CN106591254A - 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用 - Google Patents

一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明对来源于Anaerobranca gottschalkii的环糊精葡萄糖基转移酶的受体位点附近进行改造提高环糊精葡萄糖基转移酶对对苯二酚的转化率，对CGTase的265位的酪氨酸，332位的天冬酰胺进行定点突变，获得的单突变体酶的α‑熊果苷的生产能力较野生型CGTase有所增加，产物中α‑熊果苷的产量比野生型分别提高了1.6、1.4、1.2倍，更利于α‑熊果苷的生产。

Description

一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
熊果苷(arbutin)又称熊果素、熊果甙、熊果叶甙、熊果酚甙或杨梅甙，存在于一种来源于杜鹃花科熊果属的灌木植物一熊果叶子细胞中，是一种新兴的无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质，广泛应用于化妆品行业。美白机理为熊果苷对酪氨酸酶产生的竞争性及可逆性抑制，从而阻断多巴及多巴醌的合成，进而抑制了黑色素的生成。依据结构不同可将熊果苷分为α型和β型，α-熊果苷是β-熊果苷的差向异构体，并且其美白效果是β-熊果苷10倍以上，从安全性上考虑，α-熊果苷比β-熊果苷更具有较高的安全性。鉴于α-熊果苷是一种更高效、更安全的美白活性物质，国内外许多家化妆品公司已采用α-熊果苷代替β-熊果苷作为美白添加剂。除此之外熊果苷还具有抗炎、抑菌镇咳、平喘抗氧化的作用。
目前文献报道的熊果苷的制备方法分别为天然产物提取法、植物组织培养法、化学合成法以及酶转化法。α-熊果苷的制备方法主要是通过微生物细胞转化法和酶法合成制得，其中微生物细胞转化法是通过不同微生物的酶将糖基转移，一分子葡萄糖的葡糖基转移至一分子对苯二酚(HQ)上形成了单一的α-熊果苷。酶法转化生产α-熊果苷主要是将糖基转移酶作为催化剂，通过催化糖基转移来合成α-熊果苷，而其中转糖基反应中酶底物一般是双糖或多糖，酶法生产α-熊果苷具有简单方便的优势。
环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransfer，CGT酶，EC2.4.1.19)是一种胞外酶，同时也是一种多功能酶，能催化3种转糖基反应(歧化、环化和耦合反应)和水解反应。CGTases共有5个结构域，其中B域含有一个明显的底物结合凹槽，通过凹槽周围氨基酸与底物结合。在底物结合凹槽中存在9个亚位点，标记为+2～-7，每个亚位点能结合一个葡萄糖残基。对CGTase关键氨基酸的定点突变往往会造成酶活力的变化。然而对亚位点附近涉及的氨基酸进行突变的结果显示，改变该位点附近氨基酸对酶学性质的影响无法预期，例如对Leu194、Ala230和His233进行定点饱和突变，附近氨基酸残基的突变能有效提高CGT酶与底物分子的亲和性，而将230位的Ala突变为Val后，歧化活力大大降低，其水解能力成为突变酶的主要反应。因此，获得一种歧化活力提高且其它酶学性质不发生显著改变的环糊精转移酶对于降低熊果苷的工业化生产成本，提高产物的转化率具有重要的应用潜力。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是将Anaerobranca gottschalkii来源的环糊精葡萄糖基转移酶的第265位氨基酸和332位氨基酸进行突变后获得的突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述Anaerobranca gottschalkii来源的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第265位酪氨酸突变为丙氨酸(Ala)，获得序列如SEQ ID NO.2所示突变体，命名为Y265A。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第265位酪氨酸突变为组氨酸(His)，获得序列如SEQ ID NO.3所示突变体，命名为Y265H。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第332位天冬酰胺(Asn)突变为苏氨酸(Thr)，获得序列如SEQ ID NO.4所示突变体，命名为N332T。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞系。
本发明的第四个目的是提供获得所述突变体的方法，是将SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列的第265位酪氨酸突变为丙氨酸或组氨酸，或将第332位天冬酰胺突变为苏氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)由结构比对确定突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带编码SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因的载体为模板，采用基于一步PCR介导的定点突变方法对编码CGTase的基因进行定点突变；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞E.coli BL21(DE3)；
(3)分别将测序正确成功突变的菌株接种于10mL的LB培养基中，200r/min摇床，37℃培养8-10h。取上述菌液按4％(V/V)的接种量，接种至100mL TB，37℃培养当菌体长至OD600为0.6时，添加IPTG至0.01mmol/L，25℃继续诱导48h后，发酵液8000r/min、4℃离心15min，除去菌体，上清即为粗酶液。
本发明的第五个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种。
本发明的第六个目的是提供一种发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的方法，是将所述基因工程菌按体积3～6％接种至TB培养基中，培养至OD600为0.4～0.8，加入IPTG诱导24～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述接种是接种在LB培养基中培养的种子液。
在本发明的一种实施方是中，所述种子液是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，200～250r/min，30～37℃培养8-10h获得的。
本发明还提供所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在食品、生物、医药、日化领域的应用。
有益效果：本发明提供了一种CGTase酶活提高的突变体，在适当的培养条件下，突变体Y265A、Y265H和N332T的歧化活力可增强15％；产物中α-熊果苷的产量比野生型分别提高了1.6、1.4、1.2倍。
具体实施方式
酶活测定方法：
甲基橙法测定α-环化活力的方法：装有2.0mL预先用50mM的磷酸缓冲液(pH5.5)配制的1％(w/v)可溶性淀粉溶液45℃预热10min，取稀释到适当浓度的酶液0.1mL加入体系中，在45℃下反应10min后，用0.2mL 3.0M的盐酸终止反应，再加入0.2mL用0.44mM甲基橙，在16℃下保温15min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需的酶量。
歧化活力：取600μL含有终浓度4mmol·L-1的4-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖-4-6-O-亚乙基(EPS)和20mmol·L-1的麦芽糖溶液于50℃保温10min，然后加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加入50μL 3mol·L-1HCl终止反应，5min后用50μl 3M NaOH溶液中和，然后加入100μLα-葡萄糖苷酶于60℃反应60min，加入100μL 1mol·L-1Na2CO3溶液将pH调节到8以上，401nm处测定溶液的吸光值。一个酶活单位(U)定义为每分钟转化1μmol EPS所需的酶量。
熊果苷含量测定：采用HPLC进行产物分析的色谱条件是:Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，Agilent SB-Aq 5μm(4.6mm×250mm)，LC-9A紫外检测器；流动相为80％v/v的10mM的稀磷酸-甲醇，流速0.6mL min-1；检测波长281nm,柱温35℃。
实施例1
(1)环糊精葡萄糖基转移酶突变体的构建
利用快速PCR技术，根据Anaerobranca gottschalkii的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列(NCBI数据库登陆号：CAH61550.1)，分别设计并合成引入Y265A、Y265H和N332T的突变的引物对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变(下划线为突变碱基)。
引入序列Y265A突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GGTGAGTGG GCTTTAGGTAAAGATGAA-3’
反向引物：5’-TTCATCTTTA CCTAAAGCCC ACTCACC-3’
引入序列如Y265H突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GGTGAGTGG CATTTAGGTAAAGATGAA-3’
反向引物：5’-TTCATCTTTA CCTAAATGCC ACTCACC-3’
引入序列如N332T突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-TTCATCTTTA CCTAAAGCCC ACTCACC-3’
反向引物：5’-GCGATCCATA TCATGAGTAT CAATAAAAGT-3’
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
上述模板DNA为cgt/pET20b(+)，其构建方法已于2012年题为Effect oforganicsolvents on the yield and specificity of cyclodextrins by recombinantcyclodextrin glucanotransferase(CGTase)from Anaerobranca gottschalkii的论文中公开。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃7min30s)；72℃继续延伸10min。
PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。
将上述携带突变基因的质粒，转化至大肠杆菌中，筛选阳性克隆，获得重组菌株，分别命名为Y265A、Y265H和N332T。
2)突变体酶及野生酶的表达与纯化
分别将测序正确成功突变的菌株接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，200r/min摇床，37℃培养8-10h。取上述菌液按4％(V/V)的接种量，接种至100mL TB(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养当菌体长至OD600为0.6时，添加IPTG至0.01mmol/L，25℃继续诱导48h后，发酵液8000r/min、4℃离心15min，除去菌体，上清即为粗酶液。
将按照上述方法获得的上清液中缓慢加入的(NH4)2SO4终浓度为25％，4℃放置盐析过夜。4℃、10000g离心15min，收集沉淀后用20mM磷酸缓冲液(pH 6.5)复溶沉淀，在20mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.5)中透析过夜，更换2-3次透析缓冲液，获得的浓缩后的酶液。
野生酶的摇瓶发酵的粗酶液的歧化活力为60U/mL，Y265A、Y265H和N332T的歧化活力分别为69U/mL、65U/mL和40U/mL此外，酶学定性实验结果表明，各突变体的酶学性质均与野生酶相似。
实施例2
在20mmol/L pH 6.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液体系中包含50g/L麦芽糊精、8g/LHQ，60U/mL的四种CGTase，于水浴摇床中反应24h，反应结束后加入葡萄糖淀粉酶，于40℃反应4h后，沸水浴5min灭活，离心后经高效液相色谱(HPLC)分析。
表1野生酶以及突变体生产α-熊果苷的转化率
结果见表1，与野生酶相比，突变体实现了α-熊果苷转化率的提高，其中突变体Y265A、Y265H和N332T合成α-熊果苷的转化率与野生酶相比分别提高了1.6、1.4、和1.2倍。
实施例3
采用与实施例1～2相同的策略将SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖转移酶第265位和332位氨基酸分别突变为Arg和Tyr，获得的突变体分别命名为Y265R和N332Y；将第106位和189位氨基酸分别突变为Phe和Thr，获得的突变体分别命名为Y106F、T189T，测定突变体酶活及α-熊果苷转化率，结果如表2所示，制备的突变体歧化活力低于20U/mL,且生产α-熊果苷的转化率低于18％，远低于野生酶的水平。
表2突变体生产α-熊果苷的转化率
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备及应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Thr Gln Asn Ser Leu Glu His Ile Lys Glu His Thr Ser Val Asn Asn
1 5 10 15
Gln Val Asn Tyr Ala Thr Asp Val Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg
20 25 30
Phe Leu Asp Gly Asp Lys Tyr Asn Asn Pro Thr Cys Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Ser Glu Asp Gly Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Gly Gly Asp Trp Arg
50 55 60
Gly Ile Ile Gln Lys Ile Glu Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Met Gly Ile
65 70 75 80
Ser Ala Ile Trp Ile Ser Ser Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ala Val His
85 90 95
Pro Gln Phe Gly Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys
100 105 110
Arg Asn Asn Pro Phe Phe Gly Asp Leu Asn Asp Phe Arg Glu Leu Ile
115 120 125
Ala Val Ala Asn Glu His Asp Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Asn Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Phe Val Ala Ser Tyr Ser Asn Asp
165 170 175
Leu Asn Glu Ile Phe Tyr His Phe Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Tyr
180 185 190
Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Gly Leu Asn Leu
195 200 205
Asn Asn Asn Phe Val Asp Gln Tyr Leu Arg Asp Ser Ile Lys Phe Trp
210 215 220
Leu Asp Leu Gly Val Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met
225 230 235 240
Pro Leu Gly Trp Gln Lys Ser Phe Val Asp Thr Ile Tyr Asn His Lys
245 250 255
Pro Val Phe Val Phe Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Lys Asp Glu Tyr Asp
260 265 270
Pro Asn Tyr Tyr His Phe Ala Asn Asn Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp
275 280 285
Phe Glu Phe Ala Gln Thr Thr Arg Ser Val Phe Arg Asn His Glu Lys
290 295 300
Asn Met Phe Asp Leu Tyr Asp Met Leu Lys Asn Thr Glu Asn Asn Tyr
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325 330 335
Arg Phe His Tyr Asp Gly Ala Thr Lys Arg Asn Val Glu Ile Gly Leu
340 345 350
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355 360 365
Glu Gln Tyr Leu Thr Gly Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Lys Pro Met
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Ser Ser Phe Asp Gln Asn Thr Lys Ala Tyr Lys Ile Ile Gln Lys Leu
385 390 395 400
Ala Pro Leu Arg Lys Ser Asn Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Thr Thr Gln
405 410 415
Glu Arg Trp Leu Asn Asn Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly
420 425 430
Asn Asn Ile Val Leu Val Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Gln Ser Tyr
435 440 445
Ser Ile Thr Gly Leu Asn Thr Lys Leu Pro Glu Gly Tyr Tyr Tyr Asp
450 455 460
Glu Leu Asp Gly Leu Leu Ser Gly Lys Ser Ile Thr Val Asn Pro Asp
465 470 475 480
Gly Ser Val Asn Gln Phe Ile Ile Asn Pro Gly Glu Val Ser Ile Trp
485 490 495
Gln Phe Ala Gly Glu Thr Ile Thr Pro Leu Ile Gly Gln Val Gly Pro
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530 535 540
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<211> 687
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Asp Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Thr Leu Glu Phe Lys Phe Ile Lys
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Ile Asp Glu Ser Gly Asn Val Ile Trp Gln Ser Gly Leu Asn Arg Val
660 665 670
Tyr Thr Thr Pro Glu Lys Gly Thr Asp Thr Ile Tyr Phe Glu Trp
675 680 685
<210> 3
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Thr Gln Asn Ser Leu Glu His Ile Lys Glu His Thr Ser Val Asn Asn
1 5 10 15
Gln Val Asn Tyr Ala Thr Asp Val Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg
20 25 30
Phe Leu Asp Gly Asp Lys Tyr Asn Asn Pro Thr Cys Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Ser Glu Asp Gly Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Gly Gly Asp Trp Arg
50 55 60
Gly Ile Ile Gln Lys Ile Glu Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Met Gly Ile
65 70 75 80
Ser Ala Ile Trp Ile Ser Ser Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ala Val His
85 90 95
Pro Gln Phe Gly Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys
100 105 110
Arg Asn Asn Pro Phe Phe Gly Asp Leu Asn Asp Phe Arg Glu Leu Ile
115 120 125
Ala Val Ala Asn Glu His Asp Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro
130 135 140
Asn His Thr Ser Pro Ala Glu Val Asn Asn Pro Asn Tyr Ala Glu Asp
145 150 155 160
Gly Asn Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Phe Val Ala Ser Tyr Ser Asn Asp
165 170 175
Leu Asn Glu Ile Phe Tyr His Phe Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Tyr
180 185 190
Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Gly Leu Asn Leu
195 200 205
Asn Asn Asn Phe Val Asp Gln Tyr Leu Arg Asp Ser Ile Lys Phe Trp
210 215 220
Leu Asp Leu Gly Val Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met
225 230 235 240
Pro Leu Gly Trp Gln Lys Ser Phe Val Asp Thr Ile Tyr Asn His Lys
245 250 255
Pro Val Phe Val Phe Gly Glu Trp His Leu Gly Lys Asp Glu Tyr Asp
260 265 270
Pro Asn Tyr Tyr His Phe Ala Asn Asn Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp
275 280 285
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Asn Met Phe Asp Leu Tyr Asp Met Leu Lys Asn Thr Glu Asn Asn Tyr
305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Asn Asn Ile Val Leu Val Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Gln Ser Tyr
435 440 445
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
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35 40 45
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65 70 75 80
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ggtgagtggc atttaggtaa agatgaa 27
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ttcatcttta cctaaatgcc actcacc 27
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ttcatcttta cctaaagccc actcacc 27
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<400> 10
gcgatccata tcatgagtat caataaaagt 30

Claims (10)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2～4任一所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞系。
4.一种制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列中第265位酪氨酸突变为丙氨酸或组氨酸，或将第332位天冬酰胺突变为苏氨酸。
5.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌是E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种。
7.一种发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的基因工程菌按体积3～6％接种至TB培养基中，培养至OD600为0.4～0.8，加入IPTG诱导24～72h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述接种是接种在LB培养基中培养的种子液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子液是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，200～250r/min，30～37℃培养8-10h获得的。
10.权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体在食品、生物、医药、日化领域的应用。
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