Zusatzpatent zum Hauptpatent Nr. 426 795 Verfahren zur Herstellung von Retroandrostanderivaten Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in 17-Stellung eine Oxogruppe aufweisenden Retro- steroiden der Androstanreihe. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass man ein 20- Ketosteroid der Retrop.regnanreihe der aeroben enzy matischen Oxydation mittels Fusarium solani unter wirft.
Als Retrosteroide werden im folgenden solche Ster- oide bezeichnet, bei welchen die am C-Atom 10 befind- liehe Methylgruppe die a-Konfiguration und das am C-Atom 9 befindliche Wasserstoffatom (bzw. ein 9- Substituent) die ss-Konfiguration aufweist.
Steroide der Pregnanreihe mit retro-Konfiguration werden dement sprechend im folgenden als Retropregnane bzw. als 9ss,10a-Pregnane bezeichnet. Derartige Retrosteroide
EMI0001.0048
EMI0001.0049
sind z. B. aus, der belgischen Patentschrift Nummer 577 615 bekanntgeworden.
Die erfindungsgemässe Einwirkung der Enzyme von Fusarium solani (z. B. des unter der ATCC Nr. 12 823 registrierten Pilzstammes) auf 20=Ketosterolde der Retropregnanreihe bewirkt den Abbau der 17-Seiten- kette. Bei längerer Enzymeinwirkung kann sich aus dem D-Ring des Ausgangssteroids ein ö-Lactomüng bil den.
So kann z. B. aus, dem 44,E-9ss,l0a-Pregnadien- 3,20-dion (I) (4E-Retroprogesteron) durch Inkubation mit Fusanum solani gemäss nachfolgendem Reaktions- schema das d4,6-9ss,l0a-Androstaden-17ss-ol-3-on (II), das 44>6-9ss, l0a-And'ros,tadien-3,17-dion (III) und das 46-9ss,
10a-Testolakton (IV) erhalten werden. überraschenderweise bewirkt die erfindungsgemässe enzymatische Oxydation von in 1,2-Stellung hydrierten Steroiden der Retropregnanreihe selbst bei längerdau- ernder Inkubation keine nennenswerte Dehydrierung in 1,2-Stellung,
wie dhes in der normalen Reihe der Fall ist.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe können gesättigt sein oder Dop pelbindungen enthalten, beispielsweise in einer oder mehreren der Stllungen 1,4,5,6,7,8,9(11) und 15, vor zugsweise in 4-Stellung und gegebenenfalls einer wei teren Stellung [wie z.
B. zusätzlich in 1-, 6-, 1,6-, 1,6,9- (11)- oder in 6,9(11)-Stelllung]. Die Ausgangsstoffe können ausser der 20- Oxogruppe noch weitere Substi tuenten im Ringsystem oder in der Seitenkette enthal ten.
Beispiele solcher Substituenten sind: Freie oder geschützte Oxogruppen, freie oder geschützte Hy- droxygruppen, Halogenatome (wie Fluor- oder Chlor atome) oder niedere Alkylgruppen. Eine geschützte Oxogruppe ist insbesondere eine ketalisierte Oxogruppe, wie z.
B. die Äthylendloxygruppe. Eine geschützte Hy- droxygruppe ist beispielsweise eine veresterte Hydroxy- gruppe (verestert z.
B. mit einer niederaliphatischen, aromatischen oder heterocyelischen Carbonsäure, wie Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure, Furancarbon- säure) oder eine verätherte Hydroxygruppe, wie die Tetrahydropyranyloxy-,
Benzyloxy- oder Triphenyl- methoxygruppe. Bevorzugte Ausgangsstoffe sind solche 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe, welche in 3- Stellung eine Oxo- oder Hyd'roxygruppe und wenigstens in 4-Stellung eine Doppelbindung aufweisen, wie das 44-9ss,10a-Pregnen-3,20-dion (Retroprogesteron),
und das A4,1,-9ss,l0a-Pregnadien 3,20-dion (d6-Retroproge- steron).
Als Nährmedien für die Züchtung von Fusarium solam können die für die Entwicklung dieses Mikro organismus an sich bekannten Nährlösungen verwendet werden, z. B.
Nährlösungen mit einem Gehalt an einer Stickstoff- und Kohlenstoffquelle sowie anorganischen Salzen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise er wähnt:
Peptone, Maisquellwasser, Sojaprodukte, Hefe extrakte, Aminosäuren, Proteinhydrolysate, Nitrate und Ammoniumsalze. Als Kohlenstoffquellen kommen assi- milierbare Kohlehydrate, wie Glucose, Saccharose, so wie Aminosäuren in Betracht. Es können auch synthe- tische Nährlösungen verwendet werden.
Die Züchtung des erfindungsgemäss für den Selten- kettenabbau eingesetzten Mikroorganismus (Fusarium solani) erfolgt unter aeroben Bedingungen, zweckmässig im Submersverfahren, beispielsweise in Schüttelkultur oder in Fermentern unter Rühren und Belüftung. Zweck mässig arbeitet man wie folgt:
Die Nährlösung wird nach der Sterilisation angeimpft, z. B. mit einer vor gängig hergestellten Schüttelkolben-Kultur oder einer Mycel-Sporensuspension von Fusarium solani und hier auf 6-72 Stunden, vorzugsweise 24-48 Stunden, bei 15A.0 C, vorzugsweise zwischen 24 und 30 C, unter Belüftung geschüttelt bzw. gerührt.
Nach diesem Vor- wachstum erfolgt unter sterilen Bedingungen die Zugabe des zu oxydierenden Retrosteroidg in Form einer Lö sung, z. B. in Aceton, Methanol oder Äthanol. Die In- kubationsdauer kann 1-8 Tage oder auch länger, z. B. bis zu 25 Tagen, betragen.
Der Verlauf der Fermen tation fässt sich durch Entnahme von Proben und deren dünnschichtehromatographische Untersuchung kontrol lieren. Die Isolierung der Verfahrensprodukte kann, nach an sich bekannten Methoden erfolgen, wie Chromato- graphie, Gegenstromverteilung und fraktionierte Kri- stallisation.
Die Verfahrensprodukte können als Zwischenpro- dukte zur Herstellung von Heilmitteln verwendet wer den. Zum Teil sind die Verfahrensprodukte selbst physiologisch aktiv (z.
B. anaboliseh oder antiandrogen). <I>Beispiel 1</I> 4 Liter einer Nährlösung, enthaltend 20 g Saccha- rose, 3 g Hefeextrakt, 1 g Glykokoll, 1 g Natriumnitrat, 1 g primäres Kaliumphosphat, 0,5g Magnesiumsulfat, 0,5g Kaliumchlorid und 10 mg Eisensulfat pro 1000 ml destilliertes Wasser,
werden in einem Schüttelgefäss 45 Minuten bei 120 C sterilisiert. Die Lösung, deren pH- Wert 5,0 beträgt, wird hierauf mit einer Mycel-Sporen- suspension angeimpft, welche ab einer Bierwürze Schrägagarkultur von Fusarium :sol'ani gewonnen wurde. Das Gärgemisch wird unter Belüftung bei 24-28 C mechanisch geschüttelt.
Nach 48 Stunden werden 2 g 44,6-9ss,10-a-Pregnadiern-3,20-dioni-(d6-Retroprogesteron) in 40 ml Aceton zugegeben. Dann wird die Kultur 8 Tage lang unter gleichbleibenden. Bedingungen weiter gezüchtet.
Zwei auf die vorstehend beschriebene Art erhaltene Kulturen werden vereinigt und die Gärbrühe (total 8 Liter) vom Mycel abgetrennt. Die Gärbrühe wird zu nächst mit 8 Litern,
dann noch dreimal reit je 4 Litern Essigester extrahiert. Dass abgetrennte Mycel wird mit 3 Litern Essigester ausgerührt. Die vereinigten Extrakte werden mit einer wässrigen 10 % igen Kochsalzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und schliesslich unter reduziertem Druck eingedampft.
Der öligeRTI ID="0002.0229" WI="37" HE="4" LX="1351" LY="1421"> Eindampfungsrückstand (total 4,6 g) wird in 100 ml Essigester-Benzol (1 : 1) gelöst und mit 5 g Aktivkohle behandelt. Nach Filtiration durch ein Filter aus Diatomeenerde erhält: man eine hellgelbe, klare Lösung, welche auf Grund des Plattenchromatogramms (Systeme Benzol Aceton 7 : 3 und 4 :
1 auf Kieselgel) zur Hauptsache d4,6-9ss,l0a-Androstadien-3,17-dion und 44,6-9ss, l0a-Androstadien17ss-o1-3-on enthält.
Das hellgelbe Filtrat wird nun unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft und im System Ben- zol-Aceton 9 : 1 an 300 ml Kieselgel (Merek 0,05 bis 0,2 mm)
chromatographiert. Es werden 100 Fraktionen zu 10 ml gesammelt. Jede zweite Fraktion wird plat- tenchromatographisch untersucht. Die übereinstimmen- den Fraktionen werden vereinigt und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Die Fraktionen 1-15 enthalten Verunreinigungen in geringer Menge.
Die Fraktionen 16-25 enthalten 1,75 g nahezu reines All;- 9ss, l0a-And'rostadien-3,17-diion. Nach zweimaliger Kri- stallisation aus Methylenchlorid-Methanol-Isopropyl- äther erhält :man diese Substanz in analysenreinem Zu- stand mit dein: Schmelzpunkt 193-196 C;
J max. (U. V.) = 285 my; s = 25 700.
Die Fraktionen 30-34 enthalten 0,21 g 44,6-9ss,10a- Androstadien-17ss-ol-3-on vom Schmelzpunkt 169 bis <B>1711</B> (nach zweimaliger Kristallisation aus Methylen chlorid-Aceton-Isopropyläther). Amax. (U. V.) = 285 my; s = 27 500.
Aus den Fraktionen 26-29 erhält man 0,27 g eines Gemisches der vorgenannten 17-Hyd'roxy- und 17-Keto- verbind'ungen. Das hellgelbe Öl wird in 200 ml Benzol gelöst und mit einem Äquivalent Chromsäure in 50 % iger Essigsäure versetzt.
Das, Gemisch wird 10 Stunden ge- schüttelt, hierauf die organische Phase abgetrennt und diese mit Wasser, dann mit gesättigter Bicarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen, schliesslich über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhält so weitere 0,19 g d-l@',-9/i,10a-And'ros:tadiien 3,17-dion.
<I>Beispiel 2</I> Vier mit Rührwerk versehene Fernenter werden mit je 6 Litern des, im Beispiel 1 beschriebenen Nährmedi- ums unter Zusatz eines Schaumbekämpfungsmittels (Sili- conöl) beschickt.
Nach Sterilisation wird dass Nähr medium mit einer 3 Tage alten Schüttelkolben-Kultur von Fusarium solani angeimpft und die Kultur unter Rühren und Belüften bei 28 C 48 Stunden wachsen gelassen. Es bildet sich dabei bereits eine reichliche Menge Mycel. In jeden Fernenter werden nun 1,5 g 4 ,6-9ss,l0a-Pregnadien-3,20-dion (A6-Retroprogesteron) in. 40 ml Aceton gegeben.
Nach abgeschlossener Um- setzung wird die Fermentation unterbrochen (im vor liegenden Versuch waren für die einzelnen Ansätze In kubationszeiten von 2-6 Tagen für die Umsetzung er forderlich).
Nach Abtrennung des Mycels werden die Gärbrühen gemäss Beispiel 1 extrahiert und aufgearbeitet (die einzelnen Rohextrakte zeigten bei der platttenchro- matographisch.en Prüfung keinerlei Unterschiede be züglich der Zusammensetzung und wurden deshalb ver- einigt). Man erhält 10,
05 g eines gelben 61s, welches an 600 ml Kieselgel chromatographiert wird. Als. Elur ierungsmittel dient Benzol-Aceton 4:1. Es werden Fraktionen zu 25 ml gesammelt.
Die Fraktionen l-26 enthalten Verunreinigungen. Aus dien Fraktionen 28 bis 52 erhält man durch mehrmalige Kristallisation aus Methylenchlorid-Me)thanol-Isopropyläther 495 mg rei nes 44,6-9ss,10a-Androstadien 3,17-dion vom Schmelz punkt 192-195 C.
Aus den Fraktionen 90-105 kön nen durch fraktionierte Kristallisation aus Methylen- chlorid-Methanol und Methylenchloxid-MlthanolIso- propyläther 230 mg reines 44,6-9ss, l0a-Androstadien- 17f ol-3-on vom Schmelzpunkt 168-170 C isoliert werden.
Aus den Mutterlaugen dieser Fraktionen kann durch weitere Kristallisation das dG-9ss,l0a-Tesitolakton isoliert werden. Schmelzpunkt 192-194 C; A max. (U. V.) = 286 mu; e = 25 000.
<I>Beispiel 3</I> 10 Erlenmeyerkolben ä 500 ml werden mit je 100' ml einer Nährlösung der im Beispiel 1 angegebenen Zusam mensetzung beschickt, mit Wattepfropfen verschlossen und bei 120 C 20 Minuten sterilisiert. Dann wird mit einer ab einer :
Schrägagar-Kultlur von Fusarium solani auf Bierwürze-Agar gewonnenen Sporenmycel-Suspen sion angeimpft. Die zur besseren Durchlüftung mit Schikanen versehenen Kolben werden auf einer rotie- renden Schüttehnaschine bei 24-28 C geschüttelt.
Nach 66 Stunden Wachstumszeit werden pro Kolben 20 mg 44-9/3,10a-Pregnen-3,20-dio#n (Retroprogesteron) in 1 ml Aceton unter aseptischen Bedingungen zugegeben. Die dünuschichtchromatographische Kontrolle der Fermen tation nach 24, 48 und 96 Stunden zeigte, dass das ein gesetzte Retroprogesteron schon nach 24 Stunden prak tisch vollständig zum 44-9ss,10a-Androsten-3,17-dion abgebaut wird.
Dasselbe Resultat wird erhalten, wenn man wie oben beschrieben vorgeht, aber eine Nährlösung ver wendet, welche 15 g Pepton, 3 g Trockenrückstand aus Maisquellenwasser und 50 mg Glucose in, 1000 ml Lei tungswasser enthält und mit Natriumhydroxyd auf ein pH von 6,5 eingestellt ist.
<I>Beispiel 4</I> 6 Liter einer Nährlösung (15 g Pepton, 3 g Trocken rückstand aus Maisquellwasser, 50 mg Glucose pro 1000 ml Waliser, mit Natniumhydraxyd auf pH = 6,5 eingestellt)
werden unter Zusatz eines Schaumbekämp- fungsmittels in einem mit Rühren versehenen und beliif- teten Fernenter unter sterilen Bedingungen mit einer 3 Tage alten Schüttelkolben-Kultur von Fus.arnum solani angeämpft. Nach 46stündigem Wachstum.
bei 28 C wer den 1,2 g 44-9ss,10a-Pregnen-3,20-dion (Retroproge- steron), gelöst in 40 ml Aceton, zugegeben. Nach 48 Stunden (End-pH = 4,6) wird die Gärbrühe filtriert und das Filtrat, wie im Beispiel 1 beschrieben, extra hiert.
Der Rohextrakt wird in 60 ml. Aceton gelöst und in der Wärme mit 1,2 g Aktivkohl-, behandelt. Nach Filtration und Eindampfen erhält man 2,28 g eines gel ben Öls. Dieses wird in wenig Benzol gelöst und an 400 ml Kieselgel chromatographiert. Es werden Frak tionen zu 10 ml aufgefangen.
Die Fraktionen 1-116 enthalten insgesamt 780 mg Verunreinigungen. Die Fraktionen 1l7-170 (Benzol-2% Aceton) enthalten 490 mg plattenchromatographissch einheitliches 44-9ss, 10a-Androsten-3,
17-dion. Schmelzpunkt 155-156'C (nach mehrmaliger Umkristallisation aus Methylen- ch'lorid Isopropyläther); A, max. (U. V.) = 241 rau; e = 16 500.
Aus den Fraktionen 186-244 (Benzol-Ace- ton 9 : 1) erhält man 540 mg einheitliches 44-9ss,10ce- Androsten-17ss-o#l#3-on. Schmelzpunkt 154-155 C (aus Methylenchlorid - Isopropyläther); .1 max. (U. V.) _ 241 m,u; e <I>=</I> 16 000.
<I>Beispiel S</I> 1,2 g 44-9ss,10a-Pregnen 3,20-dion (Retroproge- steron) werden, wie im Beispiel 4 beschrieben, jedoch unter Verlängerung der Inkubationszeit auf 7 Tage (nach Steroidzugabe), derRTI ID="0003.0227"WI="22" HE="4" LX="1511" LY="1656"> enzymatischen Oxydation un- terworfen. Dabei erhält man 1,12 g einheitliches 44- 9ss,10a-And'rosten-3,17-d'ion (aus,
der Gärbrühe konnte bei diesem Versuch kein 44-9ss,10a-Androsten 17ss-ol- 3-on isoliert werden).