DE2044004A1 - Verfahren zur Herstellung eines neuen antifungalen Antibiotikums - Google Patents

Description

20 A A-O

Dr. O. Diitmarin K. L Schiff Dr. A. ν. Fiiner Dipl. Ing. P. Strehl

Patentanwälte , _ft

München 90, MariahilfplaU 2 & 3, Telefon 45 40 40 VA-OO JO

Beschreibung

zu der
Pa t en tanaieldung

dee

Instytut Antybiotiykow
αϊ ο Starosoinsrka Kr 5
Warszawa_s Polen

"betreffend
Verfahren, zur Heratellungeines neuen

(Priorität H₀ September 1969 -'Hr. P 135 793

.-•ι· Polen)

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen antifungalen Antibiotikums, genannt Polyfungin? auf "biosynthetischem Wege unter Anwendung des Stammes des Aktinomyzeten Streptomyces noursei var, polyfunginiATOC 21581 oder seiner Mutanten und Varianten. .

Polyfungin ist ein entibiotischer Komplex, in dem die Anwesenheit von mindestens drei biologisch v/irksamen Bestandteilen festgestellt wurde» Aufgrund von Ergebnissen der chemischen Analysen wurde festgestellt, daß die einzelnen Beetandteile in dem Makrolidring ein System von vier konjugierten Doppelbindungen, sowie ein System von awei konju-

^J 109814/1903

BAD ORIGINAL

gierten Doppelbindungen enthalten» Jedes üer drei Antibiotika der Bestandteile von Polyfungin besitst aivS'a das gl;y~ kosidiseh gebundene Mykosasdn, sin Marino aderi vat«, Auf diesen Eigenschaft en "basierend wurde Polyfungin in öle Polyenaiitioiotika aus der- Tetraengruppe eingereiht*

Die papierohromatografisehe Trennung des Polyfu&gin--»]£ciraple»· Z&3 ia System des mit Wasser gesättigten Butanols und ia.it der "biologischen Entwicklung unter Anwendung des Staiaias SaöcharomyGes cerevisiae als Seetmikroorganismus ist auf ü&r Abbildung 1 dargestellt, auf der Punkt Sir, 1 der Auftragung des Antibiotikums eiern Präparat von Polyfungin-Komples, Punkt Mr. 2 dem Präparat von Poiyfungin A_v Punkt Hr. 3 üera Präparat von Polyfuiigin B, Punkt Et _λ 4- der Mischung der Präparate ύοώ. Polyfangiii A und B entsprechen „

Die dünnsGhichtchroaiatographische Trennung des Polyfungin-Komple3c83 auf silicagal ia System von Methanol-üliloroform-V/asser /2% 2s 1/ und mit der biologischen intwioklung unter Anwendung desselben TeBtmikroorganismus ist auf der Abbildung 2 dargestellt, auf welcher die Nummer der Auftragungspunkte den Präparaten naah der Reihenfolge wie oben, entsprechen.

Die beiden chromatographisehen Nennungen haben die Anwesenheit von zwei Bestandteilen dee Polyfungins bewiesen; der Fraktion A und fraktion B mit antifungaler Wirkung.

Eine Bestätigung der chromatographisehen Ergebnisse gibt die

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BAD ORIGINAL

Trennung von i^JoXyJX⁷UgIc.nach der .Methode der G-sge trs&tion mit 4υυ· Überführungen. Im Syatsm Mstiiösi fura-^Borat-iUff er lösung /2SSsI/ 'bei eiaeai pH-Wert von 6,2 welche auf äev I\tib±ld.v.ng 3 dargestellt iat> auf der die VerteilungskurTe auch öie Anwesenheit von swei Bestandteilen "beweist,; unö. zwar der Praktion A₅. äe?;'8r Maximum im Gläschen Nr, 352 auftrittj und eier Praktior;. B_f derer Maximum im G-läschen Ev, 3u5 κα finden ist.. Die auf äs-r Al"-Oildung 4 dargestellten UltraVioiettatsorptionsspektra sowie die auf der. Abbildung 5 dargestellten InfrarotabBorptionriepektra t>eweisen_r daß Polyfungin A als auch Poliyfungin "JB-Tetraene sind ₀

Eine successive Srennung von Polyfungin A durch extraktion mit 4-uu Überführungen im System töh Isoamylalkohol - Ziträt-Bifferiesung /12s 17s 2S/.-'welche auf der Abbildung 6 dax'gestellt-isto führt ζυτ weiteren Trennung von Polyfungin A in Polyfungin A₁ und A_P«

■ "

Das Pi"äparat, welcheB aus der irafction B hei'gestellt v?urde_f erwies sich als eine homogene Substanz ua.d wurde Polyfungin genannt«

Es ist aus der Literatur bekannt, daß die inhomogenen Antibiotika in der Gruppe der Tetraen-AntiMotika, aus denen 3e zwei biologisch wirksame Bestandteile getrennt wurden, Nyetatin/Schenin D.Ju._r Kotenko T.W._f EkaempljarQw υ..H., Antibiotiki, 1968, 'MXl, Kr. 5, 387; Sohenin IKJu₉, Katenko-

1098H/1903 bad original.

T.We, ügliewa Μ»!¹., Ekaeapläerc-w C-Κ«, Materially V" HautseL-noj Konferenzji LKaingrads&ogo 3a''itsalaio-XssI(SCiüwa-usl:uo.gQ Institute Anti"biotikQw₉ 1967,.2ü6/r Äntisyteoin/ü ,P,Schaff -ner* I, D, Steinasn, B. S. Saf f erman _P IL Lselievalier,, An ti In optics annual 1957/58, 869/ und Tstrin/ S.I₆ von Hinehart ;ir,„ ¥αϊ'ο Seiiaan« W_nPo !Eacfeer_f S₀ SottIieby Justus XÄe'bi^ö An2?.a-. der Oheiide, 1963» 66Ö 77/₉ sind»

Ein© vergleichbare Trennung vor. I-'olyfangin und 1^statin öureh &egenstroiaeKtr&^:tioa iß. Craig-Apparat 'teat g-sseigtj äaß die i'Talstion A ües Polyfungxii-Koj&plsxea u-nct iiystatin eine identischs Stellung des ExtraJcticnsmaximaiaß aufweisen» Die Fi-alEtion B des Polyfangins hat feinen entspx-eoJienöen Bestandteil im Kystatin-Präpsxat*, Sei der ^.irchfilhrung vor·. weiteren vergleichenden üntersvehunger. des Polyfurigin-Pra-' parates aus der Fraktion A und Nystatin erwies es eich» daß die Polyfungine A₁ und A^ eine ide;ntiaGhe Stellung de»? ExtraktionßmaximumSi wie die Bestandteile A- und A₂ des Mj"-statins, aufweisen» Die Anwesenheit von Polyfungin B im Polyfungin-Eomplex unterscheidet wesentlich diese swei Anti-Motilca, nämlich Nystatin «nd Po

Daa aweite der "beschriebenen Tetraen-Ant^Motika,, die mehr als einen biologisch wirksamen Bestandteil enthalten, ist Tetrin, das in die Bestandteile A und Ji getrennt wurde. Ie. Gegeneata zu Polyfungin,, wurde für beide Tetrin-Bestand teile die Abwesenheit von üiengruppe und ein niedrigeres MoIekulargewioht festgestellt, was diese zwei Antibiotika Tet-

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BAD ORiGiNAL'-

204A0

■■'■ ■.;". .■ ■ - 3 ~

Tin und Polyfungin wesentlich unterscheidet.

Dae dritte der - beschriebenen antifungalen Antibiotika die-» eer Art ist Antimykoiau- Bsi seiner chx^atographisehen Trennung wurde die Anwesenheit wn zwei "biologisch wirksamen Bestandteilen festgestellt_s welche Airtimykoin A und B ge nannt wurden _β Der dieaea AntiMotikum erzeugende Stansai verlor mit der 2eit die S'^higkeit_P den ,Bestandteil B zu synthetisieren» Es ist deshalb unmöglieJv die vergleichenden Untersuchungen durchsuführea," um sq mehr als auch die .Idteraturemgaben ii"ber dieses -üäiema'nur 'foesohxiiaJtet sind-

B-entspricht keines?. d®r 'bisher "beseMebenen (Pet-

j was'durch den Unterschied im inteil von vor allem Kohlenstoffatosien in dem Molekül "bewiesen ist ο Eine Zusssmenstellung der Suajmen:?ormsln für die bekannten Tetraen-Antibiotika und Polyfwngin B ist in der libelle 1 gegeben.»

libelle 1 *

Die ZusaBBaenstellung der Summenforraeln der t-ekannten Tetraen-Antibiotika» sowie des Polyfuxigins A und B

Name des Antibiotikums Suismenfomel

irotozidin °29^Η45^ίίυ13

Pimarizin

Tetrin B

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BAD ORfQiNAL

204A004

Harne des Antibiotikums Swsuaenfomel

Tetrin A

Etruskoiaysin

iihimoziäin

Amphoter!sin A

Hystatin/A.j und Ag/

Polyfungin A /A₁ und A_g/

Polyfungin B

Wie aus den o"bea gegebenen Beweisen hervorgeht, ist Polyfungin das einsige gegenwärtig "bekannte Antibiotikum der Gruppe der Tetraene, welelxes drei antifungale Tetraene enthalt, nämlich Polyfungin A₁, A_? und B, was eine starke antifungale in vitro Wirkung des Polyfungin-Komplexes gegenüber hef eännlichen Pilzen wie auch gegenüber Fadenpilaen gewährleistet, was in der tabelle 2 gezeigt wird.

Tabelle 2 Spektrum der antifungalen Wirkung von Polyfungin

lfd. Kr. Name des lest Stammes Polyfungin-Konzentration

in mc g/ml·

1oo 1υ

1. Candida albie&ue 7St?-9 +

2ο Candida albicane 7841 - - +

3. Candida albicans 7331 -Jt ₊

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BAD ORIGINAL

20440

lid.Hr,

Bame dee Teststaames Po lyfungin-Kons ent ration,

in. acg/ml

iuu

1υ

11. 12. 13. 14, 15. 16.

19. 2ϋ. 21. 22. 23. 24. 25.

Candida albieans 7348 Candida albieans 7831 Candida albieans 647υ Candida albicans 6672 Candida albieans 72U4 Candida tropicalis Candida paraicrusei Qandida lipolytica Saccharomyces cerevleiae

ep. MicrospQ.rum canis Microeporum a douini 37υ1 Erichosporon cutaneum Tricho phyton mentagrophytes 64υ5 Erichophyton violaceum

Trichophyton verrucosum 6739

Trichophyton rubrum 6967 Epidermopiiyton floccosum Aepergillus niger 3317 Aepergillue vereicolor Peniclllua ep. 6895 Cepnalosporium sp. sp.

BAD OR(QiNAL

Die untersuchten Stämme wurden, aus den Klinischen fällen ▼on Mykosen abgesonderte Das Wirkungeapelctrum wurde nach der Verdünnungsmethode im Nährboden von Sabour&ud und zu~ sätzlicb auch für die Stämme Candida albioans nach dem Filament test bestizßmt»

- bedeutet kein Waehstum des Te st Stammes

- bedeutet Wachstuia dee Sestetamiaea in Spurenmengen + bedeutet ein starkes Wachstum des Teststames.

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2044094

■JBafcelle 2 a Spektrum der antifungalea Wirkung äes

I£d, Hr.

Minimale Konzentration

ι MQg/mX

i.-'Absidia archiüis 2ο Aspergiilus niger

3. Aspergiilu.8 terreus 56-B

9» Iu. 11. 12, "13. 14. 15. 16. 17. 18, 19. 2ϋ. 21. 22. 23. 24.

Candida albicans 1υ2

Candida tropiealis d/1 - ■ o,6

Gephaloeporium acreaonium GMl 49137 -

Oryptoeocous neoformans E-3'2 . O₅

Fuaarium caucaaicum - - ■

itLsariuia aaniliforme var-minus-- -»-

Kloeckera apiculata H«-29 U,1

üpoyeee starkejri B-28 -

Penicilliam chrysogenum Q-176 *·

fiaizopus arrjbisus . . ■ - -

Hhodotorula 11&.Y&, R-14 ~ »Saceharomyces cerevisiae ATGQ 9763-υ, ^

!EporobQlomyces aaliaanicolor Β,-41 υ, Sporotriehum eohenkii

»)rula ep. II/3.1 Ό,

Torulopsis ütilie U/38 υ, !ErichQphyton plicatile G

SriehitheciUBi roseum -

!Eriohoeporon eerioeum R-33 2, υ ÜJrigonopsia variabilis R~34 ^_48_72_J6

5_su

•J -K

5,0 0,8

mm

υ* δ u, 6 0*8 0,2

3,o
o,8
o,6

Oj 6

o_s 6 4,0 u_f6 U| 6

3,o

0».2

>9_?o 2pO 5_so O₁ -2-2,0

ο, β Oj8 u,8

1oÜ

o,3 U, 2 4s υ ·ι,υ υ,8 0,8 υ,8 5₉υ 1,0

no

1 * U 0,6

5_Ρυ o,3

75*0 3» ο

>5_fo O₉ 2*0 2j ü 1,0 2,0

1,5

3,o

o,3 0,4 5,0 3,u

1,0

1,0

1,5

1,5 1.5 1,0

5, υ

0,6

Anmerkünden: Beetimott nach der Methode der Verdünnungen auf dem Pepton-Hef e-Agar-Nährboden mit Fleiaohextrakt mit pH-Wert 6,5. ·

1098 VA/1903 bad original

2 (J 4 4 O Q

Yon äea "bisher foesohrlBte^a Über dreißig -Tstraen-Antifoiotite ä&beo. Im Eiafrliea aaf ilira "iioaa ln«TLTO-2oxi2si^-(: nur swei sine felinissäe fe^m^mg gigsf&ncl&a, ued awar JBystatin U Pissrisia» Polyfysals ΐ "'Γ ^.^1; :νΙ:ι·3 "breitsr© kliniing als asLyisgii^tisölies Araneiiiittal, im ?ar~

genilber äea a&proptejtiaoiasn Pil^®a_? 5is sin potentialea

sind, Sa lüsaa a?ieh sia wert~ oasa 38ia_s ül& iferch einen PiIs dsT feiipp'j 3)33^ats?3^t@n_s simlisli Ipi^siimapliyton floccogaa-j Tero^säfe-sM -^^il^ao ii-lsi®iissitig Ist der Poljfmngin EösiplfiS ©is- w®"%ig läozieeises Äati'biötilcuaio Bei Versuchen mit WBMQm "bei orales¹ (Mbe ia M^g@a Ton Iu g per kg Körpergewiclä'i« wuxäe keisie tosisohe Wirkung "beobachtete Bei Verab- v€'±iMmg durch äaj Baaehfell "betrug die IBe₀ 'ίυϋϋ mg per kg Körpergewicht»

Der S/tam des Alctiaomyesten, welcher das Polyfungin erzeugt j wurd© aus dem BQ&@a in Qhina isoliert» In den taxonomiechen Untersuchungen, welche gemäß der Empfehlong des Unterau88ChU8se8 für di© Angelegenheiten der Taxonomie der Aktinoaiyzeten (Intern. J our. System. Bacter. (1966) 16, 313), durchgeführt wurden und in den Tabellen 3-6 aufgeführt sind, wies dieser Mikroorganismus nach dem Schlüssel zur Elassifizierisag von■ Aktiaomyzeten S,A<, Waksman "The Actiaomycete'S 19611 B. 2_S S* 156 öle fundamentalen taxonomiachen Merk-aal*.- aU3_:e welch® für die Spezies Streptomyces

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BAD ORIGINAL

noureei charakteristisch sind, aber wegen der wesentlichen Unterschiede in der Qualität der erzeugenden Polyen-Antibiotika, wurde er als eine Abart dieser Spezies anerkannt und Streptomyces noiiraei var. polyfungini genannt«

Der Stamm des Aktinomyzeten Streptomyces noureei var. polyfungini wurde in der internationalen Kollektion ATCC hinterlegt unter der Kummer 21581,

Tabelle 3

Die Zuchteigenschaften der Streptosiyces noursei var„ polyfungini ATCC21 581

Hährboden

w~_nir.~4-,~. Sporen- Farbe des Parbe des lösliches Wachstum ^_{laung Iuf}tmyzels Grunclmy- Pigment

Mala-Hefe-Agar (2)

reich lich

reich- Pale purple lieh (227)CM ^1XQa code 7 fe Serie GY

Uc 6r

Ice in

Hafer-Agar (3)

Stärke-Agar (4)

Glyzerolaapöragi Agar (5)

reichlieh

light grayish reddish brown (45) CHM code 5 i Serie GY

üc 6t

kein

gut

light brownish gray (63) CBi code 3 fe Coo 6b Serie GY

kein

gut

light grayish

__β_*_Λ(, reddish brown _ί4_ gering _{(45) 0Μ OQfl} Uc

5 fe Serie GY

kein

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2 U 4 A

Die Parten wurden nach 14 Tagen Inkubation in der Temperatur von 28° C bestimmt«

x/ nach E.B. Shirling, D* Sotlib Methode for o&arakterization of Streptömyees species, Intern«. Journal of Systematic Bacteriology, 1966» 16, 313

acs/ nach H.D. Xreener, B.J. Backus, Appl« Mikröbiol., 1963 11»4,335; Color Harmony Manual, Container Corporation of America,, Chicago? Illi.nois5,6u6u3r "ο_β3»Α₉ X2x/ nach H. Prauser» Z₀ AlIg. Mikrobiologie, 1964p 4*1*95? Code for determinating the colours of aerial myc«lia of streptomyeetee* composed by H. Brauser froia colour tabs of Baumann Farbtonlsarten Atlas L

Tabelle 4-

Wachstum des Aktinomyzeten Streptomyoee noursei var ^oiyfungini AICC 21581 auf dem Nährboden mit verschiedenen Kohlenstoff-Quellen

Eohlenstoff-Quelle 7/aehstum des A&tinomyzeten

JMjluioae +-f-

Ir-Arabinoee ~

Saccharoae

I-Inositol

D-Mannitol -f^

D-Fruktoae ++

Hhamnose

Haffinose

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BAD ORiGSNAL

■ - 13 -

Asaerkungen: ++ bedeutet reichliches Wachstum

+ gutes Wachstum

- geringes Wachstum

- kein Wachstum .

Tabelle

Die physiologischen Eigenschaften der Streptomyces noursei var«, pol fungini AKJO 21581 -

Die zu untersuchenden Eigenschaften

Ergebnisse

1. Peptonisation von Miloh

2« Hydrolyse von Stärke

3. Verflüssigung von Gelatine 4· Reduktion von. Nitraten

5» Fähigkeit zum Wachstum in der ^temperatur 5ü° C

6 c Erzeugung des Pigments von Melamin-iEyp

7. Erzseugung von Schwefelwasserstoff

8. Erzeugung von Antibiotika

1098 U/1903 koaguliert, dann peptonieiert intensiv und alkalisiert hydrolisiert intensiv verflüssigt schwach reduziert schwach (Spurmengen an Hitraten)
schwaches Wachstum

erzeugt nicht
erzeugt nicht

Antibiotikum der Zykloheximid-Gruppe; 2 Antibiotika, die gegen die Gram-positiven Bakterien wirken; PoIyfun gin A₁, A₂ und B; Antifttngales Antibiotikum der Polyen-Gruppe, welches ein System von drei konjugierten Doppelbindungen enthält; Antifungalee Antibiotikum der PoIy en-Gruppe, welches sieben konjugierte Doppelbindungen, enthält

BAD ORIGINAL

2UU0Q4

!Datoelle 6

Sie morphologischen Eigenschaften der Streptoiayces nourael tot, polyfungini ATOC 21581

'Züchtung von 14 Tagen auf dem Malz-Hefe-Agar (2), Haferagar (3)t Starkeagar (4) und Slyzerol-Asparagin-Agar (5)

offene Spiralen mit 3 - 5 Windungen auf Fragmenten dee Iwftmyzel», wechselständig (Spira) oder Ringe Sporo- umher (Itonoverlicillus-Spira) unter"bracht» Haken, phoren locker gewickelte Schleifen, restliche Spiralen (Retinaculum - Apertum)

Form elliptische, kettenförmig geordnet, je mehr

. . ^ ^aIs 1υ Sporen _{<mmm m}

Oberfläche mehrere, dünne, lange Auswüchse

Au anäße 1,0 bis 1,5 ζ υ, 4 hie υ, 6 u

' Die Nährböden «ie In der Tabelle 3.

me in der Anlage befindlichen Photos illustrieren dl« Textur der Sporophoren in den Kulturen auf Agarnahrböden:

EhQto 1 me lype der Sporophoren des Stammes Streptomyces noureei var. polyfungini AICC 21 581· me Züchtung von 14 Tagen auf Haf«rager (125 x Vergrößerung)

Hioto 2 m« Type der Sporophoren dee Staaaee Streptoaycee noureei var. polyfungini ATCC 21581. Die Züchtung von 14 Tagen auf Starkeagar (125 x Vergrößerung)

SAD OR.'GINAL

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2ÜU0Q4 ;.■■■. - - 15 -

Das erfindungsgeaäße Verfahren zur Herstellung eines neuen antifungalen Antibiotikums, Polyfungin, auf biosynthetischem Wege, besteht darin_f daß man die Biosynthese unter Anwendung dea Stammes des Aktinomyzeten Streptomyeea noursei -rar. polyfungini AEJC 21581 oder seiner Mutanten und Varianten unter aeroben Bedingungen in wässrigem liähraiedium, das als entsprechende Quelle für Kohlenstoffs, Sauerstoff, Stickstoff , Vitamine, WaohstumsubstanZj, Makro- und Mikroelemente, sowie Puffersubstansen enthält _f bei 25 - 35° G und bei einem pH-Wert von 6-7 binnen 3-6 Tagen durchführt, das Myzel nach Beendigung der Biosynthese abfiltriert, mit Wasser wäscht und mit organischen Lösungsmitteln extrahiert«■ das Myael abtrennt«, die vereinigten Extrakte unter veimiadertem Brack eindampft; das abgeschiedene Antibiotikum abfiHriert, wäscht und trocknet_f und dann reinigt und trocknete

Die Züchtung des Stamms Streptomyces noursei var« polyfunwird auf den N&brmedien geführt, welche als Zohlen-

Btoff-Qaelle einfache und/oder zusammengesetzte Kohlenhydrate, vorzugsweise Glukose_? Stärke, Dextrin din der Menge ▼on 1-tü Gew.-^ enthalten«,

Al· Quelle von organischem Stickstoff werden Pflanzen und Tierrohetoff* verwendet, wie Pflanzenextrakte von Mehl aus Smmel, Hj'drolysate von Eflanzenmaterial_r Hydrolysate von Tieraaterial, vorsugeweioe Maiaquellwasoer, Sojamehl, TTOk kenhefe, Hefehydrolysate. Peptone, Harnstoff, Fischmehl in

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bad or,g.nal

2CK40Q4

der Menge von υ_?1 - 5 &%

Ala Quelle von niciitorganisohen Stickstoff werdest Salzse verwendet, welche das Ammonium- und/oder Nitration, vor zugsweise AimoniVffiiehlorid,, Natriumnitrat,, Ammoniumnitrat* Aiaao»ittmsulphat_s Aasaoniuma2setat zitrat in der Menge τοπ υ, 1 »3 ß-ew»-^,

Ale Quelle von . JHIafcra- und . Mikroelementen wird Netzlei-* tiingewasser verwendet«

Ale Bifferverbindung wird vorzugsweise EalsiamlEarboaat in der Menge von ü_f 1 - 3 Cr«w.-?fe verwendet.

Als organische Lösungsmittel weyden vorzugsweise niedrigere aliphatische O^ - Cc-Alkohole I)Sw* ihre wässrigen Lösungen.,, Essigsäure, Pjrridin,, schwache Pyridijilsasen, Formamid, Dirne thyIfonaamlds Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenglykol und/ oder ihre Miechungen verwendet«

Die Extraktion wird bei 10 - 5υ° 0 durchgeführt«

Die Verdampfung des Extraktes von Polyfungin wird unter versaindertea Druck "bei einer Temperatur nicsht höher als 5υ° C durchgeführt.

Die Reinigung wird durch Auswaschen der Verunreinigungen mit Lösungsmitteln "bei 15 - 6ü° C durchgeführt.

Ale organische lösungsmittel werden vorzugsweise niedrige aliphatische O₁ - O^ - Alkohole, ihre wässrigen Lösungen

1098 U/ 1903

und/oder wässrige Lösungen der Alkohole_e welche die nicht organischen Salae_f vorgagsweise Natriurahexaioataphosphat, Azeton, Ester, vorzugsweise Äthylaaetat, aliphatische Halogenderivate, vorzugsweise Äthylenchlorid; und aromatische Kohlenwasserstoffe,, vorzugsweise Bensol_$ sowie ihre Mischungen; enthalten»

Die unten gegebenen Beispiel® schildern; aber beschränken nicht das Verfahren zur Herstellung von Polyfungin.

Beispiele über die Methode der Züchtung von Aktinomyzeten-Kultur.

Beispiel 1»

Der Stamm des Aktinomyzeten Streptoxayces noursei var. polyfungini wird während 14 Tage bei 28° C auf dem schragagar des Nährbodens mit Eartoffelextrakt gezüchtet. Die SaatüäLltur auf flüssigem Nährboden wird binnen 42 Stunden in Erlenmisyerkolben von 5uü ml Inhalt gezüchtet» wobei dieser Kolben 5ü ml Hährmedium von folgender Zusammensetzung enthält;

Eeine Glukose 2^

AflEuoniumnitre t u«

Malequellwaaser (5ϋ?έ Trockensubstanz) V Ealziumkarbonat
Leitungewaeeer bis au

Dae Nährmedium in den Kolben wird im Autoklav binnen 50 Minuten bei T17° 0 nach vorhergehender Korrektur dee pH-Wer-

1098 U/1903 bad ORIGINAL

■fees auf 6,4- sterilisiert* Das auf diese Weise vorbereitete Saatmedium wird entweder alt einer Waasersuspensioa der aus der auf der Agar-Kultwr gesammelten Sporen oder mit einem Schnitzel der Kultur angeiiapft. Die Kultur wird "bei 28° 0 gezüchtet, wobei die kolben auf einer Drehsehüttelmaschine mit 22u Umdrehungen pro Minute angebracht sind« Die Produktionskultur auf einem flüssigen Nährboden wird binnen 96 Stunden in Erlenmayerkolben von 5üü ml Inhalt gezüchtet, welche 30 ml Nähimedium von folgender Zusammensetzung enthalten?

Technische Glukose
Kartoffelstärke
Maisquellwasaer

5fi

subs tans) 1/£

Oirockenhefe υ, 25%

Ammoniumeulphat ' υ, 4$>

iüälziumkarbonat u,8^

Leitungewaeeer bis zu 1υο,υ ^

Des mhzmedium in den Kolben wird im Autoklav binnen 30 Minuten bei 117° C nach vorhergehender Korrektur dee pH-Wertes auf 6,4 sterilisiert. Das auf diese Weis« vorbereitete Produktlonanäbnaedium wird mit 5fi im Verhältnis zum N&hrmedium-Volumen, der auf dem saataedlum erhaltenen Kul tur angeimpft. Sie Kultur wird bei 26° C gezüohtet, Mit den auf einer Schüttelmaeohine mit 22ü Umdrehungen pro Minute angebrachten Kolben. Das behalt au Antibiotikum wird nach der mikrobiologiechen Zylinderplattenmethode in Gegenwart

109814/1903 ^ε>&

des iCestetamiaa iEorula sp» 11/31 (unempfindlich gegen die Wirkung von jgykloheximid) im. Methanol-Extrakt aus am Myzel von Aktinomyzeten Strsptomyces noursei vax« polyfungiiii bestiiB&t« Die Bezeichnung wird in Gegenwart von einem Standard«- Präparat von Nystatin durchgeführt und die Ergebnlsas in Vergleiehaeinheiten in Umrechnung auf Brühe angegeben, für die wie oben gezüchtete Kultur erhält man die BrUhe mit einem Gehalt an Polyfungin gleich 6695 Einheiten/m!*

Beispiel 2»

Dar Stamm, des Aktinoayseten Streptomycea nouraei mr, polyfungini wird auf festem und flüssigem Saatmeäiuia in der im Beispiel 1 angegebenen Y/eise gezüchtet,, Die tür auf einem flüssigen Hahrbodesi wird in .

vmi 5üü ml Inhalt gezüchtet,, welche 30 ml Kährmedium von folgender Zusammensetzung enthalten?

Technische Glukose 2

Kiartoffeistärke 2

Maiequellwaaser (5uj4 irocken-

substana)

!ürockenhefe
AaiBioniuittsulphat
Kalziuakarbonat
JDeitungswasser biß zu

"Dom Hährmedium in den Kolben wird in Autoklav binnen 3o Minuten bei 117° G nach vorhergehender Korrektur des pH-Wertes auf IfO sterilisierte Das auf diese Weise vorbereitete Produktionsnährmedium wird mit 5^_r i^m Verhältnis sum Hähnaedi-■■ _: 1098U/1903 BAD ORIGINAL

2U -

der auf Hem Saataaedium gemäß Beiapißl 1 reiteten Kultur angeiapft, Hie Kultur wird "bsi 2ö° C gezüchtet, mit de» auf einer Schüttetoase&isie mit 22u hängen pro Minute binneai 96 Stunden angebrachten Die Bezeichnung des Gehaltes an Antibiotikum wird auf die im Beispiel 1 angegebene Weise durchgeführt» wobei-man die BrUhe mit dem Gehalt as?. Pölyfttngia gleich 9235 Einheiten/ml erhalt.

™ Beispiel 3» ■ . .

. Der Stanaa des Aktinomysetea Streptomyoes naursei var«> poly·" fungini wird auf festem und Saatmedium auf die im Beispiel 1 angegebene Weiae geaücbtst«, Die Produktionskultur wird auf einem flüssigen KTährboden in Erlenmayerkolben ^on 5uü ml Inhalt gezüchtet ₉ welche 30 Eil Bährmedium von folgender Zusammensetzung enthalten:

Technische Glukose 2_f

Kartoffelstärke
™ Maisquellwasser

!Crockenhaf e ü,

iUamoniumauiphßt υ

£alziumkarbonat U₁QjO

Leitungswasser bis zu 1üü,ü^

Das Kähnaedium in den Kolben wird im Autoklav binnen 30 Minuten bei 117° 0 nach vorhergehender Korrektur des pH-Wertes auf 7,υ sterilisiert. Das auf diese Weise vorbereitete

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BAD ORIGINAL

2 Ü 44-00

wird mit 5jS_f i® Verhältnis sum Nährboden Volumen, der auf dom. Saaiaaeäium gemäß Beispiel 1 wrbereitetea Kultur geiapft. Di® Kultur wird "bsi 28° ■ 0 gezüchtet, mit am auf eiasr SchüttelBasehin© mit 220 Umdrehungen pro Mnate wäisread 96 Stuaden angebrachten Kolben, I>ie Beaeiohaung des Sehaltes -an ijatibiotilEum wird ai\f die im Beispiel 1 angegebene Weise durohgaftiiirt_? wobei siaii die Brühe mit dem Geaalt an Polyfungia. gleiek 16569 Einheiten/ ml erhält«

Beispiele über die Isolierung und Reinigung des Antibiotikums aus der Kultur.

Beispiel 4.

5 1 der geaiäS Beispiel 3 erhaltenen Brühe mit Gehalt an Polyfungin gleich 16569 Einheitan/ml wird abfiltriert. Die erhaltenen 40ü g des feuchten Myzels werden mit 1u 1 Wasser und dann sdt ü, 4 1 Aseton gewaschen» Bas Mysel wird dreimal je 1 Stunde extrahiert, wobei far jede Extraktion 1,2 1 Methanol gebraucht wird. Die gesammelten Extrakte werden unter vermindertem Druck bei Temperatur dee Bades gleich 4υ° C zum Volumen von 5u ml eingedampft. Der abgeschiedene Niederschlag wird abfAltriert, mit 5u ml. Aa eton gewaschen und bei Zimmertemperatur getrocknet, und dann werden die Verunreinigungen bei Zimmertemperatur mit der doppelten Menge (Gew./Vol.) Äthylenchlorid extrahiert» Nach Abflltrieren. und Trocknen bei Zimmertemperatur wird der Niederschlag wieder mit der doppelten Menge (GeWc/Vol) an destilliertem Waseer

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hiert und nach Abfiltrieren unter vermiiidartaia Druck bei 4u° O getrocknet. Das erhaltene Produkt enthält 515o Einheiten Polyfungin pro 1 mg und die gesamte Ausbeute des Prozesses in Umrechnung auf das in der Briihs enthaltene Polyfungin beträgt 56$» W^ - 6υ,2 mg/kg.

Beispiel 5.

Die Verarbeitung der Brühe mit der Aktivität von 16569 Einfe heiten/ml wird auf die im Beispiel 4 angegebene Weise

durchgeführt und zwar mit dem Unterschied, daß anstatt Äthy lenchlorid eine analoge üenge von Äthylazetat verwendet wird. Das erhaltene Produkt enthält 53uu Einheiten Polyfungin pro 1 mg und die gesamte Ausbeute des Prozesses in Um» rechnung auf das in der Brühe enthaltene Polyfungin beträgt _υ = 61,7

Beispiel 6.

5 1 Brühe mit Gehalt an Polyfungin gleich 16569 Einheiten/ ml wird abfiltriert. Die erhaltenen 4υυ g des feuchten Myzels werden mit Wasser und Azeton gewaschen, mit Methanol extrahiert, dann werden die Extrakte eingedampft, der abgeschiedene Niederschlag abfiltriert und mit Azeton, «te im Beispiel 4, gewaschen. Der Niederschlag wird in der Zinuaertemperatur getrocknet* Der erhaltene Niederschlag wird in 5υ ml 3u5b-iges Isopropanol mit Zugabe von 1 i> Natriumnexametaphosphat suspendiert und binnen 30 Minuten bei 6u° C erwärmt, dann auf Zimmertemperatur gekühlt und abfiltriert. Der erhaltene Niederschlag wird mit 1ou ml Azeton gewaschen

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und unter vermindertem Druck bei 4-u⁰ C getrocknet. Das erhaltene Produkt enthält 63 5ü Einheiten Polyfungin pro 1 mg und die Gesamtausbeute des Prozesses in Umrechnung auf <3as in der Brühe enthaltene Polyfungin "beträgt 61 ?S„ UDk_υ ~, 7υυ mg/kg«

Beispiel 7.

Die Verarbeitung der Brühe mit der Aktivität von 16569 Einheiten/ml wird in der im Beispiel 6 angegebenen Weise durchgeführt und sw^i* mit dem Unterschieds daß kein Natriumhexametaphosphat. zum 3u?b-igen Isopropanol angegeben v/ird.₃ Das erhaltene Produkt enthält 648u Einheitan Polyfungm pro 1 mg und die Gesamtauebeute in üiax'echnung auf das in der Brühe enthaltene Polyfungin "beträgt 61J6. ID^₁ = 1uuü

ORIGINAL" iNSrECTED

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Claims (1)

1. Baten tansprüche.

   1* Verfahren zur Herstellung eines neuen antifungalen Antibiotikums,, Polyfungin, auf "bio synthetischem Wege, dadurch gekexm^i&Jmet^- daß die Biosynthese unter Anwen- -öung^des Stamms Aktiomyzeten Streptomyees noursei var» polyfungini ATCC 21581 oder seiner Mutanten und Varianten unter aeroben Bedingungen in wässerigem Uährmedium,, das entspreohenäe Quellen für Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Vitamine, Wachßtumsubstanz, Makro- und Mikroelemente, sowie Puffersubstanzen enthält, "bei 25 - 35° C und "bei einem pH-Wert von 6-7 Mnnen 3-6 lagen durchgeführt wird* wonach das Myzel afcfiltriert, mit Wasser gewaschen und mit organischen Lösungsmitteln extrahiert, das Myael abgetrennt* die vereinigten Extrakte unter vermindertem Druck eingedampft, das abgeschiedene Antibiotikum akfiltriert„ gewaschen und getrocknet^, und dann gereinigt und getrocknet wird..

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Züchtung des Stammes Streptomyces noursei var» polyfungini AKJC 215Ö1 auf den Nährmedien, welche als Kohlenstoff-Quelle einfache und/oder zusammengesetzte Kohlenhydrate, vorzugsweise Glukose, Stärke, Dextrin in der Menge von 1-1U Gew.-^ enthalten, geführt wird»

   3» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

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   zeichnet, daß als Qaelle des organischen Stickstoffes Pflanzen- und Tierrohetoffe, wie Pflanzenextrakt te von Mehl aus Samen, Hydrolysate von Pflanzenmaterial* T^dralysate von Tigrsaaterial, vorzugsweise Maisquellwasser, Sojamehl, IToekennefe, HeiE^JÖlrjailysate, Peptone, Harnstoff, fiselmehl in. der Menge von υ,1'- 5 Gew^^=,,^^^^^ verwendet

   4ο Verfahren nach Anspruch Λ, daäuroh g β ϊ β η η -' zei ch η e t j daß als Qaelle des zdobi Stickstoffes Salze, welche das Äsamonium»· und/oder litre tion, vorzugsweise Amaoniumchlorid, Hatriu!snitrat₉ Kaliumnitrat, itoioniuranitratj iümaoniumaaetat₉ Atamoniuaaitrat in der !enge von υ,1 - 5 Gew..-^ enthalten, verwendet werden,

   ο Verfahren nach Anspruch 1 ₉ dadurch g e k e η η a e i c h η e t j daß als φιβίΐ© von Makco- und Hikroelementen Leitungswasser verwendet wird,

   6„ Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -zeichnet, daß als Puff erverMndung vorzugsweise · Kalziumlcarhonat, in der Menge von υ, 1 - 3 G-ew*-$ verwendet wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, daß als organische Lösungsmittel vorzugsweise niedrigere aliphatisch^ G^ - Cr - Alkohole sowie ihre Wasserlösungen, Essigsäure, Pyridin, schwache

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   Pyridinbasen» Iormamid,, Disaethylformamidj Tetrachlorkohlenstoff , Ätbylenglykol und/oder ihre Mischungen ver~ wendet werden*

   8, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion "bei 1u-5u° C durchgeführt wird.

   9» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η " zeichnet, daß die Verdampfung des Extraktes von

   Polyfungin unter vermindertem Brück "bei nicht höher als 5ü° C durchgeführt wird.

   tue Verfahren nach Anspruch 1„ dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung durch Auswaschen der Verunreinigungen mit Hilfe von Lösungsmitteln "bei 15-6u° C durchgeführt wird»

   11» Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 1ü» dadurch g e ^ kennzeichnet,, daß als organische Lösungsmittel vorzugsweise niedrigere aliphatisch® C-j * O* Alkohole_s ihre %sserlÖsungen und/oder Wasserlösungen ί der Alkohole, welche die organischen Salse, vorzugsweise Siatriumhexametaphosphat, enthalten, Aaetön, Ester, vorzugsweise Äthylazetat, aliphatische Halogenderivate, vor~ zugsweise Äthylenchlorid, und aromatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise Benzol, sowie ihre Mischungen verwendet werden«

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