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Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Canarius Canarius ist
ein biosynthetisches Produkt, das als Entwicklungsprodukt von Streptomyceten erhalten
wird. Es wirkt sich hemmend auf das Wachstum von verschiedenen Mikroorganismen,
insbesondere Viren, z. B. Vaccinia, den die Newcastle-Krankheit hervorrufenden Virus,
Influenza A und Coe-Viren und verschiedene Hefesorten, wie z. B. Saccharomyces carlsbergcnsis
und Saccharomyces cerevisiae, aus. Die neue Verbindunj kann allein oder zusammen
mit anderen antimikroben Mitteln zur Verhinderung des Wachstums oder Herabsmzung
der Anzahl von in verschiedenen Umgebungen befindlichen Mikroorganismen verwendet
werden. Sie ist z. B. bei der Sterilisation von Gärbrühe und Ale nach der Fermentation
durch Hemmung des Ale-Hefe-Wachstums und der »Bodenhefe«, Sacchüromyces carlsbergensis
oder bei der Verhinderung von Verunreinigungen auf Grund von anderen Fermentationen
durch diese Hefesorten von Wert. Sie ist ferner bei der Herabsetzung oder Beseitigung
von Virusentwicklungen in Gewebekulturzellen von Wert. Sie sind ferner als Rodentizide
zti verwenden.
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Der Mikroorganismus Die gemäß der vorliegenden Erfindung zur Bildung
von Canarius verwendeten Streptomyceten wurden als Streptomyces canarius var. canarius
bezeichnet. Eine ihrer Stammeseigenschaften ist die Bildung von Canarius. Eine Subkultur
dieser Abart kann aus der ständigen Sammlung des Northern Utilization and Research
Division, Agricultural Research Service, US-Department of Artriculture, Peoria,
Illinois, USA, bezogen werden. Ihre Bezugsnummer in diesem Depot ist NRRL 2976.
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In den nachfolgenden Tabellen werden die Ergebnisse der makroskopischen
und mikroskopischen Untersuchungen bei Streptomyces canarius var. canarius wiedergegeben:
Tabelle 1: Erscheinungsbild auf Ektachrom. Tabelle 1I: Assimilation von Kohlenstoff
verbindungen in einem synthetischen Medium.
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Tabelle 111: Kultureigenschaften.
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Tabelle IV-. Mikroskopische Eigenschaften.
| Tabelle 1 |
| Erscheinungsbild von S. canarius var canarius auf Ektachrom''` |
| Agar-Medium Oberfläche Unterseite |
| B e n n e t t Maßgraurosa gelb |
| Sukrose nach C z a p e k blaßgraurosa hellgelb |
| Maltosetrypton blaßgraurosa gelb |
| Pepton-Eisen farblos gelbbraun |
| 0,10/, Tyrosin blaßgraurosa rotbraun |
| Kaseinstärke blaßgraurosa farblos |
| * A. D i e t z, »Ektachrome Transparencies as Aids in Actinomycete
Classification« in »Annals of the N. Y. Academy of |
| Sciences, Bd. 60, S.152 bis 154 (1954). |
| Tabelle 1I |
| Assimilation von Kohlenstoffverbindungen in einem synthetischen
Medium* durch S. canarius var canarius |
| D-Xylose . . . . . . . .. Cellobiose .. .. ... . + Salicin
. . . . . . . . . .. |
| L-Arabinose ...... + Raffinose ........ Na-Format ....... (-) |
| Rhamnose ....... + Dextrin . . . . . . . . . . + Na-Oxalat
. . . . . . . . (-) |
| D-Fructose ....... + Inulin ........... (+) Na-Tartrat .......
(-) |
| D-Galactose ...... + Lösliche Stärke ... + Na-Salicylat ......
- |
| D-Glucose . . . . . . . . + Glycerol . . . . . . . . . Na-Acetat
. . . . . . . . |
| D-Mannose ....... + Ducitol .. ..... ... (-) Na-Citrat ........ |
| Maltose . . . . . . ... . + D-Mannitol ....... Na-Succinat
...... |
| (+) |
| Sucrose .......... + D-Sorbitol ........ (+) Kontrollprobe
.... (-) |
| Lactose .......... + Inositol .......... + |
| + = Positive Assimilation. (-) = Schwaches Wachstum - keine
Assimilation. |
| (+) = Schwaches Wachstum - positive Assimilation. -
= kein Wachstum. |
| " T. G. P r i d h a m und D. G o t t 1 i e b, »Assimilation
of Carbon Compounds in Synthetic Medium, J. Bact., Bd. 56, S. 107 |
| bis 114, Jahrg.1948. |
| Tabelle III |
| Eigenschaften der Kulturen von S. canarius var canarius |
| Medium Luftwachstum Vegetatives Andere Merkmale |
| Wachstum |
| Einfache Gelatine farblos gelbes Pigment, teilweise verflüssigt |
| Synthetische Nitratbrühe farblos bis gelb kein bis gelbes Pigment,
Reduktion |
| bei vier von fünf Rohren |
| Pepton-Eisen-Agar schwach, weiß gelb kein Dunkelwerden durch
H,S |
| Calcium-Malat-Agar schwach, weiß bis grau farblos bis gelb
um das Wachstum Malat löslich |
| gemacht |
| Glukose-Asparagine-Agar Spuren, kremweiß bis grau gelb |
| Magermilch-Agar schwache Spuren, grau farblos bis gelb gelbes
Pigment, kaseinlöslich |
| gemacht |
| Xanthine-Agar schwach, krem bis weiß farblos bis krem gelbe
Pigmentspuren xanthinelöslich |
| gemacht |
| Tyrosine-Agar hell grauweiß bis graurosa gelb gelbes Pigment,
Tyrosine nicht lös- |
| lich gemacht |
| Bennett-Agar grauweiß gelb gelbes Pigment, Wachstum bei 18°C |
| besser als bei 24, 28 und 37°C; |
| kein Wachstum bei 55°C |
| Sukrose-Agar nach grauweiß gelb kein bis hellgelbes Pigment,
Wachs- |
| C z a p e k tum bei 18 und 24°«C besser als |
| bei 28'C |
| Maltose-Tryptone-Agar weiß bis grauweiß gelb gelbes Pigment |
Die Farben von S. canarius var canarius bei dem Agar nach B e n e t t und dem Sukrose-Agar
nach C z a
p e k entsprechen den folgenden Farbtafeln in Color Harmony Manual,
R. J a c o b s e n u. a., 3. Ausgabe, 1948.
| Oberfläche - 2 cb Elfenbeinschattierung |
| Rückseite - 11/a gc staubgelb |
| 2 me senfgelb, altgold |
| Pigment - wie Rückseite |
| Tabelle IV |
| Mikroskopische Kennzeichen von S. canarius |
| var canarius |
| Lichtmikroskop ....... Coremia anwesend |
| Sporenstrukturen zu offenen |
| Schleifen gebogen bis zu |
| Spiralen |
| Elektronenmikroskop |
| berührtes Präparat ... Sporenoberfläche glatt, je- |
| doch leicht unregelmäßig |
| Sporen deutlich, leicht oval |
| zusammengepreßte Enden |
| Kohlerepligraph ..... Sporenoberfläche zeigt feine |
| Details mit Korbstruktur |
| Sporen zusammengepreßt |
Die neue erfindungsgemäße Verbindung wird erhalten, wenn der Entwicklungsorganismus
in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert wird. Es liegt
auf der Hand, daß zur Erzielung von begrenzten Mengen Oberflächenkulturen in Kolben
verwendet werden können. Der Organismus wird in einem Nährmedium kultiviert, das
eine Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle,
z. B. eine assimitierbare
Stickstoffverbindung oder proteinhaltige
Verbindung enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind z. B. Glukose, brauner Zucker,
Sukrose, Glycerol, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und ähnliche Kohlehydratquellen.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind z. B. Maisweichwasser, Hefe, mit Milchfeststoffen
autolysierte Brauereihefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe,
Pankreasdigest von Kasein, bei der Destillation erhaltene lösliche Materialien,
tierische flüssige Peptone, Mehl-und Bohnenrückstände und ähnliche stickstoffhaltige
Quellen. Kombinationen dieser Kohlenstoff und Stickstoffquellen können mit Vorteil
verwendet werden. Spurenmetalle, wie z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen
u. dgl., brauchen den Fermentationsmedien nicht zugesetzt zu werden, da Leitungswasser
und ungereinigte Bestandteile als Medienkomponenten verwendet werden.
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Die erfindungsgemäße Verbindung kann bei einer beliebigen Temperatur
erhalten werden, bei der das Wachstum des Mikroorganismus zufriedenstellend ist,
z. B. bei etwa 18 bis etwa 40°C und vorzugsweise etwa 26 bis etwa 30°C. Gewöhnlich
werden optimale Ausbeuten der Verbindung nach etwa 2 bis 10 Tagen erhalten. Das
Medium bleibt während der Fermentation bei einem fast neutralen oder alkalischen
pH-Wert. Der endgültige pH-Wert hängt teilweise von den anwesenden Puffern, falls
solche verwendet werden, und teilweise von dem anfänglichen pH-Wert des Kulturmediums
ab, das für die Sterilisation mit Vorteil bei etwa 6 bis 8 gehalten wird.
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Entwickelt sich das Wachstum in großen Gefäßen und Tanks, so wird
die vegetative Form des Mikroorganismus der Sporenform für die Inokulierung vorgezogen,
so daß eine ausgesprochene Diskrepanz zwischen der Bildung der neuen Verbindung
und der dabei auftretenden unwirksamen Ausnutzung der Anlage vermieden wird. Es
wird daher vorgezogen, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühenkultur durch
Inokulieren der Brühenkultur mit einer proportionalen Menge einer Boden- oder Schrägkultur
zu bilden. Nachdem auf diese Weise ein junges aktives Inokulum erhalten wurde, wird
es aseptisch auf große Gefäße oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem das vegetative
Inokulum entwickelt wird, kann identisch mit oder verschieden von demjenigen sein,
das für die Herstellung der neuen Verbindung verwendet wird, so lange dabei ein
gutes Wachstum des Mikroorganismus erzielt wird.
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Die neue erfindungsgemäße Verbindung hat die empirische Formel C13Hz1N70s.
Sie ist löslich in Wasser, Dimethylsulfoxyd und Eisessig. Canarius ist in organischen
Lösungsmitteln, beispielsweise Butanol, höheren Alkoholen und Äther, verhältnismäßig
unlöslich.
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Nach einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der neuen erfindungsgemäßen
Verbindung Canarius wird die gesamte Gärbrühenmenge, falls erforderlich, auf einen
oberen neutralen pH-Wert oder einen darunter befindlichen Wert, zweckmäßigerweise
auf einen pH-Wert von 2 bis 8 gebracht, und filtriert. Eine Filterhilfe, beispielsweise
Diatomeenerde, kann verwendet werden. Die klare Brühe wird dann über ein oberflächenaktives,
absorbierendes Mittel, beispielsweise entfärbende Kohle oder ein entfärbendes Harz,
perkoliert, aus dem das absorbierende Material dann mit einem Lösungsmittel, beispielsweise
saurem wäßrigem Aceton, ausgewaschen wird. Geeignete entfärbende Harze, z. B. Permutit
DR, sind in dem USA.-Patent 2 702 263 beschrieben.
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Das in dem Eluat befindliche Material wird einem Flüssigkeit- Flüssigkeit-Extraktionsverfahren
unterworfen, dann zuerst durch Chromatographie getrennt und im Gegenstrom unter
Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme verteilt: Kolonnentrennung Äthylacetat-l-Butanol-Puffer
nach McIlvaine, pH-Wert = 6,0 (6:4:3) Äthylacetat-Puffer nach McIlvaine, pH-Wert
= 6,0 (1 : 1) Verteilung im Gegenstrom 1-Butanol-Wasser (1 : 1) 2-Butanol-Wasser
(1 : 1) Wie in Tabelle V gezeigt wird, ist Canarius gegenüber Hefe aktiv.
| Tabelle V |
| Hemmung des Hefewachstums durch Canarius |
| Konzentration Hemmungs- |
| Hefe von Canarius zone |
| mcg/ccm mm |
| Saccharomyces cerevisiae 1000 22,5 |
| NRRL-Y-628 500 17,75 |
| (Ale-Hefe) 250 15,0 |
| 125 0 |
| 1000 22,0 |
| Saccharomyces 500 18,25 |
| carlsbergensis 250 14,50 |
| 125 0 |
Die neue erfindungsgemäße Verbindung Canarius ist bei der Wachstumsregulierung der
vorstehenden Hefen in vielen Umgebungungen von Wert. Beispielsweise kann Canarius
zur Sterilisation von Gärbrühe nach der Fermentation durch Hemmung des Wachstums
der »Bodenhefe«, Saccharomyces carlsbergensis, verwendet werden.
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Die neue erfindungsgemäße Verbindung Canarius ist gegenüber nichtwachsenden
Zellen in Antivirus-Gewebekulturmedien im wesentlichen nicht toxisch. Sie ist jedoch
gegenüber wachsenden KB-Zellen toxisch. Canarius zeigt in einer in einem Reagenzglas
befindlichen verdünnten Gewebekulturprobe* eine Aktivität von 12,5 KBU/mg. Bei einer
Antitumorprobe** auf einem Blatt wird bei einer Dosis von 200 mcg/ccm eine Hemmungszone
von 121 mm erzielt. * Diese Gewebekulturprobe ist ein Maß für die Hemmung der 'roteinsynthese
in einer KB-Zellen enthaltenden Gewebekultur.
| die Verdünnung |
| von einer Materialeinheit, |
| die zu einer 50o/oigen Hemmung |
| KBU/Materialeinheit - der Proteinsynthese führt |
| (mg oder ccm) 1000 |
** Papierscheiben (12,5 mm), die mit der zu testenden Lösung gesättigt worden waren,
wurden auf Schalen gelegt, die 4. 105 KB epidermoide Carcinomzellen nach Eagle pro
Kubikzentimeter des modifizierten Miyamura Agar enthielten (s. J. E. Grady, W. L.
Lummis und C. G. Smith. Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med., 103. S. 727, 1960). Die
Schalen wurden bei 37° C während 16 Stunden inkubiert, und die Aktivitätszonen auf
den Schalen wurden dadurch festgestellt, daß man das Agar mit einer 0,40/eigen Lösung
von 2,6-Dichlorphenol-indophenol in einem Gemisch von Methanol und Salz (von 1:9,
bezogen auf das Volumen) besprühte. Nach einer Stunde, während welcher Zeit die
nicht betroffenen Zellen einen verringerten blauen Farbstoffgehalt zeigten, erschienen
die Aktivitätszonen dunkelblau gegenüber einem farblosen oder schwachblauen Hintergrund.
Bei
Mäusen führte eine intraperitoneale Dosis von 14 mg/kg Canarius bei
500/,
der Tiere zu einer Abtötung. Bei Ratten führte eine orale Dosis von 79 mg/kg Canarius
zu einer Tötung von 50°/o der Tiere. Canarius hat sich als ein ziemlich einzigartiges
hepatotoxisches Mittel erwiesen. Bei drei Species (Mäusen, Hunden und Cynomolgus-Affen)
führte es bei verhältnismäßig geringen parenteralen Dosen zu einer Fettdegeneration
fast jeder Leberzelle.
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Canarius ist in vitro gegenüber dem Parasiten E. histolytica in einer
Dosis von 200 mcg/ccm wirksam.
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Die nachfolgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren
und die erfindungsgemäßen Produkte; alle Prozentsätze sind, sofern nicht anderweitig
angegeben, auf das Gewicht und alle Mengenanteile von Lösungsmittelgemischen auf
das Volumen bezogen.
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Beispiel 1 A. Fermentation Eine Streptomyces canarius var. canarius,
NRRL 2976, enthaltende Bodenmenge wurde als Inokulum für eine Reihe von 500 ccm
fassenden Erlenmeyer-Kolben verwendet, die jeweils 100 ccm eines sterilen
vorher geimpften Mediums (GS-7) enthielten, das die folgende Zusammensetzung hatte:
Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 g Baumwollsamenmehl . . .
. . . . . . . . . . . . . . 25 g Leitungswasser, bis zur Erzielung von .. 1 1 Die
Kolben wurden bei 28°C während 48 Stunden auf einem mit 260 Umdr./Min. arbeitenden
Rotationsschüttler nach G u m p inkubiert. Der pH-Wert nach der Inkubation betrug
5,0.
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Sechs Schüttelflaschen mit dem oben beschriebenen geimpften Material
(600 ccm) wurden dazu verwendet, um 250 1 eines in einem 380 1 fassenden Tank befindlichen
sterilen Impfmediums (V-2) mit der folgenden Zusammensetzung zu impfen: Glukosemonohydrat
. . . . . . . . . . . . 10 g/l Maisweichwasser . . . . . . . . . . . : . . . 10
g/1 Baumwollsamenmehl . . . . . . . . . . . . 2 g/1 Pepton-Liquor Nr. 159* nach
W i 1 s o n . . . . . . . . . . . . . . . 10 g/1 Specköl .......................
2 ccm/1 Leitungswasser ................. Restmenge * Pepton-Luquor Nr. 159 nach
W i 1 s o n ist ein Präparat aus hydrolysierten Proteinen tierischen Ursprungs.
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Der pH-Wert des Impfmediums vor der Sterilisation lag bei 7,2. Der
Tankinhalt wurde 26 Stunden bei 28°C, einer Belüftung von 1001/Min. und 240 Umdr./
Min. fermentiert.
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12,5 1 des vorstehenden Impfmediums wurden dann dazu verwendet, 250
1 eines in einem 380 1 fassenden Fermentor befindlichen sterilen Mediums mit der
folgenden Zusammensetzung zu inokulieren: Glukosemonohydrat . . . . . . . . . .
. . 20 g/1 Brauereihefe .. . . . .. . .. . . . . . . . .. 2,5 g/1 Sojabohnenmehl
...... . . . . . . . . . . 10 g/1 Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . .
. . . 5 g/1 Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g/1 Calciumcarbonat
. . . . . . . . . . . . . . . 4 g/1 Specköl . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 2 ccm/1 Leitungswasser ................. Restmenge Der pH-Wert des Mediums
für den Fermentor vor der Sterilisation lag bei 6,5. Die Fermentationszeit betrug
dann 112 Stunden, während welcher Zeit die Temperatur bei 28'C gehalten wurde, 100
1 filtrierte Luft pro Minute zugegeben wurden und bei 280 Umdr./ Min. gerührt wurde.
Im Verlauf der Fermentation wurden 3500 ccm Specköl als Antischaummittel zugesetzt.
Bei einer quantitativen Probe wurden nach der 112 Stunden währenden Fermentation
61,5 mcg/ ccm Canarius festgestellt. Der durchschnittliche Feststoffgehalt der Canarius-Fermentationsbrühe
betrug etwa 20 bis 50 mg/cm.
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Analyse der Gewebekultur durch Auspressen des Blattmaterials (s. P.
S i m i n o f f, »A Plaque Suppression Method for the Study of Antiviral Compounds«,
Applied Microbiology, 9, S. 66 bis 72 [l961]) Die vorstehende Fermentation wurde
bis zur Verwendung eines 8000 1 fassenden Fermentors erweitert und diese Fermentation
wurde dann auf folgende Weise vorgenommen. B. Gewinnung Die gesamte Brühe, d. h.
4900 1 aus dem 8000 1 fassenden Fermentator, wurde unter Verwendung von 2,5 °/o
Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wurde mit einem Fünftel
seines Volumens (etwa 9001) Wasser gewaschen, und das Waschwasser wurde zu der klaren
Brühe zugegeben. Die klare Brühe wurde dann durch eine Harzkolonne perkoliert. Die
Kolonne bestand aus 198,17 1 Permutit DR Harz (einem anionischen entfärbenden Polymeren
mit schwachen anionischen Austauscheigenschaften für starke Säuren [s. USA.-Patent
2702263, Spalte 2, Zeilen 62 bis 73]), das mit wäßriger NaOH behandelt und
dann mit Wasser gespült und in ein aus nichtrostendem Stahl bestehendes Rohr mit
einem Innendurchmesser von 20,48 cm gegeben worden war. Die Perkolation durch diese
Kolonne erstreckte sich über 10 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 6 bis 30 1/
Min. und bei einem Druck von 2,1 bis 3,2 kgfqcm. Der pH-Wert der verbrauchten Brühe
lag zu Beginn der Perkolationszeit bei 11,9 und nach Beendigung der Perkolation
bei 6,3. Die Kolonne wurde mit 400 ccm Wasser bei einem pH-Wert von 7,4 gewaschen.
Das Harz wurde dann mit 1001 5°/oigem Aceton in Wasser gewaschen, das mit 2,21 konzentrierter
Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 angesäuert wurde. Jedes wäßrige Acetoneluat
wurde dann zu einer wäßrigen Lösung konzentriert, auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht
und im Kühlschrank getrocknet. Das erste Eluat ergab 286 g Canarius (Präparat WMH-111
D), und das zweite ergab 1667 g Canarius (Präparat WMH-111 E). Ein Teil des Präparates
WMH-111 E (858 s) wurde als Einsatzmaterial für eine Kolonnentrennung verwendet,
die wie folgt vorgenommen wurde: Ein Lösungsmittelsystem aus 6061 Äthylacetat, 4041
1-Butanol und 3031 eines Puffers mit einem pH-Wert von 6,0 nach Me 11 v a
i n e wurde gründlich gemischt und ins Gleichgewicht gebracht. Die beiden Phasen
wurden für den individuellen Gebrauch getrennt. 22 kg Diatomeenerde wurden als Filterhilfe
in 1471 der oberen Phase des vorstehend beschriebenen Systems suspendiert. Zu dieser
Suspension wurden 8,83 1 der unteren Phase zugegeben und das Gemisch, wurde homogenisiert.
Das Gemisch wurde in eine
Kolonne von 35,56 cm gepumpt und mit einem
inerten Gas bei einem Druck von 0,21 kg/qcm abgedeckt. Eine Schicht aus Seesand
wurde oben auf diese Schicht gegeben.
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858 g des Einsatzmaterials (WMH-111 E) wurden in 920 ccm der unteren
Phase und 6,13 1 der oberen Phase gelöst (das Lösungsmittelsystem für das Einsatzmaterial
bestand aus 71 Äthylacetat und 7 1 eines Puffers mit einem pH-Wert von 6,0 nach
Mc 11 v a i n e). Das Einsatzmaterial und das Lösungsmittelgemisch wurden mit 1840
g technisch reinem Supercel (Diatomeenerde-Filterhilfe) homogenisiert und vorsichtig
oben auf die Kolonne gegeben. Die Kolonne wurde mit der oberen Phase des vorstehend
beschriebenen Systems aus Äthylacetat, 1-Butanol und dem Puffer entwickelt. Das
in der Kolonne anwesende Volumen lag bei 90 1, und die Fließgeschwindigkeit in der
Kolonne betrug 1500 ccm/Min. Insgesamt wurden elf Fraktionen erhalten. Die erste
Fraktion bestand aus dem doppelten anwesenden Volumen (1801), während die Fraktionen
2 bis 10 jeweils aus einem Flüssigkeitsvolumen von 901 bestanden und die Fraktion
11 aus 601 bestand. Jede der Fraktionen wurde unter reduziertem Druck bei 50°C zu
einem Feststoff und/oder einem 01 konzentriert. In der folgenden Tabelle wird der
Feststoff Behalt der vorstehenden Fraktionen angegeben:
| Fraktion Feststoffe Gesamtmenge |
| mg!ccm g |
| 1 0,93 167,4 |
| 2 0,4 36,0 |
| 3 0,24 21,6 |
| 4 0,17 15,3 |
| 5 0,12 10,8 |
| 6 0,1 9,0 |
| 7 0,13 11,7 |
| 8 0,08 7,2 |
| 9 0,12 10,8 |
| 10 0,12 10,8 |
| 11 0,11 6,6 |
| Insgesamt ........ ... .. . 307,2 |
Die Fraktionen 3 bis 10 der vorstehenden Kolonne wurden vereinigt und in einem erhitzten
System von 300 ccm 1-Butanol zu 300 ccm Wasser geschüttelt. Nach Herstellung des
Gleichgewichts wurden die Phasen getrennt. Kristallines Material war sowohl in der
1-Butanol-Phase als auch in der wäßrigen Phase zugegen. Die Phasen wurden getrennt,
und die Kristalle wurden abfiltriert, mit dem Lösungsmittel gewaschen, aus dem sie
getrennt wurden, und im Vakuum getrocknet, um die nachfolgenden kristallinen und
flüssigen Canarius-Präparate zu ergeben: 1. Präparat 1 Kristalle aus der wäßrigen
Phase Trockengewicht = 2,8 g UV-Absorptionsmaximum (Wasser) bei 266 m#t,
a=28
UV-Absorptionsmaximum (MeOH) bei 266 m#L, a=27 2. Präparat 2 Filtrat
des Präparats 1 plus Waschwasser Volumen: 620 ccm, pH-Wert 5,9 Gesamtfeststoffgehalt:
53,48 g UV-Absorptionsmaximum (MeOH) bei 265 m#t,
a=41
3. Präparat 3 Kristalle
aus der 1-Butanol-Phase Trockengewicht = 4,4 g UV-Absorptionsmaximum (MeOH) bei
265 m#t,
a=48
4. Präparat 4 Filtrat aus Präparat 3 plus Waschwasser Volumen:
460 ccm Gesamtfeststoffgehalt = 9,2 g kein UV-Absorptionsmaximum bei 265 m#t (Dieses
Präparat wurde verworfen.) C. Reinigung Das vorstehend beschriebene Präparat 1 wurde
in 75 ccm Wasser bei etwa 90°C gerührt, bis das kristalline Material vollständig
gelöst war. Das verbleibende wasserunlösliche amorph erscheinende Material wurde
filtriert und verworfen. Das klare Filtrat wurde im Vakuum bei etwa 50°C auf ein
Volumen von 20 ccm konzentriert. Die Kristallisation begann bald nach dem Einsetzen
der Konzentration. Dann wurde die Lösung über Nacht bei 5°C gekühlt. Die Kristalle
wurden abfiltriert, mit 10 ccm Wasser, dann mit 20 ccm Aceton gewaschen und im Vakuum
auf ein bei Raumtemperatur konstantes Gewicht eingetrocknet. Die getrockneten Canarius-Kristalle
(MEB-76) wogen 2,14 g und hatten im UV-Spektrum (Wasser) ein Maximum bei 265 mu.,
a = 47.
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Die vorstehend beschriebene wäßrige Lösung und die Waschwasser (Präparat
2 mit einem Volumen von 620 ccm) wurden auf 350 cem konzentriert und mit 350 ccm
2-Butanol gemischt. 10 ccm einer jeden Phase wurden in jedes der fünfunddreißig
Rohre eines Gegenstromverteilers nach C r a i g (CCD) gegeben und in 229 Durchgängen
verteilt. Die Rohre 42 bis 66 enthielten kristallines Material. Der Inhalt eines
jeden Rohrs wurde einer UV-Analyse unterworfen, und die Fraktionen 42 bis 102 zeigten
ein Absorptionsmaximum im UV-Bereich bei 266 m#t.Der Inhalt der Rohre 42 bis 102
einschließlich wurde entnommen, und die Kristalle (Präparat MEB-A) wurden aus der
flüssigen Phase (MEB-B) abfiltriert. Die Rohre wurden mit heißem Wasser gespült,
um Kristalle zu entfernen, die an den Wänden klebten. Das Präparat MEB-A wurde in
dem heißen Spülwasser gelöst, die erhaltene Lösung wurde filtriert, im Vakuum auf
20 ccm konzentriert und bei 5°C gekühlt. Die Canarius-Kristalle wurden abfiltriert,
mit Wasser und dann mit Aceton gewaschen und im Vakuum auf ein bei Raumtemperatur
konstantes Gewicht von 3,12 g eingetrocknet (Präparat MEB-79). Dieses Präparat zeigte
ein Absorptionsmaximum im UV-Bereich in Wasser bei 265 m#4, a = 46. Das vorstehend
beschriebene, in flüssiger Phase erhaltene Präparat MEB-B wurde im Vakuum auf 40
ccm konzentriert und über Nacht bei 5'C gehalten. Die Canarius-Kristalle wurden
abfiltriert, mit Wasser und dann mit Aceton gewaschen und im Vakuum auf ein konstantes
Gewicht von 10,0 g (Präparat MEB-78) eingetrocknet. Dieses Präparat zeigte ein Absorptionsmaximum
im UV-Bereich bei 256 m#t, a=45.
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Die Kristalle aus der vorstehend beschriebenen 1-Butanol-Phase (Präparat
3, 4,4 g) wurden 5 Minuten in 150 ccm Wasser bei 90°C suspendiert und heiß filtriert.
Ein 1,59 g wiegendes unlösliches Material
wurde verworfen. Das klare
Filtrat wurde im Vakuum bei 50°C auf ein Volumen von 30 ccm konzentriert, Die Kristallisation
begann bald nach Einsetzen der Konzentration. Das Gemisch wurde über Nacht bei 5°C
gehalten. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit 10 ccm Wasser und dann mit 20 ccm
Aceton gewaschen und im Vakuum auf ein bei Raumtemperatur konstantes - Gewicht von
2,6 g Canarius (Präparat MEB-77) getrocknet. Dieses Präparat hatte ein Absorptionsmaximum
im UV-Bereich in Wasser bei 256 m#t, a = 39. D. Umkristallisation Die kristallinen
Präparate MEB-76, MEB-77 und MEB-78 wurden vereinigt (14,6g) und in 800 ccm Wasser
bei 95°C 30 Minuten suspendiert und filtriert. Das Filtrat wurde 12 Stunden bei
5°C gehalten, nach welcher Zeit die Kristallisation begann. Die Kristalle wurden
durch Filtrieren gewonnen, dann mit 50 ccm Wasser und 50 ccm Aceton gewaschen. Die
Kristalle wurden im Vakuum auf ein bei Raumtemperatur konstantes Gewicht von 11,17
g (Präparat MEB-83) getrocknet. Sie hatten im UV-Bereich ein Absorptionsmaximum
bei 165 m#L, a = 44,6.
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Das kristalline Präparat MEB-83 (11,17 g) und 2 g des kristallinen
Präparates MEB-79 wurden vereinigt und etwa 3 Minuten in 1300 ccm Wasser suspendiert,
das auf 100°C erhitzt worden war. Die Lösung wurde heiß durch einen gesinterten
Glastrichter filtriert und unmittelbar auf 50°C gekühlt. Die Lösung wurde weiter
auf 5°C gekühlt und über Nacht bei dieser Temperatur abgestellt. Die erhaltenen
Kristalle wurden abfiltriert, mit 25 ccm Wasser und dann mit 50 ccm Aceton gewaschen
und dann im Vakuum auf ein bei Raumtemperatur konstantes Gewicht von 10,62 g (Präparat
MEB-84) eingetrocknet, das im UV-Bereich ein Absorptionsmaximum in Wasser bei 265
mix zeigte, a = 47,6.
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E. Gegenstromverteilung der Kristalle nach C r a i g 200 mg des kristallinen
Präparates MEB-84 wurden 2 Stunden in einem warmen Gemisch suspendiert, das aus
einem System von 2-Butanol und Wasser (1 : 1) bestand, wobei jede Phase 90 ccm groß
war. Unlösliche Kristalle wurden abfiltriert, und das geklärte Filtrat wurde in
die Rohre 0 bis 40 der Gegenstromvorrichtung nach C r a i g gegeben und bei tausend
Durchgängen verteilt. Die Inhalte der Rohre 350 bis 400 einschließlich wurden vereinigt,
filtriert und auf ein wäßriges Volumen von 5 ccm konzentriert. Die Lösung ließ man
über Nacht bei 5'C kristallisieren. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit 2 ccm
Wasser und dann mit 5 ccm Aceton gewaschen, das als #analytisch reines Reagenz«
verwendet wurde. Die Kristalle wurden dann im Vakuum auf ein bei Raumtemperatur
konstantes Gewicht von 82 mg Canarius (Präparat MEB-91) getrocknet.
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Chemische und physikalische Eigenschaften von Canarius Canarius hatte
in seiner kristallinen Form die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften
Farbe .............. weiß Schmelzpunkt ....... unbestimmt, >180'C
Elementaranalyse:
C = 38,40 N = 24,05 O = 31,85 °/o Empirische Formel: C"H"N,08 Spezifische optische
Drehung: [a]2D5= -E - 55,4 (c = 0,09 °/o in Wasser) Löslichkeit löslich in Wasser
. . . . . . . . . . . . . etwa 1,0 mg/ccm Dimethylsulfoxyd .... > 100 mg/ccm
Eisessig unlöslich in Aceton 1-Butanol und höhere Alkohole Cyclohexan Äther Ultraviolettspektrum
Die Ultraviolettabsorptionsmaxima liegen für kristallines Canarius, wie in F i g.
2 und 3 der. Zeichnung gezeigt wird, wie folgt: Wasser.... max. bei 264,5
m#t, a = 49,79 0,01 n-HZS04 .. max. bei 272 m#t, a = 50,34 0,01 n-NaOH . . max.
bei 271,5 m#L, a = 45,36 Infrarotspektrum : .
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Das Infrarotabsorptionsspektrum von Canarius, das in einer Nujol-Mühle
suspendiert wurde, wird in F i g. 1 der Zeichnung wiedergegeben. Die folgenden Gipfel
wurden bei den folgenden Wellenlängen ausgedrückt in reziproken Zentimetern festgestellt:
| 3460(S)+ 1673(S) 1240(M) 942(M) |
| 3320(S) 1620(S) 1177(M) 923(M) |
| 3240(S) 1600(S) 1155(M) 893(M) |
| 3120(S) 1537(M) 1130(S) 850(M) |
| 2920 (S) (Öl) 1477(S) 1107(S) 800(M) |
| 2843 (S) (Öl) 1450(S) 1083(S) 770(M) |
| 2720(M) 1400(M) 1068(S) 710 (M) (Öl) |
| 2680(M) 1363(M) 1040(S) |
| 2650(M) 1333(M) 1023(S) |
| 2570(M) 1293(S) 967(M) |
Die Bandintensitäten werden mit »S«, »M< und »W« angegeben und beziehen sich
auf den in der Nachbarschaft der Bänder befindlichen Hintergrund. Ein »S«-Band ist
von gleicher Intensität wie das stärkste Band im Spektrum. »M«-Bänder haben etwa
ein Drittel bis zwei Drittel der Intensität des stärksten Bandes und »W«-Bänder
haben weniger als ein Drittel der Intensität des stärksten Bandes. Die Schätzungen
beruhen auf der prozentualen Durchlässigkeit.
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Titration pKäl, 3,00 : pKä2, 9,61 in Wasser; Molekulargewicht = 394
Andere unterscheidende Merkmale: Optische Drehung der Dispersion - positiv bei 310
bis 589 m#t Magnetische Kernresonanz Wie in F i g. 4 der Zeichnung gezeigt wird,
hat Canarius ein charakteristisches NMR-Spektrum. Das NMR-Spektrum wurde mittels
eines Varian-A-60-Spektrometers bei einer Lösung (etwa 0,5 ccm, etwa
,0,3fach
molare Menge) der Canarius-Probe in denaturiertem Chloroform festgestellt. Das Spektrum
wurde an der Eichtabelle für internes Tetramethylsilan abgelesen, und die Präzision
von d y lag bei > ± 1 Periode je Sekunde. Die Frequenzen wurden von Tetramethylsilan
abwärts in Perioden je Sekunde angegeben.