DK146941B - Glucoamylase og fremgangsmaade til fremstilling af en sirup med hoejt glucoseindhold ved saccharificering af smeltet stivelse - Google Patents

Description

i 146941

Opfindelsen angår en hidtil ukendt glucoamylase og en fremgangsmåde til fremstilling af en sirup med højt glucoseindhold ved saccharificering af smeltet stivelse til glucose.

5 Når der i dag skal fremstilles glucose industrielt ud fra stivelse, anvendes til saccharificeringsprocessen hovedsageligt glucoamylaser produceret af mikroorganismer tilhørende slægterne Rhizopus og Aspergillus. Betingelserne, hvorunder disse glucoamylaser anvendes, er pH 5,0 og 10 55 °C for enzymer fra Rhizopus-stammer og pH 4,5 og 60 °C for enzymer fra Aspergillus-stammer.

Desuden er hydrolysatets maksimale glucoseindhold omkring 96% (på tørstofbasis), når disse glucoamylaser reagerer med enzymsmeltet stivelse i en koncentration på 30%. En 15 grund til, at glucoseudbyttet ikke når 100% er, at der dannes isomaltose på grund af en omvendt reaktion af disse glucoamylaser. Imidlertid er der for nylig offentliggjort en rapport (US patentskrift nr. 3 897 305) om, at den omvendte reaktion af glucoamylaser er yderst lille i nær-20 heden af det neutrale område, og at glucoseudbyttet således kan hæves til omkring 98% ved udførelse af reaktionen ved omkring neutral pH-værdi under samtidig anvendelse af pullulanase. Pullulanasen har den virkning at afgrene stivelsen og forøge hastigheden af gluco-25 amylasevirkningen under disse næsten neutrale betingelser. Hvad angår neutrale glucoamylaser, er der kun rapporteret én til dato, nemlig den glucoamylase, som produceres af den rissvidnings-forårsagende svamp CPiricularia oryzae; Kazuo Matsuda et al.; Amylase Symposium, Vol. 9, 30 1974), men denne glucoamylase har lav varmestabilitet og kan således ikke anvendes under industrielle betingelser.

Opfindelsens formål er at tilvejebringe en glucoamylase, som er aktiv ved næsten neutral pH-værdi og har tilstrækkelig varmestabilitet til, at den kan anvendes under in- 2 146941 dustrielle reaktionsbetingelser, og som endvidere reagerer med stivelseshydrolysat til opnåelse af høje udbytter af glucose.

Der er fundet en mikroorganismestamme, som producerer 5 en hidtil ukendt glucoamylase med optimal aktivitet ved en pH-værdi på 6,0 - 6,5 og god varmestabilitet.

Denne glucoamylase er i stand til at omdanne en 30 vægt-% opløsning af en 10 D.E. (dextrose-ækvivalent) smeltet stivelse til et produkt indeholdende mindst ca. 96% glu-10 cose, når den omsættes med stivelseshydrolysatet ved pH

6,0 - 6,5 ved 55 °C.

I overensstemmelse hermed er glucoamylasen i-r følge opfindelsen ejendommelig ved, at den er identisk med den glucoamylase, der dannes ved dyrkning af stammen 15 Stachybotrys subsimplex, FRI 4377.

Glucoamylasen ifølge opfindelsen kan således fremstilles ved, at mikroorganismestammen Stachybotrys subsimplex, FRI 4377 dyrkes i et næringsmedium, og at enzymet udvindes fra dyrkningsvæsken.

På tegningen viser 20 fig. 1 sammenhængen mellem pH-værdien og enzymaktiviteten for enzymet ifølge opfindelsen og de konventionelle glucoamylaser produceret af mikroorganismerne Rhizopus niveus og Aspergillus niger; fig. 2 sammenhængen mellem temperaturen og enzymaktivi-25 teten for enzymet ifølge opfindelsen og glucoamylasen fra Piricularia oryzae; fig. 3 inaktiveringskurverne for enzymet ifølge opfindelsen, når det behandles ved forskellige pH-niveauer; 3 146941 fig. 4 en sammenligning af enzymet ifølge opfindelsen og de konventionelle glucoamylaser produceret af mikroorganismerne R. niveus, A. niger og P. oryzae, med hensyn til deres relative varmestabi1iteter.

5 I det følgende anføres egenskaberne af den hidtil ukendte neutrale glucoamylase ifølge opfindelsen i detaljer, og dens egenskaber stilles op imod de hidtil kendte gluco-amylasers.

Betegnelsen "D.E." er en forkortelse for "dextrose ækvi-10 valent", og anvendes til at betegne et materiales indhold af reducerende sukker,beregnet som D-glucose og udtrykt som procent af det totale tørstof.

Betegnelsen "stivelsehydrolysat" anvendes alment til at betegne sirup eller et tørt produkt, som er fremstillet 15 ved delvis hydrolyse af stivelse. Et sådant produkt kan fremstilles ved sur eller enzymatisk hydrolyse.

Betegnelsen "smeltet stivelse" anvendes til at betegne et stivelsehydrolysat med lavt D.E. (D.E. fra omkring 2 til omkring 20).

20 1. Aktivitet og substrat-specifitet

Enzymet ifølge opfindelsen er i stand til at hydrolysere sådanne carbonhydratforbindelser som stivelse, opløselig stivelse, amylose, amylopectin og glycogen, og at danne dextrose derudfra. Udbyttet af dextrose fra hvert af 25 disse substrater er 100%, når substratkoncentrationen er 1%. Mutarotationen af den producerede dextrose er positiv.

Dette enzym er således en glucoamylase. Enzymets reaktionshastighed blev sammenlignet med de hastigheder, som udvises af de glucoamylaser, som produceres af mikroorga-30 nismer tilhørende Rhizopus og Aspergillus i forbindelse med forskellige substrater. Resultaterne er anført i ta- 4 146941 bel I. Som det ses af denne tabel, er aktiviteten af enzymet ifølge opfindelsen mærkbart højere end aktiviteterne af de andre to glucoamylaser, især i forbindelse med hydrolysen af pullulan.

5 TABEL I

Substrat-specifitet a ) _Reaktionshastighed_

Enzym Asperaillus niger Rhizopus

Substrat ifølqe , , b) niveus opf. Slug*n^lase,,, ^5imylase1 10 Dextrin (D.E. 10) 100 100 100

Amylopectin 104 113 91

Opløselig stivelse 122 95 112

Pullulan 9 2 2

Glycogen 102 100 91 15 Maltotriose 6 12 8

Maltohexose 91 100 146

Panose 44 47 48 .Maltose 14 26 19 a) de enzymatiske aktiviteter af hver glucoamylase blev 20 bestemt med substraterne tilstede i en koncentration på 1%; hvert enzyms aktivitet i forbindelse med dextrin blev tildelt værdien 100, og aktiviteterne på de andre substrater angives som relative værdier.

b) forhandlet af Enzyme Development Corporation, 2 Penn 25 Plaza, New York, N.Y.

"Sumyzyme" forhandlet af Sumitomo Shoji Kaisha, Ltd., 1, Kanda Mitoshiro-Cho, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan.

5 146941 2. pH-optimum og stabilt pH-område

Afhængigheden mellem den enzymatiske aktivitet (relativ værdi) af enzymet ifølge opfindelsen og reaktionens pH blev undersøgt og derpå sammenlignet med de tilsvarende 5 afhængigheder for de konventionelle kendte glucoamylaser produceret af Rhizopus- og Aspergillus-mikroorganismerne. Resultaterne er anført i fig. 1. Som vist i figuren er pH-optimet for dette enzym ved 60° C 6,0 - 6,5, hvilket er betydeligt højere end pH-optimet for de andre enzymer.

10 Desuden viser dette enzym sin bedste stabilitet i nærheden af pH 6,0, men der ses ingen inaktivering af denne glucoamylase over pH-område 4-11, selv når den efterlades på substratet i 24 timer ved stuetemperatur.

3. Styrkebestemmelse 15 En 0,5 ml aliquot af en passende fortyndet enzymopløsning sattes til 0,5 ml af en 2% opløsning af en sprøjtetørret maltodextrin (D. E. ca. 10) i 0,1 M acetat pufferopløsning (pH 6,0), og blandingen blev inkuberet ved 60° C i præcis 10 minutter. Enzymreaktionen blev derpå standset ved 20 opvarmning af blandingen i 5 minutter i et kogende vandbad. Den producerede mængde dektrose blev bestemt ved glucoseoxidasemetoden. Den mængde enzym, som producerede et mikromol dextrose pr. minut blev defineret som l enhed.

25 4. Temperaturområde for optimal reaktion

Temperaturvirkningen på den relative enzymatiske aktivitet af enzymet ifølge opfindelsen ved pH 6,0 blev sammenlignet med den relative aktivitet for den kendte glucoamylase fra rissvidningssvampen, Piricularia oryzae. Denne sammenligning er vist i fig. 2. Det fremgår klart, at den op- 30 timale temperatur for reaktionen af enzymet ifølge opfindelsen under disse betingelser er 65° C, ca. 10° C højere 6 146941 end den optimale temperatur for enzymet fra Piricularia oryzae, 5. Inaktivering på grund af pH- og temperaturbetingelser

Fig. 3 viser inaktiveringskurver for den relative enzyma-5 tiske aktivitet af enzymet ifølge opfindelsen, når det blev behandlet i 60 minutter ved 60° C og over et pH-område på 3- 8. Som det ses af figuren er dette enzym mest stabilt ved pH 6, og det inaktiveres fuldstændigt ved denne behandling i 30 minutter ved pH 3 og i 1 time ved pH 10 4. Desuden viser fig. 4 en sammenligning af varmestabili teten af enzymet ifølge opfindelsen og glucoamylaseme fra Rhizopus-, Aspergillus- og Piricularia-mikroorganismer-ne. Fig. 4 giver inaktiveringskurver for disse enzymer, når de blev behandlet ved 60° C, medens de holdtes ved 15 deres respektive pH-optima for stabilitet. Det kan ses, at varmestabiliteten af enzymet ifølge opfindelsen er dårligere end varmestabiliteten af glucoamylasen fra Aspergillus, men er bedre end varmestabiliteten af glucoamylaseme fra Rhizopus- og Piricularia-mikroorganismeme.

20 6. Inhibering, aktivering og stabilisering

Enzymet ifølge opfindelsen kræver ingen specielle aktiverings- eller stabiliseringsmidler. Men, som det er tilfældet for de fleste andre glucoamylaser, inhiberes dette enzym af kviksølv(Il)-chlorid, kaliummanganat, jern(II)-25 chlorid, andre metalsalte og "tris".

7. Rensningsprocedure

Enzymet ifølge opfindelsen kan renses ved hjælp af en kombination af enhver af de almene rensningsmetoder, såsom ammoniumsulfatffraktionering, organisk-opløsningsmiddel-30 fraktionering, stivelseadsorption og forskellige chroma-tografier. Et belysende eksempel på en sådan rensningsprocedure er anført nedenfor.

7 146941

Cellerne og andet uopløseligt materiale fjernes fra dyrkningsmaterialet, og dyrkningsvsesken fryses natten over ved -20° C. Den smeltes derpå ved stuetemperatur, og det uopløselige materiale fjernes ved centrifugering. Derefter 5 tilsættes 2 volumener koldt isopropanol, og blandingen får lov at stå en nat over ved 4 °c. Enzymbundfaldet befries for overvæsken ved dekantering. Bundfaldet opløses derpå i en 0,05 M tris/HCl-puf fer opløsning (pH 7,5) indeholdende I.jdM EDTA, og det opløste materiale dialyseres derefter 10 en nat over ved 4° C over den samme puffer. Derpå sættes DEAE-cellulose, som er blevet ækvilibreret med den samme pufferopløsning til denne dialyserede enzymopløsning, således at enzymet adsorberes dertil. Efter vaskning af denne DEAE-cellulose med den samme puffer elueres 15 enzymet fra harpiksen med et præparat af den samme puffer indeholdende 0,3 NaCl. Enzymet udfældes derpå ved tilsætning af 2 volumener koldt isopropanol til eluatet, og det udfældede materiale udvindes ved centrifugering.

Bundfaldet opløses i 0,05 M tris/HCl-pufferopløsningen 20 (pH 7,5) indeholdende 1 mM EDTA efterfulgt af dialyse natten over overfor den samme puffer. Den dialyserede enzymopløsning sættes derefter på en DEAE-cellulose-søjle, som er blevet ækvilibreret med den samme 0,05 M tris/HCl-puffer (pH 7,5) indeholdende 1 mM edta. Enzymet elueres 25 fra denne søjle ved hjælp af en lineær koncentrationsgradient af den samme puffer indeholdende NaCl op til 0,5 M.

De eluerede fraktioner, som indeholder enzymet, hældes sammen, og enzymet koncentreres ved hjælp af isopropanol-udfældningsteknikken. Dette koncentrerede enzym sættes 30 derefter på en søjle af tværbunden dextrangel "Sephadej^ G-150", som er blevet ækvilibreret med en 0,05 M tris/HCl-puf fer (pH 7,0) indeholdende 1 mM EDTA, og elueringen udføres med den samme pufferopløsning. Efter denne procedure viste det rensede enzym et enkelt bånd ved .skiveelektroforese.

35 8. Molekylvægt

Molekylvægten af enzymet ifølge opfindelsen blev under- 8 146941 søgt ved anvendelse af en "Sephadex (¾ -150"-søjle i overensstemmelse med den procedure, som er beskrevet af Dunker/ A.K. and Rueckert, R.R. J. Biol. Chem. 244, 5074 (1969). Resultaterne viste, at dette enzyms molekylvægt 5 er omkring 50 000.

I det følgende forklares forskellene mellem enzymet ifølge opfindelsen og de konventionelt kendte glucoamylaser og grundene til, at dette enzym må anses for et hidtil ukendt enzym med sit pH-optimum i nærheden af neutralitet.

10 Det ses af de i fig. 1 og tabel II anførte data, at de eneste glucoamylaser, som har deres pH-optima nær ved den neutrale zone, er enzymet ifølge opfindelsen og den gluco-amylase, som produceres af rissvidnings-mikroorganismen, Piricularia oryzae. Imidlertid fremgår det af fig. 2 og ta-15 bel II, at enzymet ifølge opfindelsen og rissvidnings- glucoamylasen har yderst forskellige optimale reaktionstemperaturer. Desuden viser de i fig. 4 angivne kurver, at varmestabiliteten af enzymet ifølge opfindelsen er langt bedre end af rissvidnings-glucoamylasen. Endvidere 20 viser tabel II, at molekylvægten af enzymet ifølge opfindelsen er meget mindre end molekylvægten af de kendte glucoamylaser.

TABEL II

Sammenligning af forskellige glucoamylaser med hensyn til 25 . pH-optimum, optimumtemperatur og molekylvægt 9 146941 pH-optimum Temperatur- Molekylvægt3^

a) optimum °C

Glucoamylase _ a)_ _

Enzym ifølge opfindelsen (Stachybotrys subsiirplex) 6,0-6,5* 65X 50 000*

Rhizopus sp. ("Sumyzyme") 5,0X 60x 70 OOO*5^ 5 Aspergillus niger 4,5X 70x 97 000°^ j \

Endcmyces sp. 5,0 - 64 000 p)

Endomyces fibuligera 5,5 60

Trichoderma viride^ 5,0 60 75 000

Cephalosporium 10 charticolag^ 5,4 60 69 000 U \

Piricularia oryzae ' 6,5 55 94 000 (rissvidnings-org.) a) Alle værdier undtagen dem, der mærket med en stjerne (x), er taget fra følgende referencer: 15 b) Hiromi et al.: Biochem. Biophys. Acta 302, (1973).

c) J.H. Pazur et al.: J. Biol. Chem. 237, 1002 (1962).

d) Hattori et al.: Agr. Biol. Chem. 25, 895 (1061).

e) Harada et al.: J. Ferment. Tech. 53_, 559 (1975).

f) Okada; J. Jap. Soc. Starch Sci. 21, 283 (1974).

20 g) h. Urbanek et a.: Appl. Micro. 30, 163 (1975.

h) Matsuda et al.: Amylase Symposium £, 105 (1974).

På basis af de ovenstående data kan det konkluderes, at glucoamylasen ifølge opfindelsen er en ny neutral glucoamylase, som har været ukendt til dato.

25 Den følgende forklaring skal nærmere belyse fremgangs måden til fremstilling af enzymet ifølge opfindelsen.

Den glucoamylase-producerende mikroorganisme, stammen G. 30-1140, FRI 4377, blev isoleret fra jorden af opfinderne i denne sag. Identifikationen af denne stamme skal 30 først angives. Stammens morphologiske egenskaber blev be stemt i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet af de nedenfor anførte forskere: ίο 146941

Glimen, J. C. A MANUAL OF SOIL FUNGI. The Iowa State Uni-versity Press, Ames. 1971.

Clements, F. E. and Shear, C. L. THE GENERA OF FUNGI.

Haf ner, New York. 1964.

5 Barnett, H. L. ILLUSTRATED GENERA OF IMPERFECT FUNGI.

2nd ed. Burgess, Minneapolis. 1968.

Bisby, G. R. Trans. Br. Myco. Soc. 26, 133-43 (1943).

Ainsworth, G. C. DICTIONARY OF THE FUNGI. 6th ed. Common-wealth Mycological Institute, Kew, Surrey. 1971.

10 9. Morphologiske egenskaber af stammen G30-1140

Stammen blev dyrket på 5 slags medier i Petri-skåle. De følgende afsnit angiver de morphologiske egenskaber, som blev iagttaget for isolerede kolonier.

a) Czapek-agar-medium 15 Efter inkubation ved 30° C i ti dage er kolonierne tynde og runde med en diameter på 4-5 cm. De vegetative hypher er glasklare og viser ringe vækst med sorte conidieklyn-ger spredt som pulver over koloniernes overflade. Koloniernes undersider er brune, og et lysebrunt pigment udskil-20 les til mediet.

De vegetative hypher består af forgrenede fibre, som sjældent har nogle septa; conidiestrukturen er ensartet understøttet af fibrene. Conidiophorerne, som har septa, rager frem fra denne i rette vinkler. Conidiophorernes længde 25 er sædvanligvis 40-60 ^um, men somme tider når de mere end 100 ^um. Diameteren af disse er fra omkring 3 til omkring 6 yum, og selv om der er tilfælde, hvor deres grund- 11 146941 areal er glat, er det meste af deres overflade vortet, dækket med fine granulære fremspring. Disse conidiophorer er glasklare og de fleste er ikke forgrenet.

På spidsen af conidiophorerne danner glasklare phialider 5 snoninger på 3-8 enheder. Phialidernes form er ægformet el ler kolbe-lignende; de er 8-15 /um lange og har en diameter på 2-6 /um; deres overflade er glat. Conidierne dannes ved spidsen af phialideme og er ovale 3-5 /um x 5-10 yum og har en glat overflade. Disse er glasklare ved tids-10 punktet for deres dannelse, men bliver sortgrønne, efter hånden som de modner.

Conidiernes overflade er dækket med en stor mængde viskøst materiale. Af denne grund klæber conidierne sammen og danner store conidieklynger ved spidsen af conidiopho-15 rerne. Det viskøse materiale er transparent på dannelses tidspunktet, men bliver derefter gradvis sort.

b) Modificeret Czapek-agar-medium

Procent

Opløselig stivelse 1,0

Majsstøbevæske (tørstof-basis) 0,1 20 NaNO^ 0,2 k2hpo4 0,1 KC1 0,05

MgS04’7H20 0,05

FeS04*7H20 0,001 25 Agar 2,0

pH til 0,7 med NaOH

Koloniernes vækst på dette medium er en smule langsommere end på det ovenfor beskrevne Czapek-medium, idet de når omkring 3 cm, når de inkuberes i 10 dage ved 30° C.

12 146941

Kolonierne er cirkulære og tynde, og deres overflader har strålende ud fra deres centre et sort viskøst materiale, som er i form af olielignende dråber med diametre, der når 1-3 mm. Disse stammer fra sammensmeltningen af 5 conidieklynger, som er indesluttet i det viskøse materiale og derved danner oliedråbelignende legemer. Koloniernes undersider viser en mørkere brun farve end det ses med det ovenstående Czapek-medium, og en lille mængde brunt pigment udskilles til mediet.

10 . c) Kartoffel-dextrose-agar-medium

Koloniernes vækst på dette medium er en smule langsommere end på det ovenfor beskrevne Czapek-medium, idet den når 3-4 cm, når de inkuberes i 10 dage ved 30°C.

Disse kolonier er også cirkulære, men de har en noget 15 større tykkelse end kolonierne på Czapek-mediet. Væksten af de vegetative celler er god, og den udvikler sig i et strålemønster. Koloniernes overflader er sorte med et svagt grønt skær og er rige på hypher, conidieklynger osv.

Efter 14 dages inkubation har de gamle koloniers over-20 flader udstrålende formationer af synnemata, der står omkring 1-3 mm opret. Disse koloniers undersider viser en sortbrun farve, og en stor mængde brunt pigment udskilles til mediet.

d) Special-agar-medium 25 Procent

Opløselig stivelse 1,0

Majsstøbevæske (tørstof-basis) 0,2

Bomuldsfrøoliepresserester 0,1 Gærekstrakt 0,1 30 K2HP04 0,1

MgS04*7H2D 0,05

Agar 2,0

pH til 7,0 med NaOH

146941 13

Kolonierne på dette medium har efter 10 dages inkubation ved 30°C diametre på 5-6 cm og er runde og tynde. De vegetative hypher viser god vækst og har et sort skær. Co-nidievæksten er dårligere end på de ovennævnte medier.

5 Koloniernes undersider er lysebrune, og et lysebrunt pig ment frigøres til mediet.

e) Påvis' gær-salt-agar-medium

Kolonierne på dette medium har efter 10 dages inkubation ved 30°C diametre på 2-3 cm og er mere ovale end runde 10 af form. Hypherne er lysebrune med et anstrøg af hvidt og danner noget tykke kolonier, som er fløjlsagtige. Koloniernes undersider er lysebrune, men der udskilles absolut intet pigment til mediet.

10. Fysiologiske egenskaber af stamme G30-1140 15 a) Væksttemperatur

Denne stamme er i stand til at vokse over et temperaturområde på 10-37°C, men dens optimale væksttemperatur er i nærheden af 30°C.

b) Vækst-pH

20 Denne stamme er i stand til at vokse over et pH-område på 3 - 10, men dens optimale vækst-pH er i nærheden af pH 7.

c) Carbonkilder

Denne stamme er i stand til at udnytte sådanne carbonkil-25 der som dextrose, fructose, galactose, mannose, saccha rose, maltose og stivelse til at understøtte væksten.

14 146941 På basis af ovenstående mikrobiologiske konstateringer blev stamme 630-1140 identificeret som Gliobotrys albovirides efter opslag i genera of fungi og a manual of SOIL FUNGI. Imidlertid er denne organisme ifølge DICTI0__ 5 NARY OF FUNGI og G.R. Bisby (Trans. Br. Mycol. Soc. 26, 133-43 (1943) den samme som Stachybotrys subsimplex, og af denne grund blev stamme G30-1140 identificeret som Stachybotrys subsimplex.

Stamme G30-1140 har conidiophorer, som står opret fra dens 10 vegetative hypher, forgreninger eksisterer næsten ikke, og de har s.epta. Der er tilfælde, hvor basisdelen er glat, men spidsen er dækket med fremspring. Ved spidsen danner et niveau af phialider en spiral på 3-8 enheder. Conidier med glatte aflange overflader deler sig ud fra disse phia-15 lider, og de er indesluttet i et rigt viskøst stof. Disse egenskaber stemmer godt overens med dem, der er beskrevet for Stachybotrys subsimplex af G. R. Bisby (Trans.

Br. Mycol. Soc. 26, 133-43 (1943)).

Denne Stachybotrys subsimplex stamme G30-1140 er deponeret 20 i The Fermentation Research Institute, Agency of Industrial

Science & Technology, Chiba City, Japan under nr. 4377.

Med hensyn til dyrkningen afidenne mikroorganisme kan anvendes den almindelige viden og teknik inden for dyrkningen af svampe.

25 Som næringsmedium er det muligt at anvende de medier, som bruges til dyrkningen af almindelige svampe. F. eks. kan der som carbonkilder anvendes forskellige stivelser, sti-velseshydrolysater, majsmel, hvedemel, melasse osv., medens nitrogenkravene kan opfyldes i form af pepton, bomulds-3Q frøolierester, kødekstrakt, gærekstrakt, casein, majs- støbevæske, maltekstrakt, sojabønnerester, skummetmælk, uorganiske ammoniumsalte, uorganiske nitrater osv. Som u- U6941 15 organiske salte er det muligt at anvende calciumchlorid, magnesiumsulfat, phosphater, natriumchlorid, kaliumchlo-rid osv. Endvidere kan disse carbonkilder, nitrogenkilder og uorganiske salte anvendes enten enkeltvis eller i pas-5 sende kombinationer. Desuden er det, hvis man ønsker at fremme mikroorganismens vækst og frembringe en forøgelse i dens enzymproduktion, muligt at anvende spormængder af metalsalte, vitaminer, aminosyrer osv.

De dyrkningsbetingelser, der sædvanligvis anvendes for 10 svampe, kan også anvendes ved dyrkningen af denne mikro organisme. Hvis mikroorganismen dyrkes i væskekultur i 7 -14 dage ved pH 5 - 8 og ved 20 - 37 "C og under omrøring til at give luftning, akkumuleres enzymet ifølge opfindelsen i dyrkningsvæsken. Hvis der anvendes faste materialer så-15 som klid, er det også muligt at udføre fast dyrkning.

I det følgende anføres et eksempel på en fremgangsmåde, hvorved den hidtil ukendte neutrale glucoamylase ifølge opfindelsen kan udvindes fra dyrkningsmaterialet. I tilfælde af væskekultur fjernes myceliet ved enhver af 2o de almindeligt kendte metoder. Derpå kan filtratet kon centreres under formindsket tryk, eller enzymet kan udsaltes sammen med de andre proteiner ved tilsætning af uorganiske salte, såsom ammoniumsulfat, til filtratet, eller enzymet kan udfældes og koncentreres ved tilsætning af et 25 organisk opløsningsmiddel, såsom acetone eller isopro- panol.

I tilfælde af en fast kultur ekstraheres enzymet først fra dyrkningsmaterialet ved anvendelse af vand eller en pufferopløsning. Derpå er det som ved væskekulturen mu-ligt at opnå enzymet i koncentreret form.

De på denne måde opnåede rå præparater kan derpå renses ved udførelse af den førnævnte rensningsteknik.

16 146941

Det er muligt at anvende glucoamylasen ifølge opfindelsen til saccharificering af smeltet stivelse, når der skal produceres dextrose ud fra stivelse. Især sker der ved anvendelse af enzymet ifølge opfindelsen til saccha-5 rificering ved en pH-værdi på 6,0 - 6,5 som tidligere nævnt kun lidt omvendt reaktion, og dette resulterer i et forøget udbytte af dextrose i sammenligning med, hvad der er tilfældet ved anvendelse af de konventionelle glu-coamylaser og udførelse af saccharificeringen under sure 10 betingelser.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden til fremstilling af en sirup med højt glucoseindhold ved saccharificering af smeltet stivelse til glucose ejendommelig ved, at den smeltede stivelse saccharificeres ved en pH-værdi 15 på 6,0 - 6,5 i nærvær af glucoamylasen ifølge opfindelsen.

Saccharificeringen udføres fortrinsvis ved en temperatur på fra omkring 50 til omkring 65 °C.

Opfindelsen belyses nærmere ved de følgende eksempler, hvori alle dele og procenter er beregnet på vægt, med 20 mindre andet er anført.

EKSEMPEL 1

Et flydende dyrkningsmedium indeholdende 5% opløselig stivelse, 2% majsstøbevæske, 0,5% bomuldsfrøolierester, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumphosphat, 0,05% magne-25 siumsulfat og 0,01% calciumchlorid blev indstillet til pH 7,0, og 100 ml af dette medium blev anbragt i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe. Mediet blev steriliseret ved 121°. C i 10 minutter, podet med Stachybotrys subsimplex stamme G30-1140, FRI 4377, og inkuberet ved 30® C i 7 dage på 30 en ryster. Efter fuldførelse af dyrkningen blev myceliet fjernet fra dyrkningsvæsken ved filtrering. Filtratet fandtes at indeholde 70 enheder glucoamylase-aktivitet pr. ml.

17 146941

Dette filtrat blev frosset en nat igennem ved -20° C og derpå optøet ved stuetemperatur. Det uopløselige materiale blev fjernet ved centrifugering. Derpå sattes 2 volumener koldt isopropanol til denne opløsning,og den fik lov at 5 stå ved 4° C en nat igennem, således at enzymet blev udfældet. Overvæsken blev fjernet ved dekantering og bundfaldet opløst i en 0,05 M tris-HCl-puf feropløsning indeholdende 1 mM EDTA og med en pH-værdi på 7»5. Denne en-zymholdige opløsning blev derpå dialyseret overfor den 10 samme puffer ved 4° C en nat igennem. DEÅE-cellulose, som var blevet ækvilibreret med den samme pufferopløsning, sattes derefter til den dialyserede enzymopløsning, og enzymet blev adsorberet til denne bærer. Efter vaskning af DEAE-cellulosen med den samme puffer blev enzymet elueret 15 fra den under anvendelse af en opløsning af den samme puffer indeholdende NaCl i en koncentration på 0,3 M.

Derefter sattes to volumener koldt isopropanol til eluatet for at udfælde enzymet, og bundfaldet blev opsamlet ved centrif ugering. Dette bundfald blev opløst i 0,05 M tris/HCl-20 pufferen (pH 7,5) indeholdende 1 mM EDTA, efterfulgt af dialyse en nat igennem overfor den samme pufferopløsning.

Den dialyserede enzymopløsning sattes på en søjle af DEAE-cellulose, som var blevet ækvilibreret med den samme 0,05 M tris/HCl-puffer (pH 7,5) indeholdende 1 mM EDTA.

25 Eluering af enzymet fra denne søjle blev udført ved lineært at forøge koncentrationen af NaCl i den samme puffer-opløsning op til 0,5 M. De fraktioner af eluatet, som indeholdt enzymet blev derpå hældt sammen, og der tilsattes to volumener koldt isopropanol for at udfælde enzymet fra 30 denne opløsning og koncentrere det. Det koncentrerede enzym sattes derefter på en søjle af "Sephadex ™G-150", 18 146941 som var blevet ækvilibreret med en 0,05 M tris/HCl-pufferopløsning (pH 7,0) indeholdende 1 mM ΕΚΤΑ, og elueringen udførtes med den samme puffer. De eluerede fraktioner, som viste enzymaktivitet, blev derpå hældt sammen, og 5 der tilsattes to volumener koldt isopropanol for at udfælde enzymet. Dette resulterede i udvindingen af enzymet i renset og koncentreret form. Det rensede enzyms specifikke aktivitet fandtes at være 127 enheder pr. mg protein.

EKSEMPEL 2 10 Til en 30% opløsning af en sprøjtetørret maltodextrin (D.E. omkring 10) i 0,05 M acetatpuffer ved pH 6,5 sattes den rensede glucoamylase fra eksempel 1. Enzymet tilsattes i en dosering på 0,20 enheder enzym pr. g substrat på tørstofbasis. Efter at opløsning var inkuberet ved 55° C i 15 72 timer var dextroseindholdet i det filtrerede hydroly sat, bestemt ved højydelsevæskchromatografi, 96,5% af det totale carbonhydrat.

EKSEMPEL 5

Stivelse blev omdannet til et 10,2 D.E. stivelsehydroly-20 sat ved anvendelse af bakterie-a-amylase fra B. licheni-formis ifølge den almene procedure, som er anvendt i US patentskrift nr. 3 912 590. Opløsningen blev kogt i 5 minutter efter indstilling pH-værdien til 2,0. med 2 NHCl for at inaktivere den resterende α-amylase. Stivelsehydro-25 lysatopløsningen blev derpå indstillet til pH 6,2 og fortyndet til den ønskede koncentration før behandling med 0,20 enheder af den rensede glucoamylase fra eksempel 1 pr. g substrat (tørstofbasis). Opløsningen blev inkuberet ved 55° C i et tilproppet reagensglas. pH-værdien blev 30 indstillet til 6,2 efter 5 timer og efter 48 timer. Efter at opløsningen var blevet inkuberet i ?2 timer var dextro-seindholdet i det filtrerede hydrolysat, bestemt ved høj-ydelsesvæskechromatografi, 97,6% af det totale carbonhy- 19 146941 drat. Den endelige koncentration af opløsningen var 31,2% på tørstofbasis.

Når der udførtes saccharificeringsprøvninger ved den samme substratkoncentration med kommerciel glucoamylase 5 fra A. niger under dens optimumsbetingelser (pH 4,3 ved 60° C) var det tilsvarende dextroseudbytte 96,5%. På lignende måde gav glucoamylasen fra R. niveaus ved pH 5,0 og 55° C et dextr oseudbytte på 97%. Dextr oseudbytterne var omkring 1% lavere, når saccharificeringsprøvningerne udførtes 10 med de kommercielle glucoamylaser under de betingelser, som anvendes for enzymet ifølge opfindelsen. Disse resultater viser, at den hidtil ukendte glucoamylase ifølge opfindelsen giver højere udbytter af dextrose end de kommercielle glucoamy laser, selv når hvert enzym anvendes 15 under dets optimale reaktionsbetingelser.