DE2343963B2

DE2343963B2 - Stäbchenbakterium-Peptidase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2343963B2
Application number: DE2343963A
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Goi; Hidemasa Yokohama Hidaka; Takemi Koeda; Shinji Miyado; Tomizo Niwa; Kazuo Fujisawa Saito; Uichi Tokio Shibata; Yujiro Yamada; Kenji Kawasaki Yoshida; Yasukatsu Yokohama Yuda
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1972-09-02
Filing date: 1973-08-31
Publication date: 1980-03-20
Also published as: US3905869A; FR2197569B1; DE2343963C3; FR2197569A1; CA990672A; GB1451074A; JPS5039151B2; JPS4942883A; DE2343963A1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Stäbchenbakterium-Peptidase mit hoher Aktivität und Stabilität in alkalischem Medium und starker entzündungshemmender Eigenschaften sowie ein Verfahren zur Herstellung der neuen Stäbchenbakterium-Peptidase durch Kultivierung des Bacillus sp. ATCC 21964 in einem geeigneten Nährmedium.

Peptidasen dieser Art werden seit langem als Verdauungshilfen angewendet und finden seit jüngster Zeit auch Verwendung als Mittel mit entzündungshemmenden Eigenschaften, als eiterabbauende Mittel, als Detergentien und als Zusatzstoffe bei der Verarbeitung von Nahrungsmitteln.

Inzwischen ist eine Vielzahl derartiger Peptidasen bekanntgeworden, die die verschiedensten Stabilitäten und Aktivitäten, letztere besonders in Abhängigkeit vom pH-Wert, aufweisen und demgemäß auch in den verschiedensten Bereichen Anwendung und Einsatz finden.

So beschreiben die DE-OS 19 65 305 und die DE-OS 20 48 811 Proteasen mit vorwiegend im sauren Milieu ausreichender Stabilität, die naturgemäß für hohe ω> Aktivitäten im alkalischen Bereich nicht in Frage kommen. Zu ihrer Herstellung werden Stämme von Coprinus macrorhizus bzw. Bacillus subtilis durch Kultivierung angereichert und in bekannter Weise aufgearbeitet. b5

Proteasen mit in alkalischem Milieu nachgewiesener Stabilität und Aktivität sind aus den DE-OS 19 36 437, 19 40 488, 19 52 012, 19 54 218, 20 05 232,20 44 161 und 21 07 276 bekannt

Diese Peptidasen zeigen aber entweder nur einen sehr engen Stabilitätsbereich oder einen ebenfalls äußerst geringen Aktivitätsbereich oder einen ebenfalls äußerst geringen Aktivitätsgrad in Abhängigkeit vom pH-Wert Weiter sind einige von ihnen, so z. B. die Peptidase nach DE-OS 19 52 012 und DE-OS 20 05 232, praktisch nur in Gegenwart von ionogenen oder nichtionogenen oberflächenaktiven Stoffen von einer gewissen Proteaseaktivität begleitet, für weitere der obengenannten Peptidasen, etwa nach DE-OS 19 40 488 oder DE-OS 19 54 218, werden praktisch keine Stoffkonstanten angegeben, so daß weder Eigenschaften noch Aktivitäten herleitbar sind.

Es hat sich bei Reihenversuchen gezeigt, daß sowohl die Aktivität als auch die Produktivität bekannter alkalischer Stäbchenbakterium-Peptidasen — und dies in Übereinstimmung mit der praktischen Erfahrung auf dem Gebiet der Pharmakologie — insbesondere im Hinblick auf ihre entzündungshemmenden Wirkungen wenig zufriedenstellend ist.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine neue, im alkalischen Milieu stabile und dabei gleichzeitig eine hohe Aktivität als entzündungshemmendes Mittel aufweisende Stäbchenbakterium-Peptidase zu schaffen, die in ihrer Aktivität nicht nur bisner bekannten, vergleichbaren Peptidasen überlegen ist, sondern sich auch in ihren weiteren physikalischen und chemischen Eigenschaften von den bekannten alkalischen Peptidasen wesentlich unterscheidet.

Die Aufgabe wird gelöst durch eint· neue Stäbchenbakterium-Peptidase mit allen bekannten Peptidasen gegenüber überlegener entzündungshemmender Aktivität, die durch die Stoffkonstanten gemäß Anspruch 1 ausgewiesen ist.

Der Name bzw. die Bezeichnung der neuen alkalischen Peptidase lautet Bacillopeptidase-C.

Es sind zwar bereits Peptidasen vorgeschlagen bzw. gezüchtet worden, die in einer äußerst geringen Zahl von Merkmalen mit der neuen Peptidase ein Ähnlichkeitsverhalten zeigen, doch weisen diese entweder unterschiedliches Verhalten bezüglich der pharmakologischen Aktivität in Abhängigkeit von pH-Wert und Temperatur auf, oder sie zeigen Eigenschaften aus dem Bereich physikalischer und chemischer Stoffkonstanten, die sie gegenüber der neuen Peptidase als völlig anders geartete Enzyme ausweisen.

Die in den DE-OS 16 42 665, 19 06 001,19 65 281 und 20 26 092 beschriebenen Peptidasen bzw. alkalischen Proteasen haben nicht nur ein unterschiedliches Molekulargewicht; auch der Aufbau auf Grund der Elementaranalyse, der Isoelektrische Bereich, die UV-Absorption und — dies ist von besonderem Interesse — der pH-Bereich von Stabilität und Aktivität, der ja für eine optimale Aktivität als entzündungshemmender Wirkstoff von entscheidender Bedeutung ist, sind ganz spezifische Kennzeichen der neuen Stäbchenbakterium-Peptidase, die sie von den bekannten alkalischen Peptidasen wohl unterscheiden.

Die herkömmlichen alkalischen Proteasen werden von etwa 10¹M Diisopropyl-Fluorphosphat (nachfolgend mit DFP bezeichnet), welches ein spezieller Hemmstoff gegen Serin-Enzyme ist, völlig inaktiviert, wogegen sie von EDTA, welches einen speziellen Hemmstoff gegen neutrale Proteasen ergibt, kaum beeinflußt werden (1^. Keay und B. S. Wildi, Biotech, and Bioeng. 12, 179 (1970), K. Morlkara, Biochem. and Biophys. Research Communications 26, 656-657,

(1967); D. Tsuru et al, Agr. Biol. ehem., 30,1266 (1966); K. Horikoshl. Agr. Biol. chem. 35,1407 (1971).

Demgegenüber ist die neue alkalische Peptidase Bacillopeptidase-C inaktiv gegenüber dem Einfluß von Äthylendiamin-Tetraacetat (EDTA) und Diisopropyl-Fluorphosphat (DFP).

Der beim Verfahren der Erfindung einzusetzende, die Bacillopeptidase-C produzierende Stamm ist aus dem Erdreich isoliert und im Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, unter FERM-P Nr. 1522 und in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter ATCC Nr. 21 964 hinterlegt worden. Der Stamm weist folgende Eigenschaften auf:

Vermehrungsstäbchen: 0,7 bis 0,9 χ 2,5 bis 3,5 Mikron, beweglich mittels peritrichenähnlicher Flagellaten; gramindifferent

Sporen: 1,3 bis 1,6 Mikron mit kugelförmigen Enden.

Optimales Wachstum bei pH = 7 — 9; gutes Wachstum bei 28 bis 40⁰C; kein Wachstum bei 50°C; aerobe Bakterien.

Kolonien auf Fleischextrakt-Agar-Nährboden zeigen glatte Oberfläche mit Oberflächenglanz, die lichtundurchlässig und in der Farbe leicht gelblich-brai ι sind.

Sonstige Agar-Nährböden: ergiebiges Wachstum, glatte Oberfläche. Glukose-Agar-Nährböden: Wachstum gleich oder besser als bei sonstigen Nährböden;
Sojabohnenextrakt-Agar-Nährböden: die gleichen Eigenschaften wie bei Glukose-Nährböden, cremige Oberfläche;

Fieischextrakt-Brühe enthaltend NaCl: Wachstum bei 5% NaCl-Anteil, kein Wachstum bei 10% NaCl Anteil; die Fleischextrakt-Brühe ist gleichmäßig trübe (schlammig), und es bildet sich kein Bakterienfilm;
Fleischextrakt-Gelatine-Stichkultur zeigt schichtenförmige Verflüssigung bei 22°C innerhalb einer Woche;

Lackmus-Milch: schwach rosa gefärbt;
Glukose-Asparagin-Agar-Nährböden:

kein Wachstum;
Hydrolyse von Stärke: negativ;
Bildung von Indol: negativ;
Bildung von Azetylmethylalkohol: negativ;
Katalase: positiv;

Verflüssigung von Gelatine: positiv;
Hydrolyse von Kasein: positiv;
Reduktion von Nitrat: negativ;
pH-Wert der Glukose-Brühe beträgt 7,8 bis 8,0;
Urease: negativ;

Reduktion von Methylen-Blau (Farbe): positiv;
Gaserzeugung von Nitrat unter anaerobeii
Bedingungen: negativ;
Wachstumsfaktor: Thiamin (Vitamin Bl)

erforderlich;

Wachstum in Glukose-Brühe unter aniieroben
Bedingungen: negativ.

Ein Verglich des Mikroorganismus mit den obengenannten mj'kologischen Eigenschaften mit bekannten Mikroorgan'smen, wie sie beispielsweise in Bergey's Handbuch c'tr Bestimmungs-Bakteriologie, 7. Ausgabe, 1957, besch^rie':>en sind, zeigt, daß dieser Stamm nahe dem BacilluN frrevis und dem Bacillus sphaericus liegt. Jedoch unterscheidet er sich vom Bacillus sphaericus durch die Verwertung von Kasein und Gelatine und vom Bacillus brevis in jeder Hinsicht in bezug auf die Morphologie der Sporen, auf das Wachstum im 5%-NaCl-haltigen Medium und auf die Notwendigkeit des Vorhandenseins von Thianrä für das Wachstum. Unter den bekannten Mikroorganismen ist keiner festzustellen, der mit dem die Bacillopeptidase C bildenden Mikroorganismus völlig übereinstimmt

Demgemäß ist der bei der Erfindung benutzte Stamm wegen seiner Zugehörigkeit zu den Bacillaceae-Stämmen als neuer Bacillus sp. Nr. 794 bezeichnet worden.
Die Kultivierung oder Züchtung wird in der Regel auf

ίο übliche Weise durchgeführt, wie sie für die Kultivierung der wichtigsten Mikroorganismen entweder in fester oder flüssiger Form angewandt wird. Im allgemeinen wird die flüssige Kultivierung bevorzugt. Anwendbare Kuitivierungslösungen sind synthetische, halbsynthetische und natürliche Nährlösungen. Als Kohlenstoff liefernde Nährlösungen kommen in Betracht Glukose, Saccharose, Maltose, Glukonsäure, Stärke, Hydrolysate von Stärke und anderen Kohlenhydraten, als Stickstoff liefernde Nährlösungen Pepton, Fleischextrakt, Maiswasser, Whisky aus Mais, Sojabohnenmehl, trockene Hefe, Gluten, Kasein-Abbau-Produkte, Harnstoff, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, einzeln oder in Kombination miteinander. Wahlweise können Magnesiumkarbonat, -sulfat oder -hydrochlorid, Man-

2-5 gan- oder Calciumverbindungen und weiter Natriumchlorid oder schaumverhindernde Mittel in geeigneten Mengen hinzugefügt werden. Die bevorzugte Temperatur liegt bei 25 bis 40°C. Die Kultivierungszeit ist abhängig von der Kultivierungstemperatur, dem Kultivierungsvolumen und dem Kultivierungssystem, jedoch kann die Herstellung der neuen Protease Bacillopeptidase-C im allgemeinen innerhalb von 40 bis 100 Stunden durchgeführt werden. Die Isolierung der erzeugten Protease aus der Nährlösung wird nach einem der üblichen Verfahren für die Reindarstellung von Enzymen durchgeführt, beispielsweise durch Filtrieren, durch Ausfällen, durch wasserlösliche anorganische Salze, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat, durch Fällung, durch Zugabe von mit Wasser vermischbaren organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Azeton oder durch Adsorbierung und Elution unter Verwendung von Calciumphosphat, Aluminiumoxid, Bentonit, Austauscherharz oder Ionenaustauschern aus synthetischen organischen Zusammensetzungen, die von Polysaccarid-Dextran (DEAE-Sephahadex A-50) abgeleitet sind. Das auf diese Weise erhaltene Enzym wird nach der später beschriebenen Arbeitsweise gereinigt, so daß ein elektrophoretisch hochreines Endprodukt erhalten wird.

Die neue alkalische Peptidase BaciUopeptidase-C gemäß der Erfindung weist die nachstehend enzymologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften auf, die durch die Fig. 1—5 im Diagramm dargestellt werden. Dabei zeigt

Fig. 1 die Abhängigkeit der Aktivität vom pH-Wert (Aktivität in % auf derOrdinaten aufgetragen),

F i g. 2 die Abhängigkeit der Stabilität vom pH-Wert (Stabilität in % auf derOrdinaten aufgetragen),

Mi Fig.3 die Abhängigkeit der Aktivität von der Temperatur (Aktivität in % auf der Ordinaten aufgetragen),

Fig.4 die Abhängigkeit der Stabilität von der Temperatur (Stabilität in % auf der Ordinaten

6) aufgetragen),

Fig. 5 den Verlauf der chromatographischen Fraktionierung der neuen Protease an einer 60 ml »DEAE-Sephadex-A 50« Kolonne.

Dabei betrifft die Kurve (1) den Trennverlauf des Rohprodukts und erreicht einen Peak bei der Faktion 130 und einer optischen Dichte (bei 280 Millimikron) von 4,65, in einem Medium, das bezüglich »Tris-HCL« M/200 und bezüglich Calciumacetat M/100 eingestellt ist und einen pH von 7,5 aufweist.

Kurve (II) betrifft die Proteolytische Aktivität bei pH 10,5 unter sonst gleichen Bedingungen.

1. Aktivität bzw. Wirksamkeit

Gemäß Fig. 1, deren Werte für ein Milch-Kasein-Substraü ermittelt wurden, ist eine gute Aktivität im pH-Bereich von 6 — 11, dagegen die optimale Aktivität im pH-Bereich von 9 - 9,3 vorhanden.

Diese Aktivitäten weisen die Bacillopepiidase-C auch als alkalische Peptidase aus.

2. Spezifische Substrat-Wirksamkeit

Die folgende Tabelle 1 zeigt die spezifische Substrat-Wirksamkeit eier Bacillopeptidase-C.

Tabelle 1

Substrate

Relative Anfangsgeschwindigkeit

Milch-Kasein
Albumin
Hämoglobin
Fibrinogen

100
40

111
50

3. Messung der Protease-Aktivität

Die Protease-Aktivität wurde gemäß einem Verfahren gemessen, das auf Anson & Hagiwara basiert (B. Hagiwara et al., The J. of Biochem„45,185.1958, ibid. 45, 251, 1958) und welches wie folgt leicht abgewandelt wurde: 1 Milliliter der Enzymlösung, der mit M/50 CAPS Pufferlösung in geeigneter Weise verdünnt ist, wird mit 5 ml einer 0,6%igen Kasein-Lösung (pH = 9,0) bei 40°C vermischt. Nach 10 Minuten Inkubationszeit wird die Reaktion durch Zugabe von 5 ml einer Lösung von Trichloressigsäure, 0,44 M, gestoppt, danach folgen 30 Minuten als weitere Inkubationszeit bei 40⁰C. Im Anschluß daran werden 2 ml einer 0.55 M Natriumkarbonatlösung und 1 ml Folin-Reagenz zugefügt und die Mischung noch 30 Minuten lang bei 40⁰C stehen gelassen. Die optische Dichte der sich ergebenden Mischung wird bei 660 ιτιμ im Vergleich zu dem Leerwert der Probe gemessen. Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge Enzym definiert, die Peptid in einer solchen Menge freisetzen kann, daß es bei der besagten optischen Dichte 1 μg Tyrosin in einer Reaktionsmischung bei pH = 9,0 und 4O⁰C in einer Minute gleichkommt

4. Auswirkungen des pH-Wertes auf die Aktivität
und die Stabilität der Peptidase

Der Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität des vorliegenden Enzyms gegenüber einem Milch-Kasein-Substrat ist in Fig. i dargestellt Der optimale pH-Wert liegt bei 9,3, und die Aktivität wird bei pH = 6,0 bis 7 bzw. 10,5 bis 11 auf die Hälfte reduziert In F i g. 2 ist der Einfluß der verschiedenen pH-Werte auf die Stabilität des Enzyms dargestellt, wobei die Restaktivität nach einer Behandlung mit M/50 CAPS Pufferlösung (Cyclohexyl-Aminopropan-Sulfonsäure), bei einer Veränderung der pH-Werte bei 40°C innerhalb von 60 Minuten bestimmt wird. Wie aus F i g. 2 hervorgeht, ist das Enzym über einen weiten Bereich von pH-Werten stabil; die Restaktivität von "> mehr als 90% existiert im pH-Bereich von 7 bis 10,5, insbesondere von 10 bis 10,5.

5. Einfluß der Temperatur auf die Aktivität und
die Stabilität der neuen Peptidase

in Wie F i g. 3 zeigt, liegt die für die Aktivität der neuen Peptidase günstigste Temperatur bei 45⁰C wobei jedoch schon 35⁰C nahezu 80% der Aktivität erreicht werden.

Wie andererseits aus Fig.4 hervorgeht, ist das Enzym unterhalb 40°C relativ stabil und zeigt auch bei 55⁰C noch 50% Restaktivität.

Die in Fig.4 vorhandenen Kurven betreffen einmal die Stabilität der neuen Peptidase in M/50 CAPS-Pufferlösung (große Kreis-Meßpunkte) und zum anderen die 2n Stabilität in der gleichen Pufferlösung, jedoch mit zusätzlichen Calcium++ -Ionen (ImM Ca++-Ionen in Form von Calciumacetat). Diese Ergebnisse sind durch die Kurve mit den kleinen Kreis-Meßpunkten dargestellt.

Das Ergebnis bestätigt die bekannte Erfahrung, daß die thermische Stabilität der meisten Enzyme durch die Anwesenheit von Ca + + -Ionen verbessert wird.

Fig.4 zeigt weiter, daß bis etwa 40⁰C die Stabilität des Enzyms — unabhängig von zugesetzten Ca⁺ +-Io-3(i nen — ziemlich konstant ist (volle, schwarze Kreis-Meßpunkte); andererseits geht die Aktivität bei 70⁰C — auch in Anwesenheit von Ca⁺+-Ionen — praktisch auf Null zurück (vergl. schwarzen, vollen Kreis-Meßpunkt bei 70° C).

Die Ermittlung der Stabilität erfolgte gemäß nachstehendem Verfahren: Das Enzym wurde in M/50 CAPS (Cyclohexyl-Aminopropan-Sulfonsäure) aufgenommen und gelöst (pH = 9,0).

Dann wurde die Lösung jeweils 15 Min. bei der M) Meßtemperatur stehen gelassen und die Restaktivität nach dem Verfahren von Anson & Hagiwara (vergl. 3., »Messung der Protease-Aktivität«) bestimmt.

Eine gleiche Meßreihe wurde mit der gleichen, jedoch jeweils 1 mM Ca⁺+-Ionen (als Calciumacetat) enthaltenden Lösung vorgenommen.

6. Inaktivierungsbedingungen in Abhängigkeit von
pH-Wert und Temperatur

Bei einem pH-Wert unterhalb von 6 und oberhalb von so 12 ist die Peptidase im wesentlichen inaktiv. Sie ist völlig inaktiv nach 1 stündiger Behandlung bei 40° C und einem pH-Wert von 4 oder 12. Sie ist bei einem pH-Wert von 7 und 65° C völlig inaktiv, desgleichen bei einem pH-Wert von 9,5 und 70°C

7. Einfluß von Hemmstoffen

Tabelle 2 zeigt den Einfluß einer Anzahl von hemmenden Substanzen. Die Zahlenwerte sind in Einheiten der Restaktivität angegeben. Bekannte alkalische Proteasen sind Serin-Enzyme, welche an der aktiven Stelle Serin enthalten und dafür bekannt sind, daß sie durch spezielle Hemmstoffe, wie beispielsweise DFP und Kartoffelhemmstoff, jedoch nicht durch EDTA oder o-Phenanthrolin gehemmt werden. Andererseits sind neutrale Proteasen als Metall-Enzyme bekannt deren Verhalten gegenüber den DFP- und EDTA-Hemmstoffen in Vergleichen zu den Serin-Enzymen völlig entgegengesetzt ist

In der nachstehenden Tabelle 2 besitzen die angeführten Symbole folgende Bedeutung:

PCM B p-Chlor-Quecksilber-11-Benzoesäure
T-Enzym Thermolysin, eine bekannte, kristalline, neutrale Protease

DFP	Diisopropyl-Fluorphosphat	Konzentrationen	3 xlO-⁴ (Mol)	Α-Enzym Alkalische	5	subtilis var.	Protease II, erhalten ;	7
PI	Kartoffel-Hemmstoff		3 χ ΙΟ-⁵ (Mol)		stalliert.	amyiosacchariticus, c	21
TI	Trypsin-Hemmstoff					76
EDTA	Äthylendiamin-Tetraazetat	1.1 XlO-^(MoI)	Peptidase	T-Enzym		18
	Hemmstoffe	1.1 χ 10-" (Mol)	gem. der		A-Enzym	100
		0.1 (mg/ml)	Erfindung	o/o		100
		0.5	0	100	o/o	133
	DFP	0.1	35	100	116
	DFP	0.01	41	100	93
	PI	1 χ ΙΟ-³ (Mol)	0	100	100
	PI	Ix 10-"(MoI)	100	100	119
	TI	o-Phenanthrolin 1 χ 10"² (Mol)	100	100
	TI	PCMB	0	0
	EDTA	PCMB	0	57
	EDTA	95	0
	100
	103

Bei diT Erfindung handelt es sich somit um eine neue Peptidase. Sie ist ihrerseits ähnlich einem Serin-Enzym, mit Serin an der aktiven Stelle, wie es alkalische Proteasen aufweisen, jedoch wird sie andererseits offensichtlich von Äthylendiamin-Tetraazetat schwach beeinflußt, wodurch die maßgebende Rolle der zweiwertigen Metalle bei der Enzymwirkung angezeigt w'rd.

8. Die entzündungshemmende Wirkung der

neuen alkalischen Protease Bacillopeptidase C

geht aus folgendem Versuch hervor

Fünf Donryu-Ratten (mit einem Gewicht zwischen 130 und 150 g) wurde pro Ratte 0,5 mg einer jeden der nachfolgend angegebenen Enzym-Probenlösungen intraperitonal, d. h., im Bereich des Baufells verabreicht und nach einer Stunde 0,05 ml einer Karrageeninlösung subkutan in die Sohle eines Hinterbeines einer jeden Ratte gespritzt. Nach drei Stunden wurde das Ausmaß des entstehenden Ödems mit einer Schieblehre gemessen, um die Auswirkung der einzelnen Enzyme zu beurteilen. Im Ergebnis zeigte sich, daß das Maß der Ödembildungsverhinderung von Trypsin 33%, von «-Chymotrypsin 25% und von Bromelin 37% betrug, während das der erfindungsgemäßen Peptidase bei 85% lag.

	0,1 mg/	0,5 mg/	1,0 mg/
	Ratte	Ratte	Ratte
Bromelin	0	37	52
Trypsin	0	33	0
Chymotrypsin	20	25	0
Lysozym	0	11	23
Enzym d. Erfindung	55	85	0

(Die Zahlenwerte geben das Maß der Ödembildungsverhinderung in % gemäß dem Ratten-Ödem-Verfahren an, wobei Karrageenin als phlogistisches Agens benutztwird.)

Aus dem Vorangegangenen ergibt sich, daß die neue Protease Bacillopeptidase-C Eigenschaften aufweist, welche sich deutlich von denen bekannter Proteasen unterscheiden. Während bekannte Proteasen von DFP zwar völlig, von EDTA aber nicht inaktiviert werden, wird das Enzym nach der Erfindung sowohl von DFP als auch von EDTA angegriffen. Im Gegensatz zu den bekannten Proteasen, die einen isoelektrischen Punkt bei pH = 8 oder mehr aufweisen, besitzt das Enzym gemäß der Erfindung einen isoelektrischen Punkt beim pH 6,0 und zeigt eine weit größere Entzündungshemmwirksamkeit. Die Bacillopeptidase-C weist nur geringe Toxizität auf. Die akute Toxizität der Bacillopeptidase-C wurde durch orale Gaben getestet. LD50 des Enzyms wurde mit 9500 mg/kg bestimmt (mit 95%iger Sicherheit zwischen den Grenzen von 8796 bis 10 260 mg/kg) für Mäusemännchen und 8900 mg/kg (mit 95%iger Sicherheit zwischen den Grenzen von 8240,7 bis 9612 mg/kg) für Mäuseweibchen nach dem Verfahren von Lirchfield & Wilcoxon (J. Pharmacol. Exp. Therap. 96, 99-113, 1949) berechnet. Die erfindungsgemäße Bacillopeptidase-C kann deshalb als wirksames entzündungshemmendes Mittel benutzt werden. Für den Gebrauch bei der therapeutischen Behandlung von Entzündungen und Ödemen nach Operationen oder nach schweren Verletzungen können 2,5 bis 10 mg der Bacillopeptidase-C zusammen mit Stärke oder Laktose (Milchzucker) in Tabletten oder Kapseln gepreßt und jeweils in einer Dosis von 2 bis 3 Stück drei bis vier mal am Tag oral verabreicht werden.

Beispiel 1
(a) Herstellung des rohen Enzympulvers

Zwanzig Liter einer Nährlösung enthaltend 1% Stärke, 2% Sojabohnen-Ölkuchen, 1% Weizenkleie, 0,5% Kaliumphosphat, 0,5% Calchimcarbonat und 0,05% Magnesiumsulfat werden in einen 30 Liter fassenden Gährkolben gegeben und unter Druck während 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert

Anschließend wird das Medium mit 200 ml einer Zuchtkultur von Bacillus sp. Nr. 784 (ATCC Nr. 21964 bzw. FERM-P Nr. 1522) geimpft, die separat in einem Nährsubstrat gezüchtet wurde.

Die Kultivierung erfolgt unter Rühren bei einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min während 3 Tagen ur.tcr 10C%iger Belüftung bei 30" C.

Sofort nach beendeter Kultivierung wird die Lösung zentrifugiert, um die Bakterien zu entfernen. Dabei fallen etwa 15 Liter Filtrat an. Dieses wird im Vakuum auf etwa 3 Liter eingeengt und durch Zugabe von 27 g Calciumacetat auf einen pH von 8,0 eingestellt. Der hierbei ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und verworfen und das klare Filtrat mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 0,6 molar versetzt. Dann wird das ausgesalzene rohe Enzym durch Zentrifugieren abgetrennt. Dabei fallen etwa 80% der bei Beendigung der Kultivierung vorliegenden Enzym-Aktivität an.

Das rohe Enzym wird in einem Puffergemisch aus Tris und HCL einer Molarität von M/200 bezüglich Tris, das außerdem M/500 molar an Calciumacetat ist und einem pH von 7,5 zeigt, gelöst und die Lösung gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert.

Dann wird die erhaltene Enzymlösung an einer 3 Liter-Säule aus einem Austauscherharz auf Basis Polysaccharid (DEAE-Sephadex-A50), die mit der obigen Pufferlösung abgeglichen wurde, absorbiert und zunächst mit etwa 10 L der gleichen Pufferlösung, dann mit der gleichen, jedoch auf 0,1 molar NaCL eingestellten Pufferlösung behandelt und dabei das Enzym eluiert. In 31 Eluat konnten etwa 70% der Enzymaktivität erhalten werden.

Nach erneuter Chromatographie unter gleichen Bedingungen und anschließendem Einengen des Eluats auf '/ίο seines Volumens wurden ca. 0,8 g kristalline Protease Bacillopeptidase-C erhalten.

(b) Reindarstellung des Rohprodukts

Das wie oben erhaltene Rohprodukt wird in Wasser zu einer 10%igen Lösung gelöst und bei 5° C mehrere Stunden gerührt um optimale Auflösung zu erreichen.

Anschließend wird mit Calciumacetat bis zu einer Konzentration von 1 % versetzt.

Nach Einstellen des pH-Wertes auf 7,5 bis etwa 8,0 wird der gebildete Niederschlag durch Filtration abgetrennt und verworfen.

Zu der nunmehr klaren Lösung wird soviel Ammoniumsulfat gegeben, bis dessen Konzentration eine Molarität von 0,6 zeigt. Die Lösung wird mehrere Stunden stehen gelassen und anschließend zentrifugiert. Die als Niederschlag gewonnene Protease wird zwecks Abtrennung von nicht gelöstem Ammonsulfat in einem Puffergemisch aus Tris und HCL einer Molarität von M/200 bezüglich Tris, die einen pH von 7,5 zeigt und

Calciumacetat in einer Molarität von M/500 enthält, gelöst und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert.

Dann wird an einer Säule aus einem Austauscherharz auf Polysaccharid-Basis (DEAE-Sephadex-A-50) absorbiert und mit der 5- bis 7fachen Menge, bezogen auf das Säulenvolumen des gleichen Puffers, eluiert. Schließlich wird die Säule nochmals mit dem Tris-Puffer eluiert, der jedoch diesmal auf O.lmolar bezüglich NaCl eingestellt ist.

Die vereinigten Lösungen werden in der gleichen Weise erneut Chromatographien und schließlich auf V-. bis '/is des Volumens eingeengt. Dabei fällt das reine kristalline Enzym mit den im Hauptanspruch zusammengefaßten Eigenschaften an.

Beispiel 2
Weiteres Verfahren der Reindarstellung

50 g des rohen, nach Beispiel l(a) gewonnenen

2Q Enzympulvers werden in 300 ml Pufferlösung (Tris-

HCL-Calciumacetat; 10 mM Tris-HCL und 5 mM Calciumacetat) mit einem pH von 8,0 suspendiert, die Suspension mit 200 g Glycerin versetzt (wobei das Enzym in Lösung geht), und mit der gleichen Pufferlösung auf 1000 ml aufgefüllt.

Diese Enzymlösung wird nun an einer vorher mit der reinen Pufferlösung abgeglichenen DEAE-Sephadex-A-50 Ionenaustauschersäule (800 χ 4800 mm) absorbiert.

m Die Säule wird mit ca. 201 des gleichen Puffers gewaschen und anschließend das Enzym mit einer gleichartigen, jedoch 5 mM Calcium ++-Ionen enthaltenden Pufferlösung eluiert.

Das Eluat wird im Vakuum eingeengt, wobei eine Suspension von Enzymkristallen erhalten wird.

Diese Suspension wird dann gegen einen 5 mM Calcium + + -Ionen enthaltenden Puffer bei 5° C dialysiert und die Kristalle anschließend durch Zentrifugieren abgetrennt.

Die Kristalle werden in der gerade notwendigen Menge 75%igem Glycerin gelöst. An dieser Lösung wird durch Scheiben-Elektrophorese die Reinheit ermittelt.

Die Ausbeute, an der Aktivität gemessen, lag bei 60% und die Aktivität des über Silikagel im Exsikkator getrockneten Pulvers betrug 5500-6000 Einheiten pro mg Protein.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Stäbchenbakterium-Peptidase als wirksames entzündungshemmendes Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß die neue alkalische Protease mit der Bezeichnung Bacillopeptidase C folgende Eigenschaften aufweist:

(1) Elementaranalyse: C = 51,22%, H = 6,92%,

S = 0,9S%,N = 16,99%, Asche = 1,62%,

(2) Molekulargewicht: etwa 27 000,

(3) Maximale Absorption im ultravioletten Absorptionsbereich einer Wellenlänge von 280 mu,
E!* :12,7(pH = 6,8),

(4) Isoelektrischer Punkt: pH = 6,0,

(5) Spezifische Aktivität: 11 400 μ/mg N,

(6) Optimale Aktivität: bei pH = 9,0 - 9,3 (wie in F i g. 1 dargestellt) und etwa 45°C (wie in F i g. 3 dargestellt),

(7) Stabilität im pH-Bereich von 7 — 10,5 (wie in F i g. 2 dargestellt),

(8) Inhibition durch Äthylen-Diamin-Tetraacetat, Diisopropyl-Fluorphosphat oder Kartoffel-Hemmungsstoff, jedoch nicht gehemmt durch Trypsin-Inhibitor, o-Phenanthrolin oder Chlor-Quecksilber-II-Benzoesäure.

2. Verfahren zur Gewinnung der neuen Stäbchenbakterium-Peptidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Bacillus sp. ATCC 21 964 in einem festen oder flüssigen, Thiamin enthaltenden Nährmedium bis zur Ansammlung des Enzyms züchtet und nach einem der üblichen Verfahren für die Reindarstellung von Enzymen isoliert.

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