DE2720088A1

DE2720088A1 - Verfahren zur herstellung von thiazolorifamycinderivaten sowie 25-deacetyl-rifamycin p und -rifamycin q

Info

Publication number: DE2720088A1
Application number: DE19772720088
Authority: DE
Inventors: Renato Cricchio
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1976-05-28
Filing date: 1977-05-05
Publication date: 1977-12-15
Also published as: IE45729B1; AU510254B2; NL181011C; BE855153A; FI62098B; DK149859C; LU77427A1; US4144234A; AU2411077A; FR2366298B1; NO149175B; IL51861A0; DE2720088C2; JPS603316B2; DK149859B; AT350721B; FI771267A; PH16894A; SE439311B; ATA377877A

Description

RECHTSANWÄLTE ADELONSIΚΆ33Ε 58 FRANKFURT AM MAIN

Unsere Nr. 21 051 P/m ^/br

Gruppo Lepetit S.p.A, Mailand/Italien

Verfahren zur Herstellung von Thiazolorifamycinderivaten sowie 25-Deacetyl-rifamycin P und -rifamycin Q

70985070721

-Sf-

Vorliegende Anmeldung betrifft die in den Ansprüchen beschriebenen Gegenstände.

Die beiden Verbindungen der allgemeinen Formel I

HO

(I)

he ο

worin R die Gruppe CH,CO-,und R₁ ein Wasserstoffatom oder die Gruppe -CH₂OH sind, entsprechen den natürlichen Produkten, welche in der BE-PS 832 921 als Rifamycin P und Rifamycin Q bezeichnet werden.

Diese beiden mikrobiologisch aktiven Metaboliten wurden bislang, zusammen mit anderen Naturprodukten, bei der Fermentierung von Stämmen von Nocardia mediterranei erhalten, denen die A.T.CC- Nummern 31 064, 31 065 bzw. 31 066 zugeordnet wurden.

Das erfindungsgemäße chemische Verfahren bietet den Vorteil eines bezüglich der Ausbeuten, des Aufwands und der Produktreinheit zweckmäßigeren Herstellungswegs dieser beiden vorge nannten Produkte. Die beiden Verbindungen der Formel I, worin R ein Wasserstoffatom ist, d.h. die 25-Deacetylderivate von Rifamycin P bzw. Rifamycin Q^sind neue antibakterielle Substanzen,

709850/0721

Bei dem erfindungsgemäßen chemischen Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I wird Rifamycin S der Formel

MC MS

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet, mit einem Cysteinester der allgemeinen Formel II

HS-CHp-CH-COOR. (II)

NH₂

in der R~ eine Alkyl-, Cycloalkyl-, die Phenyl- oder Benzylgruppe ist, oder mit einem Säureanlagerungssalz desselben, wie z.B. einem Hydrohalogenid oder dem Sulfat, umgesetzt.

Unter dem Begriff "Alkylgruppe" wird im vorliegenden ein gerad- oder verzweigtkettiger aliphatischer Rest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen verstanden. Unter denBegriff "Cycloalkylgruppe" ist ein cycloaliphatischer Ring mit 5 bis 8 Ringatomen zu verstehen, welcher wahlweise ein oder zwei niedere Alkylsubstituenten aufweisen kann. Unter dem Begriff "Phenylgruppe" und "Benzylgruppe" werden im vorliegenden sowohl unsubstituierte Phenyl- bzw. Benzylreste als auch solche verstanden, welche mit einem oder zwei Chlor-, Brom- oder Fluoratomen, Nitro-, niedrig-Alkoxy-,

* - 272ÜU88

If

Cyan-, Trifluormethyl-, Sulfamoyl- oder niedrig-Alkyl-sulfonylresten substituiert sind.

Die Reaktionswege des erfindungsgemäßen chemischen Verfahrens sind in nachfolgendem Schema erläutert, in dem R. und R_? die zuvor genannten Bedeutungen besitzen.

709850/0751

272UU88

RO MC

HO K

'Ύ

ne

OH

cn

O —

ι Me

oxidative Cyclisierung

0OR,

!I

OH

milde alkalische. Hydrolyse

(Decarboxylierung) Reduktion

I(^₁= Rifamycin P-Derivat ₁₂

Rifamycin-Q-Derivat

7098B0/07?

Die Verbindungen der alicemeinen Formel I, v/obei R ein Wasserstoffatom bedeutet, können direkt nach dem zuvor beschriebenen Verfahren erhalten werden; sie können jedoch auch durch Hydrolyse der entsprechenden Verbindungen der Formel I, worin R die
Acetylgruppe bedeutet, in einem stark alkalischen Medium hergestellt werden.

Die zu dem Thiazolorifcmycin-Zwischenprodukt der Formel III
führende Reaktion kann sowohl ein- als auch zweistufig ausgeführt werden. Wenn die Umsetzung in zwei Stufen ausgeführt wird,
wird das zur Hervorrufung der oxidativen Cyclisierung erforderliche Oxidationsmittel zum Reaktionsgemisch zugegeben, nachdem die Umsetzung des Cysteinderivats mit dem Rifamycin S als
Reaktionspartner (erste Stufe) abgeschlossen ist. Die erste
Stufe wird durchgeführt, indem man etwa äquimolare Mengen der
beiden Reaktionsteilnehmer in einem organischen Lösungsmittel, welches mit Wasser mischbar ist, wie z.B. einem niederen Alkanol, Dioxan oder Tetrahydrofuran, miteinander in Berührung bringt.
Die Reaktionstemperatur kann zwischen Raumtemperatur und der
Siedetemperatur des Reaktionsgemischs liegen. Die Reaktionszeit hängt im wesentlichen von der Reaktionstemperatur ab; sie wird in der Regel ermittelt, indem man das Verschwinden von Rifamycin S anhand eines Dünnschichtchromatogramms verfolgt. Das
als Zwischenprodukt erhaltene 3-(2-substit.-Ethylthio)-rifamycin SV wird sodann mit einem Oxidationsmittel in Berührung gebracht, um die zweite Reaktionsstufe einzuleiten. Dieses Oxidationsmittel wird gewöhnlich aus einer großen Substanzgruppe ausgewählt, welche Chinone, organische Nitrite, Peroxide, Persulfate, salpetrige Säure, Derivate des vierwertigen Mangans und Bleis, des dreiwertigen Eisens sowie Hg-(II)- und Cu-(Il)-salze umfaßt.

- ίο - > 7 2 U U 8 Β

Beispiele für bevorzugte Oxidationsmittel sind p-Chinon, 2,5-Dimethyl-p-chinon , 2,6-Dimethoxy-p-chinon, Tetrach]cr-pchinon (Chloranil), Dichlordicyan-p-chinon, Tetraniethyl-pbenzochinon, Rifamycin S, Alkylnitrite, Wasserstoffperoxid, Alkalimetallpersulfate , Alkalimetallferricyanide, Kupfer-(II)-acetat, Quecksilber-(II)-acetat und Mangandioxid.

Nach Abschluß der ersten Verfahrensstufe wird das Oxidationsmittel zum Reaktionsgemisch zugegeben, und der pH-Wert wird zwischen 2 und 6,5, vorzugsweise zwischen 4 und 5, insbesondere zwischen 4,2 und 4,8, während des weiteren Reaktionsverlaufs gehalten. Ein geeigneter Weg zur Regulierung des pH-Werts besteht in der Zugabe eines wäßrigen Puffers. Diese zweite Reaktionsstufe, welche als "oxidative Cyclisierung" zu bezeichnen ist, wird vorteilhafterweise bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Siedetemperatur des Reaktionsgemischs durchgeführt. Der Temperaturbereich von etwa 18 bis etwa 45 C ist bevorzugt. Das Fortschreiten der Reaktion wird in der Regel durch Dünnschicht Chromatograph ie (unter Verwendung eines Gemisches von Chloroform und Methanol im Verhältnis 9:1 als Elutionsmittel) verfolgt, da die Bildung des Thiazolorifamycins III leicht als fluoreszierender gelber Fleck mit einem R_-Wert von etwa 0,4 ermittelt werden kann. Wenn die Umsetzung vollständig ist, wird das Gemisch aufgearbeitet, um das Oxidationsmittel oder seine Reaktionsprodukte zu eliminieren. Das hierbei verwendete Verfahren hängt im allgemeinen von der Art des benutzten Oxidationsmittels ab. In der Regel wird filtriert und extrahiert; insbesondere wenn Chinone als Oxidationsmittel verwendet werden, ist es manchmal von Vorteil, das erhaltene Hydrochinonderivat wieder zum ursprünglichen Chinon zu oxidieren und gleichzeitig letzteres mit einem geeigneten Lösungsmittel zu extrahieren. Nach Abtrennung der Nebenprodukte der Umsetzung kann das Thiazolorifamycin III leicht als ein kristallines Produkt gewonnen werden, indem man herkömmliche Verfahren anwendet.

Die zum Zwischenprodukt III führende Umsetzung kann, wenn ein Oxidationsmittel verwendet wird, in einer einzigen Stufe durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß dieses die beiden anderen Reaktionspartner nicht ungünstig beeinflußt. Für diesen Zweck geeignete Oxidationsmittel sind Rifamycin S selbst, oder ein tetrasubstituiertes Chinon, wie z.B. Tetramethyl-p-benzochinon, Chloranil oder Dichlordicyan-p-chinon. Wenn das Verfahren in einer einzigen Stufe durchgeführt wird, werden etwa äquimolare Mengen an Rifamycin S-Substrat und an dem Cysteinester als Reaktionspartner in einem organischen Lösungsmittel gelöst, welches mit Wasser mischbar ist, wie z.B. in einem niederen Alkanol, Dioxan oder Tetrahydrofuran, und zwar in Gegenwart einer zumindest stöchiometrischen Menge eines geeignet ausgewählten Oxidationsmittels. Das Gemisch wird bei einer Temperatur von 18 bis 45⁰C in Gegenwart eines wäßrigen Puffersystems bei einem pH-Wert von 2 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 5» insbesondere

von 4,2 bis 4,8, stehengelassen. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch DünnschichtChromatographie verfolgt, welche ein Verschwinden des als Ausgangsmaterial benutzten Rifamycin S-Derivats und die Anwesenheit des neuen gelben fluoreszierenden Flecks, bedingt durch das Thiazolorifamycin III, zeigt. In der Regel ist die Umsetzung^iach einem Zeitraum von 10 bis 80 Stunden abgeschlossen, und das Gemisch wird aufgearbeitet, um die Nebenprodukte abzutrennen und das Thiazolorifamycin, wie zuvor erwähnt, zu gewinnen.

Der Thiazolorifamycin-Ester III, welcher nach dem zuvor beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wird sodann durch milde alkalische Hydrolyse und nachfolgendes Ansäuern zur Verbindung der Formel I decarboxyliert, in der R₁ ein Wasserstoffatom ist. Geeignete hydrolytische Bedingungen werden durch verdünnte Alkalihydroxide oder Alkalicarbonate eingestellt.

-ψ- 272ÜÜ88

/13

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Zwischenprodukt III in einem Gemisch aus einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel und einer 10$igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung aufgelöst und sodann bei Raumtemperatur 2 oder 6 Stunden stehengelassen. Das Ansäuern mit einer starken Mineralsäure, die Extraktion mit einem, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel,und das Einengen des organischen Extrakts führt zur Verbindung I. Diese Verbindung, bei der/5übstituent R eine Acetylgruppe ist, erwies sich als identisch mit einer Probe von Rifamycin P, welches durch Fermentation nach der BE-PS 832 921 erhalten worden war. Die Identität wurde unter Zugrundelegung physikalisch-chemischer Eigenschaften nachgewiesen, wie z.B. durch den Schmelzpunkt, das chromatographische Verhalten in verschiedenen Lösungsmittelsystemen, die Elementaranalyse, das Massenspektrum, N.M.R.-Spektrum, I.R.- und U.V.-Absorptionsspektrum, das Absorptionsspektrum in sichtbarem Licht sowie ferner durch mikrobiologische Tests.

Das Thiazolorifamycin-Zwischenprodukt III, welches eine Carbcnsäureestergruppe am Thiazolring aufweist, kann mit einem Alkalimetallaluminiumhydrid zum entsprechenden Derivat, welches in der gleichen Stellung eine Hydroxymethylgruppe aufweist, reduziert werden. Für diese Reduktionsstufe können auch andere Reduktionsmittel, welche bekanntermaßen eine identische Wirkung hinsichtlich des Carbonsäureesterrests aufweisen, verwendet werden, wie z.B. AlH,, LiAlH(OCH₅),, überschüssiges NaBH₁₄, /JCH,)₂-CH-CH₂27₂A1H, NaAl(OCH₂-CH₂OCH₃J₃H₃, NaB(OCH₃J₃H oder CaClg/NaBHj.. Das Reaktionsprodukt, d.h. eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R₁ die Gruppe -CH₂OH ist, wird aus dem Reaktionsgemisch leicht abgetrennt, nachdem die überwachung durch Dünnschichtchromatographie ein vollständiges Ver-

709850/015^

272008Ö

schwinden des als Ausgangsmaterial benutzten Thiazolorifamycins zeigte. Das Gewinnungsverfahren ist ein übliches; es bringt eine Verdünnung des Reaktionsgemisches mit Wasser und eine Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel mit sich, woran sich ein Eindampfen des Extrakts auf ein geringes Volumen anschließt. Das so erhaltene Produkt erwies sich in dem Fall, daß der Substituent R eine Acetylgruppe war, identisch mit einer Probe von Rifamycin Q, welches nach dem Fermentationsverfahren gemäß der BE-PS 832 921 erhalten worden war. Die Identität wurde unter Zugrundelegung physikalisch-chemischer Eigenschaften nachgewiesen, wie z.B. durch den Schmelzpunkt, das chromatographische Verhalten in verschiedenen Lösungsmittelsystemen, die Elementaranalyse, das Massenspektrum, das N.M.R,-Spektrura, das I.R,- und U.V.-Absorptionsspektrum sowie das Absorptionsspektrum in sichtbarem Licht.

Worauf bereits weiter oben hingewiesen wurde, können die Verbindungen, bei denen R eine Acetylgruppe ist, leicht in die entsprechenden deacetylierten Derivate durch starke alkalische Hydrolyse übergeführt werden. Geeignete Hydrolysebedingungen sind beispielsweise durch eine wäßrige lOfcige oder noch höher konzentrierte Alkalimetallhydroxidlösung oder durch Alkalimetallalkoholate sowie Hydride gegeben. Diese Hydrolysebedingungen können schon während der Decarboxylierungs- oder Reduktionsstufe angewandt werden, wobei die 25-Deacety!verbindungen der Formel I direkt erhalten werden.

Die nach dein erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Verbindungen sind als antibakterielle Mittel brauchbar. Insbesondere besitzen sie in vitro und in vivo eine sehr hohe antibakterielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven sowie gramnegativen Mikroorganismen, wie z.B. Staphylococcus aureus, Streptococcus haemolyticus, Streptococcus faecalis, Diplococcus pneumoniae, Proteus vulgaris

Ϊ09850/07&1

AS'

und Mycobacteriura tuberculosis.

25-Deacetylrifamycin P, eine neue Verbindung, besitzt in vitro folgende antimikrobielle Wirksamkeit:

Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Tour

Staphylococcus aureus Tour + 3ΟΪ Rinderserum Streptococcus haemolyticus Streptococcus faecalis Diplococcus pneumoniae Proteus vulgaris Escherichia coli Klebsieila pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium tubercolosis H,₇R„

Minimale Hemmungskonzentration (ug/ral)

0,025 0,1

0,05 0,1 0,H 0,1 0,78

6,25 12,5 12,5 0,62

Nachfolgende Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beiepiel 1

Herstellung von Rifamycin P (vgl. Formel I; R=CH₃CO,

= H)

Eine Lösung von 7 g (0,01 Mol) Rifamycin S in 300 ml Methanol und 20 ml eines Puffers vom pH-Wert 4,6 (d.h. eine wäßrige Lösung von Zitronensäure und Na₂HPO₁.«12 H₃O) wurde mit 0,850 g (0,005 Mol) Cysteinmethylesterhydrochlorid versetzt, und die erhaltene Lösung wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur stehenge-

70985070751

lassen, sobald die Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung eines Gemisches von CHCl₃ und CH₃OH im Verhältnis von 9:1 als Elutionsmittel) das Verschwinden des als Ausgangsstoff benutzten Rifamycins S > die Anwesenheit eines neuen Flecks mit einem R_-Wert von etwa O,M und eines durch Rifamycin SV bewirkten Flecks mit einem R_f-Wert von 0,05, neben Spurenmengen von Nebenprodukten, anzeigte. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Liter Wasser verdünnt und sodann mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer Lösung von 6 g Kaliumferricyanid in 500 ml eines Puffers vom pH-Wert 7»38 versetzt,und das Gemisch wurde wenige Minuten zur Oxidation des Rifamycins SV zum Rifamycin S gerührt, welches seinerseits durch Ethylacetat extrahiert wurde. Die vereinten gepufferten Lösungen wurden mit lOXiger Salzsäure angesäuert und sodann mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, wasserfrei gemacht und unter Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt. Das Produkt kristallisierte aus und wurde nach Abkühlen abfiltriert und getrocknet (Ausbeute: 2,¹I g). Diese Verbindung entsprach dem Thiazolorifamycin der Formel III, worin R die Gruppe CH,CO->und R_ die Gruppe CH₃- bedeuten. Die Verbindung hatte folgende Eigenschaften: Schmelzpunkt: I90 bis 2O5°C (Zers.);

Absorptionsbanden im U.V.- und sichtbaren Licht (Puffer vom

pH-Wert 7,38)

^ma* ^Elcm

225 573

295 36H

391 238.

709850/0721

Π-

2 g der nach dem zuvor beschriebenen Verfahren erhaltenen Verbindung wurden in ein'Geraisch von 150 ml Aceton und 100 ml einer lOiigen wäßrigen Natriumcarbonatlösung aufgelöst und 4 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen.

Die Lösung wurde mit lOJiger Salzsäure angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO^ getrocknet und auf ein geringes Volumen eingeengt, wobei das Rifamycin P auskristallisierte. Ausbeute: 1,7 g·
Das Produkt hatte folgende Eigenschaften:

Schmelzpunkt: > 190°C (Zers.);

Elementaranalyse:	) ber.:	C	% H %	N %	lern	S %
*( -PfI f C* ~ H NO <?**	gef.:	61,	77 6,27	3,79	175	4,34
	in Ü.V.-	60,	27 6,35	3,68	292	4,19
Ab s orpt ionsbanden		und	sichtbarem	Licht:	450
Methanol	lcm		0,ln HCl
A max (mu)	176		Λ max (mu)
408	(Schulter)		416
350	314		303
300	349		231
268	424
228

Das vollständige Spektrum ist in Figur 1 dargestellt.

709850/0^51

I.R.-Spektrum:

Die bedeutendsten Absorptionspeaks in Nujol traten bei folgenden Frequenzen (cm ) auf:

3700-3200 (m, br); 3120-3080 (w); 3000-2850 (vs); 1465 (s); 138O (b):Nujol; 1725 (m); 1640 (m, br); 1580 (m); 1520 (m); 1325 (m); 1250 (s,br); 1155 (m)j 1130 (w); 1070 (m,br); 1045 (w); 975 (m); 950 (m); 920 (w); 88O (m); 805 (w); 76O (w); 73O (w).

Die Identität mit durch Fermentation erhaltenem Rifamycin P wurde ferner durch das chromatographische Verhalten in verschiedenen Systemen und durch Massen- sowie N.M.R.-Spektrometrie bestätigt (vgl. Figur 2).

Beispiel 2

Herstellung von Rifamycin P

Eine Lösung von 7 g Rifamycin S in 300 ml Methanol wurde mit 1,8 g des Hydrochlorids des Cysteinmethylesters und 1,53 ml Triethylamin versetzt. Das Geraisch wurde 20 Minuten unter Rückfluß erwärmt und sodann nach Abkühlen in Wasser gegossen. Nach Ansäuern des wäßrigen Gemische wurde es mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, wobei 6 g 3-(2-Amino-2-carbomethoxy-ethylthio)-rifamycin SV erhalten wurden, welches oberhalb l60°C unter Zersetzung schmolz. Die Verbindung wies folgende Eigenschaften auf:

Elementar analyse: C? HH Nil SJ

(für Cu₁H₅₁₁N₂O₁₁₄S) ber.: 59,26 6,55 3,37 3,86

gef.: 57,38 6,51 3,22 3,65.

^09850/0751

Absorptionsbanden im U.V.- und sichtbaren Licht.(Puffer vom pH 7,30):

227 155

318 260

160

8,30 mg des zuvor beschriebenen Produktes wurden in 30 ml Methanol und 2 ml eines Puffers vom pH-Wert ¹1,6 (wäßrige Lösung von Zitronensäure und Na₂HPO₁.·12Η 0) gelöst, wonach die Lösung mit 230 mg Dichlordicyan-p-chinon versetzt wurde. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gemisch eingedampft,und der Rückstand wurde mit Chloroform aufgenommen. Die organische Phase wurde sodann mit einem wäßrigen Puffer vom pH-Wert 8,OM extrahiert. Der wäßrige Puffer wurde nach Abtrennung von der Chloroformphase angesäuert und sodann mit Ethylacetat extrahiert. Beim Eindampfen der Ethylacetatlösung kristallisierte das Thiazolorifamycin-Zwischenprodukt der Formel III (R = CH₅CO, R₃ = CH₃) aus. Ausbeute: 200 mg. Dieses Produkt wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren in Rifamycin P übergeführt. Ferner wurde die Umsetzung wiederholt, wobei man jedoch anstelle von 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-chinon eines der nachfolgenden Oxidationsmittel verwendete: Tetrachlor-p-chinon, Mangandioxid, 2,5-Dimethyl-p-chinon, 2,6-Dimethoxy-p-chinon, Tetramethyl-pchinon sowie p-Chinon. In jedem Falle waren die Ausbeuten der oben angegebenen Ausbeute größenordnungsmäßig gleich.

Beispiel 3

Herstellung von Rifamycin P

Eine Lösung von 7 g Rifamycin S in 200 ml Methanol wurde mit

1,8 g des Hydrochloride des Cysteinmethylesters und 1,53 g Triethylamin versetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten unter Rückfluß erwärmt, wonach 20 ml eines Puffers vom pH-Wert 4,6 und 2,2 g Dichlordicyan-p-chinon zugegeben wurden. Das Gemisch wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei Rifamycin P in einer Ausbeute von 2,8 g erhalten wurde.

Beispiel ¹J

Herstellung von Rifamycin Q (Formel I; R= CH,CO, R₁=CH

Eine gerührte Suspension von 0,5 g LiAlH₁. in 10 ml Tetrahydrofuran wurde bei Raumtemperatur mit 1 g des Zwischenproduktes der Formel III (R = CH₅CO; R₂ = CH₃), gelöst in 25 ml Tetrahydrofuran, versetzt. Nach 10 Minuten zeigte die Dünnschichtchromatographie (Elutionsmittel: Gemisch von CHCl, und CH,OH im Verhältnis von 9:1) die Abwesenheit des als Ausgangssubstanz benutzten Rifamycins und die Anwesenheit eines neuen Flecks mit einem R,.-Wert von 0,¹I an. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser verdünnt, mit lOjiger Salzsäure angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert.

Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₁. getrocknet und auf ein geringes Volumen eingeengt, wobei Rifamycin Q auskristallisierte (Ausbeute: 0,700 g). Die Verbindung kann mit praktisch der gleichen Ausbeute unter Verwendung von 1 g NaBH₁₁ anstelle von 0,5 g LiAlH₁₄ erhalten werden. Das Produkt weist die folgenden Eigenschaften auf:

Schmelzpunkt: 178 bis l80°C (Zers.);

109850/0*751

Elementaranalyse: CJ HX NX SX

(für C₃₉H₁₁₈N₂O₁₂S) ber.: 60,92 6,29 3,64 4,

gef.: 60,69 6,26 3,60 4,16.

Absorptionsbanden im U.V.- und sichtbaren Licht:

^Elcm

176

350 Schulter

300 332

260 384

225 536.

Das vollständige Spektrum ist in Figur 3 dargestellt Infrarotspektrum:

Die wesentlichsten Absorptionspeaks in Nujöl traten bei folgenden Frequenzen (cm ) auf:

37OO-3IOO (s,br); 3O3O-28OO (vs); 1460 (s); 1375 (s); Nujol; 1720 (m); I65O (s,br); I58O (s,br); 1515 (m,br); 1320 (w); 1260 (m); 1240 (m); 1155 (m); 1090 (m); 1065 (m,br); 1020(w); 970 (w); 950 (w); 910 (m); 805 (m); 765 (w); 725 (w).

Die Identität mit durch Fermentation erhaltenem Rifamycin Q wurde ferner bestätigt durch das chromatographische Verhalten in verschiedenen Systemen bzw. durch Massen- und N.M.R.-Spektrometrie. (vgl. Figur 4).

2a

Beispiel 5 Herstellung von 25-De^acetyl-rifamycin P (Formel ^R=H₁R₁=H)

Eine Lösung von 750 mg Rifamycin P in einem Gemisch von 40 ml Aceton und 10 ml Wasser wurde mit 20 ml einer lOJtigen Natronlauge unter Rühren bei 0 bis 5°C versetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann in Eiswasser gegossen, mit verdünnter HCl auf einen pH-Wert von etwa 2 angesäuert und sodann mit Ethylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, in Chloroform aufgenommen und sodann durch Säulenchromatographie an Silicagel (unter Verwendung von CHCl, als Elutionsmittel mit steigenden Anteilen an CH₃OH bis zu 3 %) gereinigt.

Die vereinten einheitlichen Fraktionen wurden zur Trockne eingedampft, wonach der Rückstand nach Auflösung in Ethylacetat durch Zugabe von Petroläther ausgefällt wurde. Ausbeute: 400 mg. Das Produkt hatte folgende Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 172 bis 174°C (Zers.) Elementar analyse: C Ji H K H % S %

(für C₃₆H₁₁₁₁N₂O₁₀S)

ber.:	62	.05	6	.36	4	,02	4	,60
gef. :	61	.98	6	.32	4	.04	4	,56.

Das UV-Spektrum war praktisch identisch mit demjenigen von Rifamycin P.

709850/0^51

In Figur 5 ist das vollständige N.M.R.-Spektrum dargestellt.

Nach dem zuvor beschriebenen Verfahren, jedoch unter Verwendung von Rifamycin Q als Ausgangsmaterial, wurde 25-De^acetylrifamycin Q als Endprodukt erhalten.

Für: Gruppo Lepetit S.p.A, Mailand / Italien

Dr. H.

r.Beil

Rechtsanwalt

709850/0721

Leerseite

Claims

-/ ■ 272008b Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von Thiazolorifamycinderivaten der ^y allgemeinen Formel I

Me Me

Me ο

in der R ein Wasserstoffatom oder die Acetylgruppe, und R ein Wasserstoffatom oder die Gruppe -CHpOH sind, dadurch gekennzeichnet, daß man Rifamycin S oder dessen 25-Deacetylderivat mit einem Cysteinester der allgemeinen Formel

HS-CH₂-CH-COOR₂
NH

worin R₂ eine C₁- bis Cg-Alkylgruppe, eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 8 Ringatomen, die Phenyl- oder Benzylgruppe bedeuten, oder mit einem Säureanlagerungssalz desselben umsetzt, wobei ein 3-(2-substit. Ethylthio)-rifamycin SV-Derivat der allgemeinen Formel t

RO

H0

Me

/teo

CH-CH-COOR N

709860/0751

ORIGINAL INSPECTED

erhalten wird, in der R und R₂ die zuvor genannten Bedeutungen besitzen, dieses Derivat mit einem Oxidationsmittel bei einem regulierten pH-Wert von 2 bis 6,5 in Berührung bringt, und den. so erhaltenenThiazolorifamycincarbonsäureester decarboxyliert oder seinen Carbonsäureesterrest zur Hydroxymethylgruppe reduziert,

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung zwischen dem Rifamycin S-Derivat und dem Cysteinderivat in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur des Reaktionsgemisches durchfuhrt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel ein Chinon, ein organisches Nitrit, Peroxid, Persulfat, salpetrige Säure, ein Derivat des vierwertigen Mangans oder Bleis, ein Derivat des dreiwertigen Eisens oder ein Hg-(II)- oder Cu-(II)-salz verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert auf 4,2 bis 4,8 einstellt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel ein niederes Alkanol, Dioxan oder Tetrahydrofuran verwendet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel p-Chinon, 2,5-Dimethyl-p-chinon, 2,6-Dimethoxy-p-chinon, Tetrachlor-p-chinon, Dichlordicyan-p-chinon, Tetramethyl-p-benzochinon, Rifamycin S, ein Alkylnitrit, Wasserstoffperoxid, ein Alkalimetallpersulfat, Alkalimetallferricyanid, Kupfer-(II)-acetat, Quecksilber-(Il)-acetat oder Mangandioxid verwendet.

7Π9Μ0/0771

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung zwischen dem Rifamycin S-Derivat und dem Cystein derivat sowie das nachfolgende In-Berührung-ßringen des erhaltenen 3-(2-substit. Ethylthio)-rifamycin SV-Derivata mit dem Oxidationsmittel in einer einzigen Verfahrensstufe durchführt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß das Rifamycin S-Derivat mit dem Cysteinderivat in Gegenwart von Tetramethyl-p-benzochinon, Rifamycin S, Chloranyl oder Dichlordicyan-p-chinon als Oxidationsmittel bei einem auf 4,2 bis 4,8 eingestellten pH-Wert umgesetzt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Rifamycin P, dadurch gekennzeichnet, daß man den Thiazolorifamycincarbonsäureester dxirchr eine milde alkalische Hydrolyse und anschließendes Ansäuern decarboxyliert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Rifamycin Q, dadurch gekennzeichnet, daß man den Carbonsäureesterrest des Thiazolor if ame ins mittels NaAlHj₄, LiAlH₁₄, AlH,, LiAlH(OCH,),, überschüssigem NaBH₁₄, [ (CH^CH-CH^^AIH, NaAKOCH^C^OCHj) NaB(OCH₃),Hoder CaCl₂ZNaBH₁₄ als Reduktionsmittel zur Hydroxymethylgruppe reduziert.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Rifamycin P durch alkalische Hydrolyse in das entsprechende 25-Deacetylderivat überführt.

12. 25-Deacetyl-rifamycin P der Formel:

Me.

13. 25-Deacetyl-rifamycin Q der Formel

pt. ο

709850/0721