DD248145B1

DD248145B1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von sterolabbauprodukten

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Publication number: DD248145B1
Authority: DD
Publication date: 1991-01-17

Description

-2- 248 145 Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß Sterole zu einer Vielzahl von partialsynthetisch verwertbaren Produkten mikrobiell abgebaut werden können (K. Kieslich: „Steroid conversion" in: A. H. Rose [Ed.] Microbial enzymes and bioconversion. Economic Microbiology, 5 [1980], 370-467, Academic Press; London, New York, Toronto, Sydney, San Francisco).

Es ist ferner bekannt, daß die mikrobielle Transformation von Sterolen bzw. allgemein von Steroiden aufgrund der hydrophoben Eigenschaften dieser Substanzklasse mit zahlreichen Problemen verbunden ist, die oft die Ursache für schlechte Umsatzraten darstellen (siehe wiederum K.Kieslich, a.a.O.).

Es hat nicht an Versuchen gefehlt, durch spezifische technische Lösungen, so durch gezielte Zusätze zum Fermentationsansatz, z. B. die Substratverfügbarkeit (wie Benetzbarkeit, Verteilung oder Solubilisierung), den Stoffübergang oder die Schaumregulierung zu beeinflussen und damit die Gesamtumsatzraten bzw. die Pröduktausbeuten zu erhöhen. Nichtionischen Tensiden kommt hierbei seit langem eine besondere Bedeutung zu. So sind für die mikrobielle Transformation von Steroiden, insbesondere von Sterolen, vorwiegend die folgenden nichtionischen Tensidklassen im Gebrauch: Polyethylenoxidaddukte von Sorbitanfettsäureestern, Sorbitanfettsäureester, partielle Fettsäureester des Glycerols, des Ethylenglycols, des 1,2-Propandiols usw., Polyethylenoxidaddukte von Glycerolfettsäureestern, spezielle Polyethylenoxidaddukte von Polyolfettsäureestern sowie Polyethylenglykolether langkettiger aliphatischer Alkohole. Danach wurden beispielsweise unter Zusatz von 0,2% eines Glycolfettsäureesters (Tegin®) aus 12g/l Sterol (Sitosterol) durch Fermentation mit Mycobacterium spec. NRRL B-36831,2 g/l eines Pregnanderivates als Sterolabbauprodukt erhalten, was einer Gesamtausbeute von 10Gew.-% entspricht. Die Fermentationszeit beträgt allerdings 120 Stunden. Andere Vertreter der o.g. Tenside liefern ähnliche Ergebnisse, wobei, wie auch bei den nachfolgenden technischen Lösungen, die Wirkung ausschließlich auf eine verbesserte Benetzbarkeit des hydrophoben Sterols zurückgeführt wird. In der Patentschrift EP 0008214 wird die Transformation von Sitosterol zu Androst-4-en-3,17-dion mit Mycobacterium fortuitum NRRL B-11045 in Gegenwart von 0,2% Polyoxyethy lensorbitanmonooleat (Tween® 80) über einen außergewöhnlich langen Fermentationszeitraum von bis zu 15 Tagen ohne Angabe von Ausbeuten beschrieben. In der Schrift DE-OS 2632677 werden Angaben zur Anwendung von Tensiden für die Umwandlung von Sterolderivaten zu Androstenderivaten gemacht. So werden 400g 3ß-Methoxymethoxy-5-cholesten mit Mycobacterium spec. NRRL B-3805 in 120 Stunden zu 86g 3ß-Methoxymethoxy-5-androsten-17-on (Ausbeute: 21,5Gew.-%) in Gegenwart von 0,2% des Glycolfettsäureesters Tegin® und 0,2% des Polyethylenoxid-Glycerolfettsäureadduktes Tagat® umgewandelt.

Bemerkenswert ist weiter der Befund von U.Schömer und F.Wagner (Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechno!. 10 [ 1980] 99-106), wonach Tenside auf der Basis von Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Blockkopolymeren den Abbau von Sitosterol zu Ring-B-Secoverbindungen mit Nocardia spec. M29 negativ beeinflussen.

Positive Einflüsse auf den mikrobiellen Abbau von Sterolen werden an anderer Stelle von Glyceriden sowie allgemein von pflanzlichen und tierischen Fetten berichtet. So werden nach der Schrift DE-OS 2625333 5g/l Cholesterol zu 1,04 g/l Androst-1 ,4-dien-3,17-dion mit Brevibacterium lipolyticum IAM1398 in 110 Stunden abgebaut (Ausbeute: 20,8Gew.-%). Als Glycerid wird Rapsöl in einer Konzentration von 30g/l verwendet. In dem Patenttext EP 0001622 wird über die Umwandlung von Sitosterol/ Campesterol-Mischungen (2:1) zu 22-Hydroxy-23,24-bisnorchol-4-en-3-on als Sterolabbauprodukt in Gegenwart von 40g/l Sojaölmehl und 20g/l Fischölrückstand berichtet. Unter diesen Bedingungen werden 10g/l Sterolgemisch mit Mycobacterium parafortuitum complex MCI0617 zu 3,7 g/l Sterolabbauprodukt umgewandelt, was einer Ausbeute von 37Gew.-% entspricht, wobei allerdings eine Fermentationszeit von mehr als 160 Stunden in Kauf genommen werden muß.

Den bekannt gewordenen technischen Lösungen haftet der Nachteil an, daß für spürbare Steigerungen der Sterolabbauraten, auch für relativ niedrige Sterolkonzentrationen, verhältnismäßig hohe Tensidkonzentrationen, die über 1 g/l, in einigen Fällen sogar über 5g/l, liegen (Schömer, U. und Wagner, F., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 10 [1980] 99-106), erforderlich sind. Hohe Tensidkonzentrationen und vor allem die außergewöhnlich hohen Konzentrationen an zugesetzten Glyceriden bzw. ölhaltigen Rückständen pflanzlichen und tierischen Ursprungs beeinträchtigen in der Regel die Aufarbeitung der Fermentationsansätze drastisch, vor allem die Verfahrensstufen Extraktion und Reinigung der Abbauprodukte. Nachteilig ist ferner die in allen genannten Verfahrensbeispielen zu verzeichnende lange Fermentationszeit. Dies ist ein Nachteil, welcher den bisherigen mikrobiellen Verfahren zur Gewinnung von Sterolabbauprodukten generell anhaftet, auch wenn nicht ausdrücklich auf die Anwendung von Tensiden hingewiesen wird. Als Beispiel ist in diesem Zusammenhang die Umwandlung von Sitosterol zu 9a-Hydroxyprodukten mit Hilfe von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 nach dem Patent US 4223092 zu nennen (Fermentationszeit über 336 Stunden, ohne Angabe von Produktausbeuten).

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ausgewählte Sterolabbauprodukte in effektiver Weise herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von Sterolabbauprodukten, insbesondere von 9a-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion (9-OH-AD), Androst-4-en-3,17-dion (AD) und Androst-1,4-dien-3,17-dion (ADD), durch mikrobiellen Abbau von Sterolen abzugeben, das die Nachteile der bisher bekannten Lösungen vermeidet. Es wurde überraschend gefunden, daß bei der mikrobiellen Transformation von Sterolen wie Sitosterol oder Campesterol oder Stigmasterol oder Cholesterol oder Ergosterol bzw. von Gemischen aus mindestens zwei der genannten Sterole zu Androstanderivaten deutlich erhöhte Substratumsatzraten und verbesserte Produktausbeuten auftreten, wenn spezielle Tenside oder Tensidgemische vom Typ Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Blockkopolymeren (PEO-PPO-Blockkopolymere) zum Einsatz gebracht werden. Dieser Effekt ist insofern überraschend, daß für die genannte Tensidklasse am Beispiel des mikrobiellen Abbaus von ß-Sitosterol zu Ring-B-Secoverbindungen sogar eine Hemmung des Prozessors bekannt ist.

Das Wesen des Verfahrens,

welches sich in seinem technologischen Teil aus an sich bekannten Verfahrensschritten zusammensetzt, wobei üblicherweise für Fermentationen einsetzbare Apparaturen wie Schüttelkolben sowie Fermentoren im Labor-, Pilot- und Produktionsmaßstab zur Anwendung kommen

und wobei zur mikrobiologischen Transformation als Mikroorganismus jeweils ein Vertreter aus der für diesen Einsatzzweck bekannten, gutgeeigneten Gattung wie Mycobacterium eingesetzt wird,

besteht darin, daß die Fermentation in Gegenwart von Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Kopolymeren der Strukturen I oder Il (siehe Abbildung) in einer Konzentration von 1% bis 50%, vorzugsweise 10%, in bezug auf das in den Fermentationsansatz eingetragene Sterolsubstrat durchgeführt wird. Hierbei ist es für das vorgeschlagene Verfahren ohne Belang, ob die genannten nichtionischen Tenside oder Tensidgemische der Vorkultur und/oder der Fermentation gemeinsam mit dem Sterol oder von diesem getrennt zugeführt werden oder ob mit diesen die separat angezüchtete Biomasse nach dem Abtrennen in Puffer behandelt und danach für die Umwandlung des Sterolsubstrates in Puffer mit oder ohne weiteren Tensidzusatz verwendet wird. Hinsichtlich der Anwendung der Tenside obiger Kennzeichnung weist das Verfahren damit folgende Varianten auf:

Variante A

Zum Zwecke der mikrobiellen Umwandlung werden aus Sterolsubstrat und Tensiden oder Tensidgemischen obiger Kennzeichnung Sterol-Tensid-Präparationen entweder in an sich bekannter Weise (Naßvermahlung, Homogenisierung, Lyophilisierung) oder durch gemeinsames Eindüsen in die Gasphase hergestellt, indem der Anteil der Tenside bzw. der Tensidgemische 1 % bis 50%, vorzugsweise 10%, in bezug auf das Sterol beträgt, und diese werden in einer Konzentration von 1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10 g/l, bei einem pH-Wert von pH 6 bis pH 8, vorzugsweise pH 7, und einer Temperatur von 26°C bis 35⁰C, vorzugsweise 28°C, in einem Nährmedium, welches eine Kohlenstoff- sowie eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen in Gegenwart jeweils eines Mikroorganismuses der Gattung Mycobacterium, vorzugsweise in Gegenwart eines Stammes der Art M.fortuitum, zu Sterolabbauprodukten, insbesondere zu Androstanderivaten, vorzugsweise zu 9a-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion (9-OH-AD), Androst-4-en-3,17-dion (AD) oder Androst-1,4-dien-3,17-dion (ADD) fermentiert.

Variante B

Ein ansonsten komplettes Nährmedium, welches 1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10g/l, einer Sterol-Standardpräparation enthält, wobei unter Sterol-Standardpräparation neben dem in der Verfahrensvariante A gekennzeichnete Material alternativ auch ein mikronisiertes Sterol verstanden wird, das lediglich zum Zwecke der verbesserten Benetzbarkeit in wäßrigen Medien in geringen Konzentrationen, die unter 0,5g/l liegen, ein Netzmittel enthalten kann, wird mit einem Tensid obiger Kennzeichnung in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 25 g/l, vorzugsweise 1 g/l versetzt, sterilisiert und in Gegenwart jeweils eines Mikroorganismusses der Gattung Mycobacterium, vorzugsweise in Gegenwart eines Stammes der Art M.fortuitum, der Fermentation des Sterolsubstrates zu Androstanderivaten wie 9-OH-AD, AD oder ADD zugeführt.

Variante C

Der für die Fermentation jeweils einzusetzende Mikroorganismenstamm aus der o.g. Gattung wird zunächst im kompletten Nährmedium in Gegenwart eines Tensids bzw. Tensidgemisches obiger Kennzeichnung, welches in einer Konzentration von 0,1 g/1 bis 25g/l, vorzugsweise 1 g/l, vorliegt, angezüchtet und nach 12 Stunden bis 36 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, mit einer Sterol-Standardpräparation in einer Konzentration von 1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10g/l, versetzt und die eigentliche Transformation durchgeführt; oder ein komplettes Nährmedium, welches das Sterol in der angegebenen Konzentration enthält, wird mit dieser Mikroorganismenkultur im Verhältnis 1:5 beimpft und die Transformation des Sterolsubstrates zu Androstanderivaten in einem Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen zu Ende geführt.

Variante D

Der für die Transformation von Sterolen geeignete Mikroorganismenstamm obiger Kennzeichnung wird in einem kompletten Nährmedium (ggf. in Gegenwart von 0,2 g/l bis 0,5g/l Sterolsubstrat) angezüchtet, vom Nährmedium abgetrennt, mit Tensiden obiger Kennzeichnung in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 25 g/l, vorzugsweise 2 g/l, in Phosphatpuffer, pH 7, bei 26°C bis 35°C, vorzugsweise 28°C, über einen Zeitraum von 0,5 Stunden bis 10 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, inkubiert, danach von dieser Tensid-Puffer-Mischung abgetrennt, anschließend wiederum auf Phosphatpuffer, pH 7, der nunmehr eine Sterol-Standardpräparation in einer Konzentration von 1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10g/l, enthält, gesetzt und bei 26°C bis 28⁰C über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen wie in Variante B und C beschrieben, zur Umwandlung des Sterolsubstrates zu Androstanderivaten verwendet. Die Aufarbeitung der Kulturlösung erfolgt in an sich bekannter Weise, z. B. durch Extraktion und Kristallisation.

Die Vorteile der vorliegenden Lösung im Vergleich zu den bekannten Verfahren bestehen in einer deutlichen Erhöhung der Produktausbeuten bei verkürzter Fermentationszeit.

Es hat sich gezeigt, daß die chemische Aufarbeitung durch die mit den Strukturen I und Il definierten Tenside im Gegensatz zu den bekannten Verfahren, die Fermentationshilfsstoffe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs verwenden bzw. bisher verwendete Tenside in sehr hohen Konzentrationen zum Einsatz bringen, nicht beeinträchtigt wird.

In der nachfolgenden Tabelle wird die hohe Wirksamkeit am Beispiel eines Tensids der Struktur I im Vergleich zu dem häufig nach dem Stand der Technik verwendeten Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween®80) dargestellt. Die Fermentationsbedingungen entsprechen dabei den Angaben im Ausführungsbeispiel 9, wobei lediglich für die Tensidkonzentration eine Variation vorgenommen wurde.

	Sterolabbauprodukt 9-OH-AD (g/l)	0,4	0,5	0,7	1,0
Tensid	beiTensidkonzentrationen(Gew.-%)von:	2,1	2,15	1,5	0,8
	0,05 0,1 0,2 0,3
Polyoxyethylensorbjtanmonooleat	1,1 1,45 1,7 2,0	1,5	0,8	0,45	0,1
(Tween®80)
Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-	1,9 3,0 2,7 2,6
Kopolymer
Struktur I

Ausfuhrungsbeispiele

Beispiel 1 (Variante A)

1,5kg eines Sterolgemisches, bestehend aus 90% Sitosterol und 10% Campesterol, werden unter Hinzufügen von 150g eines Tenside der Struktur I mit einem Gesamtgehalt von 30% Polyethylenoxid und einem Molekulargewicht von 2790 in 151 Benzol unter Erwärmen gelöst, schnell auf —40⁰C abgekühlt und lyophilisiert. Das entstehende Produkt wird, wie in den Beispielen ab Nr.7 beschrieben, in 1001 wäßriges Nährmedium eingerührt, sterilisiert und zur Fermentation eingesetzt.

Beispiel 2 (Variante A)

1 kg eines Sterolgemisches, bestehend aus 55% Sitosterol, 6% Campesterol und 39% Stigmasterol, werden bei etwa 30⁰C unter Hinzufügen von 0,1 kg eines PEO-PPO-Blockkopolymeren der Struktur I mit einem Gesamtgehalt von 27% Polyethylenoxid sowie einem Molekulargewicht von 1730 in 5kg Chloroform gelöst und die entstehende Lösung über eine G 2-Fritte filtriert. Die Lösung wird in einem üblichen Sprühtrockner verdüst. Das entstehende feinverteilte Produkt wird, wie in den Beispielen ab Nr. 7 beschrieben, in 671 Nährlösung eingerührt, sterilisiert und für die Fermentation zum Einsatz gebracht.

Beispiel 3 (Variante A)

1 kg ß-Sitosterol wird in Gegenwart von 0,1 kg eines PEO-PPO-Blockpolymeren der Struktur I zu einem Produkt mit Partikelgrößen ѵоп4цт bis Юрт mikronisiert sowie mit einer wäßrigen Kulturlösung mit einem Gesamtgehalt von 14% PEO (Molekulargewicht des Kopolymeren: 1650) angeteigtund auf 1001 mit Nährlösung gemäß Beispiel 7 verdünnt, sterilisiert und zum Einsatz gebracht.

Beispiel 4 (Variante A)

1 kg ß-Sitosterol wird in Gegenwart von 0,1 kg eines PEO-PPO-Blockkopolymeren der Struktur I mit einem Molekulargewicht von 2250 und einem Gesamtgehalt von 20% PEO naß gemahlen sowie gemeinsam mit dem Fermentationsmedium nach Beispiel Nr.7 sterilisiert und zum Einsatz gebracht.

Beispiel 5 (Variante A)

1,5 kg ß-Sitosterol werden in 3,01 Dimethylformamid in der Hitze gelöst, mit 150g eines nichtionischen Tenside der Struktur Il mit χ = 20, у = 2, ζ = 2 (Molekulargewicht 700) versetzt sowie in 101 heißes Wasser eingerührt und abzentrifugiert. Das erhaltene Sediment wird in dem Nährmedium gemäß Beispiel Nr. 7 resuspendiert, sterilisiert und zum Einsatz gebracht.

Beispiel 6 (Variante A)

1 kg des nach Beispiel 1 bezeichneten Sterolgemisches werden mit 0,1 kg eines PEO-PPO-Blockkopolymeren der Struktur I mit dem Molekulargewicht von 3100 und einem Gesamtgehalt von 58% PEO in Gegenwart von 310,1 M Phosphatpuffer, pH 7, (nach Sörensen) mit Hilfe eines leistungsfähigen Homogenisators gemeinsam verteilt. Die entstandene Suspension wird in dem Nährmedium nach Beispiel Nr. 7 verteilt, sterilisiert und zur Fermentation gebracht.

Beispiel 7 (Variante A)

3 Tage alte Schrägagarkulturen von Mycobacteriumfortuitum ZIMET10851 werden zum Beimpfenvon500-ml-Standkolbenmit je 50ml einer Nährlösung, bestehend aus Hefeextrakt 10g, Glycerol 10g, KH₂PO₄0,5g, K₂HPO₄ 0,5g, (NH₄I₂HPO₄1,5g, MgSO₄- 7 H₂O 0,2 g, aufgefüllt mit aqua dest. auf 1 Liter, verwendet. Die Kulturen werden bei 28°Cfür 24 Stunden auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Danach werden 2,5-l-lmpfflaschen mit je 400ml der oben angegebenen Nährlösung mit dieser ersten Vorkultur beimpft und 24 Stunden bei 28°C auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Der Inhalt von je 4 Impfflaschen dient dann гит Beimpfen von 151 Nährlösung in einem 30-l-Kleinfermentor mit Rührer (500U/min) unter Belüftung (151/min). Ein 250-l-Tank mit der gleichen Nährlösung, die 2,25 kg einer Sterolpräparation nach Beispiel 1 enthält, wird mit2mal 151 dieser Impfkultur beimpft, so daß ein Endvolumen von 1501 vorliegt. Der Tank wird bei 30⁰C mit 301 Luft/min gefahren. Nach 3 Tagen wird die Fermentation abgebrochen und das Produkt 9-OH-AD mit einer Gesamtausbeute von 500g in an sich bekannter Weise aufgearbeitet.

Beispiel 8 (Variante A)

Stamm Mycobacteriumfortuitum ZIMET10850 wird unter den im Beispiel 7genannten Bedingungen kultiviert. Im 250-l-Tank werden 2,25kg (Trockengewicht) der im Beispiel 5 gewonnenen Sitosterolpräparation in 1501 Nährmedium fermentiert. Die nach 72 Stunden in bekannter Weise erfolgte Aufarbeitung ergibt eine Gesamtausbeute von 525g 9-OH-AD.

Beispiel 9 (Variante A)

Zwanzig 500-ml-Standkolben mit je 50 ml einer Nährlösung, bestehend aus Caseinhydrolysat 7,5g, Glucose 5,0g, Lactose 15g, (NH₄J₂HPO₄ 3g, MgSO₄- 7 H₂O 0,02g, FeSO₄- 7H₂O 0,01g und ZnSO₄ · 7H₂O 0,02g, werden mit je 500mg einer nach Beispiel 2 hergestellten Sitosterolpräparation versetzt. Nach dem Sterilisieren wird mit je 5ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von M.fortuitum ZIMET10849 beimpft. Nach 96 Stunden wird das Fermentationsprodukt 9-OH-AD in bekannter Weise isoliert (Ausbeute 3,0 g 9-OH-AD).

Beispiel 10 (Variante C)

50ml einer Nährlösung, bestehend aus den in Beispiel 7 angegebenen Komponenten sowie aus 50mg des im Beispiel 5 eingesetzten nichtionischen Tensids, werden mit einer 3 Tage alten Schrägkultur von M.fortuitum ZIMET10851 beimpft und 48 Stunden bei 28⁰C auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Mit je 5 ml dieser Vorkultur werden danach zwanzig 500-ml-Standkolben, die jeweils 50 ml der im Beispiel 7 angegebenen Nährlösung sowie 500mg einer nach Beispiel 2 angegebenen Sitosterolstandardpräparation enthalten, beimpft. Die Aufarbeitung des Fermentationsansatzes nach 72 Stunden ergibt 4g 9-OH-AD.

Beispiel 11 (Variante C)

Unter den gleichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 10 angegeben sind, kommt das im Beispiel 1 eingesetzte nichtionische Tensid zur Anwendung. Nach der Aufarbeitung werden 3,7 g 9-OH-AD erhalten.

Beispiel 12 (Variante D)

Zwanzig ml-Rundkolben mit je 50 ml der in Beispiel 7 angegebenen Nährlösung werden mit je 10 ml einer 2 Tage alten Vorkultur von Mycobacteriumfortuitum ZIMET10851 beimpft und 24 Stunden bei 28⁰C auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Danach werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit m/15-Phosphatpuffer gewaschen und je 2g-Portionen von Feuchtzellen in 50 ml desselben Puffers, der 1,0 % des im Beispiel 5 angegebenen nichtionischen Tensids enthält, resuspendiert. Nach 2 Stunden bis 4 Stunden Inkubation auf dem Rundschwingtisch bei 28"C werden die Zellen (je 2 g) von der wäßrigen Phase abgetrennt und mit je 50ml Puffer, der 500 mg der in Beispiel 1 angegebenen Sitosterolpräparation enthält, zur Fermentation gebracht. Nach 4 Tagen wird das Produkt 9-OH-AD in bekannter Weise mit einer Ausbeute von 4,5g aufgearbeitet.

Beispiel 13 (Variante D)

Zwanzig Rundkolben mit je 50 ml Nährlösung nach Beispiel 12, welche zusätzlich jeweils 10 mg Sitosterol enthält, werden in der beschriebenen Weise mit M.fortuitum ZIMET10851 beimpft und kultiviert. Die geernteten Zellen werden wie im Beispiel 12 mit Tensid behandelt und dann für die Fermentation verwendet. Aus 10g Sitosterolpräparation werden nach 4 Tagen Transformation in Puffer 4,5g 9-OH-AD erhalten.

Beispiel 14 (Variante B)

Zwanzig 500-ml-Rundkolben mit je 50 ml der in Beispiel 7 angegebenen Nährlösung, die zusätzlich jeweils 500 mg einer Sitosterolstandardpräparation enthält, werden mit je 50 mg des in Beispiel 1 angegebenen Tensids versetzt und nach dem Sterilisieren mit je 5ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von M.fortuitum ZIMET10851 beimpft. Kulturführung sowie Aufarbeitung erfolgen in an sich bekannter Weise. Aus 10g Sitosterol werden 4,0g 9-OH-AD erhalten.

Claims

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Sterolabbauprodukten, insbesondere der AndrostanderivateSJ-alpha-Hydroxy-androsM-en.S.U-dion.AndrosM-en-S.n-dionund Androsta-1,4-dien-3,17-dion, indem Sterole oder Sterolgemische in Konzentrationen von 1 g/l bis 50g/l in Gegenwart von 0,5g/l bis 25g/l eines als Tensid wirkenden organischen Polymeren durch zum Sterolseitenkettenabbau befähigte Mikroorganismen, vorzugsweise durch solche der Gattung Mycobacterium, bei pH-Werten zwischen pH 6,0 und pH 8,0 und Temperaturen von 26°C bis 35°C während einer Dauer von 2 Tagen bis 6 Tagen in einer Pufferlösung oder in einem kompletten Nährmedium umgesetzt werden, gekennzeichnet dadurch, daß als organisches Polymeres obiger Spezifizierung

- entweder ein Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Blockcopolymeres der Struktur I (siehe Abbildung), welches einen Anteil von 30% bis 70% Polypropylenoxid enthält sowie ein Molekulargewicht von 1 000 bis 3500 besitzt,

- oder ein Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Addukt der Struktur Il (siehe Abbildung) verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß für die mikrobielle Transformation des Sterolsubstrats

- ein ansonsten komplettes Nährmedium mit einem Komplex aus dem Sterol bzw. Sterolgemisch und einem Tensid obiger Kennzeichnung versetzt, sterilisiert und der Fermentation zugeführt wird oder

- ein ansonsten komplettes Nährmedium zunächst mit einer Standardpräparation des Sterol-Substrats und anschließend mit dem Tensid versetzt, sterilisiert und der Fermentation zugeführt wird oder

- die jeweils eingesetzten Mikroorganismen zunächst in einem kompletten Nährmedium in Gegenwart eines Tensids obiger Kennzeichnung angezüchtet sowie nach 12 Stunden bis 36 Stunden mit einer Präparation des zu transformierenden Sterolsubstrats versetzt werden und die Fermentation unter den genannten Bedingungen zu Ende geführt wird oder

- die jeweils eingesetzten Mikroorganismen nach dem Wachstum in Gegenwart eines Tensids obiger Kennzeichnung zur Beimpfung eines Fermentationsmediums, welches das zu transformierende Sterol oder Sterolgemisch enthält, verwendet werden und die Fermentation durchgeführt wird oder

- die jeweils eingesetzten Mikroorganismen zunächst in einem kompletten Nährmedium, welches zum Zwecke der Enzyminduktion 0,2g/l bis 0,5g/I Sitosterol bzw. Sterolgemisch enthalten kann, über einen Zeitraum von 24 Stunden angezüchtet, vom Nährmedium abgetrennt, mit einem Tensid obiger Kennzeichnung in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 2,5g/l in Phosphatpuffer, pH 7, bei einer Temperatur von 26°C bis 35°C über einen Zeitraum von 0,5 Stunden bis 10 Stunden inkubiert, danach abgetrennt und nunmehr für die Umwandlung einer Sterol-Präparation in Phosphatpuffer, pH 7, verwendet werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation ein Tensid-Sterol-Komplex eingesetzt wird, welcher dadurch erhalten wird, daß Sterol und Tensid zunächst gemeinsam mechanisch behandelt, anschließend entweder aus organischen Lösungsmitteln versprüht und lyophilisiert oder aus der gelösten Form in einem organischen Lösungsmittel in wäßrigen Systemen zur Fällung gebracht werden.

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Sterolabbauprodukten aus Sterolen bzw. aus Sterolgemischen, speziell der für die Partialsynthese von Steroidpharmaka wichtigen Ausgangsprodukte der Androstanreihe. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen und allgemein in Teilbereichen der mikrobiologischen Industrie.