
- 150000002994 phenylalanines Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- RCAUJZASOAFTAJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N RCAUJZASOAFTAJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NYDIVDKTULRINZ-AVGNSLFASA-N Arg-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NYDIVDKTULRINZ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- DNLQVHBBMPZUGJ-BQBZGAKWSA-N Arg-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O DNLQVHBBMPZUGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N Asn-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WZUZGDANRQPCDD-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N WZUZGDANRQPCDD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JUWISGAGWSDGDH-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JUWISGAGWSDGDH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UEHCDNYDBBCQEL-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N UEHCDNYDBBCQEL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YNJBLTDKTMKEET-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YNJBLTDKTMKEET-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010001682 Dextranase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- RMOCFPBLHAOTDU-ACZMJKKPSA-N Gln-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMOCFPBLHAOTDU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LPYPANUXJGFMGV-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LPYPANUXJGFMGV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- YRWWJCDWLVXTHN-LAEOZQHASA-N Gln-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N YRWWJCDWLVXTHN-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- ZGHMRONFHDVXEF-AVGNSLFASA-N Gln-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZGHMRONFHDVXEF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- DITJVHONFRJKJW-BPUTZDHNSA-N Gln-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N DITJVHONFRJKJW-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- QXQDADBVIBLBHN-FHWLQOOXSA-N Gln-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QXQDADBVIBLBHN-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VAZZOGXDUQSVQF-NUMRIWBASA-N Glu-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O VAZZOGXDUQSVQF-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- LSYFGBRDBIQYAQ-FHWLQOOXSA-N Glu-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LSYFGBRDBIQYAQ-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- GZUKEVBTYNNUQF-WDSKDSINSA-N Gly-Ala-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GZUKEVBTYNNUQF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N Gly-Thr-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N Gly-Thr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N Gly-Val-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- RLAOTFTXBFQJDV-KKUMJFAQSA-N His-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CN=CN1 RLAOTFTXBFQJDV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- QKXZCUCBFPEXNK-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 QKXZCUCBFPEXNK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VKCPHIOZDWUFSW-ONGXEEELSA-N Lys-Val-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VKCPHIOZDWUFSW-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KYJHWKAMFISDJE-RCWTZXSCSA-N Met-Thr-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC KYJHWKAMFISDJE-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMKYAYXCMYYNHI-AVGNSLFASA-N Phe-Gln-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N UMKYAYXCMYYNHI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- APMXLWHMIVWLLR-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Ser Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 APMXLWHMIVWLLR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N Pro-Leu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ZVEQWRWMRFIVSD-HRCADAONSA-N Pro-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)N3CCC[C@@H]3C(=O)O ZVEQWRWMRFIVSD-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- ITUDDXVFGFEKPD-NAKRPEOUSA-N Pro-Ser-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ITUDDXVFGFEKPD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N Ser-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- TUYBIWUZWJUZDD-ACZMJKKPSA-N Ser-Cys-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O TUYBIWUZWJUZDD-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MPPHJZYXDVDGOF-BWBBJGPYSA-N Ser-Cys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CO MPPHJZYXDVDGOF-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- YIUWWXVTYLANCJ-NAKRPEOUSA-N Ser-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O YIUWWXVTYLANCJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- UGTZYIPOBYXWRW-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UGTZYIPOBYXWRW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- CRZNCABIJLRFKZ-IUKAMOBKSA-N Thr-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N CRZNCABIJLRFKZ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N Thr-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N Thr-Pro-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- QJIODPFLAASXJC-JHYOHUSXSA-N Thr-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O QJIODPFLAASXJC-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 1
- 241000355691 Trichoderma reesei QM9414 Species 0.000 description 1
- RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- XQMGDVVKFRLQKH-BBRMVZONSA-N Trp-Val-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 XQMGDVVKFRLQKH-BBRMVZONSA-N 0.000 description 1
- ZWZOCUWOXSDYFZ-CQDKDKBSSA-N Tyr-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZWZOCUWOXSDYFZ-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- NZFCWALTLNFHHC-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NZFCWALTLNFHHC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ULHJJQYGMWONTD-HKUYNNGSSA-N Tyr-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ULHJJQYGMWONTD-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- AVIQBBOOTZENLH-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N AVIQBBOOTZENLH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JHDZONWZTCKTJR-KJEVXHAQSA-N Tyr-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JHDZONWZTCKTJR-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N Val-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- GTACFKZDQFTVAI-STECZYCISA-N Val-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=C(O)C=C1 GTACFKZDQFTVAI-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003519 ventilatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：合成依次由里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn‑LVK基因序列和里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；将表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；将重组表达质粒和pAN7‑1载体轻轻混匀，共转里氏木霉原生质体，经筛选得到高产热稳定性木聚糖酶xyn‑LVK的里氏木霉基因工程菌。本发明中木聚糖酶xyn‑LVK在里氏木霉中表达后，与木聚糖酶xyn‑LVK在毕赤酵母中的表达相比，木聚糖酶xyn‑LVK的产量提升约40%。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法。
背景技术
丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）的表达系统是用于同源和异源基因重组表达的重要工具，在许多方面优于原核表达系统和酵母表达系统。一方面，大肠杆菌表达系统在表达异源蛋白时易形成包涵体，并且表达的酶活性比较低及缺乏糖基化修饰等。另一方面，酵母表达系统存在着过度糖基化和蛋白折叠问题，会影响所表达酶的活性。相比较而言，里氏木霉是表达同源和异源蛋白的理想宿主。首先，里氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如高甘露糖型和N-糖基化等。其次，里氏木霉易于培养，而且培养成本低，培养体积即使达到230m3，里氏木霉的发酵性质保持良好而且不容易受到污染。里氏木霉还被认为是安全的产品生产者，因为它在酶产品生产所需的环境条件下没有致病性和不会产生真菌毒素和抗生素。由于里氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对里氏木霉的遗传改造，为同源或异源蛋白的高效生产提供了一条行之有效的途径。
木聚糖酶在许多工业中被广泛应用，如饲料行业、造纸行业和食品行业。然而，在这些应用中，往往需要酶具有良好的耐热性，宽广的pH和较高的比活。所以，人们不断去寻找新的具有优良性能的可用木聚糖酶，并通过随机突变或者理性设计方法来提高它的性能。其中，来源于瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）的木聚糖酶催化结构域xyn-CD，通过易错PCR将其随机突变得到的重组木聚糖酶Xyn-CDBFV拥有较高的酶活、较宽的pH和良好的耐热性。因此，重组木聚糖酶Xyn-CDBFV在工业产品中具有广泛的应用前景。目前，Cheng, Y.S等详细解析了该蛋白的结构，并结合实验提出了该蛋白的耐热因素。（Cheng，Y.S. et al.（2014）Structural Analysis of a Glycoside Hydrolase Family 11Xylanase from Neocallimastix patriciarum: Insights into the Molecular Basisof a Thermophilic Enzyme. J. Biol. Chem. ）。Xyn-CDBFV具有11家族木聚糖酶典型的β-jelly-roll折叠结构，但是Xyn-CDBFV具有延伸出来的N端结构域（N-terminal region，NTR），这在11家族木聚糖酶结构中是罕见的。NTR是依靠堆积相互作用、氢键和一个二硫键稳定的附着在Xyn-CDBFV的催化中心，而不是做为一个灵活的片段自由的悬挂在外面。Cheng，Y.S等的研究表明：仅删除由11个氨基酸组成的NTR后，Xyn-CDBFV突变株的酶活在55℃和75℃分别降为原来的61.5%和19.5%；仅删除由NTR和催化中心形成的二硫键后，Xyn-CDBFV突变株的酶活在55℃和75℃分别降为原来的86.8%和23.3%。由此可见，NTR在该酶热稳定性中有着重要作用，尤其是NTR和催化中心形成的二硫键更是起着关键作用，在二硫键的作用下，NTR像个夹子一样夹住催化中心，使它在高温下能稳定。
中国专利CN 102757947公开了一种热稳定性改良的木聚糖酶Xyn-CDBFV-m及其基因，其中，对木聚糖酶Xyn-CDBFV的改良之一是将33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分别替换为半胱氨酸，并称其是在木聚糖酶Xyn-CDBFV的N端引入二硫键。但随着Cheng，Y.S等解析了木聚糖酶Xyn-CDBFV蛋白的晶体结构，发现其NTR仅由11个氨基酸组成，因此，对于中国专利CN 102757947中公开的的N端引入二硫键提高木聚糖酶Xyn-CDBFV的热稳定性的结果值得怀疑，因为33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸并非位于木聚糖酶Xyn-CDBFV的N端结构域。
目前，众多学者进行里氏木霉中表达木聚糖酶的研究，但对于将木聚糖酶xyn-CDBFV进行了改造后得到的木聚糖酶在里氏木霉中表达以提升表达产量的研究还未见报道。
发明内容
本发明提供一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，将改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在里氏木霉中表达后，与木聚糖酶xyn-LVK在毕赤酵母中的表达相比，产量显著得升，木聚糖酶xyn-LVK的产量提升约40%。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；
（2）将所述表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；
（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；
（4）抽提所述重组表达质粒，将所述重组表达质粒和pAN7-1载体混匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于含抗生素的PDA固体平板上，进行培养；
（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的PDA固体平板上长孢子；
（6）用无菌水制备孢子悬液，取孢子接种于基本培养基中培养48小时后转接到产酶培养基中培养196小时；取菌液离心，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌；
其中，所述木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述木聚糖酶基因xyn-LVK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
木聚糖酶xyn-CDBFV的改造如下：通过Disulfide by Design软件对xyn-CDBFV上的二硫键进行了在线分析预测。经分析，存在26个可以形成二硫键的潜在位点。它们分别是：4位/172位；7位/217位；7位/218位；11位/45位；28位/65位；29位/42位；50位/60位；55位/58位；57位/204位；61位/198位；70位/74位；83位/172位；83位/218位；91位/208位；95位/117位；95位/118位；97位/115位；100位/200位；102位/195位；129位/145位；131位/143位；141位/164位；176位/179位；184位/189位；199位/219位；205位/208位。其中，NTR和催化中心之间除了已形成的4位/172位二硫键外，还有7位/217位和11位/45位可以设计形成二硫键。结合预测结果，理性的在NTR和催化中心之间设计引入7位/217位和11位/45位二硫键，这样在木聚糖酶xyn-LVK中，NTR和催化中心之间将有三个二硫键，它们使NTR这个“夹子”更稳固的夹住催化中心，使木聚糖酶xyn-LVK在高温下更加稳定。木聚糖酶xyn-CDBFV通过改造后得到木聚糖酶xyn-LVK，木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，木聚糖酶基因xyn-LVK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述SEQ ID NO.1的序列如下：
QSFCSSCSHSCQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWADSGNNSATFYScGSFSCTFQNAGDYLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQNSSNVGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPPGDWVGNKKHGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIDISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFcYAKVYIGD。
所述SEQ ID NO.2的序列如下：
CAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAA。
所述的里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的序列如SEQ ID NO.3所示，为：
GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAA。
所述的里氏木霉cbh1信号肽序列如SEQ ID NO.4所示，为：
ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT。
所述的里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子如SEQ ID NO.5所示，为：
GTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。
具体地，所述高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；
（2）利用PCR技术扩增所述表达框序列，然后利用限制性内切酶EcoRI ，Xba将所述表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；表达载体构建引物序列如下：
上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC（下划线为EcoRI切位点），下游引物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG（下划线为，Xba酶切位点）；
（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；
（4）抽提所述重组表达质粒，将10微克的所述重组表达质粒和10 微克的pAN7-1载体混匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于5个含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养两天，待平板上长出菌丝，将菌丝转接到新的含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养五天；
（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的PDA固体平板上长孢子；
（6）用无菌水制备孢子悬液，取105个孢子接种于30ml的基本培养基中，28℃，250r/min培养48小时后取1.5ml菌液后转接到30ml的产酶培养基中，28℃，250 r/min培养196小时；取菌液，12,000×g 离心 5min，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌；
本发明的有益效果是：将改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在里氏木霉中表达后，与木聚糖酶xyn-LVK在毕赤酵母中的表达相比，产量显著提升，木聚糖酶xyn-LVK的产量提升约40%。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：
本发明中，木聚糖酶的酶活检测方法参照《GB/T23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》。
实施例：高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制备
一、实验条件
（1） 菌株与载体
大肠杆菌E. coli Top10购自Invitrogen公司，里氏木霉QM9414购自美国模式菌种收藏中心（ATCC），pUC19、pMD19-T simple vector购自TaKaRa。质粒pAN7-1（带有真菌筛选标记潮霉素抗性基因hph和大肠杆菌筛选标记氨苄青霉素抗性基因Ap）。
（2）酶类及其他生化试剂
各种DNA工具酶，DNA Marker，DNA胶回收纯化试剂盒（Agarose Gel DNAPurification Kit）、DNA纯化试剂盒（Fragment Purification Kit Ver. 2.0）购自TaKaRa。T4 DNA连接酶购自Fermetas公司。其它生化试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
（3）培养基
LB培养基：用于培养大肠杆菌，含1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠；用NaOH调pH值至7.0；加1.5%（w/v）琼脂粉（固体培养基）。
里氏木霉液体基本培养基：含100 mL/L Mandels营养液浓缩液，1.0 mL/LMandels微量元素浓缩液，18 g/L无水葡萄糖，1.0 g/L蛋白胨，50 mL/L pH 4.5的1 mol/L的柠檬酸缓冲液，1.0-2.0 g/L吐温80。
Mandels 营养盐浓缩液配制：(NH4)2SO4：14 g/L，尿素：3 g/L，KH2PO4：20 g/L，CaCl2·2H2O：4 g/L（或CaCl2：3 g/L），MgSO4·7H2O：3 g/L，加水至1000 mL。
Mandels 微量元素浓缩液配制：FeSO4·7H2O：5 g/L，ZnSO4·7H2O：1.7 g/L(或ZnCl2：0.7 g/L)，CoCl2·6H2O：3.7 g/L（或CoCl2：2 g/L），MnSO4·H2O：1.6 g/L（或MnCl2：1.67 g/L，或MnSO4·7H2O：2.6 g/L），加水至1000 mL。
1mol/L柠檬酸缓冲液配制：柠檬酸：210 g，加NaOH(纯度96%)约78 g，加水750 mL，冷却后加水至1000 mL。
PDA固体培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，2 %葡萄糖，1.5 %Agar。20%土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 mL，煮沸30 min，用三层纱布过滤，加入葡萄糖后定容。筛选里氏木霉转化子时加入终浓度为100 g/mL的潮霉素。
产酶培养基：50 g/L黄豆饼粉，70 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，100 ml/L Mandels营养盐浓缩液，1 ml/L Mandels微量元素浓缩液，50 mL/L pH 4.5的1 mol/L的柠檬酸缓冲液，0.5 g/L吐温80，加水到1000 ml。
二、高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制备方法如下：
（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；表达框序列如下：
GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAAATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAAGTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。
（2）利用PCR技术扩增表达框序列，然后利用限制性内切酶EcoRI ，XbaI将表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；重组表达质粒构建引物序列如下：
上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC（下划线为EcoRI切位点），下游引物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG（下划线为，XbaI酶切位点）。
（3）将重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组表达质粒。
（4）抽提重组表达质粒，将10微克的重组表达质粒和10微克的pAN7-1载体混匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于5个含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养两天，待平板上长出菌丝，将菌丝转接到新的含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养五天；
（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的PDA固体平板上长孢子。
（6）将制得的孢子用无菌水制备孢子悬液，取105个孢子接种于30ml的基本培养基中，28℃，250 r/min培养48小时后取1.5ml菌液后转接到30ml的产酶培养基中，28℃，250r/min培养196小时；取菌液，12,000×g 离心 5min，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌。
三、里氏木霉基因工程菌在发酵罐水平的小试表达
里氏木霉基因工程菌发酵用5.0L发酵罐进行实验，将上述获得的高木聚糖酶活性转化子进行发酵水平发酵试验，产酶培养基发酵罐装液量3.0L，接装液量5%～10%的摇瓶种子培养液。发酵条件：28℃，搅拌速度300～500rpm，通气量0.5～1vvm，pH4.5。随着发酵时间的延长，发酵上清液中木聚糖酶酶活力显著增加，发酵170h后木聚糖酶活性可达101260 U/mL，菌体湿重达323g/L。
比较例：木聚糖酶xyn-LVK在毕赤酵母中的高效表达
实验条件
（1）菌株与载体
毕赤酵母 GS115、载体 pPIC9K 购自 Invitrogen 公司；大肠杆菌DH5α 菌株已在《刘静华，包英华，陈燕飞；大肠杆菌DH5α 感受态细胞转化率的改进，韶关学院学报，2008，29(03) ：87-90》文献中公开，大肠杆菌DH5α 菌株的感受态细胞可通过供应商天根生化科技( 北京) 有限公司购买，货号CB101-03。
（2）酶类及其他生化试剂
内切酶、连接酶购自TaKaRa公司，其它都为国产试剂。
（3）培养基
大肠杆菌培养基为LB（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0）。酵母培养基为YPD（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）。酵母筛选培养基为MD（2％葡萄糖，1.5%琼脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、MM（0.5%甲醇（体积分数），1.5%琼脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、RDB（1M山梨醇，2％葡萄糖，0.00004％生物素，1.34％YNB ，0.005%氨基酸）。酵母诱导培养基 BMGY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％生物素、1％甘油（体积分数））和BMMY（除以0.5％甲醇（体积分数）代替甘油，其余成份相与 BMGY 相同）。
（4）表达载体的构建及其在酵母的表达
以合成的木聚糖酶xyn-LVK基因为模板，设计合成了带有EcoRI和NotI限制性酶切位点的引物xyn-LVK-F 和 xyn-LVK-R，对xyn-LVK的成熟蛋白的编码区进行扩增，并利用EcoRI和NotI酶切PCR产物，连接进入表达载体 pPIC9K，使木聚糖酶xyn-LVK基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9K-xyn-LVK，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。约5微克的用限制性内切酶BglII进行线性化的重组表达质粒，电击转化酵母GS115感受态细胞，涂布于组氨酸缺陷性的 RDB 平板，30℃培养2-3天，挑取在RDB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。
酵母表达引物序列如下 ：
xyn-LVK-F：CCGGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCA（下划线为EcoRI酶切位点）
xyn-LVK-R：ATAAGAATGCGGCCGCTTAATCACCAATGTAAACCTTTGCGTA（下划线为NotI酶切位点）
（5）高木聚糖酶活性转化子的筛选
用灭过菌的牙签从长有转化子的 RDB 平板上挑取单菌落， 按照编号先点到 MM平板上，再点到相应编号的MD平板上。将点有转化子的MM、MD 平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从 MD 平板上挑取转化子接种于装有BMGY培养基的摇瓶中，30℃、250rpm摇床培养约48h；将摇瓶中培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，改用含有体积分数为0.5％的甲醇的BMMY培养基，在30℃、260rpm诱导培养；诱导培养48h后，取菌液，3,000×g 离心 5min， 取上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子。
（6）高木聚糖酶活性转化子在发酵罐水平的小试表达
高细胞密度发酵用5L发酵罐进行实验，按照Invirogen公司的毕赤酵母发酵过程指导（Pichia Fermentation Process Guidelines）操作。将上述获得的高木聚糖酶活性转化子进行发酵水平高密度发酵试验。随着甲醇诱导时间的延长，发酵上清液中木聚糖酶酶活力显著增加，诱导180h后木聚糖酶活性可达72325 U/mL，菌体湿重达413g/L。
实施例与比较例相比，里氏木霉基因工程菌发酵产木聚糖酶xyn-LVK的产量显著提升，产量提升约40%。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 深圳市绿微康生物工程有限公司
<120> 高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法
<130> LVK201502
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 225
<212> PRT
<213> 瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）
<400> 1
Gln Ser Phe Cys Ser Ser Cys Ser His Ser Cys Gln Ser Val Lys Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Val Gly Thr Ile Gly Gly Val Gly Tyr Glu Leu Trp
20 25 30
Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Cys Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Cys Thr Phe Gln Asn Ala Gly Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly Leu
50 55 60
Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr Pro Ser Gln Ile Gly Arg Met Lys Ala
65 70 75 80
Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Asn Ser Ser Asn Val Gly Tyr Ser Tyr
85 90 95
Val Gly Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile
100 105 110
Val Asp Asn Trp Leu Ser Pro Phe Pro Pro Gly Asp Trp Val Gly Asn
115 120 125
Lys Lys His Gly Ser Phe Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Thr Val Tyr
130 135 140
Glu Asn Thr Arg Thr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asp Thr Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp
165 170 175
Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly
180 185 190
Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly
195 200 205
Gly Ala Ser Gly Thr Ala Asp Phe Cys Tyr Ala Lys Val Tyr Ile Gly
210 215 220
Asp
225
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）
<400> 2
caaagtttct gtagttcatg ttctcactct tgtcaaagtg taaaggtaac cggcaacaag 60
gttggaacta ttggtggtgt tggttacgaa ttatgggctg atagtggtaa taacagtgct 120
actttctatt cttgtggttc cttctcatgt actttccaaa atgctgggga ttacttatgt 180
cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tatgaaggct 240
gatttcaaac ttgtcaaaca aaatagttcc aatgttggtt attcctatgt tggtgtttac 300
ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360
ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420
tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480
caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540
tttgatcaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600
ggtgaagccg gtaacgttaa cggtggtgcc agtggtactg ctgatttctg ttacgcaaag 660
gtttacattg gtgattaa 678
<210> 3
<211> 1437
<212> DNA
<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）
<400> 3
gacgcagaag aaggaaatcg ccccgccggt tccgtaaaaa aaatatgagc gcagggacaa 60
gcacagcctt ggccctgggc ctagccttgc gccttgtttg atgcaatcgg cgacatgtcg 120
aatgctgtaa ttttttttgt ttaggttccc cttttccttt tgtgttaata ataattctcg 180
aagggcgctg attttgaaat ttgtcggtga gagccaaacg gatatacagg cgcggctgat 240
gaataatgat gaatcgagct gacttgatgc tgtatgtaca atattgactg cgaggaccat 300
caggtgttgt atggatggaa tcattctgta accaccaagg tgcatgcatc ataaggtatt 360
ctcctcagct caccaacaac gaacgatggc catgttagta aaggcaccgt gatggcaaga 420
tagaaccact attgcatctg cgcttcccac gcacagtacg tcaatgtaac gtcaaagccg 480
ccctcccgta acctcgcccg ttgttgctcc ccccgattgc ctcaatcaca tagtacctac 540
ctatgcatta tggcgcctca acccaccccc ccagattgag agctacctta catcaatatg 600
gccagcacct cttcggcgat acatactcgc caccccagcc ggggcgattg tgtgtactag 660
gtaggctcgt actataccag caggagaggt gctgcttggc aatcgtgctc agctgttagg 720
ttgtacttgt atggtacttg taaggtggtc atgcagttgc taaggtacct agggagggat 780
tcaacgagcc ctgcttccaa tgtccatctg gataggatgg cggctggcgg ggccgaagct 840
gggaactcgc caacagtcat atgtaatagc tcaagttgat gataccgttt tgccaggatt 900
aggatgcgag aagcagcatg aatgtcgctc atccgatgcc gcatcaccgt tgtgtcagaa 960
acgaccaagc taagcaacta aggtacctta ccgtccacta tctcaggtaa ccaggtacta 1020
ccagctaccc tacctgccgt gcctacctgc tttagtatta atctttccac ctccctcctc 1080
aatcttcttt tccctcctct cctctttttt ttttcttcct cctcttcttc tccataacca 1140
ttcctaacaa catcgacatt ctctcctaat caccagcctc gcaaatcctc aggttagtat 1200
tactactact acaatcatca ccacgatgct ccgcccgacg atgcggcttc tgttcgcctg 1260
cccctcctct cactcgtgcc cttgacgagc taccccgcca gactctcctg cgtcaccaat 1320
ttttttccct atttacccct cctccctctc tccctctcgt ttcttcctaa caaacaacca 1380
ccaccaaaat ctctttggaa gctcacgact cacgcaagct caattcgcag atacaaa 1437
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）
<400> 4
atgtatcgga agttggccgt catcacggcc ttcttggcca cagctcgtgc t 51
<210> 5
<211> 909
<212> DNA
<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）
<400> 5
gtgctgtgtt cctcagaatg ggccccagaa gggcgtcgag cattgtctat gaatgcaaac 60
aaaaatagta aataaatagt aattctggcc atgacgaata gagccaatct gctccacttg 120
actatccttg tgactgtatc gtatgtcgaa cccttgactg cccattcaaa caattgtaaa 180
ggaatatgag ctacaagtta tgtctcacgt ttgcgtgcga gcccgtttgt acgttatttt 240
gagaaagcgt tgccatcaca tgctcacagt cacttggctt acgatcatgt ttgcgatctt 300
tcggtaagaa tacacagagt aacgattata catccatcgc tttctatgat taggtactca 360
gacaacacat gggaaacaag ataaccatcg catgcaaggt cgattccaat catgatctgg 420
actggggtat tccatctaag ccatagtacc ctcgagagaa ggaatggtag gacctctcag 480
gcgtccacca tctgtgctgc aaatccaaga aaccccccaa aagcacctac ctatctacct 540
agagtaatct gcacgagaaa agaaaaggag cagaagaaga atgatctcaa gaggccgtga 600
acgcagaaac acactcctcc caacttttca agttttgaac aaaaaaagaa agatgaggac 660
tagaagatgg agtatttcct tcttagagag ctctcggtga ggtgacctgt cagggtttac 720
ctcaaaccgt ctgtggttct atccaattaa tcaagtccct ctcctctcct cttctctcct 780
gtcctttcat agaatccctt ttccttgttg cttgatcgaa gcgggttatc gacgccacca 840
aagtattgtc ttggtgactt atcaaatccc tttggtgatc aaacagcccc cgagtgatca 900
gatccgtaa 909
Claims (2)
1.一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：
（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉 cbh1 信号肽序列、木聚 糖酶 xyn-LVK 基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；
（2）利用 PCR 技术扩增所述表达框序列，然后利用限制性内切酶 EcoRI，XbaI 将所述表达框序列克隆至 pUC19 中，得到重组表达质粒；表达载体构建引物序列如下：上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC，其中，下划线为 EcoRI酶切位点；下游引 物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG，其中，下划线为 XbaI 酶切位点；
（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞 DH5a，阳性转化子进行 DNA 测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；
（4）抽提所述重组表达质粒，将所述重组表达质粒和 pAN7-1 载体混匀，共转里氏木霉原 生质体，涂布于含抗生素的 PDA 固体平板上，进行培养；
（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的 PDA 固体平板上长孢子；
（6）用无菌水制备孢子悬液，取孢子接种于基本培养基中培养 48 小时后转接到产酶培养
基中培养 196 小时；取菌液离心，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性 的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶 xyn-LVK 的里氏木霉基因工程菌； 其中，所述木聚糖酶 xyn-LVK 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示，所述木聚糖酶基因 xyn-LVK的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉 cbh1 信号肽序列、木聚 糖酶 xyn-LVK 基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；
（2）利用 PCR 技术扩增所述表达框序列，然后利用限制性内切酶 EcoRI ，XbaI 将所述表 达框序列克隆至 pUC19 中，得到重组表达质粒；表达载体构建引物序列如下：上游引物： CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC，其中，下划线为 EcoRI 酶切位点；下游引 物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG，其中，下划线为 XbaI 酶切位点；
（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，阳性转化子进行 DNA 测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；
（4）抽提所述重组表达质粒，将 10 微克的所述重组表达质粒和 10 微克的 pAN7-1载体混 匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于 5 个含抗生素的 PDA 固体平板上，28℃培养两天，待 平板上长出菌丝，将菌丝转接到新的含抗生素的 PDA 固体平板上，28℃培养五天；
（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的 PDA 固体平板上长孢子；
（6）用无菌水制备孢子悬液，取 105 个孢子接种于 30ml 的基本培养基中，28℃，250r/min 培养 48 小时后取 1.5ml 菌液后转接到 30ml 的产酶培养基中，28℃，250 r/min培养 196 小 时；取菌液，12,000×g 离心 5min，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶 xyn-LVK 的里氏木霉基因工程菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510741236.5A CN106676126B (zh) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | 高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510741236.5A CN106676126B (zh) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | 高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106676126A CN106676126A (zh) | 2017-05-17 |
| CN106676126B true CN106676126B (zh) | 2019-08-13 |
Family
ID=58857552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510741236.5A Active CN106676126B (zh) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | 高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106676126B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109402091B (zh) * | 2017-08-18 | 2022-02-11 | 潍坊康地恩生物科技有限公司 | 木聚糖酶突变体 |
| CN107988127B (zh) * | 2017-11-02 | 2021-09-03 | 南京农业大学 | 里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用 |
| CN109988715B (zh) * | 2017-12-29 | 2022-03-01 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种高产木聚糖酶的突变菌株及其应用 |
| CN108642075A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-10-12 | 深圳大学 | 适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体及其制备方法 |
| CN111349569B (zh) * | 2018-12-24 | 2022-05-31 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种里氏木霉及其在木聚糖酶生产中的应用 |
| CN112961788B (zh) * | 2021-02-24 | 2023-06-13 | 江南大学 | 一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560513A (zh) * | 2009-05-15 | 2009-10-21 | 邢苗 | 一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用 |
-
2015
- 2015-11-05 CN CN201510741236.5A patent/CN106676126B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560513A (zh) * | 2009-05-15 | 2009-10-21 | 邢苗 | 一种里氏木霉表达盒及其重组菌株和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Achieving efficient protein expression in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters;Junxin Li et al.;《Microbial Cell Factories》;20120618;第11卷(第84期);第1页左栏第1段至第9页左栏第2段 |
| Structural Analysis of a Glycoside Hydrolase Family 11 Xylanase from Neocallimastix patriciarum INSIGHTS INTO THE MOLECULAR BASIS OF A THERMOPHILIC ENZYME;Ya-Shan Cheng et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20140418;第289卷(第16期);Descriptions，Alignments，REFERENCE，FEATURES和摘要，第11020页右栏第1段至第11026页右栏最后1段 |
| 木聚糖酶EvXyn11TS 耐热性与其N 端二硫键的相关性分析;闵柔 等;《微生物学报》;20130404;第53卷(第4期);摘要，第346页左栏第1段至第351页左栏最后1段 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106676126A (zh) | 2017-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106676126B (zh) | 高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法 | |
| CN106676086B (zh) | 一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因 | |
| CN106978360B (zh) | 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用 | |
| CN107574159A (zh) | 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体 | |
| JPH0773499B2 (ja) | 組換えｄｎａ発現ベクタ−およびペニシリウム・クリソゲナムのイソペニシリンｎシンセタ−ゼをコ−ドしているｄｎａ化合物 | |
| CN105838729B (zh) | 一种新型高活力蒜氨酸酶及其制备方法 | |
| CN109022438B (zh) | 一种角蛋白酶异源表达的启动子及其应用 | |
| CN110117602A (zh) | 灰树花udp-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用 | |
| CA2198828C (en) | Method for increasing thermostability in cellulase emzymes by removal of the cellulose binding domains | |
| CN104480087B (zh) | 一种耐高温α‑淀粉酶及其制备方法和应用 | |
| CN109468240A (zh) | 一种表达天冬酰胺氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法 | |
| CN108588060A (zh) | 一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶 | |
| CN107746836A (zh) | 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体 | |
| CN1814761B (zh) | 吡咯喹啉醌合成相关基因及其编码蛋白 | |
| CN110106160A (zh) | 催化活性提高的碱性蛋白酶突变体prok-g及其编码基因和应用 | |
| CN101993887A (zh) | 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 | |
| CN103966110A (zh) | 一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌 | |
| CN102485890A (zh) | 用毕赤酵母分泌表达重组人蛋白质二硫键异构酶 | |
| CN113755509A (zh) | 溶血磷脂酶变体及其构建方法和在黑曲霉菌株中的表达 | |
| CN101649340A (zh) | 人白细胞介素18的制备方法 | |
| CN102533841B (zh) | 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法 | |
| CN110923223A (zh) | 一种新型腈水解酶及其应用 | |
| CN105838693B (zh) | 一种耐高温酸性果胶酶pagl8及其基因和应用 | |
| CN110527690A (zh) | 一种耐热型单宁酶及其应用 | |
| CN108864293A (zh) | 一种由犬白蛋白与犬干扰素γ组成的融合蛋白及其制备方法和一种重组犬长效干扰素γ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170613 Address after: 247099 Shuanglong Road 1, Chizhou economic and Technological Development Zone, Anhui, China Applicant after: ANHUI LEVEKING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 518055, a biological incubator building in central high tech Zone, Shenzhen, Guangdong, 2-112, 113, Nanshan District Applicant before: SHENZHEN LEVEKING BIOLOGY ENGINEERING Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200416 Address after: Room 1201, building a, Qiaode science and Technology Park, No.7, West District, Guangming high tech park, Tianliao community, Yutang street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: SHENZHEN BAGEMEI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 247099 Shuanglong Road 1, Chizhou economic and Technological Development Zone, Anhui, China Patentee before: ANHUI LEVEKING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230529 Address after: 518000 room 1201, building a, Qiaode science and Technology Park, No.7, West District, Guangming Gaoxin Park, Tianliao community, Yutang street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: Benhu (Shenzhen) Investment Co.,Ltd. Address before: 518000 room 1201, building a, Qiaode science and Technology Park, No.7, West District, Guangming Gaoxin Park, Tianliao community, Yutang street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee before: SHENZHEN BAGEMEI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 518000 room 1201, building a, Qiaode science and Technology Park, No.7, West District, Guangming Gaoxin Park, Tianliao community, Yutang street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: Shenzhen Dinghong Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 518000 room 1201, building a, Qiaode science and Technology Park, No.7, West District, Guangming Gaoxin Park, Tianliao community, Yutang street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee before: Benhu (Shenzhen) Investment Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |