DE1952012B2

DE1952012B2 - Biotechnisches verfahren zur herstellung alkalischer protease

Info

Publication number: DE1952012B2
Application number: DE19691952012
Authority: DE
Inventors: Jyuichiro Takarazuka Yamamoto Takehiko Amagasaki Tsuru Daisuke Sakai Fukumoto, (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-10-25
Filing date: 1969-10-15
Publication date: 1973-06-07
Also published as: FR2021538A1; DE1952012C3; IT941535B; GB1292319A; DE1952012A1

Description

setzt. Die pH-Aktivitätskurven der F i g. 2 wurden nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten, jedoch wurde der entsprechende pH-Wert mit Hilfe eines Puffers eingestellt.

Die Enzy:naktivität wird also hinsichtlich der Wirkung des Enzyms gegenüber Kasein bestimmt. Wenn das Kasein durch das Enzym auf die vorstehend beschriebene Weise hydrolysiert wird, wird neben den anderen Aminosäuren eine bestimmte Menge Tyrosin in Freiheit gesetzt. Diese Menge an gebildetem Tyrosin ist ein Maß für die Enzymaktivität. Sie läßt sich leicht mit einer bestimmten Menge an reinem Tyrosin an Hand der UV-Absorption vergleichen. So hat 2. B. Tyrosin eine spezifische Absorption bei 275 ιτιμ. Die Differenz zwischen der Absorption des Testmaterials und der Kontrollprobe im Vergleich n\ einer bekannten Menge an Tyrosin, _. B. ίύγ, bei dieser Wellenlänge ist dann ein Maß für die Aktivität des Enzyms.

In der nachstehenden Tabelle 1 sind fünf typische Proben von gereinigter Protease von verschiedenen Bacillus subtilis-Stämmen hinsichtlich pH- und Temperaturoptimum, pH-Stabilität und Beständigkeit gegenüber verschiedenen Inhibitoren miteinander verglicher. Die neutrale Protease I und die alkalische Protease ! wurden aus Kulturflüssigkeit von Bacillus subtiüs var. amyloliquefaciens Fukumoto isoliert und gereinigt. Die neutrale Protease II und die alkalische Protease Ii wurden aus Kulturflüssigkeit von Bacillus subtilis var. amylosacchariticus Fukumoto isoliert

ίο und gereinigt. Die alkalische Protease 111 wurde unter Einsatz der vier obengenannten ATCC-Stämme von Bacillus subtilis erhalten. Aus der Tabelle geht hervor, daß die alkalische Protease ill gegenüber ionischen oder nicht ionischen grenzflächenaktiven Verbindungen überraschend stabil ist. Dies ist bei den angegebenen neutralen und alkalischen f.oteasen nicht der Fall. Es liegt auf der Hand, daß die fü. Waschmittel zu verwendenden Enzyme gegenüber grenzflächenaktiven Verbindungen beständig sein müssen und unter alkalischen Bedingungen eine hohe Aktivität und Stabilität aufweisen sollen.

Tabelle 1

A. Vergleich der Eigenschaften von Proteasen, die von verschiedenen Stämmen von Bacillus subtilis erzeugt wurden

Neutrale Protease
I H

Alkalische Protease
I II I

ill

pH-Optimum

■pH-Stabilitätsbereich

Temperaturoptimum (15 Minuten Um-

setzune), ^CC

Wärmebeständigkeit (in Gegenwart von

Calciumionen), ⁰C

(5,8 bis 7,3 6 bis 9,5

55 50

7,0
6 bis 10

52 50

10,3 bis 10,7
5,5 bis 10,8

55 50

10,3 bis L0,7
5,5 bis 10,8

55 50

10,5 bis 11,0 5,5 bis 11,2

55 50

B. Einfluß verschiedener Inhibitoren:

Relative Restaktivität *) nach 1 stündiger Inkubation

bei pH 7,5 und 30⁰C

Neutrale
Protease

1 I Il ! 1

i Alkalische Protease

π I in

ÄDTA (5-10'm)
DFP(2,5 · 10-⁴m)..

PPI (0,05%)

CuSO., (5 · 10 ³ m)
HgCl, (5 · ΙΟ-³ m)

Tw (0,5%)

Tr (0,5%)

NLS (0,2%)

BKCL (0,2%) ....
ABS (5-10-³ITi)...

0	0	98	98
100	100	40	55
100	100	14	18
5	15	75	98
3	8	12	17
85	90	100	100
92	94	96	98
0	0	59	0
0	0	42	38
0	0	40	30

90 40 100 98 93 67 70

·) Relative Restaktivität: Jede ursprüngliche Enzymlösung

wurde auf eine Konzentration von 100 Einheiten/ml mit kaltem Wasser verdünnt und 1 Stunde auf 30° C erwärmt. Diese Kon-Irollösungen haben die Aktivität 100.

ÄDTA = Äthylendiamintp'raessigsäure.

DFP = Diisopropylfluorphosphat.

PPI = Protease-lnhihitor aus Kartoffeln.

NLS — Natriumlaurylsulfat.

BKCL -- Bcnzalkoniumchlorid (Gemisch aus Alkyldimethylbcnzylammoniumchloriden der allgemeinen Formel C_r,H_r,CH₂N(CH₃)jRCI, in der R einen Alkylrest mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet).

ABS =- Alkylbenzolsulfonat.

Tw -- Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat.

Tr = Isooctylphenylpolyäthoxyalkohol.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Bacillus subtilis-Stämme wachsen im Gegensatz zu den anderen Stämmen sehr gut in einem Nährmedium, dem Natriumlaurylsulfat in einer Endkonzentration von 0,15% einverleibt wurde, und können die gleiche Menge an Protease bilden, unabhängig davon, ob das Nährmedium Natriumlaurylsulfat enthält oder nicht.

Das Verfahren der Erfindung mit den obengenannten vier ATCC-StämiTien von Bacillus subtilis kann entweder in einem flüssigen oder festen Nährmediiim durchgeführt werden. Ein flüssiges Nährmedium wird im allgemeinen bevorzugt, und in diesem Fall wird die Züchtung entweder durch Schütteln oder Belüften durchgeführt.

Das Näh.medium enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere, für den jeweils eingesetzten Stamm notwendige Nährstoffe in solcher Form, daß sie von Bacillus subtiüs assimiliert werden können. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Lactose, Maltose, Glucose, Fructose, Melasse und Abfälle, die bei der Verzuckerung von Holz entstehen. Geeignete Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze, Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, säurehydrolysiertes Kasein, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Kasein und Weizenkleie. Als Fermentationsbeschleuniger können z. B. noch Hefeexlrakt, Trockenhefe und Vitamine zugesetzt werden. Ferner können anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Eisensalze, Mangansalze oder Zinksalze einzeln oder im Gemisch

zugesetzt werden. Die optimale Fermentationstempera- alkalischen Protease ein, und sn. erreichte nach

tür liegt bei etwa 25 bis 40° C, der optimale pH Bereich 50 Stunden ein Maximum (13 000 Einheiten/ml),

der Fermentation bei 5,5 bis 8,5, und die Züchtung Während der Züchtung stieg der pH-Wert von 7,0

wird im allgemeinen etwa 20 bis 72 Stunden lang auf 8,0. Neben der alkalischen Protease enthielt das

durchgeführt. 5 Medium eine geringe Amylase (0,5 bis 1,0 Einheiten/ml)

Die nach dem Verfahren der Erfindung erzeugte sowie Spuren von Hemicellulase, jedoch keine neutrale

alkalische Protease kann durch Zusatz organischer Protease oder Cellulase.

Lösungsmittel, wie Aceton und/oder Äthanol, in Nach beendeter Züchtung wurden 101 des Fermen-

Mengen von etwa 50 bis 65 Volumprozenten oder durch tationsansatzes durch Zusatz eines wasserlöslichen

Aussalzen z. B. mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, io Calciumsalzes auf eine Endkonzentration von 0,05mo-

Calciumchlorid oder Natriumchlorid in Mengen von larem Calciumsalz und mit lnormaler Natronlauge

etwa 40 bis 70 Gewichts-Volumprozenten ausgefällt auf pH 8,0 eingestellt. Die erhaltene Fällung wurde

und konzentriert werden. Bei der Züchtung auf festen abzentrifugiert. Das Filtrat wurde zur Entfernung

Nährboden wird das Lösungsmittel oder Salz zu einei geringen Menge von schleimigen Stoffen mit

einem wäßrigen Extrakt gegeben. Bei der Züchtung 15 Benzalkoniumchlorid (s. Fußnoten Tabelle I) bis zu

in einem flüssigen Nährmedium wird das Lösungs- einer Endkonzentration von 0,2% versetzt. Nach

mittel oder Salz dem Kulturfiltrat einverleibt. Die 2stündigem Stehen wurde die erhaltene Fällung

Protease läßt sich leicht nach herkömmlichen Metho- abfiltriert. Aus dem Filtrat wurde durch Zugabe

den reinigen, z. B. durch Adsorption und Desorption von Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration

oder durch Behandlung an Ionenaustauschern. ao von 70% Sättigung die alkalische Protease ausgefällt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Nach 15stündigem Stehen in der Kälte wurde die

erhalten*. Fällung abzentrifugiert und getrocknet.

Beispiel 1 Nach teilweiser Reinigung durch Aussalzen wurden

Ein Anzuchtmedium wurde folgendermaßen zube- etwa 500 g Enzym mit einer Aktivität von 200 000 Einreitet (alle Prozentangaben in Gewichtsprozent): 45 heiten/g erhalten.
Bacillus subtüis ATCC 21 415 wurde 2 Tage bei 35°C „ ·.:_,-»
unter Schütteln in einem flüssigen Nährmedium Beispiel*
vorgezüchtet, das 5% mit Alkali extrahiertem Soja- Es wurde Bacillus subtiüs ATCC 21 416 verwendet, bohnenkuchen, 3 % Dextrin, 1 % Ammoniumphos- Eine gemäß Beispiel 1 erhaltene Anzuchtkultur wurde phat, 0,03% KCl und 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O enthielt. 30 entsprechend einer Inoculationsmenge von 10 Volum-Anschließend wurde diese Anzuchtkultur auf einer prozent in 500 ml fassende Flaschen überimpft, die Schüttelmaschine mit einer Amplitude von 8 cm und je 50 ml des nachstehend genannten Nährmediums 120 bis 180 UpM bei 37 ⁰C weiter gezü:htet. Es wurden enthielten. Die Züchtung wurde 40 Stunden gemäß jeweils 50 ml Medium je eine 500 ml fassende Sakagu- Beispiel 1 durchgeführt. Die Aktivität der alkalischen chiflasche verwendet. 35 Protease im flüssigen Nährmedium erreichte 10 000 Ein-

Nach etwa 20 Stunden setzte die Bildung der heiten/ml.

Zusammensetzung des Nährmediums:

Glucose 1%

Lösliche Stärke 5%

Sojabohnenmehl 1 %

Ammoniumphosphat 0,5 %

MgSO₄ · 7 H₄O (pH 7,0) 0,05%

Die Kulturbrühe wurde mit Calciumchlorid auf Beispiel 4

eine Endkonzentration von 0,05molarer und mit 50 Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde Bacillus 1 normaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 subtiüs ATCC 21 418 verwendet. Die Aktivität der eingestellt Die erhaltene Fällung wurde abzentri- alkalischen Protease erreichte nach 40 Stunden fugiert, das Filtrat auf a°c abgekühlt, mit 2 Volum- 7000 Einheiten/ml,
teilen kaltem Aceton versetzt und 4 Stunden in der .

Kälte stehengelassen. Die Fällung wurde abzentrifu- 55 Vergleichsversuche

giert, zweimal mit kaltem Aceton gewaschen und Die Versuche wurden unter Verwendung des im

unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurde ein Beispiel 1 beschriebenen ."Jährmediums bei einer gelbstichigbraun gefärbtes Pulver erhalten. Die Aus- Fermentationstemperatur von 30° C und einer Fermenbeute betrug 88%, und die spezifische Aktivität tationsdauer von 50 Stunden durchgeführt, mit der (Proteaseeinheiten/mg Protein) stieg um das Dreifache 60 Ausnahme von Streptomyces moderatus NRRL-3150, an. der wegen seines langsamen Wachstums 120 Stunden

gezüchtet wurde. Die Fermentation erfolgte in einem

Beispiel 3 250 ml fassenden konischen Kolben mit 30 ml Nähr

medium auf einer Rotationsschüttelmasciune.

Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde Bacillus 65 Die Proteaseaktrvität der so erhaltenes Kultursubtilis ATCC 21 417 verwendet Die Aktivität der brühen wurde, wie vorstehend beschrieben, bestimmt alkalischen Protease erreichte nach 40 Stunden Fer- Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II mentation 8000 Einheiten/ml. zusammengestellt

Tabelle

Stamm	Litcraturslcllc	Protcasc- akliviiät. Einheiten ml
Serratia sp. ATCC 21 074 Candida lipolytica ATCC 16 617 Pseudomonas aeruginosa IFO 3446 Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 Streptomyces moderatus NRRL-3150 Cytophaga NCIB 9497 Bacillus subtilis ATCC 21 415 ATCC 21 416 ATCC 21 417 ATCC 21 418	französische Patentschrift 1 533 993 französische Patentschrift 1 491 343 britische Patentschrift 967 848 USA.-Patentschrift 3 345 269 USA.-Patentschrift 3 331 751 USA.-Patentschrift 3 330 738 gemäß Beispiel 1 gemäß Beispiel 2 gemäß Beispiel 3 gemäß Beispiel 4	700 335 40 60 25 kein Wachstum 13 000 10 000 8000 7000

Aus der Tabelle II ist ersichtlich, daß unter Verwendung der im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzender Stämme von Bacillus subtilis weit höhere Proteaseaktivitäten erhalten werden als mit den bekannten Stämmer der Tabelle II.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

1 2

Patentanspruch· ^zur Herstellung alkalischer Protease mit einem

pH-Optimum von 10,5 bis 11,0, einem Stabilitäts-Verfahren zur Herstellung alkalischer Protease bereich von 5,5 bis 11,2 und einem Temperaturmit einem pH-Optimum von 10,5 bis 11,0, einem optimum von 55⁰C, das dadurch gekennzeichnet ist, Stabilitätsbereich von 5,5 bis 11,2 und einem 5 daß man Bacillus subtilis ATCC 21415, Bacillus Temperaturoptimum von 55⁰C, d a d u r c h ge- subtilis ATCC 21 416, Bacillus subtilis ATCC 21 417 kennzeichnet, daß man Gacillus subtilis oder Bacillus subtilis ATCC 21 418 in einem flüssigen ATCC 21415, Bacillus subtilis ATCC 21416, oder festen Nährmedium züchtet.
Bacillus subtilis ATCC 21417 oder Bacillus Untersuchungen der Bildung von Protease durch subtilis ATCC 21418 in einem iVissigen oder io Bacillus subtilis haben ergeben, daß verschiedene festen Nährmedium züchtet. Stäiiime von Bacillus subtilis Protease mit erheblich

verschiedenen Eigenschaften bilden können (vgl.

Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 30 [1966],

S. 651 bis 658, S. 856 bis 862, S. 1164 bis 1169 und

Die Irfindung tx'rifft ein biotechnisches Verfahren 15 S. 1261 bis 1268, und Bd. 31 [1967], S. 330 bis 335 7ur Herstellung alkalischer Protease. und S. 718 bis 723). Spätere Untersuchungen ergaben Bekanntlich wird der größte Teil der gegenwärtig das überraschende Ergebnis, daß die mit Hilfe der verfügbaren Proteaseenzyme bakterieller Herkunft obengenannten vier ATCC-Stämme von Bacillus durch Züchtung von Stämmen von Bacillus subtilis subtilis erzeugte alkalische Protease eine hohe Beerhalten. Der größte Teil diese; Protease fällt als 20 ständigkeit gegenüber allen Typen von grenzflächen-Nebenprodukt bei der Amylaseproduktion an. Zahl- aktiven Verbindungen zeigt.

reiche Stämme von Bacillus subtilis bilden sowohl Wie aus F i g. 1 und 2 hervorgeht, können die neutrale als auch alkalische Protease. Da die neutrale Stämme von Bacillus subtilis in vier Typen unterteilt Protease ein instabiles Enzym ist, wird lediglich die werden, die sich durch ihre Proteasebildung unteralkalische Protease in der Lebensmittelindustrie, in der 25 scheiden. Der erste Typ gehört zu den amylasebilden-Gerberei und der Textilindustrie verwendet. Seit einigen den Stämmen von Bacillus subtilis. Diese Stämme Jahren sind enzymatisch aktiv ε Was Vimittel mit einem zeigen eine ausgeprägte Neigung zur Bildung neutraler Gehalt an alkalischer Proteas? auf dem Markt. Protease, und sie können alkalische Protease erst auf Im allgemeinen bilden Proteine η t grenzflächen- einer späteren Stufe der Züchtung bilden, wobei die aktiven Verbindungen Komplexe. So bildet z. B. 3° neutrale Protease allmählich verschwindet (vgl. F i g. Invertase und durch Bakterien erzeugte x-Amylase 1-1 und F i g. 2-1). Unter diesen Umständen ist die kristalline Komplexe mit grenzflächenaktiven Ver- sich ansammelnde Menge an alkalischer Protease bindungen, ohne daß ihre enzymatische Aktivität verhältnismäßig gering. Der zweite Typ kann gleichverlorengeht. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft zeitig alkalische und neutrale Krctease bilden. In wurde ein Verfahren zur Herstellung eines sehr 35 diesem Fall ti let nach verhältnismäßig kurzer Zeit eine reinen, wirksamen Enzyms entwickelt (vgl. N e g ο r o, Abnahme der enzymatischen Aktivität auf, da sich J.Biochem. (Tokyo), Bd. 32 [1960], S. 306 bis 327). beide Proteasen gegenseitig beeinflussen (vgl. F i g. 1-11 Es ist ferner bekannt, daß die Wärmebeständigkeit und Fig. 2-II). Der dritte Typ von Bacillus subtilis von Enzymen durch Kombination mit grenzflächen- kann lediglich alkalische Protease bilden. Infolge des aktiven Verbindungen unter bestimmten Bedingungen 40 Fehlens einer Wechselwirkung zwischen zwei ververbessert werden kann (vgl. japanische Patentschrift schiedenen Proteasen kann sich in diesem Fall eine 483 896). Es ist ferner möglich, grenzflächenaktive beträchtliche Menge an alkalischer Protease ansam-Verbindungen zur Reinigung von Enzymen zu ver- mein. Dies trifft auf die vier obengenannten ATCC-wenden, indem man sie unter Bedingungen kombiniert, Stämme von Bacillus subtilis, die im Verfahren der bei denen lediglich das unreine Protein ausgefällt 45 Erfindung verwendet werden, zu (vgl. Fig. 1-ΙΠ und wird. Im Gegensatz zu anderen Enzymen verliert F i g. 2-1II). Stämme von Bacillus subtilis des vierten jedoch Protease im allgenif' 'n ihre enzymatische Typs bilden lediglich neutrale Protease (vgl. F i g. 1-1V Aktivität, wenn sie mit ioni- :n grenzflächenaktiven und F i g. 2-IV).

Verbindungen in Berührung ommt. Die Proteaseaktivität wurde folgendermaßen be-

Es ist bekannt, alkalische rotease durch Züchten 5° stimmt: 5 ml einer 0,6°/₀igen Kaseinlösung wurden

bestimmter Stämm^ von Candida lipolytica (franzö- bei 30^cC mit 1 ml Enzymlösung versetzt. Nach 10 Mi-

sische Patentschrift 1 491 343), Serratia (französische nuten wird die Umsetzung durch Zusatz von 5 ml einer

Patentschrift 1 533 9^ιβ;, Pseudomonos aeruginosa Lösung abgestoppt, die in einem Gesamtvolumen

(britische Patentschrift 967 848), Cytophaga (USA.- von 1000 ml 36 ml einer 5ü°/_oigen (Gewicht/Volumen)

Patentschrift 3 330 738), Streptomyces moderatus 55 Trichloressigsäurelösung, 220 ml einer lmolaren Na-

(USA.-Patentschrift 3 331 751) und Arthrobacter urea- triumacetatlösung und 330 ml einer lmolaren Essig-

faciens (USA.-Patentschrift 3 345 269) herzustellen. säurelösung enthält. Das nicht umgesetzte Kasein

Bei diesen Verfahren werden jedoch nur realtiv wurde so ausgefällt und die erhaltene Fällung mit

niedrige Ausbeuten an alkalischer Protease erhalten. einem Filterpapier bestimmter Porengröße abfiltriert.

Ziel der Erfindung war es daher, ein mit hohen 60 Die optische Dichte des Filtrats wurde bei 275 ιτιμ

Ausbeuten verlaufendes Verfahren zur Herstellung gegen eine Substrat-Kontrollösung bestimmt. Die

einer alkalischen Protease zu schaffen. Sie sollte ferner Kontroilösung wurde durch Zugabe von 5 ml der

im Hinblick auf die bekannte Verwendung sehr stabil Trichloressigsäure enthaltenden Lösung zu 1 ml der

sein, ihre enzymatische Aktivität in Gegenwart der Enzymlösung, anschließende Zugabe des Kaseins und

vcschiedensten Arten von grenzflächenaktiven Ver- 65 lOminutiges Inkubieren bei 30^cC hergestellt. Die

biiidungen beibehalten und bei erhöhte,· Temperatur Einheit der Enzymaktivität ist definiert als diejenige

und hohen alkalischen pH-Werten aktiv sein. Menge an Enzym, die trichloressigsäurelösliche Stoffe

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren entsprechend 10y Tyrosin in 10 Minuten in Freiheit