JPS6024719B2 - ステロイドアルコールの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ステロイドアルコールの製造法に関するもの
である。

詳しくは、微生物によるステロイドアルコールの製造法
の培地の改良に関するものである。ミコバクテリウム（
Ｍｙｃｏｂａｃにｒｉｍｍ）（以下「Ｍ．」と略記する
）属に属する微生物が、２０Ｑ−ヒドロキシメチルプレ
グナー１，４ージエン−３ーオン（＝２２ーヒドロキシ
ー２３、２４−ビスノルコラー１，４ージェンー３−オ
ン）（以下「ＨＰＤ」と略記する）および２０Ｑーヒド
ロキシメチルプレグンー４−エンー３ーオン（；２２−
ヒドロキシ−２３ ２４−ビスノルコラー４ーエンー３
ーオン）（以下「岬Ｐ」と略記する）を生産すること自
体は、例えば次の三つの文献に記載されており、公知で
ある。

Ａ アプライドマイクロ／ゞイオロジー （ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ鱗）２３巻１号
７２〜７７頁１９７２手 米国Ｂ 米国特許第３，聡
４，６５７号明細書Ｃ 同 第３，７５９ ７９１
号明細書しかし、Ａ〜Ｃの文献に記載されているＨＰＤ
および４花（以下ＨＰと総称する）の生成量は徴量で、
工業的意味は殆んどない。

すなわち、ＨＰＤの生産量に関しては文献Ａでは約２０
ムタ／私、文献Ｂでは４０山タノ地、文献Ｃでも２０山
夕／似【を越えていないし、虹花については文献Ｃの実
施例で唯１ヵ所高々４０メタ／地となっているだけであ
る。しかるにＨＰは、通常の有機合成化学反応により、
容易に副腎皮質ホルモン（コルチコィド）、黄体ホルモ
ン、蛋白同化ホルモン等の活性を有するステロイドに変
換されうる非常に有用な中間体であり、その工業的に有
利な製造方法の開発が望まれていた。

本発明者等は、これらの事情に鑑み鋭意研究を進めた結
果、ある新規な培地を用いれば目的を達成しうろことを
知り、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨はＭ．属に属する微生物を使用
し、ステロール類を基質にしてＨＰＤまたは凪Ｐを製造
するに際し、０．１重量％以上のグリセリドを含有する
培地を用いることを特徴とするステロイドアルコールの
製造法およびＭ．属に属する微生物を使用し、ステロー
ル類を基質にしてＨＰＤまたは虹Ｐを製造するに際し、
０．１重量％以上のグリセリドおよび植物油脂粕を含有
する塔地を用いることを特徴とするステロイドアルコー
ルの製造法に存する。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明方法で使用される微生物は、Ｍ．属に属し、ＨＰ
Ｄまたは虹花を生産しうる微生物である。

勿論言うまでもないが、このような微生物はＨＰＤを生
産するものでも、４ＨＰを生産するものでも、またＨＰ
Ｄと山花を併産するものであってもよい。そのような微
生物としては迅速発育性（的ｐｉｄ母ｏＭｈ）を示すＭ
．陸菌の袷んどの種が含まれる。

例をあげるとＭ．フレイ（ｐｈｌｅｉ）、Ｍ．ローブシ
アエ（ｒｈのｅｓｉａｅ）、Ｍ．フオーツイタム（位ｒ
ｔｕｉｔ山ｍ）、〔異名：Ｍ．ラナェ（ｒａｎａｅ）、
Ｍ．ギアエ（ｇａｅ）、Ｍ．ミネツチ（ｍｉ股ｔｔｉ）
〕、Ｍ．フオーツイタム（ｆｏｒ瓜ｉｔｍｍ）サブスピ
ーシーズ（ｓ地ｓｐ．）サーモフイラム（ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｍｍ）、Ｍ．べレグリナム（ｐｅｒｅｇｒｌｎ
ｍｍ）〔異名：Ｍ．アナババン テイ（ａ船ｂａｂａｎ
ｔｉ）、Ｍ．チ ェ ロ ネイ（ｃｈｅｌｏｎｅｉ）〔
異名：Ｍ．ボルシェテレンセ（功ｒｓにｌｅｎｓｅ）〕
、Ｍ．チェロネイ（ｃｈｅｌｏｎｅｉ）サプスピーシー
ズ（ｓｕ戊ｐ．）アブセツサス（ａ戊ｃｅｓｓｕｓ）〔
異名：Ｍ．アブセッサス（ａ広ｃｅｓｓｕｓ）、Ｍ．ル
ニョニイ（ｒ肌ｙｏｎｉｉ）〕、Ｍ．スメグマチス（ｓ
ｍｅｇｍａｔｉｓ）〔異名：Ｍ．ラクテイコーラ（ｌａ
ｃｔｉｃｏｌａ）、Ｍ．ブチリカム（ｂｕｔＭｉｃｕｍ
）、Ｍ．スピーシーズ（ｓｐ．）＃６０７）、Ｍ．フラ
ヴエツセンスｍａｖｅｓｃｅｎｓ）〔異名：Ｍ．アカプ
ルセンシス（ａｃａｐ山ｃｅｎｓｉｓ）、 Ｍ‐チ ユ
ー フ エ ン セ（ｃｈｕｂｕｅ船ｅ）〔異名：Ｍ
．トーカィェンセ（℃ｋａｉｅｎｓｅ）〕、Ｍ．ギルヴ
アム（ｇｌｖｕｍ）、Ｍ．サ−モレジステイビレ（ｔｈ
ｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔｉｂｉｌｅ）、Ｍ．チタエ（ｃｈ
ｉｔａｅ）、Ｍ，ヴアツカエ（ｖａｃｃａｅ）、Ｍ．デ
ユバリー（ｄｕｖａｌｉｉ）、Ｍ．アグリ（ａ幻ｉ）、
Ｍ．ラクタェぐｌａｃｔａｒ）、Ｍ．オブエンセ（ｏｂ
肥ｎｓｅ）、Ｍ．アイチエンセ（ａｉｃｈｉｅｎｓｅ）
、Ｍ．パラフオーツイタムコンプレツクス（ｐａｒａｆ
ｏれｕｉｔｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）〔Ｍ．オーラム（ａ
ｕｍｍ）、Ｍ．ネオオーラム（船ｏａｕｍｍ）、Ｍ．パ
ラ フオルツイタ ム（ｐａぬｆｏれｕｉ山ｍ）、Ｍ．
デイエルンホツフエリ一（ｄｉｅｒ血ｏ笹ｒｉ）、力ナ
ザワ ストレインズ（脇ｎａＺａｗａ−ｓｔ紅ｉｎｓ）
〕などがあげられる。

これらの微生物は、大別するとＨＰの生産にキレート剤
などの阻害剤存在を必要としない突然変異株と、キレー
ト剤などの阻害剤を必要とする野生株に分けられる。キ
レート剤などの阻害剤添加を必要としない突然変異株と
しては、例えばＭ．パラフオーッィタムコンプレックス
ＭＣＩ−０６１７号菌（微生物工業技術研究所徴工研菌
寄第４２５８号）、Ｍ．スピーシーズ（ｓｐ．）ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−細０５号菌およびＭ．スピーシーズ（ｓｐ．）
ＮＲＲＬＢ−３６８３号菌がなどがあげられる。

次にキレート剤やＮｉ、Ｃｏなどの阻害剤の添加の下で
徴量ながらＨＰを生成する菌として、例えばＭ．バッカ
ェ ＡＴＣＣ２５９５４号菌、Ｍ．パラフオーッィタム
ＡＴＣＣ２球０７号菌およびＭ．デュバリー ＮＣＴ
Ｃ８６４５号菌などがあげられる。

本発明で使用しうる微生物は上記したものに限られるも
のではなく、つまりは阻害剤の添加、無添加を問わずス
テロール類よりＨＰを生成し迅速発育性を示すＭ．属菌
なら何でもよい。また２以上の微生物を混合して使用す
ることも出来る。ここで具体例として上託したＭ．パラ
フオーツィタム コンプレツクスＭＣＩ−０６１７号菌
について詳述する。本菌はＭ．／ぐラフオーツイタム
コンプレックス ＡＴＣＣ ２５７９０〔 ＝ Ｍ．ネ
オ オ ー ラ ム（肥ｏａｕｍｍ）ＡＴＣＣ２５７
９０〕号菌より紫外光照射にて獲得した突然変異株であ
る。Ｍ．スピーシーズＮＲＲＬＢ−３６８３号菌、同Ｂ
−総０５号菌がいずれもステロール類よりアンドロスタ
ー１，４ージェンー３，１７ージオン（以下「ＡＤＤ」
と略記する）またはアンドロスト−４ーェソー３，１７
ージオン（以下「４ＡＤＪと略記する）を壬生産物とし
て生産し、ＨＰは副産物であるのに比し、ＭＣＩ−０６
１７号菌は、消費ステロールの半分以上をＨＰに転換蓄
積させる能力を有する。

ＭＣＩ−０６１７号菌の親株について詳述すると、親株
ＡＴＣＣ２５７９０号菌は、Ｍ．に関する尊間家達１３
名が集った抗酸菌分類国際研究班（ｌｎにｒＭｔｉｏｎ
ａＩＷｏｒｋｉｎｇＧｒｏｕｐｏｎ Ｍｙｃｏｂａｃに
ｒｉａＩＴａｘｏｎｏｍｙ）の共同研究の結論として、
Ｍ．／ｆラフオーッィタムコンプレックスに属するとさ
れている。

〔斎藤肇、東村道雄ら・インターナショナルジャーナル
オブシステマテイツクバクテレオロジイー（ｌｎｔ．Ｊ
．Ｓ＄ｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）２７巻、７５〜８５
頁（１９７７年、アメリカ）参照〕この菌株ＡＴＣＣ２
５７９び号菌は、初め東村＃３０９号菌とし、東村＃３
班号菌（ＡＴＣＣ２３３６６号菌）を基準菌株として設
けた新種Ｍ．オーラム（ａｍ印ｍ）東村に含められてい
た。

〔東村道雄、医学と生物学、７２蓋、２７０〜２７３頁
、１９６６年〕その後、東村氏は東村＃３５０３号菌（
ＡＴＣＣ２５７９５号菌）を基準菌株とし、Ｍ．オーラ
ムの別種としてＭ．ネオオーラム（ｎｅｏａｍｍｍ）束
村を創設したが、ＡＴＣＣ ２５７９ぴ号菌はＭ．オー
ラムに属するとされていた。〔東村道雄、医学と生物学
、８５萱、２２９〜２３３頁、１９７２王〕しかし、最
近の斎藤、東村らの文献（前世）によれば、ＡＴＣＣ
２５７９び号菌は、Ｍ．オーラムではなく、Ｍ．ネオオ
ーラムの一員であるとされている。

〔斎藤、東村ら、前出文献７刀頁図１参照〕さらに、同
じ文献の中で、Ｍ．属の分類に関してＭ．パラフオーツ
ィタム東村、Ｍ．オーラム東村、Ｍ．ネオオーラム東村
、Ｍ．デュェルンホフェリーべニツク アンド コーハ
ツ（ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ節ｎｉｃｋｅ ＆ Ｊ血ａ
ｓＺ）および“力ナザワ ストレィンズ”（‘‘Ｋａ順
ｚａ岬ｓｔｒａｉｎｓ”）は相互に極めて近縁関係にあ
り、現段階では区別できないとして、こ５種は分散して
おかずにＭ．パラフオーッィタム コンプレックスとし
て一括して取り扱うように結論づけられている。東村ら
も別の文献でほぼ同様な結論に達し、Ｍ．オーラムおよ
びＭ．ネオオーラムはＭ．パラフオーツイタム コンプ
レックスの一員としてか、またはＭ．パラフオーツイタ
ムの亜種とするとしている。

〔ジヤーナル オブ ジヱネラルマイクロバ イ オ
ロ ジ ー （ Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）９８巻５１１〜５１刀頁、
（１９７７年、イギリス）参照〕Ｍ．バラフオーツイタ
ム コンプレツクスの一般的性質および近縁同類との比
較は斎藤肇（結核、５０、ｐ４０２、１９７５）、斎藤
ら（前出、２７巻、８０〜８１頁、１９７７年）および
東村ら（前出、５１５頁、１９７７年）を参照されたい
。

以上の如く、親株ＡＴＣＣ２５７９ぴ号菌〔ッカムラ（
Ｔｓ叱ａｍｍａ）＃３０９〕の分類学的位置は、この方
面の最高権威者の結論に従い、Ｍ．パラフオーツィタム
コンプレツクスに属するものとするのが妥当である。

Ｍ．パラフオーツイタム コンプレツクスはグラム腸性
、抗酸性、非運動性、非胞子形成の梓菌であり、迅速発
育性、晴発色性抗酸菌（ ｒａｐｉｄｌｙ ｇｒｏ
ｗｉｎｇ ｓｃｏｔｏｃｈｒｏｍｏ蟹ｎｌｃｍｙｃｏ
舷ｃｔｅｒｉａ）あるいはルニヨン（Ｒｕｎｙｏｎ）の
Ｗ群抗酸菌に属する。

ところで、この親株ＡＴＣＣ２５７９び号菌より分離し
た突然変異株ＭＣＩ−０６１７号菌は親株に比し、前者
が寒天培地上で粕面の（ｒｏｕ軌）の集落を形成する点
以外に菌学的な相違はなかったし、さらに親株が既述の
如くＭ．パラフオーッイタム コンプレックスに属する
ので突然変異株ＭＣＩ−０６１７号菌はＭ．パラフオー
ツィタム コンプレツクスに属する。故に当然の事なが
ら、これらの突然変異株は、米国特許第３，７５９ ７
９１号および同３，６８４，６５７号明細書に４ＡＤお
よびＡＤＤ生産突然変異株として開示されたＭ．スピー
シーズ（ｓｐ．）ＮＲＲＬ Ｂ−３６８３号菌および同
ＮＲＲＬ Ｂ−３８０５号菌〔本菌株は特公昭５２−１
０５，２８９号公報にてＭバッカェ（ｖａｃｃａｅ）と
固定されている〕と異なる親親な菌である。これらの分
類群の比較についてはバーギーの便覧第８版 〔‘‘Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓＮねｎ雌ｌ ｏｆ Ｄｅにｒｍｊｎａｔ
ｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｅｄ．８”，６９
５〜６９６頁、ウィリアム＆ウイルキンスカンパニ‐（
Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉ船Ｃｏ．）、１９７
４年、アメリカ）〕、斎藤肇（前世、４０２頁、１９７
３王）、斎藤ら（前出、８０〜８１頁、１９７７年）お
よび東村ら（前世、５１５頁、１９７７年）の文献を参
照されたい。なお、ＭＩＣ−０６１７号菌はＮＲＲＬ
Ｂ−３８０５号菌、Ｂ−３６８３号菌と分類学的性質の
他、ＡＤＤ、少の、９Ｑ−ＯＨ−４ＡＤの分解能力が異
なり、前者がこれらを基質にして若干生育するのに、後
者は生育しないという相違点がある。本発明で基質とし
て用いられるステロール類とは、各種ステロール、その
Ｃ−３ェステル、エーテル誘導体またはそれらの酸化中
間体を総合してステロール類と称す。

各種ステロールとはベルヒドロシクロベンタノフェナン
トレン核のＣ−３にヒドロキシル基を、通常Ｃ−５に二
重結合を、Ｃ−１７に炭素数８ないし１０個の鎖式の側
鎖を有し、場合によってはＣ−７、Ｃ−８、Ｃ−９（１
１）等に二重結合を有してもよい。のような各種ステロ
ールとしては、コレステロール、スチグマステロール、
カンベステロール、シトステロール、エルゴステロ−ル
、ブラツシカスステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロール、
ジヒドロアグノステロール等が挙げられる。

好ましいステロールはコレステロール、カンベスナロー
ルおよびシトステロールである。また各種ステロールの
３８水酸基と硫酸等の無機酸または脂肪酸等の有機酸と
のＣ−３ェステル譲導体も本発明方法の原料として使用
される。

このようなＣ−３ェステル誘導体としては、コレステリ
ルオレエート、コレステリルパルミテート、コレステリ
ルサルフェート等が挙げられる。さらに、たとえば各種
ステロールの３８水酸基にアルキレンオキシドを付加さ
せる方法等により得られるＣ−３ェ−テル議導体も本発
明方法の原料として使用される。このようなＣ−３エー
テル誘導体としてはポリオキシェチレンコレステリルェ
ーテル等が挙げられる。

上託した各種ステロールのＣ−３ェステル誘導体を含有
する羊毛脂（ウールワックス）、ラノリンおよびラノリ
ンの加水分解で得られるコレステロールを含有するウー
ルアルコールおよびウールアルコールにエチレンオキシ
ドを反応させて得られる、Ｃ−３エーテル誘導体である
ポリオキシェチレンラノリンアルコールェーテルも本発
明方法の原料として使用されることはいうまでもない。

魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油、さらに植物
油の脱臭スカム、脱臭スラッジ、トール油などのステロ
ール含有天然物および加工物も同様に本発明方法の原料
として使用される。さらに各種のステロ−ルまたはその
Ｃ−３ェステルもしくはエーテル議導体の酸化中間体も
本発明方法の基質として使用される。

このような酸化中間体としては各種ステロール、そのＣ
−３ェステル、Ｃ−３ーェーテル誘導体の４ーェン−３
−オン又は１，４−ジェン−３−オン譲導体が挙げられ
るが、具体的には、たとえば、コレストー４ーヱンー３
ーオン、コレスタ−１，４−ジエンー３−オン、コレス
ター４，２２−ジエン−３−オン等である。本発明で培
地中に添加されるグリセリドはモノ、ジおよびトリグリ
セリドを含む。

また結合している脂肪酸基が同一である単一グリセリド
および２種または３種の脂肪酸基を含む混合グリセリド
も同様に添加することができる。脂肪酸基は不飽和脂肪
酸基および飽和脂肪酸基を含む。グＩＪセリドの脂肪酸
基の炭素数は、親水性の観点からは、通常２６以下であ
ることが好ましい。このようなグリセリドとしては、Ｑ
−モノアセチン、８−モノアセチン、Ｑーモノパルミチ
ソ、８ーモ／パルミチン、Ｑ−モノステアリン、８ーモ
ノステアリン、Ｑーモノオレイン、８−モノオレィン等
のモノグリセリド；Ｑ，Ｑ′−ジアセチン「Ｑ，３−ジ
アセチン、Ｑ，Ｑ′ージパルミチン、ｑ，８−ジパルミ
チン、Ｑ，Ｑ′ージステアリン、Ｑ，ａージステアリン
、Ｑ，Ｑ′−ジオレイン、Ｑ，８−ジオレィン等のジグ
リセリド；トリアセチン、トリラウリン、トリミリスチ
ン、トリパルミチン、トリステアリン、トリオレイン等
のトリグリセリドがあげられる。上記したモノ、ジおよ
びトリグリセリドはいずれも単一のグリセリドであるが
、その他１ーアセトー２，３ージパルミチン、１ーパル
ミト−２，３ージ力フリン、１−ラウロ−２ーミリスト
ー３ーパルミチン、２−オレオ−１，３ージパルミチン
、２ーステアロー１，３−ジオレィン等の混合グリセリ
ドも同様に使用することができる。

本発明方法では、グリセリドそのものの代りに、グリセ
リドを含有する油脂を使用することができる。油脂には
植物油脂および動物油脂が含まれる。植物油脂としては
、例えば、アマニ油、ェノ油、キリ油、ゴマ油、トウモ
ロコシ油、ナタネ独、綿実油、サフラワー油、大豆油、
大豆レシチン、ツバキ油、ヌカ油、オリーブ油、ヒマシ
油、落花生油、ャシ油、パーム油、パーム核油などをあ
げることができる。動物油脂としては魚油、鯨油、牛脂
、豚脂、羊脂、牛脚油、肝油、タロー油脂などをあげる
ことができる。上記した天然油脂は必ずしも十分に精製
されたものである必要はないが、ステロイド類の微生物
酸化に悪影響を与える物質は予め除去することが望まし
い。

好ましい植物油脂類としては、たとえば、オリーブ油、
大豆油、大豆レシチン、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ
油、ナタネ油、落花生油、ツバキ油、バーム油、ャシ油
等の食用油をあげることができる。

特に好ましいのは、その供Ｖ給が安定している綿実油、
大豆油、ナタネ油、パーム油等である。好ましい動物油
脂類としては、豚脂、タロー油脂等をあげることがきる
。グリセリド含有物質は、単独で使用することもできる
が２以上の同種または異種のものとを混合して使用する
こともできる。

グリセリド含有物質の使用量が少ないと、ＨＰの収量増
加は僅かである。

他方、グリセリド含有物質の使用量が過度に増加すると
、阻害があらわれグリセリド含有物質が塊状となり好ま
しくない。従って、グリセリド含有物質は、培地中のグ
リセリド濃度が培地重量に対し、通常約０．１〜１０重
量％、好ましくは約０．２〜７重量％、さらに好ましく
は約０．３〜４重量％となるように培地に添加される。
グリセリドは油種子、油果実として、そのグリセリド濃
度が上記の範囲で培地に含まれるよう添加してもよい。

そのような油種子、油果実としては、例えばアマニ、丸
大豆、ナタネ、綿実、ゴマ、落花生、サフラワー、トウ
モロコシ、米ぬかなどがあげられる。また、本発明方法
はに於いては、グリセリド含有堵地にさらに植物油脂粕
を添加すればＨＰの収量が顕著に増加する。

そのような植物油脂柏としては、各種油種子または油果
実から油脂を抽出した粕を使用することができる。

具体的には、例えば、アマニ粕、脱脂大豆粕、ェノ油粕
、ナタネ油粕、綿実油粕、ゴマ油柏、落花生油粕、サフ
ラワー油粕、キリ油柏、脱脂トウモロコシ粉、ツバキ油
柏、脱脂米ヌカ、オリーブ油柏、ャシ油柏、パーム油柏
、などをあげることができる。なお、植物油脂粕は、微
生物による資化をうけやすくするために、よく粉砕して
添加されることが望ましい。

植物油脂粕は単独で使用されうるが、２種以上混合して
も使用されうる。

なお、植物油脂粕の使用量が少ないと、収量増加は僅か
である。

他方、植物油脂柏の使用量が多くなると、醗酵液の粘度
が上昇し、縄梓が困難となる。従って、植物油脂粕は、
その濃度が培地重量に対し、通常約０．５〜２０重量％
、好ましくは約１〜１５重量％、さらに好ましくは約１
．５〜１０重量％となるように培地に添加される。

本発明では、微生物によってはＨＰの生産に阻害剤の添
加を必要とする。

阻害剤としては、キレート剤；ニッケル、カドミウムも
しくはコバルトの塩類；または錘セレン酸ナトリウム、
メチレンブルー、ナフタリン、Ｑーナフトール、８−ナ
フトール、フエナントレン、アントラセン等を意味する
。

キレート剤の代表例は１，１０ーフェナントロリン、２
，２′ービピリジル、８ーヒドロキシキノリン、クベロ
ン、イソニコチン酸ヒドラジド、オルソフエニレンジア
ミン、Ｎ，Ｎージエチルジチオカルバミド酸ナトリウム
等である。

本発明方法で使用される培地は、上記したグリセリド、
油果実、油種子、植物油脂粕の他に、炭素源、窒素源、
および無機物が適宜添加される。

そのような炭素源としては、例えば、炭化水素；メタノ
ール、エタノール等のアルコール類；コハク酸、酢酸等
の有機酸およびその塩；澱粉、麦芽糖、ショ糖、ブドウ
糖、ラムノース等の糠類があげられる。炭素源、窒素源
およびその他の栄養物質を含む天然栄養源としては、／
・ィテスト糖密、精製糖密およびキシロース糖密を含む
糠密類；バカス、コーンコブ、アルファルファ、コーン
ステイープリカー、デイステイラーズソルプル、味液、
魚粉、フスマ、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエ
キス、麦芽エキス、グルテン、べプトン、グルタミン酸
塩、アスパラギン、グリシン、カゼイン、カゼイン分解
物、スキムミルクなどがあげられる。無機物としては硫
安、塩安などの窒素源；リン酸水素二カリウム等のカリ
ウムおよびリン源：鉄、銅、マグネシウム、マンガン、
コバルト、亜鉛、カルシウム等の塩類：糖密等天然物の
灰化物があげられる。

その他必要に応じてビタミン類を添加することもできる
。培地の組成は用いる菌種の種類に応じて選ばれるが、
炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマグネシウムは
培地成分として不可欠である。

消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すればよい。
具体的にはポリオキシアルキレングリコールなどが挙げ
られるが必ずしも消泡剤を添加する必要はない。界面活
性剤はステロール類の乳化剤として有効であり、培地中
に添加されることが望ましい。

界面活性剤としては、非イオン系及び陰イオン系のもの
が好ましい。具体的には例えば、ポリオキシヱチレンソ
ルビタンモノステアレート、ソルビタンモノパルミテー
ト、ポリエチレングリコールモノステアレートなどを挙
げることができる。培養温度は通常２０〜４０ｏｏであ
るが、培養温度は３０〜３９０付近が最高である。培地
の風は通常５〜１０に調整されるが、６〜９が好ましい
。

本発明で使用する微生物がＭ．属に属するものなので周
知のように１の寸近のｐＨにも耐えられる。本発明方法
の原料であるステロール類は培地と共に殺菌されるのが
一般的であるが、培養開始後、培地に添加されてもよい
。

また分割添加も可能である。この場合、乾燥殺菌あるい
は緑熱殺菌後そのまま添加されるか、あるいはジメチル
ホルムアミド等に溶解して溶液として添加されるか、あ
るいは超音波処理により微細に分散懸濁して懸濁液とし
て添加される。また、界面活性剤を同時に添加すると基
質ステロール類等の乳化が促進されるので好ましい。本
発明方法に従って添加されるグリセリド含有物質はステ
ロール類の酸化の全段階に於て有効であり、また菌の生
育を促進するので、通常は培養開始時培地に添加される
。

しかし、上記グリセリド含有物質はステロール類の１７
位の側鎖の酸化に有効であると考えられ、従って原料ス
テロール類の添加時、あるいは培養途中時に添加されて
も、ＨＰの生成量は大きく増加する。また、前述したと
おり、グリセリド等は消泡剤としても作用するので、前
記した濃度範囲のグリセリドを培養中分割して添加する
ことも好ましい。

培養時間は特に制限されないが、通常、原料スプロール
類等添加後３日目頃からＨＰの生産量が急増する。

その後は、培養時間と共に徐々にＨＰの生産量が増加す
るが２０日以上培養するのは工業的意味が薄い。培養終
了後、培養液中に蓄積したＨＰは既知の方法で採取分離
精製されうる。

例えば培養液からＨＰを数倍量の酢酸エチルなどの水と
混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液から溶媒を留去
すると粗ＨＰが得られる。ＨＰＤ、姫Ｐ、基質ステロー
ル類または副生物を相互に分離する必要がある場合には
、多孔性樹脂、シリカゲル、アルミナ等を吸着剤とし、
石油エーテル、ベンゼン、クロロホルム・エーテル、ア
セトン、メタノール、酢酸エチル等を溶離剤として使用
する力ラムクロマトグラフィにより、上記生成物を分離
することができる。単離したＨＰＤ又は４ＨＰを夫々精
製するには、例えば１０％エタノール−へキサンなど適
当な溶媒で再結晶を繰り返えせばよい。

本発明方法によれば、ＨＰの生産量をグリセリド非含有
培地を用い場合と比較して３〜１Ｍ部こ向上することが
でき、ＨＰの生産を工業的に有利に実施することを可能
とした。

以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定さ
れない。

なお、以下の実施例に於て、ステロール類およびその誘
導体、ＨＰ残存ステロール類および創生ステロイドの特
性および定量はガスクロマトグラフィにより行った。

また、以下の実施例に於て、パーセントは重量による。

実施例 １グルコース１．０％、肉エキス１．０％、ベ
ブトン１．０％および水よりなる種培地（ｐＨ７．２）
１００泌を５００机と肩付きフラスコに分注し、１２０
００で１５分間蒸気殺菌後、Ｍ．／ャラフオーツィタム
コンプレックス ＭＣＩ０６１万菌を白金耳接種し３
０００で１２の主復／分、振中７伽の往複振濠条件で７
２時間種培養する。

この種培養液２の‘を脱脂大豆粉５．０％、綿実油１．
０％、Ｋ２ＨＰ０４０．２％、ＮａＮ０３０．２％、Ｍ
ｇＳ０４・７４００．１％、コレステロール０．８％お
よび水よりなる本培養培地５０の【（ｐＨ７．０、１２
０ｏ０２０分間殺菌）を含む５００の【肩付フラスコ１
０本に接種する。本培養は３０００で１２の主復／分、
振中７狐の往複振錘条件で行い、培養開始後１５功時間
目に培養を停止し、培養液を全てあわせて酢酸エチル２
そで２回抽出する。この抽出液を併わせて菌体などの不
漆物を櫨過後、ＨＰの量をガスクロマトグラフィで分析
した。結果を表１に示す。

なお、抽出液をシリカゲルクロマトグラフィにかけ、２
０％酢酸エチル−ｎーヘキサン溶媒として溶出すると、
ＨＰＤと４ＨＰは相互に分離し、さらに基質コレステロ
ール及び副生物からも分離する。

藩出したＨＰＤおよび４ＨＰの夫々の区分を１０％エタ
ノール−へブタンより再結晶する事により、ＨＰＤ、心
花は精製される。コレステロールの代りにＰーシトステ
。

ールとカンベステロールの２：１混合物、コレストー４
−エン−３−オン、コレスター１，４ージエン−３ーオ
ンまたはコレステリルオレエートを用いて、上記した培
養を繰り返えした。結果を同じく表１に示す。なお、比
較の為、綿実油を添加しなかった場合の結果も併わせて
示す。

なお、用いた綿実油は、ほぼ１００％のグリセリド混合
物である。

以下の実施例で用いた油脂も同様である。表１ 実施例 ２ 実施例１において、本培養培地に綿実油に代えて各種グ
リセリドおよび油脂を添加した事を除いては実施例１を
繰り返えす。

結果を表２に示す。表 ２実施例 ３ 実施例１に於て、１％の綿実油に代えて種々の濃度のト
リステアリンを使用した事を除いては実施例１を繰り返
えす。

結果を表３に示す。表 ３ 実施例 ４ 実施例１と同様にして微生物にＭ．スピーシーズＮＲＲ
Ｌ Ｂ−３６８３号菌および同ＮＲＲＬ−Ｂ−３８０５
号菌を用いて実施例１の種培養を繰り返えす。

その種培養を２地を脱脂綿美粧８．０％、Ｋ２ＨＰ０４
０．１５％、硫安０．１０％、いわし油０．８％、コレ
ステロール１．０％および水よりなる本培養培地５００
の‘（ｐＨ７．０、１２０ｑＣ、２０分間殺菌）含む５
そ肩付フラスコに接種する。本培養は３０ｑｏで１０の
主復／分、振中７肌の往復振糧条件で行い、培養開始後
２０餌時間目に培養を停止し、培養液を酢酸エチル２そ
で２回抽出する。

この抽出液を餅わせて、菌体などの不落物を猿過後、そ
の中のＨＰの量をガスクロマトグラフィで分析した。結
果を表４に示す。なお、いわし油無添加の場合の結果も
あわせて記す。

表 ４ 実施例 ５ 菌株にＭ．デュバリー ＮＣＴＣ８６４５号菌およびＭ
．バツカェ ＡＴＣＣ２５９５４号菌を用い、これを実
施例１と同様に種培養を行う。

この種培養液２の‘をおのおの脱脂大豆粕６．０％、酵
母エキス〔ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕１．０％、Ｋ
２ＨＰ０４０．１５％、コレステロール１．０％、大豆
油０．７％および水よりなる本培養培地（ｐＨ７．０、
１２０ｏｏ、２０分間殺菌）５０の‘を含む５００Ｍ肩
付コルベン１０本に接種する。これを１２の主復／分、
７肌振中の往復鑑条件で培養する。培養開始後４８時間
目にキレート剤である２２ージピリジル３の９を各コル
ベンに無菌的に添加する。キレート剤添加後１４餌時間
後に培養を停止し、全ての培養液を菌株ごとにあわせて
酢酸エチル１そで抽出する。抽出液中のＨＰの量をガス
クロマトグラフィにて分析した結果を表５に示す。なお
、大豆油を含まぬ培地での結果を表５に示す。

表 ５ 実施例 ６ 実施例１において本培養培地としてグルコース２ ％、
（ＮＨ４）夕０４０．２％、Ｋ２ＨＰ０４０．１５％、
ＭｇＳ０４・７日２００．１％、パ−ム油１．０％、酵
母１．０％、各種の４％の植物油脂粕および水よりなる
培地を使用した事を除いては実施例１を繰り返えす。

結果を表６に示す。表 ６ 実施例 ７ 実施例１において、本培養塔地として、魚粕２０％、Ｋ
２ＨＰ０４０．２％、ＮａＮ０３０．２％、Ｍが０４１
７比００．１％、コレステロール０．８％、丸大豆磨砕
物（グリセリド含有約１７％）６．０％および水よりな
る培地を用いた事を除いては実施例１を繰り返えす。

さらに丸大豆魔砕物に代えて、落花生磨砕物（グリセリ
ド含有約３５％）３．０％又は菜種磨砕物（グリセリド
含有約４０％）２．５％、ないしはごま磨砕物（グリセ
リド含有約４０％）２．５％を用いて同様に培養した結
果を併わせて表７に示す。

表 ７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ミコバクテリウム属に属する微生物を使用し、ステ
   ロール類を基質にして２０α−ヒドロキシメチルプレグ
   ナー１、４−ジエン−３−オンまたは２０α−ヒドロキ
   シメチルプレグン−４−エン−３−オンを製造するに際
   し、０．１重量％以上のグリセリドを含有する培地を用
   いることを特徴とするステロイドアルコールの製造法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の方法において、ステロ
   ール類が、ステロール、そのＣ−３エステル誘導体、Ｃ
   −３エーテル誘導体またはそれらの酸化中間体からなる
   群から選ばれたものであることを特徴とする方法。３
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法において
   、微生物が突然変異株であることを特徴とする方法。 ４ ミコバクテリウム属に属する微生物を使用し、ステ
   ロール類を基質にして２０α−ヒドロキシメチルプレグ
   ナー１、４−ジエン−３−オンまたは２０α−ヒドロキ
   シメチルプレグン−４−エン−３−オンを製造するに際
   し、０．１重量％以上のグリセリドおよび植物性油脂粕
   を含有する培地を用いることを特徴とするステロイドア
   ルコールの製造法。 ５ 特許請求の範囲第４項記載の方法において、ステロ
   ール類が、ステロール、そのＣ−３エステル誘導体、Ｃ
   −３エーテル誘導体またはそれらの酸化中間体からなる
   群から選ばれたものであることを特徴とする方法。 ６ 特許請求の範囲第４項または第５項記載の方法にお
   いて、微生物が突然変異株であることを特徴とする方法
   。