CS226036B2

CS226036B2 - Method of preparing b mg 162-af2 antibiotic

Info

Publication number: CS226036B2
Application number: CS816592A
Authority: CS
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Hiroshi Naganawa; Hironobu Iinuma; Setsuko Kunimoto
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1980-09-08
Filing date: 1981-09-07
Publication date: 1984-03-19
Also published as: NL8104069A; HU188077B; DK157890C; SE450836B; US4416899A; FR2489819B1; CA1175763A; ES8302090A1; FR2489819A1; GB2084999B; ES505256A0; ATA386081A; IT1209896B; BE890229A; SE8105079L; KR870001373B1; AU523222B2; JPS5748957A; CH655498B; DK394281A

Description

(54) Způsob výroby antibiotika BMG 162-aF2

Vrnález se týká způsobu výroby nového antibiotika BMG-116-aF2 vzorce

X c-NH-(ck₂)₄-ch-ch₂-co

NH	.OH NH 1 CH-OH CO-№H-(CH2)4-NH-(CH2)₃-NH₂

a jeho farmaceuticky vhodných solí. ·

Podstata vynálezu je v tom, že se kmen mikroorganismů druhu Badlus leterosporus kultivuje aerobně v kapalné živné půdě ' obsahhjící zdroje dusíku a uhlíku a anorganické soli, při teplotě 15 až 40 °C a při pH 5,0 ež 8,2, po dobu potřebnou k nahromadění dostatečného množžtví antibiotika BMG 162-eF2, načež se entibiotilmn BMG 162-aF2 z kultivačního prostředí izoluje a popřípadě převede v jeho farmaceuticky vhodnou sůl.

Jako kmene mikroorganismů produbijícího anti-bicikum BMG 162-eF2 se používá druhu Becillus laterosporus BMG l62-eF2, FERM-P 5230, ATCC 31932 nebo BeaiUus leterosporus OUT 8139 nebo jeho varianty.

Izolace antibiotika BMG 162-aF2 z kultivačního prostředí se provádí pomocí sloupcové clnromaaoogrfie za pouužtí slabých katexových pryskyřic, maaících kerboxylovou skupinu jako aktivní skupinu. Antibiotkkm BMG 162-aF2 adsorbované, ne ketexové pryskyřici se eluuje vodným roztokem kyseliny nebo soli. '

Jako příklad kmene mikroorganismů produlnxjícího entibiotikm BM(GaF2 a patřícího k rodu ' BcCllus lze uvést ' kmen BcCIlue BMG 162-aF2, který byl izolován ze vzorků půdy shromážděných autory tohoto vynálezu v prostoru hory Mt. Teihei v prefektuře Tochigi v Japonsku v srpnu roku 197β.

Kultivační a texonomické chíαrekieгistiib zmíněného kmene BMG l62-eF2 jsou popsány níže.

1. . Mikroskopická. morfologie

Kmen BMG 162-eF2 je becd vytanuje! nekonstantní Gramovu barevnou reakci a vytvářející spory a tyčinky o velikosti obvykle 0,6 až 0,8 дт krát 2 až 3,5 дт. Uvedený bacil má rovněž postranní bičíky a vykazuje aktivní pothbbivost. Spory jsou eliptické, jejich převládající poloha je centrální, jejich rozměry 0,5 až 0,7 )um krát 1,0 až 1,5 дт, a tyčinka je zřetelně zvětšená. Spora má na své boční straně část (parespOTální tělísko), které se dobře vybarvuje ve tvaru kanoe krystalovou violetí, a je rezistentní vůči teplu. Spora se nevybervuje barvivý stáými vůči kyselinám.

2. růstu na různých živných půdách

Všechny ·inkubace při těchto testech byly prováděny piři 37 °C^ s výjimkou inkubace ne živné želetinové půdě.

a) Rst na živné agarové desce

Kolonie jsou matné, neprůhledné, kuletého tvaru, jejich okraj je neprairiLdelný a je hnědavě bílý.

b) · Rist ne Šikmém živrném agaru

Růst je rozptýlený a rozmnožený po povrchu šikmé plochy agaru, povrch kolonií se zdá neprůhledný a suchý. Barva kultury je hnědavě bílá.

o) Rist ne tekuté živné půdě

Kultivační prostředí se v prvém' dnu po inkubaci v celém objemu zakalí a ve druhém dnu začne na povrchu narůstat blána. Ve třetím dnu potáhne blána celý povrch, prostředí se vyčeří, a mmceliím se vysráží u dna testovací zkumavky.

d) Růst na živné želatině

PH · inkubování při 20 °C se v prvém dnu objevuje kolem vpichu rozmnožování mikroorganismů. Ve druhém dnu dojde k depresi uvedeného rozmnožování. Asi od šestého dne začíná želatina v prostředí ztekucorat. Alternativně, při ^kubování při 30 °C, · začne ve druhém dnu narůstat blána a ve čtvrtém dnu začne prostředí ztekucovet. Ztekucení želatiny v prostředí je skončeno v sedmém dnu.

e) Růst na BCP mléku

Asi od pátého dne po inkubaci v přítomnosti brrmk'esrlrvé červeně (BCP) se červené barva mění ne modrou, a asi od dvanáctého dne začíná peptrnizere.

f) Růst na Sabouraudově glukosovér.i agaru a v Seboureldoáě glukosové živné půdě

Na šikmém Saboureu^dově glukosovém agaru (obsahujícím 10 g peptonu, 40 g glukosy, 15 g agaru a 1 000 ml deiriisc>vcné vody, pH neupravováno) a v tekuté Sebrшraldráě glukosové živné půdě (rbsohilící stejné složky jako výše s výjimkou agaru), při 30 °C a p:ři 37 . °C, nebyl ▼ tekuté Živné půdě pozorován žádný růst a na ŠUmém agaru se objcěrtl slabý růst v jeho spodní šásU.

3. Fyziologické vlastnosti

Pokud není specificky uvedeno jinak, byly inkubace prováděny při teplotě 37 °C.

a) Redukce dusičnanů

V prostředí hLtrátové živná půdy (obsahujjcí 10 g masového výluhu, 10 g peptonu, 5 g chloridu sodného, 1 g dusičnanu draselného β I 000 ml deionisované vody a majcí pH 7,2) byl detegován dusitan ve vSech kultivačních půdách v prvém, třetím a pátém dnu inkubace. Specificky v pátém dnu tyla pozorována významné reakce, a když bylo reakční činidlo přidáno do kultivační půdy, vznikla červenavě hnědá sraženina.

b) Denitrifikeční reakce

Při provedení testu na derdtrifikační reakci způsobem popsaným Koinagatou a spolupracovníky (viz m^nnorsafi T. Hasegawy, Taxonomy and Iádnnificetion of Mcroorgenisma', str. 223, vydveael The Un^ve^ty of Tokyo Prese, 19*75) byl získán negativní výsledek.

e) MR -test

V kultivačním prostředí obsahujícím 5 g glukosy, 7 g peptonu, 5 g chloridu sodného a 1 -000 ml deionisované vody, naaícím pH 7,5, po inkubaci při 30 °C, byl v prvém, druhém a pátém dnu proveden test s meeylčervení (MR. Ve všech testovaných případech byl test - pozitivní.

d) VB test

V kultivačním prostředí obsahujícím 5 g glukosy, 7 g peptonu, 5 g chloridu sodného a 1 000 ml deionisované vody, maaícím pH 7,5, po inkubaci při 30 °C, byl v prvém, druhém a pátém dnu proveden Voge8Ův-Pro8kaunrův (VP) test; ve všech testovaných případech byl test negativní.

e) Tvorba indolu

V kultivačním prostředí obsahujícím 20 g polypeptonu, 5 g chloridu sodného a 1 000 ml deionisované vody a maaícím pH 7,,4 nebyla v prvním a druhém dnu kultivace pozorována tvorba indolu, ale v pátém dnu byla pozorována.

f) Tvorba sirovodíku

Ne TSI agaru (agar s trojím druhem cukru a se železem: 3 g extraktu z hovězího mase, 3g kvasnlčného výluhu, 15 g peptonu, 5 g protedzového peptonu, 10 g laktosy, 10 g sacharosy, 1 g - glukosy, 0,2 g síranu železnatého, 5 g chloridu sodného, 0,3 g sirnatanu sodného, 12 g agaru, 0,024 g fenolové červeně a 1 000 ml destilované vody; pH 7,2) - po dobu - 7 dnů inkubace nebyla pozorována tvorba sirovodíku.

g) tyddolýza škrobu

Mikroorganismus byl kultivován na živné agarové desce nbsahujjcí 0,2 % rozpustného škrobu, a v 1., 2., 3., 5·, 6., 13. a 15· dnu bylo provedeno na proužcích agaru testování rozto/ kem jodu v jodidu draselném; v žádném případě nebyl pozorován rozklad škrobu.

h) Využívání kyseliny citrónové

Ha Kosařově citrátové živné půdě a ne Christensenově agaru nebyl během pěti dnů pozorován žádný růst.

i) Využívéné anorganických zdrojů dusíku pro růst

Byly provedeny testy kultivace po přidání zdrojů dusíku (1 g dusičnanu sodného, 0,76 g síranu amonného nebo 1,7 g glutamátu sodného) к základnímu živnému prostředí (obsahujícímu 10 g glukosy, 1 g dihydrogenfosforečnenu sodného, 0,5 g heptahydrátu síranu hořečnatého 0,2 g chloridu draselného o 1 000 ml deionisovené vody, majícímu pH 7,2), a v žádném případě z testovaných zdrojů dusíku nebyl pozorován růst·

j) Tvorba barviv

Po inkubaci přes noc na Kingově agaru A (obsahujícím 20 g peptonu, 1,4 g chloridu hořečnatého, 10 g síranu amonného, 15 g agaru a 1 000 ml destilované vody; pH 7,2) byla kulture ponechána stát při teplotě místnosti po dobu 6 dnů, popřípadě na Kingově agaru В (20 g peíptonu, 1,5 g hydrogenfosforečnenu draselného, 1,5 g síranu hořečnatého, 15 g agaru, 1 000 ml destilované vody; pH 7,2) po dobu 6 dnů; v žádném z obou případů nebyle pozorována tvprbe rozpustného barviva.

i-'.'· ·.;

k^Ureáza

Při kultivaci kmene na ureázové živné půdě (2 g peptonu, 30 g močoviny, 5 g chloridu sodného, 9 g dihydrogenfosforečnenu draselného, 3 g hydrogenfosforečnenu sodného, 0,01 g fenolové Červeně a 1 000 ml destilované vody; pH 6,2) po dobu 24 hodin byl výsledek testu ne ureázu negativní.

l) 0xidáza čerstvá kultura na Šikmém živném agaru (kultivovaná přes noc) vykazuje pozitivní oxidázovou reakci při zkouěce cytochromovým oxidézovým papírkem (vyráběný firmou Nissui Co.).

m) Kataláza čerstvá kultura na Šikmém agaru (kultivovaná přes noc) způsobuje pěnění a vykazuje pozitivní reakci při katelázovém testu za použití 3½ vodného peroxidu vodíku.

n) Podmínky růstu

Po dobu 24 hodin byla testována schopnost růstu mikroorganismu ne tekuté živné půdě při pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 6,8, 7,8, 8,2 a 8,8 po předchozí sterilizaci; růst byl pozorován při pH 5,0 až 8,2. Optimální pH pro růst je v rozmezích pH 6,0 až 7,8. Podobně byl během 24hodinové inkubace testován růst při teplotě 9 °C, 15 °C, 20 °C, 24 °C, 27 °C, 30 °C, 37 °C, 40 °C, 45 °C a 50 °C; růst byl pozorován při teplotě v rozmezí od 15 do 40 °C. Optimální teplota pro růst leží v okolí 37 °C.

o) Vliv kyslíku

Po suspendování kultury do živného agaru obsahujícího 1 % glukosy, a po ztuhnutí směsi ve formě hluboké vrstvy agaru, byl pozorován dobrý růst kultury kolem povrchu uvedeného prostředí. Na TEP agaru (7 g rostlinného výluhu, 5 g kvasničného extraktu, 3 g masového výluhu, 10 g peptonu, 10 g triptonu, 3 g sojového peptonu, 3 g glukosy, 2,5 g díhydrogenfosforečnanu draselného, 2 g chloridu sodného, 0,3 g hydrochloridu L-cysteinu, 0,3 g thioglykolátu sodného, 14 g agaru a 1 000 ml destilované vody; pH 7,2) za anaerobních podmínek byl pozorován růst.

p) O-F test (Hu^t^ův-lLiJfsonův test)

V obou případech, jak aerobních, tak_;anaerobních podmínek, byla glukosa rozkládána a tvořila se kyselina.

q) Vyžívání zdrojů uhlíku

Při test ování schopno o ti kmene vyžívat Uhlíkatých sloučenin, za použíií metody popsané Iizukou a Kommgatou (viz mo^ografi T. Hasegamy, Toxonooy and IdenOificetioo of McroorgarOstn, str. 230, vyda^iel The Unveessty of Tokyo Press, 1975)» byly pro růst využívány glukosa, glycerin a janteran sodný, zatímco- octan sodný, -citřeo sodný- a perahydroxybenzoát sodný nebyly využívány.

r) Tvorba kyselin a plynných zplodin z cukrů

Kmen BMG 162-eF2 byl nanesen v pruzích na Šikoé agary, které byly připraveny sterinním přidáním různých roztoků cukrů, separátně vysteriliaoraných, k základnímu kultivačnímu prostředí (skládajícímu se z 1 g hydrogertfosforečnanu amonného, 0γ2 g chloridu sodného, 0,2 g heptahydrátu síranu horečnatého, 0,2 g kvasničného extraktu, 15 g agaru, 4 ml 0,% vodného roztoku bromkkeeolové červeně a 1 000 ni deiooisovaoé vody; pH 7,2), tak, aby konečná koncentrace příslušného cukru byle 1%.,- a poté ztuhnutím směsi. Tvorba kyselin byla sladována po dobu ' - 40 dnů. Kyselina se tvořila z D-glukosy, D-monosy, D-fruktosy, D-morntu, maatosy, trehalosy a glycerinu, ale ne z D-xlosy, L-arabinosy, D-galaktosy, rhaooosy, D-sorbitu, . ioositu, l^aktosy, - secharosy, rafinosy a ze šllarobu.

Ne druhé straně, ze pouuití Duehgm^^чvy trubice, byla teatorána tvorba plynných zplodin po přidání různých cukrů, stejných, jek bylo uvedeno výše, k základní živné půdě, skládající se z 10 g peptonu, 5 g chloridu sodného, 0,008 g broothymolové modře a 1 000 ml deiori.zované - vody (mající pH 7,2); každý test byl sledován po dobu dvou týdnů. Z žádného z testovaných cukrů se netvořily plynné zplodiny·

s) Oddační test s kyselinou glukonovou

Za pocítí glukonátové živné půdy (2 g dihydrogeunfosf oredianu draselného, 0,5 g síranu hořečoatého, 5 g chloridu sodného, 0,5 g síranu ao torného, 10 g glukooátu draselného a 1 000 ml destilované vody; pH 6,3) byl test оедоtivní.

t) Tvorba dihydroxyacetoou

Po inkubaci na živné půdě obsahhjjcí 10 g kvasničného extraktu, 20 g glycerinu, 15 g agaru a 1 000 ml delo^-sované vody, majcí pH 7,0, po dobu 3, 5, 10 a 24 dnů, nebyla - při zkoušce Fehliigoovýo činidlem v žádném z testovaných vzorků pozorována tvorba dihydroxyacetonu.

u) Reezsteoce vůči chloridu sodnému

Po - .οθ^Ι^! kmene do^-živné půdy připravené přidáním chloridu sodného k základnímu živnému roztoku obsahujícímu 10 g tryptikasy (Typticase^ BBL) a 1 000 ol deionisované vody, ' o pH 7,0, tak, aby koncentrace chloridu sodného v jednotlivých kultivačních prostředích byla 2, 5 a 7%, bylo sledováno rozmnožování kmene na povrchu kultury po dobu 4 dnů. V základním - živném prostředí se 2 S chloridu sodného bylo pozorováno rozmnožování koteoe, ale v prostředích s více oež 2 * chloridu sodného oebyl růst pozorován.

v) Test na rozklad kyseliny hipurové

Po inkubaci kmene po dobu 4 dnů v živné půdě (pH 7,4) připravené přidáním 10 g hipurátu sodného do 1 000 ol srdečního iofusního živného roztoku (zo. Difco) tyl při testování roztokem chloridu železného pozorován rozklad kyseliny hipurové.

226036 б

w) Test na fenylpyrohroznovou kyselinu (ΡΡΛ test)

Po silné inokulaci na šikaý agar obsahující 3 g kvesničného extraktu, 2 g DL-fenylelaninu, 1 g hydrogenfosfořečněnu sodného, 5 в chloridu sodného, 12 g agaru a 1 000 nl deioni8ováné vody a mající pH 7,3, e poté po inkubaci po dobu 24 hodin, byl test na kyselinu fenylpyrohroznovou ze použití 10% roztoku chloridu želez!tého negativní.

z) Test na rozpouštění tyrosinu

Při inkubaci kmene na tyrosinovém agaru (obsahujícím 1 000 ml živného agaru a 5 g tyrosinu; pH 7,2) při 30 °C a 37 °C po dobu 2 ež 4 dnů bylo pozorováno rozpouštění tyrosinu.

Shora uvedené vlastnosti lze shrnout následujícím způsobem. Kmen BMG l62-eF2 je bacil fakultativně anaerobní, vykazující nekonstantní Gremovu barevnou reakci, vytvářející spory, mající postranní bičíky a projevující pohyblivost. Spora je eliptické s centrální polohou, má na své boční straně část (parasporální tělísko), která se dobře vybarvuje ve tvaru kanoe krystalovou violetí, a má rezistentní vlastnosti vůči teplu. Tyčinky jsou zřetelně zvětšené a spora se nevybarvuje barvivý stálými v kyselém prostředí. Kmen se rozrůstá a rozmnožuje na agarové živné půdě a tvoří blánu v tekutém živném prostředí. Ztekucuje želatinu e peptonisuje BCP mléko po změně zbarvení přítomné bromkresolové červeně na modré. V tekuté Sebouraudově glukosové živné půdě nebyl pozorován růst tohoto kmene, ele byl pozorován slabý růst na Saboureudově glukosovém agaru. Kmen redukuje dusičnany, jeho denitrifikeční reakce je negativní, MR test je pozitivní, VP test negativní. Indol nyl detegován v pátém dnu kultivace, Birovódík se při pěstování nevytváří. Kmen nerozkládá škrob e nevyužívá kyseliny citrónovou. Výsledky ureázového testu jsou negativní, oxidázového testu pozitivní a katalázového testu negativní. Růst byl pozorován v rozmezí pH ód 5,0 do 8,2, optimální pH pro růst je 6,0 ež 7,8.

Růst byl dále pozorován v rozmezí teplot od 15 °C do 40 °C e optimální teplota pro růst je přibližně 37 °C. Růst byl rovněž pozorován za aerobních podmínek. Mikroorganismus rozkládá glukosu za oxidačních a fermentečních podmínek, a vytváří kyseliny. Vytváří kyseliny a netvoří plynné zplodiny z D-glukosy, D-manosy, D-fruktosy, D-menitu, maltosy, trehelosy a glycerinu. Neoxiduje ani kyselinu glukonovou, ani glycerin ze vzniku dihydroxyасеtonu. Nerozkládá kyselinu hipurovou, nepůsobí ne fenylalenin a rozpouští tyrosin. V kultivačním prostředí obsahujícím více než 5 % chloridu sodného nebyl pozorován růst kmene.

Ne základě shora uvedených charakteristik bylo zjištěno, že tento kmen petří do rodu Bacillus, speciálně к druhu Becillus firmn, B. leterosporus, B. brevis nebo B. spheericus, které tvoří skupinu druhů, které mají společné následující charakteristiky: kataléze je pozitivní, dihydroxyeceton se nevytváří, jek je popsáno v Bergeyově příručce o determineční bakteriologii (Bergey*s Manuel of Determinative Becteriology, osmé vydání, str. 542; R. E. Buchanan a N. E. Gibbons, The Willlams Wilkins Company, Baltimore, 1974). Charakter kmene BMG l62-aF2 ve srovnání se čtyřmi shora uvedenými druhy je uveden v tabulce 1.

Tabulka 1

Srotmání kmene BMG 162-aF2 s jemu podobnými druhy

Charakteristika B. firmus B. leterosporus B. brevis B. spheericus BMG 162-aF2

Spory_

Tver E £ E S eliptický.

Rozšiřuje sporengium odlišně - ♦ + ++

Převládající postaveníC

CT potoačování tabulky 1

Chhαikkteistika 1	3. firmus	B. laterosporus	B	. bravis	B. sphaerieus	BMG 162-kF2
Tvorba látek z glukosy
kyseliny * (slabě)	+	+	nebo -	- .	+
plynných zplodin	-	-		-.	-	-
acetoinu -	- -	-		-	-	-
Tyčinky
šířka, a™ (	),6 až 0,9	0,5 až 0,Š	0,	,6 až 0,9	0,6 až 1	0,6 kž 0,8
délka, '(um 1	1,2 až 4	2 až 5	1	,5 až 4	1,5 «5	2 až 3,5
Gramová reakce	+	dav		dav	dav	dav
Snadno vyb^rv-telné
tělísko, připojené		, чЪ
na jednu stranu spory	-	+ (+)		-	-	4
Pohhbiivost	d	+		+	+	+
Teplota potřebná pro
růst, °C
maadmální	40 až 45	35 až 50		40 až 60	30 až 45	40
minimální	5 až 20	15 až 20		10 až 35	5 až 15	15
Tvorba kyseliny 2; arabinosy k xylosy	d					. _{— -}
maaitolu	+	+ '		d	-	+
Hcdolysk Škrobu	+	-		-	-	-
Růst
na anaerobním agaru	-	+		-	- .	+
v 7% roztoku NeCl	+	-		-	d	-
v > ' tekuté Skboureu-		4
dově glukosové půdě	-	-CÍ)^b		d	d	+
na Sabo^audově glu-
koso vém agaru		-
Vytváření
alkalické reakce na
V-P živné půdě	-	-		+	+	- ·
Tvorba indolu	-	d		-	-	+
Redukce NO^- nk NO₂	+	+		d	-	při 5denní
Rozklad						4
keseinu	+	+		+	d	+
tyrosinu	d	+		+	-
Deeminece fesblаlenisu	d	-			+	. —

Poznámky k tabulce 1

E - eliptický nebo cylindrický tvar; S - kulovitý nebo téměř tailovitý tvar; C - centrální; T - terminální nebo aubterminélní; CT - centrální až terminální; změny uvnitř nebo mezi kmeny: + = pozitivní pro 90 až 100 % z kmene; - = negativní pro .. 90 až 100 % z kmene; d = rozdílná reakce, pozitivní pro 11 až 89 % z kmene; v = charakktristika nekonstantní v jednom kmenu.

^b) ex^p^l^iLme^^st^^l^)^J^í výs^člek

Jak je zřejmé z tabulky 1, kmen BMG 162-aF2 je velmi podobný k druhu Bcdlus latérosporus. Roozdl mezi kmenem BMG 162-aF2 a B. Laterosporus je pouze ten, že se jeden od druhého liší v popisu vzhledu růstu na Sabouraudově glukosovém agaru.

Když autoři bynálezu dootali od Dr. Ryozo Azurny z National Institute of Animel Heelth, Japonsko, kmen B. laterosporuš, vyzkrnižteli ho a porovnal s kmenem uvedeným v tomto vynálezu. Z výsledku vzájemného porovnání jasně vyplynulo, že oba kmeny mají tělísko vybarrmjící se ve tvaru kanoe (část vybaarvjící se ve tvaru kanoe; perasparální tělísko) na toční straně jejich spor, které je významnou chM^aatterstikou těchto druhů. A dále bylo zjištěno, že . růst obou kmenů ne Sabouraudově gltkosovém agaru je navzájem shodný. Vzhledtm k výše uvedenému byl kmen BMG 162-kF2 označen jako Bkdlus laterosporus BMG l62-eF2.

, Zmíněný kmen ' BMG 162-aF2 tyl dále dne 12. října 1979 uložen ▼ japonské autorizované sbírce kultur - ve Výskané· ústavu pro fermenitnC, zastupitelství pro průmyslovou vědu a technologgi, Ingg·, mfiěto Chibia, Japonsko, pod úložtym číslem FERM - P ' 52'30, a potom tyl dne

31. července 1981 rovněž uložen v Amercké sbírce typových kultur (A^eetčan Type C^tum Collection) v Perklawn D*ive, RookiVlln, Mar^nd, USA, pod úložtym číslem 31932.

Předložený vynález pokrývá pouuití věech kmenů shora uvedeného kmenu a jeho variant, a kmenů náležejících k rodu Bacilus, které produkuj gntibiotkkm BMG 162-eF2.

Účelem předloženého vynálezu je zaajstit substanci nového antibiotika BMG 162-aF2, uaoožnt její výrobu a výrobu nových antineoplaeticky působících prostředků nbsa^ULjícícU zuíněné nové aitibiotiUш jako, účinnou složku a posléze poskytnout metodu k léčení nádorových nneDOoniní u teplokrevných živočichů.

Účel a podstata tohoto vynálezu jsou déle' objasněny v následujícím popisu.

Způsob výroby antibiotika BMG 162-aF2 za pouužtí shora zmíněných ιηϋϋΜέΙϋί^ kmenů je uveden níže.

^V přiloženým obrázcí^ je ne obr. ¹ zn^ázorn^ěno 'н-NMR spektrum ty (hro chlorid antibiotika BMG 162-eF2 v (CD-JgSO, za pouužtí tntremenylsilenu jako vnitřního standardu (příJ 1 -5 stroj ¹⁰⁰ MHz. ^Na obr. ² je zn^ázorn^ěno ^C-IMR spektrum ty &Ό chloridu antibioUk BMG ¹⁶²-aF2 v D,0 za pio^žtí tntramenyl8tl8nj jako vnějšího standardu (25 MH). Ne obr. 3 je znázorntao spektrum tyíhrochlwhdu antibioUk B^MG 1⁶²-a^F2 v D^g0 za ^uužtí NH^ jako vnějšího standardu (10 MH). Na obr. 4 je znázorněno infračervené absorpční spektrm hydrochlOTidu antibiotika BMG 162-aF2 v tabletě bromidu draselného.

Aliibtotkkш BMG 162-eF2 lze podle vynálezu vyrábět tím způsobem, že se spory nebo tyčinky kmene mllkrnnrrant8mu z rodu Bacilus, produkujícího toto antibiotikm, nebo jeho nutant, aerobně kutivují v kultivačním prostředí obsahujícím živné látky. Pro účely tohoto vynálezu lze obecně jako živných složek kultivačního prostředí používat těch substancí, které se - obvykle užívají při kltivaci běžných beakeerí. Tak například lze jako zdrojů dusíku používat, komerčně - dostupných dusíkatých látek, jako peptonu, medového výluhu, kukuřičného výluhu, moučky z bavlníkových semen, podzemi^-cové moučty, sojové moučky, kvesničného extraktu, N-Z aminu, tycdrolysátu keseinu, dusičnanu sodného, dusičnanu amorného, síranu amornrého aipodobných. Jako zdrojů uhlíku lze pouuívat komerčně dostupných glycerinů, sncUarnsy, Škrobu, glukosy, maltosy, Meks a dalších glycidů, a rovněž tuků a olejů. Jako doplňkových solí lze používat chloridu sndnéhonfnsf^,orečnanů, uhličitanu vápenatého, síranu hořečnatého a jiných anorganických solí. Je-li třeba, lze ve stopových přidávat rovněž další soli kovů a daaší pomocné látky, pokud jsou vy užívány kmenem produkujícím aitibioiikm BMG l62-aF2 a pokud nejsou ne újmu produkci zmíněného antibiotika.

Při způsobu podle vynálezu lze používat jakýchkoiv živných látek užívaných obecně při kultivaci bakteri, pokud jsou asimilove^l^ kmenem produk^ícím gntibiotikm BMG 162-aF2 pro produkci uvedeného antibiotika.

Pro produkci antibiotika BMG 162-aF2 v širokém - - měřítku lze s výhodou pouuíret tekutých živných půd. Kuutivaci lze provádět při - jakékoliv teplotě, při které - je kmen produkuje! anti-bicikum BMG 162-aF2 schopný růst a produkovat toto gnetbiotkkш, ale s výhodou se pro inkubaci používá teploty v rozmmzí od 20 do 35 °C. Vhodné pH kultivačního prostředí je 5,0 až 8,2, s výhodou v rozmmzí 6,0 až 7,8. Kuutivace se provádí po dobu pootačuuíci k produkci a nahromadění dostatečného mmi0žtví antibiotika BMG 162-aF2 v živné - půdě nebo tekutém živném prostředí. Tak například produkce a gkumDlacn antibiotika BMG 162<-eF2 byla pozorována při jednodenní inkubaci na rotační třepačce při 27 °C za aerobních podrnmnek, za ponjití tekuté živné půdy ob8ahujjcí 2,0 % glycerinu, 2,0 % glukosy, 1,0 % peptonu, 0,3 % kvasnlčného extraktu, 0,2 % uhličitanu vápenatého (nejvýUoddiěβí pH je přibližně 7,4), která byla předem vysterilizována a pak'inokulována aporaai a tyčinkami vypěstovanými na Šikmé agarové kultuře kmene BMG 162«aF2.

MoosSví vyniklého antibiotika BMG 162-aF2 lze testovat standardní cylindříkovou metodou používanou běžně pro ho&iiocení známých antibiotik, za použití Bcillus subbilis ko testovacího mikroorganismu.

Při kiltivaci kmene mikroorganismů z rodu Bcillus, produloiuícího antibiotikum BMG 162-aF2, lze kromě shora uvedeného pastování» na rotační třepačce podívat pro výrobu v Širokém měřítku kultivace ve fermentačních nádobách nebo v kultivačním tanku. V případě kultivace v širokém měřítku se kmen s výhodou pěstuje v kapalné živné půdě popsané výše po dobu 20 až 40 ho<dLn, ze třepání, a živná půdě se s výhodou inokuluje 0,5 až 2,0 % (objemovými) očkovacího 'roztoku.

Po skončení fermentece se zre^e^ovaná živná půda zfiltruje a z filtrátu se antibiotika BMG 162-aF2 izoluje sloupcovou itaromaCigreffí, za pouužtí iontoměničové pryskyřice majcí zbytek karboxylové kyseliny jako aktivní skuptou. Jako zmíněných slabých katexových pryskyřic lze používat Amerlitu IRC-50 ™ a C(G50™ (obchodní značky katexových pryskyřic, jejichž aktivita je způsobena výhradně karboxylovou skupinou; výrobek firmy Rohm & Haas Co.), nebo towaeitu CP*® (o^bc^ho^dní zna^čka pro ^katexovou prysk^ic^ její^ž aktivita je zpisotona skupinami karboxylové kyseliny a sulfonové kyseliny; výrobek firmy Bayer Ltd.) nebo CM-Sephe(obvodní značto ^pro ⁱar^boxymmeyl^dextreo» tetex vyré^ný firmou nharmmaie Fine Cheιη1οίΗ.β.), dostupných v H-formě, . Na-formě, P^-formě a ve smíšených formách. ArtiM-otkum BMG l62-aF2 adsorbované na některé ze zmíněných pryskyřic’se eluuje vodným roztokem kysseiny, jako kyseliny chlorovodíkové, kyseliny octové a podobnými, nebo vodnými roztoky solí, jako roztokem chloridu sodného.

K získání antibiotika BMG l62-aF2 v čisté, formě lze používat znémých extremních, sepaocčoícI a čisticích metod, jeko gelové fiir^ce., ultoacаotoifrg;aie a -shora uvedených metod použivoCíiíih iont©měničových pryskyřic, při vhodném -komminowání nebo opakování zmíněných způsobů.

Vzhledem k tomu, že со^Ь.о^Цш BMG !62-eF2 je ve formě volné báze nestálé, připravuje se ve formě svého hydrochloridu. Hydoothorid je hygroskopický, takže tvoří hydráty. - Fyzikálně chemické vlastnosti hydrátu hydrochloridu antibiotika BMG 162 eF2 jsou následnicí:

Teplotu tání hydrochloridu nelze stcoovOt vzhledem k jeho extrémní hyρroskioCčnooSi. HydOohlorid vykazuje specifickou optickou rotaci^ — - -11° (c = 1,0, voda).

Elementární anelýzy: Pro C^H--?⁰- . 3 HC1 .2 ^0

Vypooteno: 37,20 % C, 8,08 % H, 17,B6 % N, 19,38%Cl;

Nalezeno: 37,00 % C. 7,89 % H, 17,02 » N, 18,61%Cl.

Jeho 'н-NMR spektrum je znázorněno na obr. 1, - a '³C-NMR spektrum na obr. 2. V jeho ¹⁵N-IMR spektru, které je znázorněno na obr. 3, lze pozorovat sedm atomů dusíku (3 atomy dusíku v guarn.dylové skupině se jeví jako signál o dvou vrcholech). Ultrafialové absorpční spektrum vykazuje pouze koncovou absorpcc. Infračervené spektrum je znázorněno ne obr. 4.

Hyřdoohlorid antibiotika BMG 162-aF2 je lehce rozpustný ve vodě a v metanolu, ale těžko rozpustný nebo nerozpustný v etanolu, аtřlaiаiátu, chloroformu . a v benzenu. Dává p^2^1^^<íívoí o^nhřdiigovou» eekoguchiho - a R^c^ť^o^o^vv^-^^i^^hovu reakci. Při ten^^ste^é hhroιmαtorofii ne Avvcelu® (ιmlk·o0kOřSaliciá cernose), v rozpouštědlové soustavě but8no0-př‘idio-iy8elioa , octová-voda (6:411j3) nebo iutanoO-eicool-vodc (4:1:2) dává hydrochlorid antibiotika BMG 162eaF2 jednu skvrnu o Ry = 0,14, popřípadě Rp = 0,20. Při vysokovoltové eleкioofooesа ne papíře (3 500 V, 15 - minnu), za coužití sísí rozpouštědel kyselina mrrvenčí - kyselina octo226036 vá - voda (1:3:36) vykážuje antibiotikum BMG 162-aF2 relativní potyblivoat (vzhlede· k slaninu jako 1,00) 1,70 až 1,74.

B.ologické vlastnosti antibiotika' 'BMG 162-aF2 jsou popsány níže. Jek je uvedeno v tabulkách 2-1 až 2-3, vykazuje hyfrochlorid antibiotika BMG 162-aF2 pouze slabou inhiliční účinnost vůči gre·pozitivní· a gramnagativní· bakterií·. Z tabulek 3 až 7 vyplývá, že antibiotikum BMG 162-aF2 má pozoruhodný léčebný účinek a vliv na prodloužení doby přeiž.tí u ·τίί s experimentální·1 nádory, jak s leukérní L-1210 a EIr4, tak s ' Eur lichoty· ascl^^iCký^· nádore· a se sarkome· 180, a je zřejmé, že zlíněné οι^Η^οΗ^· je vhodné jako antineoplesHeky účinná látka.

1. Altlblkitriέlní účinnost antibiotika BMG 162-aF2

Altiliztitam BMG 162-aF2 rná slabou antibakkeriální účinnost a rni^irnái^íí inhUiční koncentrace vůči různý· bakterií· na živné· agaru jsou uvedeny v tabulkách 2-1 až 2-3. Testování bylo prováděno agarovou zřeSovací rnetodou za pouMtí tydrochloridu antibiotika BMG ' 162-eF2. Jek je zřejmé z ' tabulky 2-1, uvedené a]ntibioiikm inhlbuje slabě gra·pooitivní a gra·negetivní bakterie.

Tabulka 2-1

A ИЬнО kterém aktivita antibiotika BMG i62-aF2

Testovaný ·itarzzrgani8·us	M^rniní inhibiční koncentrace (mg/ml . 102)
1. Staph^lococcus aureus FDA209P	100
2. Staph;^lococcus eureus Smith	12,5
3. Шcroczccks flavus FDA16	25
4. Mcrococcus lysodelkticus IFO3333	100
5. Sarcina IuIsi PCI1001	100
6. Bacilus anthrecis	25
7. Bacilus subUlis NRRL B-558	100
8. BafUus subbHis PCI219	6,25
9. Bacilus cereus AAGC10702	>100
10. Corynebacteriírn bovis 1810	50
11. EBCherichia coli NIHJ	>100
12. Escherichia coli K-12	100
13· Escherichia coli ML629	>100
14. Shigella dysenteriee JS11910	100
15. Stih-gella flexneri 4bJS11811	>100
16. Shigella soniei JS11746	>100
17. Salrnonelle typhi T-63	>100
18. SalrnoneHe e^t^ť^i^rtidis	>100
19. Próteus vulgeris 0X19	12,5
20. Próteus ·1ιγ01118 IFM 0M-9	>100
21. Próteus ριΙ^ιγ! ΦΙ311	>100
22. Próteus nHgni (31466	>100
23. Serretla rn^^í^^^cens	>100
24. Pseudo^e^s an^^osa A3	>100
25. Kle^ieUa plnk·orйal PCI602	>100
26. MechuíicÍ!· s·eegnmais ATCC607	>100

Pobitá živná půda: živný agar

Teplota: při .37 °C

Tabulka 2-2

Atibekteriální aktivita antibiotika BMG !62-aF2

Testovaný mikroorganismus	Midmální inhibiční koncentrace (m&/ml . 10²)
1. Aeroaornks punctete LAM1 646	>100
2. Aeromonas srlmonecidk ATCC14174	>100
3. Aeromonas sp. (KT-444)	>100
4. Vítalo ^^^111^1^ NCBM6	50
5- Psrudomonas fluorescens	>100
6. Psrudomonas lectaymens	50
7. Erwinik aroideie	50

PouUitá živné půda: živný agar Teplota: pM 27 °C.

Tabulka 2-3

ΑηηΐΝ№^Γ1έ1ηί účinnost antibiotika BMG l62-aF2

Testovaný mikroorganismus	Minminí in^^bičňí' koncentrace («/1 . 10²)
1.Candidk tropic^Hs F-1	>100
2. Candidk pseudotiopPccalt N17494	>100
3. Candidk albicens 3147	>100
4. Candidk Yu-1200	>100
5. Candidk krusei, N17492	100
6. Skcchkromyces cernev-sike	100
7. Cryptococcus nrogormans	100
8. Helminthosporiím oryzae	100
9. Pyricularie rnryzer	100
10. Peniculrrik ^remen^se sesekli	100
11 .Xetihomonθs citri	100
12. Xanthomones oryzre	100
13. AAspegUlus niger	100
14. Trichophyion asteroides 429	100
15. Tгichophyiot	100

Použitá živné půda: živný agar + 1 % glukosy Teplota: při 27 °C

2. AntneopPestická účinnost antibiotika BMG 162-kF2

a) Účirnnost vůči měí leukémii L 1210 (systém i. p. - i. p.)

Skupině osmi myších samic CDF^ 6 až . 7 týdnů starých byly itirepгritonгáltě inokulovány ^lrukrmi^cké, ^bunky ^{L 1210} v mn^žtví ¹⁰^ buněk/^0,25 ml/myš. Zr ^{24 h}odin tylo zahájeno ^podévéní hydrochloridu antibiotika BHG 162-eF2, rozpuštěného ve fyziologickém roztoku soli, intreperitoneélně jednou denně kontinuálně po dobu 9 dnů, a byla sledována úmrtnost pokusných zvířat a stupeň prodloužení doby jejich života.

Jak vyplývá z výsledků uvedených v tabulce 3, vykázalo antibiotCkum BMG l62-eF2 léčebný účinek a účinek na prodloužení doby živote'myší s leukémií L 1210.

Tabulka 3

Účinnost antibiotika BMG 162-aF2 vůči myší leukémii L 1210 (i. p. - i. p. systém)

Dávka (mg/kg/den)	Průměrná doba přežžtí (dny.) léčených zvířat ----------------------- x 100	Počet ryší přežívajících 60 dnů
průměrná doba přežžtí (dny) kontrol	počet myší testovaných
50	295X	0/8
25	334	0/8
12,5	586	4/8
6,25	732	8/8
3,13	441	3/8
1 ,56	301	1/8
0,78	107	0/8

x 1 ⁷ objevují se toxické příznaky

Průměrné doba přežití kontrolních zvířat: 8,2 dnů

b) Účinnost vůči myší leukémii L 1210 (systém s. c. - i. p.)

Skupině pě-ti myyích samic druhu CDF. , starých 6 eř 7 týdnů, byly injkkovény ryší leu* Ε ¹ kerické buňky L 1210 v dávce 109 buněVO^S rl/myš, subkutánně ne stranu břicha, e za hodin bylo zahájeno podávání hydrochloridu antibiotika BMG 162-eF2 ve fyziologickér roztoku soli, intreperitoneálně jednou denně kontinuálně po dobu 9 dnů. Byle sledována úmrtnost mrší a stupeň prodloužení dpby jejich života. Jek vyplývá z údajů v tabulce 4, vykázalo antibioUum BMG 162-aF2 silný terapeutický účinek e účinek ne prodloužení doby živote pokusných . · zvířat, stejně jeko výše v pokusu . · a).

Tabulka 4

Účinnost antibiotika BMG 162-eF2 vůči myší leukémii L 1210 (s. c. - i. p. systém)

_. Dávka (rr/kg/den)	Průměrná doba přežžtí (dny) léčených zvířat · — — -------— x 1 00 průměrná doba přežžtí (dny) kontrol	Počet ryší přežívajících 30 dnů
počet mSi léčených
50	>309	5/5
25	>309	5/5
12,5	>309	5/5
6,25 .	>240	3/5
3,13	120	0/5
1 ,56	105	0/5

Průměrné doba přežžtí kontrolních zvířat: 9,7 dnů

c) Účinnost vůči myší leukémii EL-4

Skupině pěti myších samic druhu C^yBL/6, 10 týdnů starých, byly intreperitoneálně inokulovány buňky myší leukemie EL-4 v množství 10⁵ buněk/0,25 ml/myš, a za 24 hodin bylo zahájeno podávání hj'drochloridu antibiotika BMG 162-aF2 ve fyziologickém roztoku soli intraperitoneálně jednou denně kontinuálně po dobu 9 dnů. Byle sledována úmrtnost myší a stupeň prodloužení jejich života. Jak je zřejmé z údajů uvedených v tabulce 5, vykázalo antibiotikum BMG l62-aF2 rovněž terapeutický účinek a účinnost na prodloužení doby živote pokusných zvířat s leukémií EL-4.

Tabulko 5

Účinnost antibiotika BMG 162-eF2 vůči myší leukémii EL-4

Dávka	Průměrná dobo přežití (dny) léčených zvířat
(mg/kg/den)	Průměrná doba přežití (dny) kontrol
5	193
2,5	1 64
1,25	159
0,625	130
0,313	131

Průměrná doba přežití kontrolních zvířat: 11,0 dnů

d) Účinnost vůči myšímu Ehrlichovu ascltlckému tumoru skupině čtyř myších samic druhu ICR, 6 týdnů starých, byly intreperitoneálně lnokulovány buňky Ehrlichove escitického tumoru (2 x 10⁶ buněk/0,^5 ml/piyš) e po 24 hodinách bylo zahájeno podávání hydrochloridu antibiotika BMG 162-eF2 ve fyziologickém roztoku soli ve formě lntraperitoneálních injekcí jednou denně kontinuálně po dobu 9 dnů. Byl sledován stupeň prodloužení doby života pokusných zvířat. Jak vyplývá z údajů uvedených v tabulce 6, vykázalo antibiotikum BMG 162-aF2 rovněž protirakovinnou účinnost vůči Ehrlichovu escitickému tumoru.

Tabulka 6

Účinnost antibiotika BMG 162-aF2 vůči myšímu Ehrlichovu escitickému tumoru

Dávka (mg/kg/den)	Průměrná doba přežití (dny) léčených zvířat
Průměrná doba přežití (dny) kontrol
50	54*
25	72^x
12,5	170^x
6,25	336
3,13	186
1 Ы⁶	Lžl

objevují se toxické příznaky

Průměrná doba přežl/tí kontrolních zvířat: 13,8 dnů

e) Účinnost vůči sarkomu 180

Skupině Čtyř myších samic druhu ICR, 6 týdnů sterých, byly intreperitoneálně inokulovány buňky myšího sarkomu 180 (2 x 10^ buněk/0,25/myŠ) a po 24 hodinách bylo zahájeno podávání hydrochloridu antibiotika BMG 162-eF2 ve fyziologickém roztoku soli ve formě intraperitcneálních injekcí jednou denně kontinuálně po dobu 9 dnů. Byl testován stupeň prodloužení doby života pokusných zvířat. Jak vyplývá z tabulky 7, antibiotikum BMG !62-aF2 rovněž má entineoplastický účinek vůči sarkomu 180.

Tabulka 7

Účinnost antibiotika BMG 162-aF2 vůči myšímu sarkomu 180

Dávka (mg/kg/den)	Průměrné doba přežijí íckny) léčených zvířat
JL 1 v v Průměrná doba přežití (dny) kontrol
50	53X
- 12,5	27 9^X
6,25	181^x
3,13	243
1 ,56	220

x) ' objevují se toxické příznaky

Průměrné doba přežití kontrolních zvířat: 13,8 dnů

3. Ataitní toxicita antibiotika BMG l62-aF2 *

Při . injekčním podání hytdrochloridu antibiotika BMG 162-aF2.. myším samicím druhu - ICR, sterým 4 týdny, byle nelezene střední smrtná dávka LD^q vyšší nei 80 mg^kg·

Aitibiotkkum BMG 162-aF2 mé shore popsané fyzikálně chemické a biologické vlastnosti. Vzhledem k tomu, ie v mmletaule antibiotika BMG 162-bF2 je obseien spermi&Ln, který je společný řadš níže uvedených antibiotik, podobá se attibioilkum BMG 162-aF2 bleomycinu, produkovanému mikroorganismem Strepoomyces verticillus, attibloiiůům LL-EM 123P, y, a y^ produkovaným rnikroorgansstDem Noocadia, edeninu produkovanému mikroorgamimmem' cecillus toerds a laterspporaminu produkovanému mikroorganismy Bccilus.

Jelikož struktura antibiotika BMG 162-eF2 je známé a odpovídá shora - uvedenému vzorci I, je zřejmé, ie se toto antibioiktaim liší od bleomycinu, antibiotik LL-íM 123β, a y₂ a od edeninu, jejichž struktura je rovnši známá. Dále se liší od lateropporeminu (viz The JowrnBl of AAnibbotics 29, 390 ai 393 /1976/), a to v infrвBevvtném spektru, v rozpustnosti v alkoholu, v antibaktrriálním spektru a ve stautečnossi, ie látka sumárního vzorce CgR^N^O, která je souččstí lateroppořeminu a která dává pooztivní Sakeguchiho reakci, není obsaiena v rozkladných produktech antibiotika BMG l62-aF2. Jb tedy potvrzeno, ie antibioiiuum.BMG 162-eF2 jr novým anntibioiiBem.

Z výše uvedených výsledků vyplývá, ir antibioikum BMG l62-aF2 vykazuje cheaaateerstickou an.titвspltsticksu účinnost vůči leukémii u teplokrevných iivočichů, včetně lidí, a rovnši vůči sarkmmům a jiným nádorům, a ir mé relativně nízkou toXcitu. A^nt-hbiotika BMG 162-aF2 lze proto používat jako výskajícího antinrsplastCcγý..půssbícíhs léčiva.

Pokud se týká farmaceutických přípravků a způsobů podávání antibiotika BMG 162-aF2 jako antinroplasticky účinné látky, lzr na nš aplikovat různé o sobš známé metody. K terapeutickým účelům ho lzr podávat injrkčnš, orálnš jebo rektálnš. Pokud jde o farmaceutické přípravky obsahující attibioiiUus BMG l62-aF2z lze jr formulovat vr formš injekcí, prášků, grandi, tablet, čípků a podobných.

Při výrobš zmínšných farmaceutických přípravků lzr, je-li třrba, . poiŽívat jakýchkoliv farmaceuticky vhodných pomocných látek, jako pevných nebo kapalných nosičů, stabilizátorů, antisrptik, látek odstraňujících boSesStL, emmugátorů a podobných, pokud jsou inertní vůči antibiotiku BMG l62-aF2.

Tak například v konkrétním případě, pří výrobě injekčního farmaceutického přípravku, se antibioiiUm BMG 162-aF2, výhodně Ve formě příslušné ve vodě rozpustné soli, jako hydrochloridu, rozpistí spolu s vhodným cukrem, jako manitolem, v destilované vodě a roztok se rozdělí do malých nádobek, výhodně injekčních ampulek, nebo se může zmíněný roztok dále zlyofLlizovat a před použitím rozpstit ve fyziologckkém roztoku soli nebo v destilované vodě na roztok vhodný pro injekční aplikaci.

Ve farmaceutických přípravcích může obsah účinné látky kolísat v širokém rozmezí podle druhu přípravku; obecně obsahují 0,01 ež 100 hmoonootních %, výhodně 0,1 až 70 hmot. %, . . .

antibiotika BMG · 162-aF2, a zbytek, to je 0 až 99,99 hmot. %, výhodně 99,9 ež 30 hmot. %, tvoří farmaceuticky vhodné nosiče. V případě injekčního přípravku je vhodný následnicí poměr složek:

aitibioiiUm BMG 166-aF2., 0,1 až 99,0 hmot. % cukry 991 až 5,,0 hmot. % chlorid sodný 0 a až 99,9 hmot. %

Μοζβίνί podávaného antibiotika BMG 162-aF2 kolísá podle symptomů nemooi; obvykle se používá u dospělých v dávce 0,01 až 800 mg denně, výhodně v dávce 0,1 až 600 mg denně, Je-li třeba ho podávat kontinuálně, lze denní dávku snížit.

Ve farmaceutických přípravcích se aotibioiij1m BMG 162-aF2 obvykle používá ve formě svých solí, jako hyidrochloridu a podobiýchm vhodných pro terapeutické ponHií.

Způsoby výroby nového antibiotika BMG 162-aF2 jsou blíže objasněny v následujících příkladech, které však rozsah vynálezu nijak neomezil. V příkladech jsou koncentrace látek, pokud není uvedeno jinak, udány v hmotnostní procentech.

P řík led 1

Pět litrů tekuté živné půdy obsah^íc! 2,0 % glycerinu, 2,0 % dextrinu, 1,0 % sojového peptonu (znyčky Etezto-soytonz, výrobek firmy Difco LaborZtores), 0,3% kvasnič^ného extraktu (výrobek firmy D^igo-Elj^o-^Kagaku Co., Ltd.), ^: 0,2 % síranu amoorného a 0,2 % uhličitanu vápenatého, upravené na pH 7,4, se umíítí v podílech po 125 ml v Sakaguchiho fermentačních nádobách o objemu 500 m.. Po vy sterilizování se obsah buněk 1 % předem připravené očkovací látky (kmen BoHlus laterosporus BMG 162-aF2 FERM-P 5230, ATCC 31932/ zz šikmého živného agaru sz pěstuje 2 dny v živné půdě stejného složení jak uvedeno výše) a (mikroorganismus se kultivuje 5 dnů při 28 °C.

Pak se zfermentovaná směs zfiltrujz, získaný filtrát (4 900 ml) se nalije nz sloupec (5⁰⁰ poměru 5^ cm⁾ Amber litu IRC-50G⁹ (výroBk ^firmy Rohm a Ha as Co^ směs Na⁺ t^ypu spolu s H⁺ typem v po^ru 7j3) a účinná látka se nezdsortojz. Sloupec sz promyjz vodou a účinná látka sz zluujz 2 000 ml 1,0 N kyseliny chlorovodíkové. ELuát sz zneuuralizujz 10 N roztokem hycdrotidu sodného na pH 6, zneutralizovzný roztok se zředí čtyřnxáoobkem vody a nalije ne slou^pzc ⁽4⁰⁰ ml, prtoěr ^4,3 cm) ^Sz^pha^dztu ^C-2²⁵® protek ^firmy ^pham(^^cia Fine Chezmccas; předem nabobtnalý s vodou), na kterém sz účinná látka naadsortojz.'Účinná látka se zluujz 0,3 M vodným roztokem chloridu sodného. Frakce obsshhuící účinnou látku se spooí a rozpouštědlo se oddezsilujz k suchu za sníženého tlaku. Odjpirzk sz digzrujz s 5 ml metanolu a nerozpuštěný chlorid sgdný sz odlltrujz. Filtrát sz na lije ne sloupec (445 ml, průměr 2,6 cm) Sephadetu LH-20<9 (obchodní značka dextranu určeného pro gelovou filtraci s'organickými rozpouštědly; výrobek firmy Pharmacia Fine . Chezmccas; předem nzbobtnalý s rrtantier) a produkt se zz . sloupce zluujz metanolem.

Zz spojených frakcí obsah^ících žádanou účinnou látku sz tdeezSilujz rozpouštědlo zz sníženého tlaku a získá sz 460 mg čistého hythrochloridu antibiotika BMG 162-aF2 vz formě bílého prášku.

Př 1 kl e d 2

Živná půda (10 li-trůl· obsahující 2,0 % glycerinu, 2,0 % dextrinu, 1,0 % sojového peptonu (značky Bato-soytone™ , výrobek firmy Dlfco Lbbrreorrie), 0,3 % kvasničného extraktu (výrobek firmy D^igo-^E-l^y^c^^^Kbgeku Co., Ltd.), 0,2 % síranu amoirného, 0,2 % uhličitanu vápenatého a 0,03 % silkoonoráho oleje jako upravená na pH 7,4, se vnese do nerezového fermentačního tanku o objemu 30 litaů a obsah se sterilizuje 20 minut při téplotě 120 °C. Po ochlazení fermentoru se půda asepticky iookullje 125 ml očkovací kultury kmene BcCHus l^a^l^e^r^c^i^I^o^rus BMG 162-aF2 FERM-P 5230, ATCC 31932, produjtlícíhr antibiotkuím BMG 162-aF2, vypěstované - ze . třepání po dobu 48 hodin. Za - provzduěnorání a při teplotě 28 °C, se provede kultivace uvedeného mikroorganismu ve fermentoru (výchozí rychlost provzdušnováoí 15 litarů za minutu, počet otáček míchadle 450 ze minutu; po 16 hodinách kultivace rychlost provzdušnování 10 litrů . ze minutu a 350 otáček ze mi^utt^), a po 40 hodinách se zře^e^ovaný obsah zfilmuje. Zíзkabnýfii’trát (9 500 ml) se chromaéooprafuje na sloupci Amberlitu IRC-5C® a pak CM-ephadexu C-25^ , v podstatě steOrým způsobem jako v ' příkladu 1.

(r)

Sloupec CM-ephadexu 0-25^ se eluuje 4 litry 0,3 M vodného roztoku chloridu sodného. Jímej se frakce po 290 kapkách a získají se dva poddly frakcí účinnou látku:

poddl I (frakce číslo ' 14 až 63) ' a poddl II (frakce číslo 64 až 154). Aktivní frakce podílu II, které neobsahují látku absorb^^jc! při 280 nm, se spooí (1 660 ml) a k roztoku se přidá ze účelem adsorbování- účinné složky 33 - g aktivního ulU-í. Akklvní uIU-Í se odfiltruje, promyje se vodou a botieiottlιm BMG 162-eF2 se eluuje- 500 ml 0,05 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v 80% vodném metanolu.

^uát se neutralizuje Anteelitem IR-45® (výrotee Ro^um a Heas ^OH” forma) a po odfiltrování enexu a odddesilování rozpouštědel za sníženého tlaku se získá 305 mg hydrochloridu antibiotika BMG 162-aF2. Spojené aktivní frakce podílu I, obsahuuící látku absorbující při pH 280 nm, se odpaří k suchu, odparek se extrahuje metanolem, extrakt se rozpustí v 1 litru deionizoveoé vody e^roztok se rehhlobbbogrβfuje ne sloupci (400 ml, průměr trubice 4,3 cm^{) CM-}ephedexu ^C-25® za ^uMbí ^grb^fi.eo^trv^ě e^ce ⁰ a^{ž 1} M roztokem Floridu sodného (celkem 4 litry). Frakce obsahuuící účinnou látku se spoj a rozpouštědlo se odddesiluje k suchu. Olperek se vyextrahuje m^ba^ol^e^m a meeanolický roztok se nanese na sloupec (780 ml, průměr 2,8 cm) Septadexu LH-20. Sloupec se eluuje metanolem ze účelem odstranění chloridu sodného a po odpaření rozpouštědla se získá 670 mg čistého hycdrochloridu anOibLotika BMG 162-eF2. Celkový výtěžek 975 mg hydr ©chloridu antibiotika BMG 162-eF2.

Příklad 3

K roztoku 150 mg hydrochloridu antibiotika BMG 162-eF2, získaného postupem popsaným v příkladu 2, v1 ul mmtanolu se přidá 1 ml nasyceného roztoku kyseliny pikrové v tamtanolu a směs se zahřeje k varu. Rozpouštědlo se odpádí, odparek se za účelem odstranění přebytku kyseliny pikrové promyje benzenem a et^^lem, a po přetarysbalováoí surového produktu ze smm8Í- vody s etbnoleb se získá 62 mg krystalického pikrátu antibiotika BMG 162-aF2.

P ř -.í k 1 a d 4 '

Injekce

V 970 hmoonootních dílech přečištěné vody sé rozpučí 30 hmoonootních dílů hyddoohUooidu anbleiotita BMG 162-aF2 připraveného způsobem popsaným v příkladu 1 a roztok se přefiHnje přes bakk, ekologický filtr značky Mllipore fiter--GS-type. Zárodků prostý filtrát se ploí v dávkách po 1 g do injekčních ami^p^lzí o obsahu 10 ml a obsah se lyorilizuje. Získají se suché lyofiizooveoé injekce obsahuuící po 30 mg hydrochloridu antibiotika BMG 162-aF2.

Příklad 5

Granule hmoonostních dílů hydrochloridu antibiotika BMG 162-aF2 připraveného způsobem popsaným v příkladu 1, 600 hnoonootaích dílů lgttsgy, 330 hooonoostoích dílů krystalické calulosy a 20 hmoonootních dílů lydroзχrJPoopSlclulssy se navzájem důkladně promííí, směs ae slisuje za pouužtí válcového kompresoru (značky B^^H^r^r-C^ť^op^c^tor ™) a produkt se rozdrtí oa granule, které se proijí síty na velikost částeček v rozmezí 1,59 až 0,42.

Příklad 6

Tablety hmotnostních dílů hydrochloridu antibiotika BMG 162-aF2 připraveného způsobem . popsaným v příkladu 1, 20 h^oot^c^o^it^:ích dílů tarystalioické laktosy, 147 hmoonootních dílů krystalioické celul^osy a 3 h^oot^o^fi^s^t^:í díly st^ranu hořačcatého se proioísí oa V-oixéru a smés se lisuje oa tablety obsah^jcí 300 mg - hydrochloridu antibiotika BMG 162-aF2.

Příklad 7

Postupem popsaným v příkladu 1 sa kultivuje standardní koen Bedlus ljtero8psrui, který je uložen va Faeulty of &og.neericg, Osake UrCwasity, Osake, Japonsko, pod deposiiOiío ČísOeo-OUT 8139. Získá se 4,4 litru živného filtrátu. Jelikož uvadaný kmen produkuje kromě antibiotika BMG 162-aF2 současně také v oleji rozpustná antibiotika, vySís^ se antibiotikum BMG 162-aF2 následujícím způsobem: živný filtrát se vlijr do sloupce (310 ol, Na* typu) Amber li tu IRC--⁵⁰® ^, sloupec sa prooyje vodou a aktivní slo^a se eluuje ^{0,5 N}-HC1. Aktivní poddly (podíly mea^í aotioitaObiální aktivitu proti ' Brdlus subttills PCI 219) se spojí (1 480 ol) a 1 N-NaOH. HLuát se smíchá se 4,4 g aktivního uhlí. Směs se nechá stát 30 minut, a potom se fdtrujr, aby se odstr^nio aktivní mí. ΛΑΗνηί Pili sa smíchá s 30 ol 50% vodného acetonu a aktivní složka se vyextrahuje při pH 2,0. Tento extrakční postup se opakuje dvakrát. Extrakty se spojí a zatnutí za sníženého tlaku oa 45 - ol. KoncenOrát se upraví na pH 7 8, smíchá sa se 45 ml n-butanolu a podrobí extrakci za současného třepáií. Vodná vrstva sa oddděí, její pH se upraví oa hodnotu 5,0 a smíchá z vodou, aby vniklo ²⁰⁰ ol roztok. Roztok se nelije ca sloupec ⁽1W ol, Na* t^ypu) C-Bphadexu —-25 ™ a sloupec se promyje vodou a potom se vyvdCjí roztokem chloridu sodného s lineárně se zvyšující se - tancenO.ire<cí od culy do 1,2 M. Eluované aktivní podíly se spojd a vysuší za sníženého tlaku, čímž se získá bílý prášek. Bílý práiak se extrahuje metanolem a extrakt se vlijr ne sloupec (55 ml) Sephadexu 2LH-20 suspendovaného v omtanolu a sloupec se vyvdají motanolam. Výsladné aktivní podíly se spojí a vysuší za sníženého tlaku, čímž se získá

5,8 mg bílé visko^cí látky. Teto látka vykazuje stejcé protonové NMR spektrum a stejcé ultračervecé absorpční spektrum jako - 001^4.0^^0 BMG 16,2-aF2.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby jntiiistitg BMG 162-aF2 vzorce

C-NH-ÍCH2)a-CH-CHj-CO

I ²⁴ I ² I NH OH NH

I

CH-OH

I

C<O-NH- (CH2) 4-NH- (0¾) ₃~NH₂ a jeho farmaceuticky vhodných solí, vyznačující se tím, že se mikroorganismus Becillus leterosporus BMG 162-aF2, FERM-P 5230, ATCC 31932 nebo OUT 6139 kultivuje aerobně, v kapalné živné půdě obsahující zdroje dusíku a uhlíku a anorganické soli, při teplotě 15 až 40 °C a při pH 5,0 až 6,2, načež se antibiotikum BMG 162-aF2 z kultivačního prostředí izoluje a popřípadě převede v jeho farmaceuticky vhodnou sůl.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se izolace antibiotika BMG 162-eF2 z kultivačního prostředí provádí pomocí sloupcové chromatografie ze použití slabých katexových pryskyřic, majících karboxylovou skupinu jako aktivní skupinu·
3. Způsob podle bodu 2 vyznačující se tím, že se antibiotikum BMG 162-aF2 adsorbované ne ketexové pryskyřici eluuje vodným roztokem kyseliny nebo soli.