HU190360B - Process for preparing macrolide antibiotics - Google Patents

Process for preparing macrolide antibiotics Download PDF

Info

Publication number
HU190360B
HU190360B HU813327A HU332781A HU190360B HU 190360 B HU190360 B HU 190360B HU 813327 A HU813327 A HU 813327A HU 332781 A HU332781 A HU 332781A HU 190360 B HU190360 B HU 190360B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
omt
dmt
formula
intense
weak
Prior art date
Application number
HU813327A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard M Baltz
Herbert T Kirst
Gene M Wild
Eugene T Seno
Original Assignee
Eli Lilly And Co,Us
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Co,Us filed Critical Eli Lilly And Co,Us
Publication of HU190360B publication Critical patent/HU190360B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/54—Streptomyces fradiae
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y10S435/896—Streptomyces fradiae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Szabadalmas: (73)
Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, US (54) ELJÁRÁS MAKROLID ANTIBIOTIKUMOK ELŐÁLLÍTÁSÁRA (57) KIVONAT
A találmány tárgya eljárás (I) általános képletű makrolidok előállítására - e képletben
Q jelentése hidrogénatom vagy (A) képletű csoport.
Az eljárás során
a) a Streptomyces fradiae ATCC 31 733 törzset, vagy ennek egy mutánsát vagy variánsát süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat és szervetlen sókat tartalmazó táptalajban tenyésztjük, amíg lényeges mennyiségű antibiotikum képződik, vagy
b) egy (I) általános képletű makrolidról - ahol
Q jelentése (A) képletű csoport - ezt a mikarozilcsoportot enyhe hidrolízissel lehasítjuk.
Áz (I) általános képletű vegyületek állatgyógyászati készítmények hatóanyagaiként alkalmazhatók.
-1(I) .190 360
N-CHj
A találmány tárgya: eljárás makrolid antibiotikumok, különösen olyan vegyületek előállítására, amelyek hasonlóak a tilozinhoz, ehhez a jól ismert terápiás ágenshez (1. pl. Tetrahedron Letters 2339., 1970).
A tilozin nagy értékei ellenére állandó igény áll fenn új antibiotikumok kifejlesztésére, egyebek között arra való tekintettel, hogy rezisztens törzsek keletkezhetnek. A szerkezeti módosítások ezenkívül változásokhoz vezethetnek az érzékeny mikroorganizmusok spektrumában. A tilozin-szerű makrolidok szerkezetének kémiai módosítása sajnálatos módon rendkívül bonyolultnak bizonyult. A J. Org. Chem. 44, 12, 2050-2, 1979 helyén pl. utalás található arra, hogy megoldhatatlan problémákkal jár a micinozil-glukozid kötés kémiai úton végzett leválasztása a tilozinról. Az esetek túlnyomó többségében ténylegesen az ezen a területen dolgozó kutatók, akik új szerkezetek vizsgálatával foglalkoznak, arra kényszerülnek, hogy új - akár természetben előforduló, akár mesterségesen előállított mikroorganizmusokat keressenek, abban a reményben, hogy tenyésztésük hasonló szerkezeteket fog eredményezni.
A találmány szerinti eljárással összefüggésben azt találtuk, hogy az (I) általános képletű makrolidok - e képletben Q jelentése hidrogénatom vagy (A) képletű csoport - gátolják patogén mikroorganizmusok növekedését.
Ha Q mikaróz cukor monomert jelent, az (I) általános képletű vegyület a 20-dihidro-20-dezoxi23-demicinozil-tilozin (DH-DO-DMT): (II) képletű vegyület.
Ha Q jelentése hidrogénatom, az (I) általános képletű vegyület 20-dihidro-20-dezoxi-5-0-mikaminozil-tilonolid (DH-DO-OMT): (III) képletű vegyület.
Bár sztereokémiái jelzéseket nem tüntetünk fel a fenti szerkezetekkel kapcsolatban, a vegyületek sztereokémiája a tilozinéval azonos. A semleges cukor a mikaróz, az amino-cukor pedig a mikaminóz.
Mint fentebb jeleztük, a DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT gátolja állatokra nézve patogén organizmusok növekedését. Közelebbről: a DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT antibakteriális szer, amely Gram-pozitiv mikroorganizmusokkal és a Mycoplasma specieshez tartozó organizmusokkal szemben aktív.
A DH-DO-DMT a 2’-, 4”-, 3”, 23- és 3-hidroxicsoportokon, a DH-DO-OMT pedig a 2'-, 4’-, 23és 3-hidroxi-csoportokon észterezhető, a hasznos acilészter-származékok képzésére. Legkönnyebben végezhető el a 2’- és a 4’-hidroxi-csoportok észterezése. Tipikusak a 2-18 szénatomos monokarbonsavak észterei vagy dikarbonsavak hemiészterei.
A DH-DO-DMT, DH-DO-OMT és acilészterszármazékaik bázisos vegyületek, amelyek savakkal való kezeléssel savaddíciós sókká alakíthatók. Ezen savaddíciós sók előállítása ugyancsak a találmány részét képezi.
A találmány szerint egy Streptomyces fradiae törzset süllyesztett fermentációs körülmények között tenyésztjük, amíg jelentős mértékű antibiotikus aktivitás alakul ki. A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT a fermentlé meglúgosított szürletéből poláris szerves oldószerekkel vonható ki és extrakcióval, kromatográfiás és/vagy kristályosítási technikákkal tovább tisztítható.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy eljárás a DH-DO-OMT előállítására, DH-DO-DMT enyhe savas hidrolízisével.
A DH-DO-DMT (szabad bázis) és a DH-DOOMT) szabad bázis kloroformban felvett IV abszorpciós spektrumát az 1. és a 2. ábrán mutatjuk be.
.190 360
A következő fejezetekben a DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT tulajdonságait íijuk le. DH-DO-DMT
A DH-DO-DMT szerkezetét az 1. képlet mutatja be.
A DH-DO-DMT fehér kristályos szilárd anyag, olvadáspontja kb. 198-200 ’C. A DH-DO-DMT közelítő százalékos elemi összetétele a következő: szén 63; hidrogén 9; nitrogén 2; oxigén 26. A DHDO-DMT tapasztalati képlete C3gH6JNO12 és molekulasúlya kb. 728 (mező-deszorpciós tömegspektrometriával meghatározva 727).
A DH-DO-DMT szabad bázis (kloroformban) IV abszorpciós spektrumát az 1. ábrán mutatjuk be. Abszorpciós maximumok figyelhetők meg a következő frekvenciákon (cm-1): 3676 (gyenge), 3598 (gyenge), 3470 (nagy, széles), 3010 (intenzív), 2974 (intenzív), 2938 (intenzív), 2925 (váll), 2880 (intenzív), 2799 (gyenge), 2457 (gyenge, széles), 1715 (intenzív), 1676 (közepes), 1629 (gyenge), 1595 (nagyon intenzív), 1456 (intenzív), 1411 (intenzív), 1380 (intenzív), 1363 (váll), 1315 (intenzív), 1273 (gyenge), 1263 (váll), 1220 (gyenge, széles), 1184 (intenzív), 1162 (intenzív), 1144 (gyenge), 1117 (közepes), 1096 (váll), 1076 (intenzív/váll), 1050 (nagyon intenzív), 1015 (intenzív), 997 (közepes), 986 (közepes), 923 (közepes), 1905 (közepes), 867 (gyenge), 842 (közepes), 720 (széles), és 660 (gyenge).
A DH-DODMT UV abszorpciós spektruma 95 %-os semleges etanolban 283 nm-en mutat abszorpciós maximumot (epszilon 21,800).
A DH-DO-DMT (szabad bázis) fajlagos forgatása: [alfa] -46,3’ (c 3,3, CH3OH). DH-DO-OMT
A DH-DO-OMT fehér kristályos szilárd anyag, amelynek olvadáspontja kb. 214-217 °C. A DHDO-OMT közelítő százalékos elemi összetétele a következő: szén 64; hidrogén 9; nitrogén 2,5; oxigén 24,5. A DH-DO-OMT tapasztalati képlete CjiH53NO9 és molekulasúlya kb. 584 (tér-deszorpciós tömegspektrometriával 583).
A DH-DO-OMT szabad bázis (kloroformban) IV abszorpciós spektrumát a 2. ábrán mutatjuk be. Abszorpciós maximumok figyelhetők meg a következő frekvenciákon (em~'): 3677 (nagyon gyenge), 3601 (gyenge), 3422 (széles), 3006 (intenzív), 2971 (intenzív), 2937 (intenzív), 2879 (intenzív), 2798 (gyenge), 1714 (intenzív), 1677 (intenzív), 1627 (gyenge), 1593 (nagyon intenzív), 1457 (intenzív), 1407 (gyenge), 1382 (közepes), 1362 (váll), 1315 (közepes), 1269 (gyenge), 1181 (nagyon intenzív), 1141 (gyenge), 1115 (gyenge), 1079 és 1058 (intenzív, dublett), 1008 (közepes), 983 (közepes), 923 (gyenge), 903 (gyenge), 865 (gyenge), 835 (gyenge), 712 (széles), 658 (gyenge) és 629 (gyenge).
A DH-DO-OMT UV abszorpciós spektruma 95%-os semleges etanolban abszorpciós maximumot mutat 282 nm-en (epszilon 22,400).
A DH-DO-OMT (szabad bázis) fajlagos forgatási értéke: [alfa] - 7,35 (c 6, CH3OH).
Az Ή mágneses magrezonancia (NMR) adatokat a DH-DO-OMT-re (szabad bázis) vonatkozóan - 360 MHz, CDC13 - az 1. táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
A DH-DO-OMT-re vonatkozó NMR adatok 360 MHz-en
Helyzet delta+
2 2,0/2,5
3 -3,7/-3,85
4 1,64
5 -3,7/-3,85
6 NA+ +
7 NA
8 2,8
10 6,27
11 7,27
13 5,78
14 2,91
15 4,96
16 NA/1,64
17 0,96
18 1,05
19 1,49
20 0,89
21 1,18
22 1,82
23 -3,7/-3,85
1’ 4,31
2’ 3,55
3’ 2,40
4’ 3,08
5’ 3,22
6’ 1,31
NMe2 2,51
+ ppm, trimetilszilán mint belső standard alkalmazása mellett + ‘nem azonosított
A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT mint szabad bázis oldható vízben és a legtöbb poláris szerves oldószerben, így acetonban, metanolban, etanolban, kloroformban, dimetilformamidban és dimetilszulfoxidban. A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT savaddíciós sóinak vízben való oldhatósága nagyobb, mint a szabad bázisoké.
A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT vékonyiétegkromatográfiával különböztethető meg (TLC). A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT közelítő Rf értékeit egy adott TLC rendszerben a 2. táblázatban foglaljuk össze. A kimutatáshoz az UV abszorpciót használtuk fel.
2. táblázat
Vékonyrétegkromatográfiás adatok3, b
Vegyület Rf érték
DH-DO-OMT 0,53
DH-DO-DMT 0,64
a Közeg: E. Merck, Darmstadt-szilikagél 60 b Oldószer: etilacetát:dietilamin (95:5)
-3.190 360
A DH-DO-OMT előállitása
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy eljárás a DH-DO-OMT előállítására, a DH-DO-DMT enyhe savas hidrolízisével. Az enyhe savas hidrolízis körülményei a szakember számára ismertek. A hidrolízis végrehajtására kb. 4 vagy ennél alacsonyabb pH-jú megfelelő oldatok alkalmazhatók. Ezen eljárás keretében kb. 20 °C kb. 100 °C nagyságrendű hőmérsékletek alkalmazhatók. A hidrolízis végrehajtásához szükséges reakcióidő a reakcióelegy pH-ja és az alkalmazott hőmérséklet függvényében változik. Magasabb pH érték mellett a reakciósebesség alacsonyabb, magasabb hőmérsékleteken magasabb. A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a DH-DO-DMT-t enyhén savas oldattal kezeljük kellően hosszú ideig ahhoz, hogy végrehajtsuk a mikarozil csoport eltávolítását, a DH-DO-OMT keletkezése mellett.
Egy másik megoldás szerint, amely olykor előnyösebbnek bizonyulhat, a DH-DO-OMT-t úgy állítjuk elő, hogy a DH-DO-DMT-t a fermentlében kezeljük, amelyben képződött, a fent leírtaknak megfelelően enyhén savas körülményeket alkalmazva, kellően hosszú ideig ahhoz, hogy a DHDO-DMT-t DH-DO-OMT-vé alakítsuk át. Az így előállított DH-DO-OMT a fermentléből a következőkben leírt eljárások segítségével különíthető el.
A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT előállítása Str. fradiae-vel
A DH-DO-DMT-t és a DH-DO-OMT-t egy Str. Fradiae törzs, pl. a Str. fradiae ATCC 31 733 tenyésztésével állítjuk elő, amely ezeket a vegyületeket termeli süllyesztett fermentációs körülmények között megfelelő táptalajon. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg jelentős antibiotikus aktivitás nem halmozódik fel. A Str. fradiae tenyésztéséhez bármilyen táptalajt alkalmazhatunk, nagyszámú táptalaj közül. A termelés gazdaságossága, az optimális kitermelés és a termék elkülönítésének egyszerűsége érdekében azonban előnyben részesítünk bizonyos táptalajokat. így pl. a nagyüzemi fermentációban a kitüntetett szénforrások közé tartoznak a szénhidrátok, mint a dextrin, glukóz, keményítő, kukoricaliszt és az olajok, pl. a szójaolaj. A kitüntetett nitrogén források közé tartozik a kukoricaliszt, szójaliszt, halliszt, aminosavak stb. A táptalajba bevihető szervetlen tápsók közé tartoznak a szokásos oldható sók, amelyek vas, kálium, nátrium, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, nitrát stb. ionok leadására képesek.
A táptalajban jelen kell lenniük a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges eszszenciális nyomelemeknek. Ilyen nyomelemek általában szennyezésként fordulnak elő a táptalaj más komponenseiben, kellő mennyiségben ahhoz, hogy kielégítsék a mikroorganizmus növekedési szükségleteit. A nagyüzemi fermentációban szükségessé válhat kismennyiségű (0,2 ml/liter) habgátló, pl. polipropilénglikol hozzáadása (molekulasúly kb. 2000), ha a habzás problémákat okoz.
Jelentős mennyiségű DH-DO-DMT vagy DH-DO-OMT előállítására előnyben részesítjük a fermentotokban végzett fermentációt. Kismennyiségű DH-DO-DMT vagy DH-DO-OMT előállít4 ható rázott lombikos tenyészetben. Az antibiotikum-termelésben egy holtidő lép fel azzal összefüggésben, hogy a nagy fermentorokat a mikroorganizmus spórás alakjával oltjuk be. Ezért előnyben részesítjük vegetatív inokulum felhasználását. A vegetatív inokulumot úgy állítjuk elő, hogy kistérfogatú táptalajt a mikroorganizmus spórás alakjával vagy micéliumtöredékével oltunk be és ily módon egy friss, aktívan növekedő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulumot ezután átvisszük egy nagyobb fermentorba. A vegetatív inokulum előállításához ugyanazt a táptalajt alkalmazhatjuk, mint a nagyobb volumenű fermentációkhoz, de más táptalajokat ugyancsak használhatunk.
A Str. fradiae ATCC 31 733 kb. 10 és kb. 40 ’C közötti hőmérsékleteken tenyészthető. Optimális antibiotikum-termelés várható kb. 28 ’C körüli hőmérsékleten.
Mint ez az aerob süllyesztett tenyésztési eljárások esetében szokásos, steril levegőt buborékoltatunk át a tenyészközegen. A hatékony antibiotikum-termelés érdekében a fermentor-tenyészet levegővel való telítettsége kb. 30% vagy ennél magasabb kell, hogy legyen (28 ’C-on és 1 atm. nyomáson).
Az antibiotikum-termelés úgy követhető a fermentáció alatt, hogy a fermentléből vett mintákat megvizsgáljuk olyan mikroorganizmusokkal szemben, amelyekről ismert, hogy érzékenyek ezekre az antibiotikumokra. Egy hasznos teszt-mikroorganizmus a Staphylococcus aureus ATCC 9144. A biológiai meghatározást előnyösen automatizált turbidimetriás módszerrel végezhetjük. Az antibiotikum-termelés ezenkívül egyszerűen követhető nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával, UV detektálás mellett.
A DH-DO-DMT vagy a DH-DO-OMT, amely a süllyesztett aerob fermentációs körülmények között keletkezett, ismert eljárásokkal nyerhető ki a fermentléből. A DH-DO-DMT vagy a DH-DOOMT előállítását úgy végezzük, hogy a fermentlevet először szűrjük. A szűrt fermentlevet ezután tovább tisztíthatjuk a kívánt antibiotikum kinyerésére. Ezzel a tisztítással kapcsolatban számos eljárást alkalmazhatunk. A szűrt fermentlé tisztítására előnyben részesített eljárás keretében a lé pH-ját kb. 9-re állítjuk be; a levet megfelelő oldószerrel, pl. etilacetáttal, amilacetáttal vagy metil-izobutilketonnal extraháljuk; a szerves fázist vizes savoldattal extraháljuk és az antibiotikumot a vizes kivonat meglúgosításával kicsapjuk. A további tisztítás extrakciót, kromatográfiás és/vagy kicsapásos eljárásokat foglalhat magában.
Az új mikroorganizmust, amely DH-DO-DMT-t és DH-DO-OMT-t termel, egy olyan Str. fradiae törzs kémiai mutációjával állítottuk elő, amely tilozint termel. Az új mikroorgaznizmus csak minimális mennyiségű tilozint termel, de főbb komponensként közel azonos mennyiségben állít elő DH-DO-DMT-t és DH-DO-OMT-t.
A DH-DO-DMT-t és DH-DO-OMT-t termelő mikroorganizmust ugyancsak Str. fradiae-nek osztályozzuk. Az új mikroorganizmus tenyészetét
1980. október 16-án letétbe helyeztük az ATCC-nél (Rockville, Maryland). így az az alap-törzsgyűjte-41 .190 360 mény részévé vált és onnan ATCC 31 733 számon a köz számára hozzáférhető.
Mint ez más mikroorganizmusok esetében is fennáll, a Str. fradiae ATCC 31 733 jelű törzs jellemzői változásokon mennek keresztül. Az ATCC 31 733 törzs mesterséges variációi és mutánsai előállíthatok különböző ismert fizikai és kémiai mutagénnel, pl. UV besugárzással, X-sugarakkal, gamma-sugarakkal és N-metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidinnel végzett kezeléssel. A találmány szerinti eljárás keretében a Str. fradiae ATCC 31 733-nak minden olyan természetes és mesterséges változata és mutánsa felhasználható, amely megtartja a DH-DO-DMT és/vagy a DH-DO-OMT termelését eredményező tulajdonságot.
A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT gátolja patogén baktériumok, különösen Gram-pozitív baktériumok és Mycoplasma-félék növekedését. A 3. táblázatban foglaljuk össze a standard agarhígításos módszerrel mért minimális gátló koncentrációkat (MIC), amelyek mellett a DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT (szabad bázisként) gátol egyes baktériumokat
3. táblázat
A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT in vitro aktivitása
Organizmus MIC (gg/ml) DH-DO-DMT DH-DO-OMT
Staph. aureus NRRL B313 128 4
Staph. aureus V41 128 4
Staph. aureus X400 128 f.+ 8
Staph aureus S13E 64 4
Staph. epidermidis EP11 128 8
Staph. epidermidis EPI2 64 8
Streptoc. pyogenes C203 128 f. 8
Streptoc. pneumoniae Park 1 128 f. 8
Streptoc. faecium ATCC 9790 128 f. 16
Streptoc. sp. D csop. 9960 128 f. 16
Haemophilus influenzáé C.L. 128 f. 16
Shigella sonnei N9 128 f. 128 f.
Escherichia coli N10 128. f 128 f.
Esherichia coli EC 14 128 f. 128 f.
Escherichia coli TEM 128 f. 64
Klebsiella pneumoniae X26 128 f. 4
Klebsiella pneumoniae KAE 128 f. 128 f.
+ f.: a megadott értéknél nagyobb
A DH-DO-OMT ugyancsak gátolja egyes anaerob baktériumok növekedését. A 4. táblázatban foglaljuk össze azokat az MIC értékeket, amelyek mellett a DH-DO-OMT gátolja ezeket a baktériumokat. Az MIC értékeket standard agar-hígításos módszerrel határoztuk meg és a végpontot 24 óra elteltével olvastuk le.
4. táblázat
A DH-DO-OMT in vitro aktivitása anaerob baktériumokkal szemben
Mikroorganizihus MIC (pg/ml)
Clostridium difficile 2994 2
Clostridium perfringens 81 2
Clostridium septicum 1128 2
Eubacterium aerofaciens 1235 2
Peptoc. saccharolyticus 1302 8 f.’
Peptoc. prevoti 1281 8 f.
Peptostreptoc. anaerobicus 1428 8 f.
Peptostreptoc. intermedius 1264 8 f.
Propionibacterium acnes 79 2
Bacteroides fragilis 111 8 f.
Bacteroides fragilis 1877 8 f.
Bacteroides fragilis 1936B 8 f.
Bacteroides thetaitaomicron 1438 8 f.
Bacteroides melaninogenicus 1856/28 8 f.
Bacteroides melaninogenicus 2736 8 f.
Bacteroides vulgáris 1211 8 f.
Bacteroides corrodens 1874 8 f.
F isobacterium symbiosum 1470 8 f.
Fusobacterium necrophorum 6054A 8
+A megadott értéknél nagyobb
A DH-DO-OMT ugyancsak gátolja a Chlamy-
dia trachomatis növekedését sejttenyészetben; MIC 0,5 pg/ml. A DH-DO-OMT ezenkívül gátolja a Mycoplasma speciest. M. gallisepticum és M.
synoviae esetében pl. egyaránt 12,5 DH-DO-OMT MIC értéke. pg/ml a
A DH-DO-OMT in vivő antibakteriális aktivi-
tást mutat kísérleti baktériumos fertőzések esetében. A kísérleti vegyületből két dózist vittünk be egereknek, kísérleti fertőzés esetében és a megfigyelt aktivitást ED50 értékként mértük (ez a kísérleti állatok 50%-ának megvédését biztosító dózis, ma/kg-ban; W. Wick et al., J. Bacteriol. 81., 233-235, 1961). A DH-DO-OMT (szabad bázis)
esetében megfigyelt ED50 értékeket az bán mutatjuk be. 5. táblázat
5.-táblázat
A DH-DO-OMT in vivő aktivitása egerek kísérleti
fertőzésével szemben
:,„i· Bakteriális Organizmus hatás, ed50, mg/kg χ 2
Staph. aureus 3055 orális 100 44
Staph. aureus 3055 s. c. 221 Streptoc. 37,3
pyogenes C203 orális 64 Streptoc. 75,3
pneumoniae Park I. orális 20,4 223,6
5
-5.190 360
A találmány szerinti makrolidokat rendszerint állatgyógyászati készítmények alakjában alkalmazzuk a terápiában, amikor az aktív makrolid komponenst egy vagy több nem-toxikus vivőanyaggal keverjük össze. Az ilyen készítmények és a vivőanyagok hagyományos jellegűek és a szakember számára ismertek.
Bár a DH-DO-DMT és származékai rendelkeznek egy bizonyos antibakteriális aktivitással, ezek a vegyületek legmegfelelőbben a DH-DOOMT vegyületek intermedierjeiként használhatók fel.
A DH-DO-OMT felületi fertőtlenítésre is felhasználható. Fertőtlenítés .céljából a 0,01 súly% koncentrációjú oldatok használhatók. Az ilyen oldatok, amelyek előnyösen tartalmaznak egy detergenst vagy más tisztítószert is, tárgyak és felületek fertőtlenítésére alkalmazhatók, ha fontos a steril körülmények fenntartása.
A találmány szerinti eljárás pontosabb illusztrá lása érdekében a következő példákat mutatjuk be
1. példa
A) A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT fermentációja rázott lombikban
A Str. fradiae ATCC 31 733 tenyészetből egy liofilizált rögöt 1-2 ml steril desztillált vízben szuszpendálunk. Ebből az oldatból 0,5 ml-t használunk fel 150 ml, alábbi összetételű vegetatív táptalaj beoltására :
Komponens Mennyiség, %
kukoricalekvár 1,0
élesztőkivonat 0,5
szójakorpa 0,5
CaCO3 0,03
szójaolaj (nyers) 0,45
ionmentes víz 97,25
Egy másik módszer szerint egy Str. fradiae ATCC 31 733 vegetatív tenyészetet, amelyet 1 ml-es térfogatokban folyékony nitrogénben tároltunk, gyorsan felolvasztunk és ezt használjuk fel a vegetatív közeg beoltására. A beoltott vegetatív tenyészetet 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban 29 “C-on kb. 48 órán át inkubáljuk, zárt terű rázógépen, 300 ford./perc mellett.
Ennek a vegetatív tenyészetnek 0,5 ml-ével 7 ml termelő táptalajt oltunk be, amelynek összetétele a következő:
Komponens Mennyiség, %
cukorrépamelasz 2,0
kukoricaliszt 1,5
halliszt 0,9
kukoricaglutén 0,9
NaCl 0,1
(NH4)2HPO4 0,04
CaCO3 0,2
szójaolaj (nyers) 3,0
ionmentes víz 91,36
A beoltott fermentációs táptalajt 50 ml-es lombikokban inkubáljuk 29 °C-on, kb. 6 napon át, zárt terű rázógépen, 300 ford./perc mellett.
B) A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT előállítása fermentorban
Nagy térfogatú inokulum előállítására 1200 ml inokulált vegetatív tenyészetet - amelyet az A). pontban leírtakhoz hasonló módon állítottunk elő - használunk fel 250 gallon második fázisú vegetatív tenyésztő táptalaj beoltására, amely a következő összetételű:
Komponens Mennyiség, %
kukoricalekvár 1,0
szójaliszt 0,5
élesztőkivonat 0,5
CaCO3 0,3
szójaolaj (nyers) 0,5
lecitin (nyers) 0,015
VÍZ 97,185
A pH-t 50%-os NaOH oldattal 8,5-re állítjuk be.
Ezt a második fázisú vegetatív táptalajt 350 gallonos fermentorban kb. 48 órán át 28 “C-on inkubáljuk, megfelelő levegőztetés és kevertetés mellett.
144 gallon inkubált második fázisú tenyészetet amelyet az előzők szerint állítottunk elő - használunk fel 1000 gallon steril termelő táptalaj beoltására, amelynek összetétele a következő:
Komponens Mennyiség, %
halliszt 0,875
kukoricaliszt 1,5
kukoricaglutén 0,875
CaCO3 0,2
NaCl 0,1
(NH4)2HPO4 0,04
cukorrépamelasz 2,0
szójaolaj (nyers) 3,0
lecitin 0,09
víz 91,32
A pH-t 50%-os NaOH oldattal 7,2-re állítjuk be. Az inokulált termelő táptalaj fermentációját
1800 gallonos fermentorban 8-9 napon át folytatjuk, 28 °C hőmérsékleten. A fermentlevet steril levegővel levegőztetjük annak érdekében, hogy az oldott oxigén szintjét kb. 30% és 50% között tartsuk, és hagyományos keverővei kb. 250 ford./perc sebességgel kevertetjük.
2. példa
A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT elkülönítése liter, az 1. példa szerint előállított fermentlevet szűrési segédanyag alkalmazásával szűrjük. A mi-6.190 360 célium-lepényt vízzel mossuk; a szűrlet és a mosóoldat (30 liter) pH-ját 10%-os nátriumhidroxid oldattal 9,1-re állítjuk be. A kapott oldatot kétszer extraháljuk (15 liter és 5,5 liter) etilacetáttal. Az etilacetátos kivonatokat egyesítjük és 9 liter, majd 5 3 liter híg foszforsav oldattal extraháljuk (a vizes fázist pH 4,1-re állítjuk be 28%-os H3PO4 hozzáadásával). Az egyesített vizes kivonatok (8,8 liter) pH-ját nátriumhidroxiddal pH 9,2-re állítjuk be és kétszer extraháljuk 2-2 liter kloroformmal. A kló- 10 roformos kivonatokat szárítjuk; így 32 g szilárd anyagot kapunk.
Ebből az anyagból 5 g-t etilacetátban oldunk és egy hatfázisú ellenáramú megosztási eljárás alkalmazásával etilacetáttal és 0,5 M foszfátpufferrel 15 kezeljük pH 6,1-n; így 2,5 g DH-DO-OMT-t kapunk. Egy második hatfázisú eljárás - pH 5,5-n további 0,1 g DH-DO-OMT-t eredményez. A DHDO-OMT-t száraz acetonból kristályosítjuk.
Ez az eljárás egyúttal 1,42 g szennyezett 20 DH-DO-DMT-t is eredményez. A DH-DO-DMT tisztítására olyan ellenáramú rendszert alkalmazunk, amely egy 1:2 arányú etilacetát-heptán összetételű szerves fázisból és egy pH 6,2 értékű 0,5 M foszfát pufferből mint vizes fázisból áll. A hat 25 fázis a DH-DO-DMT részleges elkülönítését eredményezi. A DH-DO-DMT-t vizes metanolból kristályosítjuk. 1 g nyers anyagból 400 mg tisztított DH DO-DMT-t kapunk.
3. példa
DH-DO-OMT előállítása DH-DO-DMT-ből
A 2. példa szerint előállított DH-DO-DMT-t 35 híg sósav-oldatban oldjuk (a vizes qldathoz pH 1,8-íg HCI-t adunk). A kapott oldatot 24 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd pH-ját nátriumhidroxid hozzáadásával 9,0-ra állítjuk be.
A lúgos oldatot etilacetáttal, diklórmetánnal vagy 40 kloroformmal extraháljuk. A kivonatot szárítjuk és vákuumban bepároljuk; így DH-DO-OMT-t kapunk.
4. példa
Egy másik eljárás a DH-DO-DMT előállítására
A DH-DO-OMT-t úgy állítjuk elő, hogy a DH-DO-DMT-t a fermentlében, amelyben keletkezett, a 3. példában leírt módon gyenge savval kezeljük. A DH-DO-OMT elkülönítését a 2. példában leírthoz hasonló módon végezzük.

Claims (3)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás (I) általános képletű makrolidok előállítására - e képletben
    Q jelentése hidrogénatom vagy (A) képletű csoport -, azzal jellemezve, hogy (a) a Streptomyces fradiae ATCC 31 733 törzset, vagy ennek egy mutánsát vagy variánsát süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat és szervetlen sókat tartalmazó táptalajban tenyésztjük, amíg lényeges mennyiségű antibiotikum képződik, vagy (b) egy (I) általános képletű makrolidról - ahol
    Q jelentése (A) képletű csoport - ezt a mikarozilcsoportot enyhe hidrolízissel lehasítjuk.
    Eljárás állatgyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy aktív komponensként az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű makrolidot - e képletben
    Q jelentése az 1. igénypont szerinti - egy vagy több nem-toxikus vivőanyaggal keverjük össze.
  2. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktív komponensként 20-dihidro-20-dezoxi-23-demicinozil-tilozint alkalmazunk.
  3. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktív komponensként 20-dihidro-20-dezoxi-5-0-mikaminozil-tilonolidot alkalmazunk.
    oldal rajz
    Kiadja az Országos Találmányi Hivatal A kiadásért felel: Hímer Zoltán osztályvezető Szedte a Nyomdaipari Fényszedő Üzem (878124/09) 88-0980 — Dabasi Nyomda, Budapest — Dabas Felelős vezető: Bálint Csaba igazgató
    -7190 360
    NSZO4 C 07 Μ 17/08 C 12 Ρ 19/62
    9¾
    N—CHj (S)
    CHj
    -8.190360
    NSZ04: C '07 M 17/08 C 12 P 19/62 o o
    O OO co
    J_I_L
    O O o
    Kö m
    CM '«ί- o
    oo o
    o o
    CM m
    CM o
    -§ co in co
    U>i i CM o o
    -9190 360
    NSZ04: C 07 M 17/08 C 12 P 19/62
    CM
HU813327A 1980-11-10 1981-11-06 Process for preparing macrolide antibiotics HU190360B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/205,539 US4304856A (en) 1980-11-10 1980-11-10 Process for producing 20-dihydro-20-deoxy-23-demycinosyltylosin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU190360B true HU190360B (en) 1986-08-28

Family

ID=22762621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU813327A HU190360B (en) 1980-11-10 1981-11-06 Process for preparing macrolide antibiotics

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4304856A (hu)
EP (1) EP0052005B1 (hu)
JP (1) JPS57108097A (hu)
KR (1) KR850001666B1 (hu)
AR (1) AR227563A1 (hu)
AU (1) AU7731381A (hu)
BG (1) BG36939A3 (hu)
CA (1) CA1169374A (hu)
CS (1) CS236663B2 (hu)
DD (1) DD202032A5 (hu)
DE (1) DE3168693D1 (hu)
DK (1) DK494381A (hu)
FI (1) FI813527L (hu)
GB (1) GB2086902B (hu)
GR (1) GR75386B (hu)
HU (1) HU190360B (hu)
IE (1) IE51826B1 (hu)
IL (1) IL64240A (hu)
PH (1) PH17375A (hu)
PL (1) PL233747A1 (hu)
PT (1) PT73947B (hu)
ZA (1) ZA817718B (hu)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4419508A (en) * 1980-11-10 1983-12-06 Eli Lilly And Company 20-Dihydro-20-deoxy-23-demycinosyltylosin and process for its production
AU551142B2 (en) * 1981-07-09 1986-04-17 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyukai Tylosin derivatives
US4423148A (en) * 1982-07-02 1983-12-27 Eli Lilly And Company Process for producing 20-dihydro-20-deoxy-23-de(mycinosyloxy)tylosin
US4528369A (en) * 1982-07-02 1985-07-09 Eli Lilly And Company 20-Dihydro-20-deoxy-23-de(mycinosyloxy)tylosin
US4452784A (en) * 1982-07-19 1984-06-05 Eli Lilly And Company C-23-Modified derivatives of DMT
US4443436A (en) * 1982-09-13 1984-04-17 Eli Lilly And Company C-20-Modified macrolide derivatives of the macrolide antibiotics tylosin, desmycosin, macrocin, and lactenocin
US4629786A (en) * 1983-02-28 1986-12-16 Eli Lilly And Company C-20- and C-23 modified macrolide derivatives
IL71032A0 (en) * 1983-02-28 1984-05-31 Lilly Co Eli C-20 and c-23-modified macrolide derivatives
US4468511A (en) * 1983-02-28 1984-08-28 Eli Lilly And Company C-20- And C-23-Modified macrolide derivatives
ATE151767T1 (de) * 1993-07-15 1997-05-15 Pfizer Amid-derivate von 16-gliedrige heterocyclen als antibiotische macrolide
US6362009B1 (en) 1997-11-21 2002-03-26 Merck & Co., Inc. Solid phase synthesis of heterocycles

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3178341A (en) * 1960-06-27 1965-04-13 Lilly Co Eli Antibiotics tylosin and desmycosin and derivatives thereof
US3326759A (en) * 1962-07-19 1967-06-20 Lilly Co Eli Antibiotics macrocin and lactenocin
US3344024A (en) * 1963-04-17 1967-09-26 American Cyanamid Co Antibiotic am-684 and method of production
BE667952A (hu) * 1964-08-05
US4161523A (en) * 1972-11-15 1979-07-17 Schering Corporation Rosamicin esters, acid addition salts and methods for production thereof
US4056616A (en) * 1976-03-05 1977-11-01 Schering Corporation Rosamicin derivatives and method of using same
GB1587685A (en) * 1977-03-09 1981-04-08 Microbial Chem Res Found Macrolactone derivatives and their production
US4252898A (en) * 1979-05-23 1981-02-24 Eli Lilly And Company Antibiotics A6888C and A6888X
NL8004922A (nl) * 1979-09-19 1981-03-23 Toyo Jozo Kk Deformyltylosinederivaten.

Also Published As

Publication number Publication date
IE812616L (en) 1982-05-10
GB2086902B (en) 1985-06-26
AR227563A1 (es) 1982-11-15
DD202032A5 (de) 1983-08-24
IE51826B1 (en) 1987-04-01
IL64240A (en) 1985-08-30
CA1169374A (en) 1984-06-19
EP0052005A1 (en) 1982-05-19
PH17375A (en) 1984-08-06
ZA817718B (en) 1982-10-27
DK494381A (da) 1982-05-11
GB2086902A (en) 1982-05-19
US4304856A (en) 1981-12-08
FI813527L (fi) 1982-05-11
PL233747A1 (hu) 1982-11-22
DE3168693D1 (en) 1985-03-14
KR830007833A (ko) 1983-11-07
JPS57108097A (en) 1982-07-05
EP0052005B1 (en) 1985-01-30
AU7731381A (en) 1982-05-20
CS236663B2 (en) 1985-05-15
BG36939A3 (en) 1985-02-15
PT73947A (en) 1981-12-01
GR75386B (hu) 1984-07-13
PT73947B (en) 1983-11-30
KR850001666B1 (ko) 1985-11-13
IL64240A0 (en) 1982-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4321361A (en) Demycinosyltylosin and process for its production
US4559301A (en) Process for preparing macrocin derivatives
HU190360B (en) Process for preparing macrolide antibiotics
CA1225053A (en) Methods and compounds and compositions for treating protozoal infections with a novel antibiotic
US4247542A (en) A-40104 Antibiotics and process for production thereof
US4385116A (en) Demethylmacrocin and process for its production
CA1211731A (en) De(mycinosyloxy)tylosin derivatives
US4129721A (en) A-40104 antibiotics and process for production thereof
US4431809A (en) Antibiotic A-33853 derivatives
HU211594A9 (en) Anti-bacterial compound and pharmaceutical compositions thereof
US4560662A (en) Streptomyces antibioticus ATCC 31771 and process for obtaining same
US4419508A (en) 20-Dihydro-20-deoxy-23-demycinosyltylosin and process for its production
KR840001193B1 (ko) 마크로라이드 항생물질의 제조방법
GB2136424A (en) Macrolide derivatives
US4486584A (en) Demethylmacrocin compounds and derivatives thereof
US4656258A (en) Macrocin derivatives
US4528369A (en) 20-Dihydro-20-deoxy-23-de(mycinosyloxy)tylosin
US4334019A (en) Process for producing de(mycinosyloxy)tylosin
US4419447A (en) Fermentation process for producing demycinosyltylosin
US4537957A (en) Process for the production of mycaminosyltylonolide
US4293649A (en) Process for production of antibiotic A-33853
US4654211A (en) New compound, FR-900451, production and use thereof
HU199899B (en) Process for production of poliether antibioticum marked as a 80577 and fodder composition containing them
JPH0152398B2 (hu)