DE1228256B - Verfahren zur Herstellung von 17-oxygenierten Retrosteroiden der Androstanreihe - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESGHRIFT

Int. CL:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C07c

Deutsche Kl.: 12 ο-25/04

1228256
H52508IVb/12o
27. April 1964
10. November 1966

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Retrosteroiden der Androstanreihe, die am C-Atom 17 Sauerstoff enthalten, insbesondere eine Hydroxy- oder Oxogruppe. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein in 1,2-Stellung gesättigtes 20-Ketosteroid der Retropregnanreihe der aeroben enzymatischen Oxydation mittels Fusarium solani in an sich bekannter Weise unterwirft.

Als Retrosteroide werden im folgenden solche Steroide bezeichnet, bei welchen die am C-Atom 10 befindliche Methylgruppe die α-Konfiguration und das am C-Atom 9 befindliche Wasserstoffatom (bzw. ein 9-Substituent) die /9-Konfiguration aufweist. Steroide der Pregnanreihe mit Retro-Konfiguration werden dementsprechend im folgenden als Retropregnane bzw. als 9/J,10a-Pregnane bezeichnet. Derartige Retrosteroide und ihre Herstellung sind z. B. aus den bekanntgemachten Unterlagen des belgischen Patents 577 615 bekanntgeworden.

Die erfindungsgemäße Einwirkung der Enzyme von Fusarium solani (z. B. des unter der ATCC-Nr. 12823 registrierten Pilzstammes) auf in 1,2-Stellung gesättigte 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe bewirkt den Abbau der 17-Seitenkette unter Ausbildung einer 17-Hydroxy- oder einer 17-Oxogruppe. Bei längerer Enzymeinwirkung kann sich aus dem D-Ring des Ausgangssteroids ein ö-Lactonring bilden. So kann verfahrensgemäß z. B. aus dem /)⁴-⁶-9^,10a-Pregnadien-3,20-dion (I) (J⁶-Retroprogesteron) durch Inkubation mit Fusarium solani gemäß nachfolgendem Reaktionsschema das J⁴·⁶ - 9ß,10a - Androstadien-17/3-ol-3-on (II), das zd⁴.⁶-9/3,10a-Androstadien-3,17-dion (III) und das J⁶-9/?,10a-Testolacton (IV) erhalten werden. ^_TT

(I)

(Π) Verfahren zur Herstellung von 17-oxygenierten
Retrosteroiden der Androstanreihe

Anmelder:

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr. G. Schmitt, Rechtsanwalt,
Lörrach (Bad.), Friedrichstr. 3

Als Erfinder benannt:

Elisabeth Becher, Basel;

Dr. Hans Els, Binningen;

Dr. Andor Fürst,

Gisela Gross, Basel;

Dr. Pierre Reusser, Riehen (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 22. Mai 1963 (6407)

H₃C

(III)

H₃C

(IV)

überraschenderweise bewirkt die erfindungsgemäße enzymatische Oxydation von in 1,2-Stellung hydrierten 20-Ketosteroiden der Retropregnanreihe selbst bei längerdauernder Inkubation keine nennenswerte Dehydrierung in 1(2)-Stellung, wie dies in der normalen Reihe der Fall ist.

Dje als Ausgangsstoffe verwendeten 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe können vollständig gesättigt sein oder Doppelbindungen enthalten,

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beispielsweise in einer oder mehreren der Stellungen 4, 5, 6, 7, 8, 9(11) und 15, vorzugsweise in 4-Stellung und gegebenenfalls einer weiteren Stellung (z. B. zusätzlich in 6-, 1,6-, 1,6,9(11)- oder in 6,9(11)-Stellung). Die Ausgangsstoffe können außer der 20-Oxogruppe noch weitere Substituenten im Ringsystem oder in der Seitenkette enthalten.· Beispiele solcher Substituenten sind: freie.oder geschützte Oxogruppen, freie oder geschützte Hydroxygruppen,/Halögenatome (wie Fluor- oder Chloratome) oder niedere Alkylgruppen. Eine geschützte Oxogruppe ist insbesondere eine ketalisierte Oxogruppe, wie z. B. die Äthylendioxygruppe. Eine geschützte Hydroxygruppe ist beispielsweise eine veresterte Hydroxygruppe (verestert z. B. mit einer niederaliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, wie Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure, Furancarbonsäure) oder eine verätherte Hydroxygruppe, wie die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Triphenylmethoxygruppe. Bevorzugte Ausgangsstoffe sind solche 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe, welche in 3-Stellung eine Oxo- oder Hydroxygruppe und wenigstens in 4-Stellung eine Doppelbindung aufweisen, wie das /l⁴-9/9,10a-Pregnen-3,20-dion (Retroprogesteron) und daszl⁴'⁶-9/S,10a-Pfegnadien-3,20-dion (zl⁶-Retroprogesteron).

Als Nährmedien für die Züchtung von Fusarium solani können die für die Entwicklung dieses Mikroorganismus an sich bekannten Nährlösungen verwendet werden, z. B. Nährlösungen mit einem Gehalt an einer Stickstoff- und Kohlenstoffquelle sowie anorganischen Salzen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise erwähnt: Peptone, Maisquellwasser, Sojaprodukte, Hefeextrakte, Aminosäuren, Proteinhydrolysate, Nitrate und Ammoniumsalze. ' Als Kohlenstoffquellen kommen assimilierbare Kohlehydrate, wie Glukose, Saccharose, sowie Aminosäuren in Betracht. Es können auch synthetische Nährlösungen verwendet werden.

Die Züchtung des erfindungsgemäß für den' Seitenkettenabbau eingesetzten Mikroorganismus (Fusarium solani) erfolgt unter aeroben Bedingungen, zweckmäßig im Submersverfahren, beispielsweise in Schüttelkultur oder in Fennentern unter Rühren und Belüftung. Zweckmäßig arbeitet man wie folgt: Die Nährlösung wird nach der Sterilisation angeimpft, z. B. mit einer vorher hergestellten Schüttelkolbenkultur oder einer Mycel-Sporensuspension von Fusarium solani und hierauf 6 bis 72 Stunden, vorzugsweise-24 bis 48 Stunden, bei 15 bis 40⁰C, vorzugsweise zwischen 24 und 30⁰C, unter Belüftung geschüttelt bzw. gerührt. Nach diesem Vorwachstum erfolgt unter sterilen Bedingungen die Zugabe des zu oxydierenden Retrosteroids in Form einer Lösung, z. B. in Aceton, Methanol oder Äthanol. Die Inkubationsdauer kann 1 bis 8 Tage oder auch langer, z.B. bis zu 25 Tagen,'betragen. Der Verlauf der Fermentation läßt sich durch Entnahme von Proben und deren dünnschichtchromatographische Untersuchungkontrollieren. Die Isolierung der Verfahrensprodukte kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, wie Chromatographie, Gegenstromverteilung, und fraktionierte Kristallisation,
. Die Verfahrensprodukte können als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln verwendet werden; Zum Teil sind die Verfahrensprodukte selbst physiologisch aktiv (z. B. anabolisch oder 'antiandrogen). ,

B ei s ρ ieF'l ' .- -

41 einer Nährlösung, enthaltend 20 g Saccharose, 3 g Hefeextrakt, 1 g Glykokoll, 1 g Natriumnitrat, Ig primäres Kaliumphosphat/ 0,5g Magnesiumsulfat, 0,5 g Kaliumchlorid und 10 mg Eisensulfat pro 1000 ml destilliertes Wasser, werden in einem Schüttelgefäß 45 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Die Lösung, deren pH-Wert 5,0 beträgt, wird hierauf

ίο mit einer Mycel-Sporensuspension angeimpft, welche aus einer Bierwürze-Schrägagarkultur von Fusarium solani gewonnen wurde. Das Gärgemisch wird unter Belüftung bei 24 bis 28 ⁰C mechanisch geschüttelt. Nach 48 Stunden werden 2 g zI⁴«⁶-9/S,10a-Pregnadien-3,20-dion (zl⁶-Retroprogesteron) in 40 ml Aceton zugegeben. Dann wird die Kultur 8 Tage unter gleichbleibenden Bedingungen weiter gezüchtet.

Zwei auf. die vorstehend beschriebene Art erhaltene Kulturen werden vereinigt und die Gärbrühe (total

81) vom Mycel abgetrennt. Die Gärbrühe wird zunächst mit 8 1, dann noch dreimal mit je 41 Essigester extrahiert. Das abgetrennte Mycel wird mit 3 1 Essigester ausgerührt. Die vereinigten Extrakte werden mit einer wäßrigen 10%igen Kochsalzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und schließlich unter reduziertem Druck eingedampft.

Der ölige Eindampfungsrückstand (total 4,6 g)

wird in 100 ml Essigester—Benzol [1 : 1] gelöst und mit 5 g Aktivkohle behandelt. Nach Filtration durch einen Filter aus Diatomeenerde erhält man eine hellgelbe, klare Lösung, welche auf Grund des Plattenchromatogramms (System Benzol—Aceton [7 : 3] und [4 : L] auf Kieselgel) zur Hauptsache Δ⁴-⁶ - 9/3,1Oa - Androstadien - 3,17 - dion und d⁴.⁶-9/5,10a-Androstadien-17/?-ql-3-on enthält.

Das hellgelbe Filtrat wird nun unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft und im System Benzol—Aceton [9 : 1] an 300ml Kieselgel (Merck, 0,05 bis 0,2 mm) chromatographiert. Es werden 100 Fraktionen zu 10 ml; gesammelt. Jede zweite Fraktion wird plattenchromatographisch untersucht. Die übereinstimmenden Fraktionen werden vereinigt und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Die Fraktionen 1 bis 15 enthalten Verunreinigungen in geringer Menge. Die Fraktionen 16 bis 25 enthalten 1,75 g nahezu reines J⁴'⁶-9^,10o-Androstadien-3,17-dion. Nach zweimaliger Kristallisar tion aus Methylenchlorid—Methanol—Isopropyläther erhält man diese' Substanz in analysenreinem Zustand mit dem Schmelzpunkt 193' bis 196° C; λπιαχ (UV) = 285 πΐμ; ε = 25 700.

Die Fraktionen 30 bis 34 enthalten 0,21 g Δ⁴·⁶-9β, 10a-Androstadien-17/?-ol-3-on vom Schmelzpunkt 169 bis 171⁰C (nach zweimaliger Kristallisation aus Methylenchlorid — Aceton — Isopropyläther). X_ma,x (UV) = 285 πΐμ; ε = 27 500.

Aus den Fraktionen 26 bis 29 erhält man 0,27 g eines Gemisches der vorgenannten 17-Hydroxy- und 17-Ketoverbindungen. Das hellgelbe Ol wird in 200 ml Benzol gelöst und mit einem Äquivalent Chromsäure in 5%iger Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird 10 Stunden geschüttelt, hierauf die organische Phase abgetrennt und diese mit Wasser, dann mit gesättigter Bicarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen, schließlich über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhält so weitere 0,19 g /l⁴-⁶-9;S,10a-Androstadien-3,17-dion.

B eisp iel 2

Vier mit Rührwerk versehene Fermenter werden mit je 61 des im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums unter Zusatz eines Schaumbekämpfungsmittels (Siliconöl) beschickt. Nach Sterilisation wird das Nährmedium mit einer 3 Tage alten Schüttelkolbenkultur von Fusarium solani angeimpft und die Kultur unter Rühren und Belüften bei 28 ⁰C 48 Stunden wachsen gelassen. Es bildet sich dabei bereits eine reichliche Menge Mycel. In jeden Fermenter werden nun 1,5 g zl⁴'⁶-9/UOa-Pregnadien-3,20-dion (zl⁶-Retroprogesteron) in 40 ml Aceton gegeben. Nach abgeschlossener Umsetzung wird die Fermentation unterbrochen (im vorliegenden Versuch waren für die einzelnen Ansätze Inkubationszeiten von 2 bis 6 Tagen für die Umsetzung erforderlich). Nach Abtrennung des Mycels werden die Gärbrühen nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert und aufgearbeitet (die einzelnen Rohextrakte zeigten bei der plattenchromatographischen Prüfung keinerlei Unterschiede bezüglich der Zusammensetzung und wurden deshalb vereinigt). Man erhält 10,05 g eines gelben Öls, welches an 600 ml Kieselgel chromatographiert wird. Als Eluierungsmittel dient Benzol—Aceton [4 : I]. Es werden Fraktionen zu 25 ml gesammelt. Die Fraktionen 1 bis 26 enthalten Verunreinigungen. Aus den Fraktionen 28 bis 52 erhält man durch mehrmalige Kristallisation aus Methylenchlorid—Methanol—Isopropyläther 495 mg reines zH-^&lOa-Androstadien-3,17-dion vom Schmelzpunkt 192 bis 195°C. Aus den Fraktionen 90 bis 105 können durch fraktionierte Kristallisation aus Methylenchlorid—Methanol und Methylenchlorid—Methanol—Isopropyläther 230 mg reines d⁴>⁶-9^,10a-Androstadien-17/?-ol-3-on vom Schmelzpunkt 168 bis 170⁰C isoliert werden. Aus den Mutterlaugen dieser Fraktionen kann durch weitere Kristallisation das J⁶-9/?,10a-Testolacton isoliert werden. Schmelzpunkt 192 bis 194° C; λνιαχ (UV) = 286 Πΐμ; ε = 25 000.

B e i s ρ i el 3

Zehn Erlenmeyerkolben (je 500 ml) werden mit jeweils 100 ml einer Nährlösung der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung beschickt, mit Wattepropfen verschlossen und bei 120° C 20 Minuten sterilisiert. Dann wird mit einer aus einer Schrägagarkultur von Fusarium solani auf Bierwürze-Agar gewonnenen Sporenmycelsuspension angeimpft. Die zur besseren Durchlüftung mit Schikanen versehenen Kolben werden auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 24 bis 28° C geschüttelt. Nach 66 Stunden Wachstumszeit werden pro Kolben 20 mg zl^&lOa-Pregnen-S^O-dion (Retroprogesteron) in 1 ml Aceton unter aseptischen Bedingungen zugegeben. Die dünnschichtchromatographische Kontrolle der Fermentation nach 24, 28 und 96 Stunden zeigte, daß das eingesetzte Retroprogesteron schon nach 24 Stunden praktisch vollständig zum A⁴-9ß, 10a-Androsten-3,17-dion abgebaut ist.

Dasselbe Resultat wird erhalten, wenn man wie oben beschrieben vorgeht, aber eine Nährlösung verwendet, welche 15 g Pepton, 3 g Trockenrückstand aus Maisquellwasser und 50 mg Glukose in 1000 ml Leitungswasser enthält und mit Natriumhydroxyd auf ein pH von 6,5 eingestellt ist.

Beispiel 4

61 einer Nährlösung (15 g Pepton, 3 g Trockenrückstand aus Maisquellwasser, 50 mg Glukose pro 1000 ml Wasser, mit Natriumhydroxyd auf pH = 6,5 eingestellt) werden unter Zusatz eines Schaumbekämpfungsmittels in einem mit Rührer versehenen und belüfteten Fermenter unter sterilen Bedingungen mit einer 3 Tage alten Schüttelkolbenkultur von Fusarium solani angeimpft. Nach 46stündigem Wachstum bei 28°C werden 1,2 g zl⁴-9/S,10a-Pregnen-3,20-dion (Retroprogesteron), gelöst in 40 ml Aceton, zugegeben. Nach 48 Stunden (End-pH = 4,6) wird die Gärbrühe filtriert und das Filtrat, wie im Beispiel 1 ■beschrieben, extrahiert. Der Rohextrakt wird in 60 ml Aceton gelöst und in der Wärme mit 1,2 g Aktivkohle behandelt. Nach Filtration und Eindampfen erhält man 2,28 g eines gelben Öls. Dieses wird in wenig Benzol gelöst und an 400 ml Kieselgel chromatographiert. Es werden Fraktionen zu 10 ml aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 116 enthalten insgesamt 780 mg Verunreinigungen. Die Fraktionen 117 bis 170 (Benzol—2% Aceton) enthalten 490 mg plattdhchromatographisch einheitliches /i⁴-9_/8,10a-Androsten-3,17-dion. Schmelzpunkt 155 bis 156°C (nach mehrmaliger Umkristallisation aus Methylenchlorid—Isopropyläther); X_max (UV) = 241 πΐμ; ε = 16 500. Aus den Fraktionen 186 bis 244 (Benzol—Aceton [9:1]) erhält man 540 mg einheitliches A⁴ - 9/ο,ΙΟα - Androsten -17/3 - öl - 3 - on. Schmelzpunkt 154 bis 155⁰C (aus Methylenchlorid— Isopropyläther); l_max (UV) = 241 ηΐμ; ε = 16 000.

Beispiel 5

1,2 g zl⁴-9/?,10a-Pregnen-3,20-dion (Retroprogesteron) werden, wie im Beispiel 4 beschrieben, jedoch unter Verlängerung der Inkubationszeit auf 7 Tage (nach Steroidzugabe), der enzymatischen Oxydation unterworfen. Dabei erhält man 1,12 g einheitliches ,J⁴-9/S,10a-Androsten-3,17-dion (aus der Gärbrühe konnte bei diesem Versuch kein J⁴-9/S,10a-Androsten-17β-ο1-3-οη isoliert werden).

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 17-oxygenierten Retrosteroiden der Androstanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein in 1,2-Stellung gesättigtes 20-Ketosteroid der Retropregnanreihe der aeroben enzymatischen Oxydation mittels Fusarium solani in an sich bekannter Weise unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein J⁴-3,20-Diketosteroid der Retropregnanreihe als Ausgangsstoff verwendet.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man J⁴-9/5,10a-Pregnen - 3,20 - dion oder J⁴ⁱ⁶-9ß,10a-Pregnadien-3,20-dion als Ausgangsstoffe verwendet.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Experientia, Bd. 9 (1953), S. 371.

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