DK144657B

DK144657B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum c-15003 p-3

Info

Publication number: DK144657B
Application number: DK514378AA
Authority: DK
Inventors: E Higashide; K Hatano; M Asai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-11-18
Filing date: 1978-11-17
Publication date: 1982-05-03
Also published as: DK514378A; ES475178A1; US4228239A; HU179600B; GB2011385B; DK144657C; PL211028A1; DE2849696A1; FR2409307B1; NL7811325A; FR2409307A1; CH640270A5; JPS5473194A; SU1036251A3; IT1206651B; JPS6016236B2; GB2011385A; IT7829922A0; PL122463B1

Description

U4657

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum C-15003 P-3 med formlen H„C XH, 3 \ / 3

CH

CO

Cl CH_ 0 0 I il I °\ CH3°yk / " C\AiX/CH3 %) CH3 1°

/^N^O

^ ^ /h H

CH3 OCH3 ved dyrkning af en mikroorganisme, som hører til den art, hvortil stammen Nocardia nr. C-15003 (IFO 13726) hører, i et dyrkningsmedium, der indeholder assimilerbare carbonkil-der og omsættelige nitrogenkilder.

Antibiotikum C-15003 P-3 forkortes i det følgende til P-3.

De ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendte mikroorganismer frembringer, når de dyrkes i konventionelle dyrkningsmedier, almindeligvis forskellige komponenter af antibiotikum C-15003 samtidigt, se beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 4588/77. Til fraskillelse af den enkelte komponent fra dyrkningsvæsken kræves meget komplicerede processer, som uundgåeligt giver et lavt udbytte af den ønskede komponent.

For at overvinde denne ulempe er der foretaget omfattende undersøgelser især med henblik på specifik udvinding af P-3, og det har vist sig, at P-3 kan produceres i en bemærkelsesværdig stor mængde i forhold til det totale indhold af antibiotikum C-15003, hvis dyrkningsmediet indeholder visse specifikke forbindelser.

2 144657 I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at dyrkningsmediet indeholder valin, iso-smørsyre og/eller derivater deraf.

I sammenhæng med denne opfindelse er udtrykket "antibiotikum C-15003" eller "C-15003" en generisk betegnelse for de fire forbindelser med den følgende almene formel (I) som en gruppe eller en blanding af to eller tre af disse forbindelser eller enhver af disse forbindelser for sig.

CH o X ίΞ3 S i A

ch30yV“c^V\ ks/ CH, V^H3 "λ, (i) 0 ch. och.

3 2 /CH.

(hvori R står for -CO-CHg-CH,, -GO-CK^ 5 , ^"CH.

/CH.

-C0-CH/CHo-CH. eller -00-CHo-CHT p ).

d. d. 5 d \CH

3

Idet der henvises til den almene formel I kaldes den forbindelse, hvori R er -CO-CE^-CH^ her "antibiotikum C-15003 P-2" eller mere kortfattet "P-2", den forbindelse,hvori R CH

er -CO-CH(^ ^ , kaldes her "antibiotikum C-15003 P-3" eller xCH2 5 mere kortfattet "P-3", den forbindelse,hvori R er -CO-C^-CHg-CH^,kaldes heri "antibiotikum C-15003 P-3'" eller mere kortfattet "P-3"', 0g den forbindelse, hvori R er /CH.

-C0-CHo-CRf ^ , kaldes her "antibiotikum C-15003 P-4" ά CH.

3 eller mere kortfattet "P-4". Antibiotikum C-15003 P-2 er den samme forbindelse som maytansinolpropionat, der er beskrevet i Kupehan et al.* s rapport (The Journal of American Chemical 3 U4657

Society _97, 5294 (1975)) med hensyn til elementaranalyse, specifik drejning, absorption af ultraviolet lys, absorption af infrarødt lys, massespektrum m.m.

De mikrobiologiske karakteristika af stamme nr. C-15003 undersøgtes ved metoder, der er analoge til dem, der foreslås af Shirling & Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)). Resultaterne af observationerne ved 28UC i 21 dage er som følger: 1) Morfologiske karakteristika.

Det vegetative mycelium er veludviklet og forgrenet, både på agar og i flydende medium. Mange af hyferne måler 0,8 til 1,2 μ i diameter og kan i visse tilfælde dele sig i fragmenter, som ligner stavformede bakterier eller forgrenede korte hyfestykker. Stammen giver god vækst på forskellige taksonomiske medier, idet luftmyceliet er overlejret på det vegetative mycelium, skønt den ofte danner coremia-lignende legemer (50-200 x 200 - 1000 μ), hvorpå videre vækst i luften finder sted. Mange af luftmycelierne er bugtede, og lige eller løst spirallignende konfiguration træffes ved nogle få lejligheder. Mikroskopisk undersøgelse af ældre kulturer afslører, at de konidielignende celler kun i få tilfælde optræder i kæder, mens de cellesuspensioner, der opnåedes fra overfladerne af sådanne kulturer, ved mikroskopisk undersøgelse viste sig at indeholde mange langstrakt ellipsoide (0,8-1,2 μ x 4-,8-6,8 μ) og ellipsoide (0,8-1,2 x 1,0-2,0 μ) legemer, som lignede arthrosporer.

Elektronmikroskopiske undersøgelser viste, at disse legemer havde glatte overflader.

2) Cellebestanddelene.

Stammen dyrkedes under omrystning i modificeret ISP nr. 1 medium ved 28°C i 66 til 90 timer, hvorefter cellerne opsamledes og skylledes. Ved metoden ifølge B.Becker et al.

(Applied Microbiology 12, 4-21 (1964·)) og metoden ifølge M.P. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine 21, 934 (1968)) undersøgtes de ovennævnte hele celler for diaminopimelinsyre og sukkersammensætning. Førstnævnte 4 144657 viste sig at være meso-formen, mens der påvistes pletter, som svarede til galactose og arabinose.

3) Karakteristika på taksonomiske medier.

Stammen viste forholdsvis god vækst på forskellige medier, idet det vegetative mycelium var farveløst til bleggult i de indledende dyrkningsfaser og lyst gulbrunt til gulbrunt i senere faser. Stammen producerer opløselige pigmenter, gule til gulbrune, i forskellige taksonomiske medier. Luftmyceliet er pulveragtigt og giver generelt moderat vækst, idet det er hvidt til gult eller lyst gulbrunt. Karakteristika for stammen i forskellige taksonomiske medier er opført i tabel 1.

gabel 1 Dyrkningskarakteristika for stamme nr. C-15003 på taksonomiske medier.

(A) Sucrose-nitrat-agar: Vækst (G): Moderat, "Brite Melon Yellow" (3 ia)* til "Amber tan" (3 lc)#, coremialignende legemer damet.

Luftmycelium (AM): Sparsomt, hvidt.

Opløseligt pigment (SP): Intet eller blegt gulbrunt.

(B) Glycerol-nitrat-agar; G: Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)*, coremialignende legemer damet.

AM: Moderat, hvidt.

SP: Intet.

(C) Glucose-asparagin-agar: G: Moderat, "Brite Marigold" (3 pa)* til "Brite Yellow" (2 pa)*.

AM: Sparsomt, hvidt.

SP: "Brite Yellow" (2 pa)*.

5 144657 (D) Glycerol-asparagin-agar: G : Moderat, "Lt Ivery" (2 ca) , coremialignende legemer dannet.

AM: Sparsomt, Irvidt.

SP: Intet.

(E) Stivelsesagar: G : Moderat, "Lt Ivory” (2 ca)* til "Lt Wheat" (2 ea)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Rigeligt, "Lt Ivory" (2 ca)’- .

SP: Intet.

(P) Næringsagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)* til "Colonial

Yellow" (2 ga)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Sparsomt, hvidt.

SP: Intet.

(G) Calcinmmalatagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)* til "Lt Wheat" Ή* (2 ea) , coremialignende legemer dannet.

AM: Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)*.

SP: Intet.

(H) Gærekstrakt-maltekstrakt-agar: G : Moderat, "Amher" (3 lc)* til "Brite Yellow" (3 la) , coremialignende legemer dannet.

AM: Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)*.

SP: Intet.

(I) Havremelagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)* til "Colonial

Yellow" (2 ga)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Sparsomt, hvidt til lysegult.

SP: Intet.

6 UA 657 (J) Pepton-gærekstrakt-j ern-agar: G : Moderat, "Colonial Yellow" (2 ga)*.

1M: Intet.

SP: "Colonial Yellow" (2 gaf'.

(Σ) Tyrosinagar: G : Moderat, "It Ivory" (2 oa)* til "Lt Melon

Yellow" (3 ea)*, coremialignende legemer dannet.

1M: Moderat, hvidt til "It Ivory" (2 ca)*.

SP: "Camel" (3 ie)*.

* Parvekoderne svarer til "Color Harmony Manual", 4th Ed. (Container Corporation of America, 1958).

4) Eysiologiske karakteristika.

De fysiologiske karakteristika af stammen er vist i tabel 2. Temperaturområde for vækst: 12 til 38°C. Temperaturområdet, hvori der optræder god luftvækst på agar (ISP nr. 2), er 20 til 35°C.

Tabel 2 De fysiologiske karakteristika af stamme nr. C-I5OO3.

Temperaturområde for vækst: 12 til 38°C.

Temperaturområde for luftvækst: 20 til 35°C.

Gelatinesmeltning: Positiv.

Hydrolyse af stivelse: Positiv.

Reduktion af nitrater: Positiv.

Peptonisering af mælk: Positiv.

Koagulering af mælk: Negativ.

Dekomposition af kasein: Positiv.

Produktion af melanoide pigmenter:

Negativ (pepton-gærekstrakt-jern-agar),

Positiv (tyrosinagar).

U4657 7

Dekomposition af tyrosin: Positiv.

Dekomposition af xantMn: Negativ.

Dekomposition af bypoxantbin: Negativ

Tolerance overfor lysozym: Positiv.

Tolerance overfor natriumchlorid: 2%.

5) Udnyttelse af forskellige carbonkilder:

Udnyttelsen af forskellige carbonkilder undersøgtes under anvendelse af et medium beskrevet i Pridbam og Gottlieb (Journal of Bacteriology ^6, 107 (1948)) og et basalmedium med samme sammensætning plus 0,1% gærekstrakt. Det resulterende spektrum er vist i tabel 3·

Tabel 3 Udnyttelsen af carbonkilder af stamme nr. C-I3OO3. Carbonkilde Vækst Oarbonkilde Vækst D-Xylose + ++* Raffinose +_ +* L-Arabinose + + Melibiose + + D-Glucose ++ ++ i-Inositol D-Galactose + + D-Sorbitol D-Pructose +++ ++ D-Marmitol ++ ++

Ti-Rhamnose + + Glycerol - +_ D-Mannose +++ ++ Opløselig stivelse + +

Sucrose ++ ++ Kontrol (ingen) lactose - -

Maltose + +

Trehalose + ++ * Basalmedium med 0,1% gærekstrakt tilsat.

Note: +++: Pig vækst +_: Ringe vækst ++: God vækst -: Ingen vækst.

+: Vækst 8 U4S57 6) Andre karakteristika.

Cellerne opsamledes ved den tidligere i 2) teskrevne metode, og MA'et præpareredes analogt med metoden ifølge J. Marmur et al. (Journal of Molecular Biology 208, 1961). G-C (guanin-cytosin)-indiiQldet i DNA'et fandtes at være ca. 71 mol-%.

Gram-farvning af det vegetative mycelium af denne stamme var positiv.

De ovenstående karakteristika for stamme nr. C-15003 sammenlignedes med "beskrivelserne i S.A. Waksman's "The Actino-mycetes Vol. 2" ("The Villiams and Vilkins Co., 1961); R.E. Buchanan og R.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udg., 1974-"; og anden litteratur.

Da denne stamme formodes at høre til gruppe III i slægten Nocardia, og da man ikke fandt arter med de hidtil beskrevne karakteristika blandt de kendte stammer konkluderede man, at denne stamme repræsenterer en ny mikroorganismeart.

Den foreliggende stamme nr. C-I5OO3 er deponeret hos fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (BERM), Japan,under indleveringsnummeret EERM-P nr. 3992; hos The Institute for Bermentation,

Osaka (IBO), Japan,under accessionsnummeret IEO 13726,og hos The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, II.S.A., under accessionsnummeret ATCC-31281.

En mikroorganisme af slægten Rocardia er, ligesom mikroorganismer generelt, tilbøjelige til at undergå variationer og mutationer, enten spontant eller induceret.

De mange varianter af stammen, hvilke varianter er opnåelige ved bestråling med røntgenstråler, gammastråler, ultraviolet lys o.lign., ved isolering af enkelte celler, ved dyrkning på medier indeholdende forskellige kemikalier, eller ved enhver anden mutagen behandling, såvel som de mutanter, der 9 U46B7 spontant afledes af stammen, og hvis egenskaber ikke afviger væsentligt fra de givne karakteristika, og som er i stand til at frembringe C-15003 P-2, P-3, P-3' og/eller P-4, kan udnyttes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Når stamme nr. C-15003 eksempelvis underkastes forskellige mutagene behandlinger, dannes mutanter, som i det væsentlige mangler evnen til at producere opløselige pigmenter, mutanter med substratmycelier, som er farveløse, gulgrønne, rødbrune eller orangerøde, mutanter, hvis hyfer er rede til at fragmen-tere i bacillære elementer eller forgrenede korte hyfefragmenter, og mutanter med rigeligt, hvidt luftmycelium eller i det væsentlige uden luftmycelier.

Valin og/eller isosmørsyre kan, som tilsætningsstoffer ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, anvendes i form af derivater. Eksempler på derivater er estere, såsom · alkylestere med 1 til 2 carbonatomer (f.eks. methylestere og ethylestere) af de ovennævnte forbindelser, amider, såsom amider eller alkylamider med 1 til 2 carbonatomer (f.eks. N-methyl-amider og N-ethylamider), af de ovenstående forbindelser, deres ketosyrer (f.eks. α-ketoisovalerianesyre), salte af de ovennævnte forbindelser, såsom deres hydrochlorider, natriumsalte, kaliumsalte eller calciumsalte. Valin kan anvendes som dets D-form, L-form eller DL-form. De ovennævnte tilsætningsstoffer kan være blandinger af valin, isosmørsyre og/eller deres derivater.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes de ovennævnte stoffer generelt i mediet i en mængde på ca. 0,01 til 1,0% (vægt/vol.), fortrinsvis ca. 0,1 til 0,5% (vægt/vol,), på ethvert tidspunkt under dyrkningen, så længe dyrkningen af Nocar-dia sp. nr. C-15003 finder sted, fortrinsvis under den indledende dyrkningsfase.

Mediet, der anvendes til dyrkningen af en sådan antibiotikum C-15003 P-3-producerende stamme, kan være et hvilket som helst flydende og fast medium, hvis det blot indeholder næringsstoffer, som stammen kan udnytte. Til større produktioner foretræk- 10 144657 kes almindeligvis et flydende medium. Mediet skal indeholde de nævnte tilsætningsstoffer samt carbon- og nitrogenkilder, som stamme nr. C-15003 kan assimilere og omsætte. Desuden kan mediet indeholde uorganisk stof, mikronæringsstoffer og lignende. Som eksempler på carbonkilder kan nævnes glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, stivelse, glycerol, mannitol, sorbitol, fedtstoffer og olier (f.eks. sojabønneolie, svinefedt og hønsefedt). Nitrogenkilderne kan f.eks. være kødsekstrakt, gærekstrakt, tørgær, sojabønnemel, majsstøbevand, pepton, bomuldsfrømel, melasse, urinstof, ammoniumsalte (f.eks. ammoniumsulfat, ammoniumchlorid og ammoniumnitrat) og nitratsalte (f.eks. natriumnitrat og kaliumnitrat). Mediet kan yderligere indeholde salte af natrium, kalium, calcium, magnesium, jern, mangan, zink, cobalt, nikkel og lignende og salte af phosphorsyre, borsyre, m.m. Endvidere kan mediet indeholde vitaminer (f.eks. B^, nicotinsyre, ^^2' C og E), nucleinsyre (f.eks. af purin, pyrimidin og derivater deraf) m.m. Til indstilling af mediets pH kan der f.eks. tilsættes en mineralsyre og/eller et alkali eller ammoniak såvel som de tilsvarende baser som pH-justerende midler.

Endvidere kan olier og fedtstoffer, overfladeaktive midler og antiskummidler sættes til mediet, om ønsket.

Dyrkningen kan gennemføres stationært under omrystning, submers aerobt og under enhver anden dyrkningsbetingelse.

Til større produktioner foretrækkes selvfølgelig submers aerob dyrkning. Selv om dyrkningsbetingelserne naturligvis afhænger af fermentationsbetingelserne og sammensætningen af mediet, den anvendte stamme, dyrkningsmetoden og andre faktorer, foretrækkes det normalt at gennemføre inkubationen ved 20 til 35°0 med et udgangs-ρΞ på ca. 5 , 5-8,5, især ved 23 til 30°C med et udgangs-pH på 6,5 til 755- Da dyrkningstiden også er variabel ifølge de samme faktorer som nævnt ovenfor, er det tilrådeligt at fortsætte dyrkningen, indtil styrken af P-3 bliver maksimal. I tilfælde af 11 144657 en rystekultur eller en aerob submers kultur i flydende medium, er den nødvendige tid normalt fra ca. 48 til 240 timer.

Det følgende er et konkret eksempel på metoden til fremstilling af P-3. Stamme nr. C-15003 inokuleredes i et dyrkningsmedium (i) indeholdende 3% opløselig stivelse, 0,2% ammoniumchlorid,. 0,05% magnesiumsulfat, 1,09% kalium-dihydrogenphosphat, 2,09% dikaliumhydrogenphosphat, 0,001% ferrosulfat og tilsætningsstoffet eller et dyrkningsmedium (II) indeholdende 5% dextrin, 3°/° majsstøhevand, 0,1% pepton, 0,5% calciumcarhonat og tilsætningsstoffet og dyrkedes ved 28°C i 144 timer i en roterende rystemaskine (200 omdr./min.) eller i en fermentor.

Tabel 4 og 5 viser resultaterne under anvendelse af mediet (I) henholdsvis (II).

Styrken af C-15003 prøvedes ved papirskivemetoden med Talaromyces avellaneus IPO 7.721 som prøveorganisme. Prøvemediet bestod af 3,5 g dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g kaliumdihydrogenphosphat, 5 g gærekstrakt (Difco), 10 g glucose, 15 g agar og 1000 ml destilleret vand (pH 7,0). Bestemmelsen af det i dyrkningsmediet akkumulerede P-2, P-3 og P-4 udførtes som følger.

Dyrkningsmediet ekstraheredes med det samme volumen ethyl-acetat. Opløsningsmiddellaget koncentreredes og tørredes.

Det tørrede stof opløstes i ethylacetat til et volumen på 1/100 af dyrkningsmediet. Produkterne elueredes ved silica-geltyndtlagskromatografi (silicagelplade 60F254) med vandmættet ethylacetat. Mængden af antibiotikumet og forholdet mellem komponenterne bestemtes ved hjælp af en "Shimazu Dual-wave length TLC-scanner" model CS-910 på basis af inte-graltætheden af hver plet på kromatogrammet ved 254 nm. Forholdet mellem komponenterne er angivet som vægt/vægt-% i 12 144657 det totale produkt af P-2, P-3 og P-4.

Som vist i tabel 4 og 5 producerede stamme nr. C-15003 antibiotikum P-3 i en mængde på 90fo eller mere af det totale under tilstedeværelse af de specifikke additiver, og 65% eller mindre under fravær af sådanne forbindelser.

Derfor bliver udvindingen af P-3 fra dyrkningsmediet mere effektiv i det førstnævnte tilfælde end i det sidstnævnte.

Tabel 4

Tilsætnings- Tilsæt- Tilsæt- Fortold mellem Total

St°f Sg; S&Jrt *°»®°^terne styrke (.%) (time)* (vægt/vægt-%) ^g/ml) ____P-2 P-3 |P-4_

Intet - - 10 65 25 10 L-valin 0,1 0 1 95 4 16 I-valin 0,3 0 1 97 2 26 I-valin 0,1 72 2 95 3 10 D-valin 0,1 0 2 95 3 16 isotutyrat 0,01 ° ^ 91 8 8 * Tidspunktet 0 betyder, at tilsætningsstoffet sættes til mediet som en af bestanddelene.

13 144657 gabel 5 giisætnings- Tilsæt- Tilsæt- Forhold mellem Total 3t°f S i«p°nei*er røc.

(%) (time)* (vægt/vægt-%) (pg/ml) _____ P-2 P-3 P-4

Intet - - 15 60 25 18 L-valin 0,1 0 5 90 5 15 L-valin__0^3__0__3 94 5 15 L-valin 0,5 0 2 98 2 13 L-valin 0,3 48 3 9^ 3 13? 5 sgw 1 °’? 1 ° å 921 ? I ~ * Tidspunktet 0 har samme "betydning som i noten til tabel 4.

Da P-3, som således produceres i dyrkningsmediet/ er et lipofilt, neutralt stof, kan det bekvemt udvindes fra dyrkningsmediet ved adskillelses- og rensningsmetoder, som normalt anvendes til udvinding af sådanne mikrobielle metaboliter. P-3 ekstraheres let fra kulturfiltratet med med vand ikke blandbare organiske opløsningsmidler, såsom fedtsyreestere, f.eks. ethylacetat og amylacetat; alkoholer, f.eks. butanol; halogenerede carbonhydrider, f.eks. dichlor-methan og chloroform; og ketoner, f.eks. methylisobutylke-ton. Ekstraktionen af P-3 fra filtratet udføres ved et pH nær neutralpunktet, fortrinsvis med ethylacetat ved pH 7* Ekstrakten vaskes med vand og koncentreres under reduceret tryk. Derefter sættes et upolært opløsningsmiddel, såsom petroleumsether eller hexan,til koncentratet og råproduktet, der indeholder de aktive forbindelse, udvindes som et bundfald. Råproduktet underkastes fortløbende passende rensningsmetoder, om ønsket. Som en rutinemæssig rensningsmetode er adsorptionskromatografi således nyttig, og-til dette 14 144657 formål kan anvendes almindelige adsorptionsmidler, såsom silicagel, aktivt aluminiumoxid og makroporøs, ikke-ionisk, adsorberende harpiks. P-3 i råproduktet underkastes silica-gelkromatografi, f.eks. med petroleumsetlier og hexan, og elueres ved tilsætning af et polært opløsningsmiddel, såsom ethylacetat, acetone, ethanol eller methanol, eller et halogeneret.carbohhydrid, såsom dichlormethan eller chloroform, indeholdende et polært opløsningsmiddel, såsom.en alkohol, f.eks·. methanol eller ethanol, en keton, f.eks. acetone eller methylethylketon, eller lignende. På denne måde elueres, fraskilles og udvindes P-3- •hår en makroporøs adsorberende harpiks anvendes til rensning af P-3, udføres elueringen af P-3 fra søjlen med en blanding af vand og en lavere alkohol, en lavere keton eller en ester. Den lavere alkohol kan f.eks. være methanol, ethanol, propanol eller butanol, og den lavere keton kan f.eks. -være acetone eller methylethylketon. Esteren kan f.eks. være ethylacetat eller butylacetat. I en typisk fremgangsmåde opløses råproduktet i 60%'s methanol-vand og adsorberes på en søjle af "Diaion HP-10", som er en non-ionisk makroporøs ionbytterharpiks. Søjlen vaskes med 70%'s methanol-vand, og P-3 elueres med 90%'s methanol-vand.

I den ovenfor beskrevne fremgangsmåde samles fraktionerne, der indeholder P-3, og de koncentreres under reduceret tryk.. Til det tørre produkt sættes 5 til 8 volumen af ethylacetat, og blandingen henstår, hvorefter P-3 udkrystalliseres.

Ifølge den omhandlede fremgangsmåde når produktionsandelen af P-3 i C-15003-produkterne 90% eller mere, og P-3 udvindes let fra dyrkningsmediet.

Den omhandlede fremgangsmåde er derfor meget fordelagtig til en industriel fremstilling af P-3·

De fysisk-kemiske egenskaber af det i eksempel 1 opnåede 15 144657 P-3 er vist i ta"bel 6.

Tabel 6

Antibiotikum C-15003 P-3 C32H43C't,:N209=555 , 169

Smeltepunkt (°C) I90 - 192

Specifik drejning -136°± 10°

ppO

[a]^ (c=0,375 CHCt3)

Elementaranalyse C 60,06 H 7,04

Pundet (%) N 4,33 ___Gi 3,37_

Elementaranalyse C 60,51 H 6,82

Beregnet (%) U 4,41

Ot 5,58

Ultraviolet 233(30250) 240(sii 28450) absorptionsspektrum 252(27640) 280(5750) nm (e) 288(5700) (i metbanol)

Infrarødt 1740, 1730, 1670, 1580 absorptionsspektrum 1445, 1385, 134-0, 1255 (cm-1)KBr 1180, 1150, 1100, 1080 1038 luclearmagnetisk 1,27(d) (3H) resonansspektrum 1,28(d) (3H) (ppm) 100MHz i CDCtj 16 144657

Massespektrum (m/e) 573, 485, 470, 450

Opløseliglied Uopløseligt i petroleums- etlier, hexan og vand.

Lidt opløseligt i "benzen og ether.

Opløseligt i chloroform, ethylacetat, acetone, ethanol, methanol, pyridin, tetrahydrofuran og dimethyl-sulfoxid.

Parvereaktioner Dragendorff: Positiv

Beilsteim Positiv

Den "biologiske aktivitet af P-3 er som følger: A) Antimikrohiel aktivitet:

Med trypticase-soja-agar (BBL) som prøvemedium, undersøgtes de inhibitoriske koncentrationer overfor de nedennævnte mikroorganismer ved papirskivemetoden. Pilterpapirskiver (Toyo Seisakusho, tynd type, 8 mm i diameter), som hver var imprægnerede med 0,02 ml af en 300 pg/mi opløsning af P-3, placeredes på agarplader, der hver især var inokuleret med en af de nedennævnte mikroorganismer. P-3 havde ingen aktivitet mod de følgende bakterier:

Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mira-bilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus,

Klebsiella pneumoniae,Serratia marcescens og Mycobacterium avium.

På den anden side inhiberes væksten af en svamp, Talaromyces avellaneus,af P-3 på en agarplade bestående af 3,5 S dina-triumhydrogenphosphat, 0,5 g monokaliumdihydrogenphosphat, 5 g gærekstrakt (Difco), 10 g glucose, 15 g agar, 1000 mi destilleret vand, pH 7,°. Den minimale inhibitoriske koncentration var 3 pg/W f°r P-3· 144657 17

Endvidere dyrkedes Tetrahymena pyriformis W som prøveorganisme på et prøvemedium, sammensat af 20 g proteose-pepton (Difco), 1 g gærekstrakt, 2 g glucose, 1000 mt destilleret vand og 10 m[, 1 M pbospbatpuffer, pH 7>0, ved 28°C i 44 til 48 timer, og den vækstinhibitoriske aktivitet af P-3 mod denne protozo bestemtes ved seriefortyndingsmetoden. Vækst-inbibition optrådte ved 1 pg/mf,.

P-3 bavde aktivitet mod de følgende mikroorganismer:

Eusicladium levieri, Helminthosporium sigmoidium var. irregulare, Pyricularia oryzae, Cocblioborus miyabeanus, Sclerotinia screrotiorum, Pellicularia sasakii, Trichophyton rubrum, Rhodotorula rubra og

Cryptococcus neoformans.

B) Antitumoraktivitet:

De terapeutiske virkninger af P-3 (indgivet intraperito-nealt i 9 på hinanden følgende dage) på P388-leukæmi bos mus (1 x 105 celler/dyr, mus, intraperitonealt transplanteret) undersøgtes. P-3 bavde en antitumoraktivitet så høj som 168% levetidsforøgelse ved en dosisstørrelse på 0,00625 mg/kg/dag.

C) Toksicitet: I en foreløbig akut-toksicitetstest med mus som forsøgsdyr med intraperitoneal injektion af P-3 viste dette antibiotikum en ID^q-værdi på over 0,313 mg/kg.

Som før nævnt bar P-3 stærk inbibitorisk aktivitet mod fungi og protozoer og er derfor værdifuldt som antifungalt eller antiprotozoisk middel. Da P-3 viser en levetidsforøgende virkning på tumorbærende pattedyr (f.eks. mus), forventes det også, at forbindelsen vil være anvendelig som antitumorlægemiddel .

144657 18 P-3 kan som antifungalt og antiprotozoisk middel med fordel anvendes til en vurdering af den bakterielle økologi i jorden, i aktivt slam, i dyrs legemsvæske eller lignende, således når værdifulde bakterier skal isoleres fra jordprøver, eller når virkningerne af bakterier skal vurderes uafhængigt af den af fungi og protozoer i forbindelse med funktionen og analysen af et aktivt slamanlæg anvendt til behandling af spildevand, idet det foreliggende antibiotikum kan udnyttes til opnåelse af en selektiv vækst af den bakterielle flora uden at tillade vækst af de ledsagende fungi og protozoer i prøven. I et typisk tilfælde sættes prøven til et flydende eller fast medium, og der tilsættes 0,1 mt, af en 10 til 100 pg/mj, opløsning af P-3 i 1%'s methanol-vand pr. mi af mediet, som derefter inkuberes.

P-3 kan også anvendes som antimikrobielt middel til behandling af plantesygdomme forårsaget af de mikroorganismer, der er nævnt i det ovenstående. I den typiske anvendelse bruges P-3 i form af en 1%'s methanolisk vandig opløsning indeholdende 0,5-5 pg/mt af antibiotikumet. P-3 kan f.eks. anvendes til at kontrollere bladpest, helminthosporium bladpletsyge og skedevisnen hos risplanter.

De følgende eksempler skal belyse opfindelsen nærmere, dele er vægtdele, såfremt andet ikke er angivet, forholdet mellem del(e) og volumendel(e) svarer til forholdet mellem g og mt, og % er baseret på vægt/volumen, med mindre andet er angivet.

164657 i 19

Eksempel 1 A.

40 volumendele podningskulturmedium (1,0% glucose, 2,0% bactotrypton og 1,2% bacto-gærekstrakt, pH 7,0) hældes i en 200 volumendeles Erlenmeyerkolbe.

Efter sterilisation inokuleredes Nocardia nr. C-15003 (IFO 13726) i mediet. Det inokulerede medium inkuberedes ved 28°C i en roterende rystemaskine (200 omdr./min.), hvorved der opnåedes en podningskultur.

Cellerne i kulturen vaskedes tre gange med steriliseret, destilleret vand, og de vaskede celler genopslæmmedes i steriliseret, destilleret vand med samme volumen som det oprindelige medium. 1 volumendel af den ovenstående blanding inokuleredes i 40 volumendele hovedkulturmedium bestående af 3% opløselig stivelse, 0,2% ammoniumchlorid, 0,05% magnesiumsulfat, 1,09% kaliumdihydrogenphosphat, 2,09% dikaliumhydrogenphosphat, 0,001% ferrosulfat og 0,1% 1-valin, og hoveddyrkningen udførtes ved 28°C i 8 dage i en roterende rystemaskine (200 omdr./min.).

Den totale produktionsmængde af 0-15003 var 16 pg/mt, og andelen af P-3 heri var 95% (vægt/vægt).

500 volumendele af den under A opnåede podningskultur inokuleredes i en 2.000 volumendeles Sakaguchikolbe og dyrkedes ved 28°C i 48 timer i en frem- og tilbagegående rystemaskine (110 slag/min.), hvilket gav et inokulum. In- 3 okulet overførtes til 100 x 10 volumendele af et medium bestående af 2,0% glucose, 3,0% opløselig stivelse, 1,0% majsstøbevand, 1,0% sojabønnemel, 0,51 polypepton, 0,3% na-triumchlorid og 0,5% calciumcarbonat, pH 7,0, i en 200 x 3 10 volumendeles rustfri stålfermentor.

20 144657

Dyrkningen gennemførtes ved 28°G i 48 timer under gennem-luftning (100 x 10^ volumendele/min.) og omrøring (200 Λ omdr./min.) Dyrkningsmediet (10 x 10J volumendele) overførtes til 100 x lCr volumendele af et fermentationsmedium (5% dextrin, 3% majsstøbevand, 0,1% pepton, 0,3% L-valin og 0,5% calciumcarbonat, (vægt/vol.), pH 7,0) i en 200 x lCr volumendeles rustfri stålfermentor. Dyrkningen gennemførtes ved 28°C i 4 dage under gennemluftning (100 x 10^ volumendele/min.) og omrøring (150 omdr./min.).

Den totale produktionsmængde af C-15003 var 12 μg/m{,, og andelen af P-3 i C-15003 var ca. 98% (vægt/vægt).

3

Til 95 x 10 volumendele af det under B opnåede dyrknings- 3 medium sattes 50 x 10 volumendele acetone. Blandingen omrørtes i 30 minutter. Til den resulterende blanding sattes 3 2 x 10 dele "Hyflo Super-Cel", og blandingen omrørtes godt. Blandingen filtreredes gennem et trykfilter, hvorved der op- 3 nåedes 135 x 10 volumendele filtrat. Til filtratet sattes 3 3 50 x 10 volumendele vand og 90 x 10 volumendele ethylacetat, og blandingen omrørtes og ekstraheredes to gange. De opnåede ethylacetatlag samledes og vaskedes to gange med vand, hver 3 gang med 80 x 10 volumendele. Til det opnåede ethylacetatlag 3 sattes 1 x 10 dele vandfrit natriumsulfat, og blandingen tørredes og koncentreredes til 200 volumendele. Til koncentratet sattes petroleumsether, og det fremkomne bundfald udvandtes ved filtrering, hvilket gav 35 dele af råproduktet.

Til det således opnåede råprodukt sattes 50 volumendele ethylacetat, og blandingen omrørtes. De uopløselige bestanddele fjernedes ved filtrering, og til filtratet sattes 10 dele silicagel (0,05 til 0,2 mm). Efter omrøring af blandingen fjernedes ethylacetatet ved destillation under reduceret tryk.

144657 21

Remanensen anbragtes øverst i en silicagelsøjle (500 volumendele). Antibiotikaerne elueredes trinvis med 500 volumendele n-hexan, 500 volumendele af en "blanding af n-hexan og ethylacetat (3:1), 2.000 volumendele af en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1) og 2.000 volumendele vandmættet ethylacetat, og eluaterne opsamledes i fraktioner på hver 50 volumendele.

1 volumendel af hver fraktion koncentreredes til tørhed, og 0,1 volumendel ethylacetat sattes til koncentratet, hvorved der opnåedes en blanding. Blandingen anbragtes i en plet 2,5 cm fra den nederste kan af en silicagel-glasplade (60 F254, 0,25 mm, 20 x 20) og elueredes ca. 17 cm med vandmættet ethylacetat. Efter eluering gennemførtes påvisning med ultraviolet lys (2537 Å). De aktive fraktioner med Rf 0,42 opsamledes og koncentreredes under reduceret tryk til ca. 2 volumendele. Til dette koncentrat sattes 20 volumendele petroleumsether, hvorved der opnåedes 9,1 dele rå krystaller. De rå krystaller opløstes i 20 volumendele varmt ethylacetat. Efter afkøling udvandtes 0,85 dele P-3 krystaller. Renhedsgraden af de opnåede P-3 krystaller var 97% (vægt/vægt), og smeltepunktet var 189 til 190°C.

?Ll I 400 volumendele 50%'s methanol opløstes 20 dele af det under C opnåede råprodukt. 1.000 volumendele "Diaion-HP-10" anbragtes i en søjle (2,5 cm i diameter) sammen med 3.000 volumendele 50%'s methanol-vand. Den ovenfor fremstillede prøveopløsning sendtes gennem søjlen og vaskedes med 1.000 volumendele 60%'s methanol, og der udførtes kontinuerlig gra-dienteluering under anvendelse af 7.500 volumendele 60%'s methanol-vand og 7.500 volumendele 95%'s methanol-vand.

Eluatet opsamledes i 75 volumendeles fraktioner, og hver fraktion underkastedes silicageltyndtlagskromatografi som beskrevet under C.

22 U4657

De aktive fraktioner nr. 145 til 153 opsamledes og koncentreredes. Til koncentratet sattes 500 volumendele vand og 1.000 volumendele ethylacetat.

Blandingen omrystedes i en skilletragt, og det vandige lag fraskiltes, og efter to ganges vask med 300 volumendele vand tørredes ethylacetatlaget over vandfrit natriumsulfat, koncentreredes og lienstilledes.

De resulterende krystaller af P-3 opsamledes ved filtrering og tørredes (0,880 del P-3)· Renheden af de opnåede P-3-krystaller var 95% (vægt/vægt), og deres smeltepunkt var 188 til 190°C.

Eksempel 2 På samme måde som i eksempel 1 anvendtes methylesteren af valin, N-methylesteren af valin, hydrochloridet af valin, a-ketoisovalerianesyre, methylesteren af isosmørsyre, N-methylesteren af isosmørsyre eller en blanding af valin og isosmørsyre i stedet for L-valin, hvorved der opnåedes lignende resultater, dvs. specifik produktion af det omhandlede P-3.