DE1767901A1 - Herstellung und Gewinnung eines Antibioticums - Google Patents

Description

• Herstellung und Gewinnung eines Antibiotiouas

  Zusatz zu Patent 1 213 569

  Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung des Anti-

  biotlaumer, das 3m folgenden mit der Nummer 11 837 R.P. bezeichnet

  wird. .

  In dem Hauptpatent 1 213 569*ist den Antibioticum 11 8.37 R.P. und seine

  Herstellung durch Mohtung eitles Nikroorßsnismus, der mit

  "9treptouVaee viridam D3 94b6" (MRL 3 087) bezeichnet wird.

  in idhmtliohen Medien beschrieben.

  Es wurde eeitdent durch Prütunj; durch Papierchromatagraphie und

  Dtümaahiahtehrov*togmphie sowie durch Blektrophoraae und an-

  sohliegende nikrobiologiachs Bestirwung gerunden, äai das

  11 837 R.?. ein Gemisch von mehreren Bestandteilen ist, die sehr

  ähnliche biologieohe und pijsiloetliech-ohenisobe Eigensohaften

  beäitzen.

  Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung des Anti-

  bl.otieums 11 837 IR,?. durch Vlohtung von »ei neuen Nikroorganis-

  wen, die Im folgenden vollstärdiger identifiziert werden, unter

  aeroben Bedingungen. Diese beiden neuen Mikroorgtnisaen, die

  untereinander sehr ähnliche Eigenschaften zeigen, gehören zum

  Genus StreptonWees und innerhalb dieses Venus zur Specä.es Streptoy

  nyces venezuelae, von der sie eine Varietät darstellen.: der der

  Name StreptonWoes venezuelae, Varietät fulvofurvesoens gegeben

  wurde. Diese beiden Mikroorganismen werden mit "3. venezuelae,

  var. tulvofurvesoerna DS ? 103" (MRL 3354) und "S. vennzuelae,

  varo fulvofurvesoena DS 11 355" (NRRL 3355) bezeichnet.

  Der "Streptomßroee venezuelae, var, fulvofurvescens DS ? 103"

  wurde aus einer in Algerien bei Algier entnommenen Erdprobe und

  der"StreptonWees venezuelae, var. fulvofurvescens D8 11 355"

  aus einer in England im Gebiet von Gloucester entnommenen Erd-

  probe isoliert

  Ihre Isolierung wurde unter Anwendung der folgenden üblichen

  Methode vorgenommen:

  Die entnommene Erdprobe wird in sterilem destilliertem Wasser

  stuapendiert und die Suspension dann auf verschiedene Kon:entrationen

  vezMant. Ein kleines Volumen jeder Verdfüinuig r;i rd auf die Ober

  fib:ohe von Petrisohalen aufgebracht, die ein Agar-Nä'iraaedium

  enthalten.

  Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei *6"f: werden die Kol(,-

  nien der Mikroorganismen, die man isolieren wil".t au.? Schräg-Agar

  versetzt, um reichlichere Kulturen züi erhalten

  D1& das Antibiotioum 11 837 R.P. erzeugenden neuen Mikroorganismen

  gehören cum Genus Streptomyces und stellen insbesondere eine

  Varietät der Speoiea StroptomWces venesuelae dar, an die ihre

  wesentliohen Eigenschaften erinnern.

  Die Gesamtheit der folgenden Charakteristiken, die sie aufweisen,

  stimmen mit denjenigen der Species 9. venezuelae Uberein, die

  einerseits in "The Aetinozycetes", Band 2 (3.A. Wakaman, The

  Williaum and Wilkias Company, Baltimore, 1961), Seiten 280 - 281-,

  und andererseits in "Hergey's Manual of Determinative Baateriology"

  (@. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 195?)

  Seite 780 - j81, beschrieben sind: Produktion von schwarzem Melanin,

  pigment auf geeigneten Medien mit Tyrosin imd Produktion von lös--

  liehem braunsehwärzllchem Pigment auf den meisten organischen

  Medien, gelbbraw7e bis dunkelbraune Färbung des vegetativen Mycel s

  auf allen Kulturen. rosa Färbung des sporulierten luftau-ge

  setzten Mycelg.. Organi.gatiorr des Sporentel "r . die in der @xc?-a@a@

  tion von sehr langen, geraden oder aohusoh gebogenen @poropdoren

  besteht.

  Sie unterscheiden sich von den Spoeiea-ep von B. venazuelae

  dadurch, das sie Unterschiede in den Kohlenatoffquellsn, die sie

  zur ßewährleistung ihrer Entwicklung zu verwerten vermtWn, zeigen,

  als Antibiottoum nicht Chlorau;henlool, sondern 11 837 R.P.

  produzieren und insbesondere reichlich ein dunkles lösliches Pigm

  nent von oranesbrauner Farbe produsieren,das rasch immer dunkler

  wird, um bis zu schwarz zu gehen, und gleichseitig das vegetative

  Kloel und das Wohtungssedlum färben kann. 3. venszuelae produziert

  in einer gewissen Zahl von Fällen ein zierlich ähniiobea Pigment,

  jedoch i® allgemeinen in geringerer Nsngs und in einer Bewiesen

  TAU von Fällen überhaupt keines, in denen die neuen 1@likroorganis@

  nen das Pigment produzieren (insbesondere au! gewieasn synthetischen

  Medien . Dies ist der Grund,wsrun diese letzteren mit StrsptomWoes

  venezuelae, Varietät fulvofurvesoeM bezeichnet wurden.

  Die ZUohtungseigensohaften und bioohenisohen Eigensohslten,von

  B. venezuelae, var. fulvoturresoene, 8t@ D.9 r 103 wurden auf

  einer gewissen Anzahl von Ublioherweise zur PrUfung des Ausgehens

  von Stäamen von Streptongoes verwendeten Agar-Nährnaäien und Nähr

  bouillons geprUft. Die erhaltenen Beobachtungen sind in der toi®

  genden Tabelle @suaammengettollt. Ohne besondere- genaue Angaben

  betreffen sie Kulturen von 2 bis 4 Wochen bei 26'C, die ein gutes

  Entwioklungstadium erreicht haben. Eine gewisse Anzahl der ver-

  wendeten Kulturmedien wurde nach den in "The Aotinoryoetes",

  3.A. Wa%emns zelte 193 - 1979 Chrmioa BOtanioa compaw,

  Waltbam, lass., V.8.A., 1 , afgebenen Rezepturen hrtrgestelltn

  in -diesem Falle sind sie ad.t dem Bwhstaben W, dem die Numer,

  die ihnen in "The Kotinooproetes" gegeben 3s t, folgt,. bezeiohsret .

  Die AnmsrlnaX_tn oder Zusammnsetsungsn der anderen Züohtuagan

  mdien sind die folgenden:

  Ante. A: x.z. Jones, Journal of Baateriology,, m, 142, 1949

  Am. B, Rezeptur W. 23, versetzt aalt 2% Agar

  Ante. C: " Siekey und Trasner's ", T.0. Pridham u. Mitarb. ,

  Antibiotios Annual,

  957, Seite 950

  Anm.D: "Y«tit Extraot Agar", T.t#. Pridham u.Mitarb., Antibiotias

  Annual, 1956 - 19579 Seite 958

  Am. 8t "Tomto Paste Oatmeal A", T.(1. Pridham u-litarbr,

  Antibiotios Annual, 1959-- 1957, Seite 950

  Arms. p: The AotinoaWoeten, Band 2s Seite 3 'j'39 Nr. $2, 3.A. krakoman,

  The William and Wilkins CompaW, Baltimore, 1961

  Am. 0t W.ß. 0u. Mitarb., Antibiotios and Chem. P,, 401, 1952

  Anm. Es "Inorganio Salto - 3taroh Agara, f.0. Pridham u. Mitarb.,

  Antibiotias Annual, 1956 - 1957, Seite 951

  Anm. I: entspricht der Rezeptur w 1, wobei 30 g saooharose durch

  15 g Gluooee ersetzt sind

  Am. J: entspricht der Rezeptur V i, wobei 30 g Saocharose durch

  15 g Olyoerin ersetzt sind

  Anne Kt "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben des "Manual

  of Methode for Pure Culture Study of Baoterla" der

  Sooiaty of Ameriaan Baateriologiata, Genova, N.Y., I150-18

  Ans. Lt entspricht der Rezeptur W 18, wobei üie Sae(iharose weg-

  gelassen und durch kleine Filterpapierstreifen, die teil--

  weise in die Flüssigkeit eintauchen, ersetzt, ist

  Am. M: H.D. Treener und B. Danga, Journal of Baote-Vio).ogy, _Ze

  2 - 244,9 1

  Anne X# HanäelaUbliohes Magermilohpulver, nach der Angaben des

  Herstellei.-i angzah'@

  S. venezuelae, var. fulvoAirvesoens, Stamm DS 11 355 weit

  mit den Charakteristiken von S. venezuelae, var. fulvofurvescens,

  Stamm DS 7 103 auf den Medien, die in der obigen Tabelle be-

  schrieben sind, vergleichbare Charakteristiken auf. Der einzige

  bisher festgestellte merkliche Unterschied in dem Verhalten

  dieser beiden Stämme liegt In ihrer Fähigkeit, gewisse Kohlen-

  stoff- oder Stickstoffquellen zu verwerten, wobei der Stamm

  DS 11 355 Adonit nicht verwertet, den der Stamm DS 7 103 verwer-

  tet, und dagegen Saroosin verwertet, das der Staun D3 7 103 nicht

  verwertet.

  Die Fähigkeit der beiden Stämme, verschiedene Kohlenstoff-

  und Stickstoffquellen zur Gewährleistung Ihrer Entwicklung zu

  verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und

  Gottlieb (J. of Bact. 5¢,, 107 - 114, 1948) bestimmt. Der Entwick-

  lungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium

  bestimmt, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig

  untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (N84)2904 durch die

  verschiedenen jeweilig untersuchten SV.ekstoffquellen ersetzt

  wurde. Die Ergebnisse sind in der folgendect Tabelle angegeben:

  Das neue Verfahren zur Herstellung des Antibiotioum 11 83'r R.P.

  besteht in wesentlichen darin, "Streptoraroes venea»lae, va r.

  fulvofruweecena D3 7 103" oder "3treptoaWoes venezuelae, var.

  fusvoftwvesoens D3 11 355" auf geeigneten Nedien und unter geeig-

  neten Bedingungen zu suchten und anschließend das Antibiotioum

  11 837 R.P., beispielsweise in Form seines Kaliumsalzes, abzu-

  trennen.

  Die allgemeinen Bedingungen, unter denen die Züchtung von

  "Streptomyaes venezuelae, var. fulvofurvesoens DS 7 103" sind

  "StreptorWoea venezuelae, var. fulvofurvesoens D8 11 355" zur

  Produktion des Antibiotiaum 11 837 R.?. durohgelUhrt wird, sowie

  die Methoden zur Isolierung dieses Antibiotioums aus den Fermen-

  tationemaisohen sind mit denjenigen identisch, die in dem Haupt-

  patent zur Herstellung von 11 837 R.P., ausgehend von "8treptouroes

  viridans D3 9 466" (HRRL 3 087) beschrieben sind.

  Das durch die 8tDs 7 103 und D3 il 355 erzeugte Antibiotioum

  11 837 R.P. ist ein Gemisch, dessen Art von

  mit der-

  jenigen der Bestandteile des von dem Stamar DS 9 Q66 erzeugten Antibto-

  tioums 11'837 R.P. identisch ist. Lediglich die relativen Mengenanteile

  der Bestandteile untereinander können von einem :Stamm zum andern

  oder selbst tUr ein und denselben Stamm von einer Produktohsrge

  zu einer anderen variieren.

  Der Nachreis der Bestandteile der Gemische kann nach den Ub-

  liahen Methoden der Analyse von Antibiotiaa-ßemisohen vorgenosmsn

  werden, beispielsweise durch Papierahromatographie oder DOnnsohiaht-

  ctographie, sowie durch Elektrophorese und anschließende

  nd.)wobiologisahe Bewertung, beispielsweise durch Aufbringen auf

  beimpfte Agar-Platten.

  Die Infraratapektren der durch Züchtung der neuen Stämme erhal-

  tenen Produkte sind zwar nicht vollständig identisch mit dem

  in dem Nauptpatent gezeigten Spektrum, doch weisen sie praktisch

  die gleichen Absorptionsbanden mit nur einigen relativen Intensi-

  tätsuntersahieden auf, die auf den variablen Mengenanteilen der

  Bestandteile untereinander beruhen.

  Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu

  beschränken. In folgenden wird die Aktivität stets durch biologi-

  sehe Bestimn m ,ng nach der Diffusionsmethode unter Verwendung von

  8aeillus subtilis als empfindlichem Keim und bezogen auf eine reine

  Probe von 11 837 R.P. als Eichmaß bestimmt. Diese Aktivität ist

  in Einheiten (S) je mg für die festen Produkte und in Einheiten

  je ccm für Lüaungen ausgedr4ickt (die Einheit ist als die kleinste

  MerWe des Produkts definiert, die, gelöst in 1 oom eines geeigne-

  ten Kulturmedium, das Wachstum von Staphylocoeeus aureus 209 P

  unter bestimmten Bedingungen inhibiert).

  Betspiel 1

  In einen 170 1-fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

  Mainquellwasser 4<,800 kg

  hydratisierte Gluao$e 2,400 kg

  Natriumhlorid 0,600 kg

  magneeiumsultat 0,120 kg

  Wasser ad 110 1

  Nach Einstellen des pH-Werts des Gemischs weit 535 0o® Natronlauge

  ( d = 1.33) au' 7,30 setzt mein noch 0,600 kg CalaIusoarbonat zu.

  Das Kulturmedium wird dann bei PR 7,30 durch 40-d.nfitigea Durch-

  leiten von Dampf von 122°C sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt

  das Volumen der Bouillon 120 1 und der pü-ifert 6,90. Des Medium

  wird dann mit 200 0« einer geruhrten äm. gssohhttelten Erlen»7er-

  Kultur den Stammes StreptoeWcen venezuelae var. lalvoftrresoens

  D9 7 103 beimpft. Die Züchtung wird 28 Stunden bei 30'C unter Be-

  wegen und unter Belüften mit steriler Luft entwickelt. Sie ist

  dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeiga»t.

  Die Produktionskultur wird in einem 800 1-Fe:menter durohgefUhrt,

  der mit folgenden Substanzen beschickt ist:

  Maiaquellvw»er 20 kg

  sterka 705w ki

  Sojaöl 7.54ß 1

  Mmokaliumpbmpöat 1 kg

  Magmsiuammlfat 1 kg

  hydmtisiertes lobaltahlorid 0,010 k6

  Wasser ad 460 1

  Mach Einstellen des PR-Werts des Gemisches auf 7.15 mit 280C a« koosen

  trierter N,trOU,UM (a = 1,33) setzt mit rnoah 5 kg Caloiumarbonat zu.

  Das Züchtungsmedium, das einen pH-Wert von 7,35 aufweist, ,wird

  durch 40-minUtigea Durchleiten von Dampf von 122'C sterilisiert.

  Nach Abkühlen beträgt das Volumen 490 1 und der pH-Wert 7.-05.

  Man beimpft dann mit 50 1 der obigen Impfkultur aus d« 170 1-Fer®en-

  ter. Die ZUehtung ,wird während 96 Stunden bei 30'C unter Bewegen

  mit Hilfe einer Turbine, die mit 285 Upg betrieben wird, und unter

  Hsl(iftuna mit steriler Luft mit einer Rate von 25 aR'/Stunde

  durchgeführt. Der pB-Wert des Medium beträgt dann 8.55 und das

  Volusen der Maische 420 1. Die' vorhandene )kntibiotioua-Nenge be-

  trägt 1820 8/0a9.

  Beispiel 2

  420 l Maische aua der Züchtung von Streptoaqoee venezuel», var.

  fulvufurvesaen's D3 7 103,9 die wie in Beispiel 1 beschrieben herge-

  stellt wurde, werden mit Phosphorsäure in einen Bottich unter

  Rühren auf pH k eingestellt. Nach 1/2-stündigem Hellegen werden

  20 kg Filterhalte (Claroel DIC) zu der Mische zugegeben, und die

  Suspension Wird auf eine Filterpresse gebracht. Nach dem riltrie.

  wen wird der tgyaelkuohen auf dem Filter mit 200 1 Wasser gewaschen.

  Das mit dem Waachxasser vereinigte Filtrat (Gesamtvolumen 5501)

  wird verworfen. Der feuchte Kuchen, dessen tkewioht 113 kg beträgt,

  wird in einem Gemisch von 250 1 Nethanol und 50 1 Wasser in einem

  Bottich unter Rühren suspendiert. Der p8-Wert der Suspension

  wird mit Natronlauge (d = 1,33) auf 7 eingestellt, und das Bewegen

  wird eine Stwlde fortgesetzt. Nach dieser Zeit wird die Suspension

  auf eine Filterpresse gebracht, und der Kuchen wird mit 50 1

  Methanol, das 30o Wasser@enthält, gewaschen.

  Das ausgezogene Nyoel, dessen Gewicht 96 kg beträgt, wird verwor-

  fen. Der Methanolextrakt des Kycels (Gesamtvolumen: 360 1) wird

  unter vermindertem Druck (40 mm Hg) in

  einer Apparatur mit kontinuierlicher RUokfMhrung bis :u einem

  Volumen von 6 1 eingeengt. Das Konzentrat wird dann mit einem Ge-

  misch von 30 :L Äthanol und 40 1 Aceton ausgefällt.

  Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und in einem Vakuum-

  Trockensohrank getrocknet. Man erhält so 'j80 g eines Produkts

  mit einem Gehalt von 515 $/ng.

  Beispiel 3

  "0 g des wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten Antibiotioum

  mit einem Gehalt von 515 E/mg werden in 10 1 destillierten Wasser

  gelegt.

  Die Lösung wird durch eine Schicht Intusorienerde filtriert

  und darm durch eine "Säule (Innendurchmesser: 9 am) geleitet,

  die 6 1 Dcwrex 1 X 2 Harz im Chlorzyklus enthält. Die Säule wird

  naeheinander gewaschen mit:

  destilliertem Wasser, bis der Abflug

  ungefärbt ist 6 1

  Aroeisensäure-ttasser-Gemisah

  (10 zu 90 Volumina) 20 1

  Awis ensäure-Wasser-Methanol-ßemisah

  (10 zu 10 zu 80 Volumina) 20 1

  Methsnol-Wasser-Gemisch

  (80 zu 20 Volumina) 20 1

  Das Antibiotiaum wird dann mit dem Gemisch Methanol-Wasaer

  (80 zu 20 Volumina), versetzt mit 10 gfi an Kaliumahlorid, eluiert.

  Ion samelt Fraktionen von 10 1. Die aktivsten Fraktionen (2 bis 6)

  worden umgruppiert und unter vermindertem Druck bei einer Tempera-

  tur unter 40°C bis zur Erzielung eines Endvolumens von 3 1 einge-

  eri$t.

  Das Konzentrat wird 48 Stunden gegen 44 1 destilliertes Wasser,

  das dreimal erneuert wird, durch eine Cellophanmembran dialysiert.

  um die Salze und verschiedene Verunreinigungen zu entfernen,

  und dann ljophilisiert.

  Man erhält so 27 g gereinigten Antibiotiaum In Form den Kallum-

  salzen mit einem Gehalt von 12 300 E/mg und den folgenden

  phyaikalisch-chemischen Eigenschaften:

  Aussehen: Amorphen, beigerosa, in Wasser leicht lösliches Pulver

  Ultraviolett-Spektrum: Bestimmt mit einer LSsung mit 50 mg/1 in

  Wasser : Absorptionsmaximum bei 255 nm

  (Ei%m = 1o6,5)

  Seine Elementarzusammensetzung ist etwa die folgende:

  C m 46"95d H = 6,65% 0 = 36.9% (durch Differenz)

  9 = 4.5% p = 2,1 5d K = 2,95%

  Beispiel 4

  In einem 170 1-Fermenter stellt man das Impfkulturmedium wie in

  Beispiel 1 beschrieben her. Das Medium, dessen pH-Wert nach der

  Sterilisation 7,0 beträgt, wird mit 200 o« einer gerührten bsw.

  geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des Stammes Streptonyces venezuelae

  var. tlrlvofurvescen DS 11 355 beimpft. Die Kultur wird während

  30 Stunden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen be-

  strlieh der Bewegung, Helurtung und Temperatur entwiokslt.

  Die Froduktionskultur wird in einem 800 1-Fermenter durchgeführt,

  der mit 5U0 1 des in Beispiel 1 beschriebenen Mediums besahiakt

  ist. Diesen Medium, dessen pH-Wert nach der Sterilisation 6,90

  beträgt, wird mit 5 0 1 der obigen Impfkultur aus den 1'j'0 1-Formenter

  beimpft. Nach 99-stUndiger Züchtung unter den für die Züchtung

  von Beispiel 1 angewendeten Bedingungen bezüglich Bewegung, Be-

  lilftung und Temperatur beträgt der pH-Wert des Mediums 8,45

  und das Volumen der Maische 495 1. Die vorhandene Antiblotlcum-

  Menge beträgt 1520 E%oem.

  Beispiel 5

  495 1 der Maische der Züchtung von Streptom7oe$ venezuelae, var.

  fulvoturvenaens DS 11 355 werden wie in Beispiel 2 beschrieben

  behandelt. Man erhält 480 g rohes Antibioticum mit einem Gehalt von

  1U04 $jtwg.

  ßeiepiel 6

  4T0 g den wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellten rohen Anti-

  biottoi,aes wit einem Gehalt von 1000 Ewmg werden wie in Beispiel 3

  behau .!e lt .

  Men erhält dann 14,6 g gereinigtes Antibiotioum in Vorm des

  KAliumsalzes mit einem Gehalt von 19 400 B/ng und den folgenden

  pl"ikalisoh-chemischen Eigensohaftens

  Aumehen: Amorphes, weißliches, in Wasser leichtlösliches

  Pulver.

  Ultraviolett-epektrum: Hestiaamnag mit einer Lösung mit 50 mg/1

  in Wassert Abeorptionsmsacimum bei 256 naa@ (@ m = 120)

  Die! $lementar$usamensetzung ist die folgenäe r

  4% D - 6.35% m - 491% T m 2.33 K m 6,99 0 = 33995%

  (durch Differenz),

Claims (1)

1. P a t e n t a n s p r u o h Verfahren zur Herstellung des Antibiotioums 11 $37 R.P. durch Farmentation@eines Streptouyoes unter den üblichen Bedingungen nach Patent 1 213 569, gekennzeichnet durch die Verwendung der neuen Stämme "StreptonWees venezuelae, var. £ulvoturvesaens D3 7 103" (Mn 335e oder "gtreptomyoes venezuelae, gar. fulvo- furvesaene Ds 11 355" (3355).