HU180021B

HU180021B - Process for producing 20-alpha-hydroxy-methyl-pregna-1,4-dien-3-one,20-alpha-hydroxy-methyl-pregn-4-en-3-one or the mixture thereof

Info

Publication number: HU180021B
Application number: HU78MI638A
Authority: HU
Inventors: Yukio Imada; Katsuhiko Takahashi
Original assignee: Mitsubishi Chem Ind
Priority date: 1977-10-14
Filing date: 1978-10-12
Publication date: 1983-01-28
Also published as: DD140478A5; IT1099728B; DE2861166D1; IT7828778A0; US4223091A; EP0001622A1; IE47369B1; CA1118376A; IE781890L; EP0001622B1

Description

I 2

A találmány tárgya eljárás szteroid alkoholok előállítására oly módon, hogy új mikroorganizmus felhasználásával végzett mikrobiológiai oxidáció útján valamely szterinből nyerjünk 20a-hidroxi-metil-pregna-l,4-dién-3-ont és/vagy 20a-hidrcxi-metil-pregn-4-én-3-ont. E leírásban a szterin kifejezést szokásos jelentésével használjuk, szteránvázas egyértékű alkoholok gyíijtő- neveként, melyeknél a ciklopentano-perhidrofenantrén váz. 3-helyzetében hidroxilcsoport, általában az 5-helyjj zetben kettős kötés, a 17-helyzetben 8—10 szénatomos ‘I oldallánc van, s adott esetben lehet kettős kötés a 7-helyzetbcn, 8-helyzetben, 9- (11-) helyzetben stb.

A 20a-hidroxi-metil-pregna-l ,4-dién-3-on (22-hidroxi-23,24-bisznorkola-l,4-dién-3-on) (továbbiakban: HPD) és a 20a-hidroxi-metil-pregn-4-én-3-on (22-hidroxi-23, 24-bisznorkola-4-én-3-on) (továbbiakban: 4HP) fontos köztitermékek értékes szteroidok előállításánál, mint pl. a kortikoszteroidok, progesztogének, anabolikus hormonok stb.

Ismeretes, hogy HPD és 4HP előállítható a Myco- 20 bacterium génuszhoz tartozó mikroorganizmusok tenyésztése útján. Ilyen eljárásokat ismertetnek a következő forrásokban:

(A) Applied Microbiology 23 No. 1.72—77 (1972), (B) 3 684 657 Isz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, (C) 3 759 791 lsz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

Az ezekben az irodalmi forrásokban leírt eljárások során azonban csak igen kis mennyiségű HPD, illetve

4HP képződik, ezért ezeknek az eljárásoknak a gazdálkodó tevékenység szempontjából nincs jelentőségük. Pontosabban szólva, az (A), (B) és (C) irodalmi forrásokban leírt eljárások során képződő HPD koncentrá5 ciója a tápközeg milliliterére vonatkoztatva — e közlemények szerint — 20 ug, 40 (J.g vagy 20 y.g-nál is kevesebb.

A (C) irodalmi forrásban olyan példa is szerepel, mely szerint a 4HP képződött mindössze 40 μg/ml koncent10 rációban. Az említett eljárások főterméke viszont androszta-l,4-dién-3,17-dion (továbbiakban: ADD) vagy androszt-4-én-3,17-dion (továbbiakban: 4AD), s a képződött HPD, illetve 4HP aránya a főtermékhez viszonyítva nem éri el az 1/10 értéket.

Sürgető igényként jelentkezett ezért, hogy a HPD és a 4HP előállítására olyan eljárást fejlesszenek ki, mely a gazdálkodó tevékenység követelményeit kedvezően kielégíti.

Találmányunk alapja az a felismerés, hogy a HPD és 4HP magasszintű kitermeléssel, nagy koncentrációban nyerhető, ha mikrobiológiai oxidációnak vetünk alá, valamely szterint vagy annak C₃ észterszármazékát, illetve C₃ éterszármazékát vagy ezek oxidációja során keletkező valamely köztiterméket olyan új mikroorga25 nizmus alkalmazásával, mely a Mycobacterium génuszhoz tartozik és mely a HPD-t, illetve a 4HP-t főtermékként képes termelni.

Amikor azt mondjuk, hogy a Mycobacterium génuszhoz tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazunk, 30 mely képes a HPD-t, illetve 4HP-t főtermékként ter180021 “ Ι8ΟΟ21 melni, azt úgy értjük, hogy a találmány szerint az eljárásban bármilyen mikroorganizmus alkalmazható, mely a HPD-t, a 4HP-t vagy ezek elegyét főtermékként képes termelni. Mind a leírásban, mind az igénypontokban azt a fogalmat, hogy a HPD-t, illetve a 4HP-t főtermékként termelik, úgy értjük, hogy a Telhasznáít szterin szubsztrátumhoz viszonyítva a HPD és a 4HP együttes kitermelése mólszázalékban kifejezve meghaladja az 50%-ot, vagyis teljesül az alábbi egyenlet:

(gl 82) ^Y=IH ⁺ gJ^x100>50’ ahol Y jelenti a %-ban kifejezett kitermelést, gj a képződő HPD-mennyiséget (mólban), g₂ a képződő 4HP mennyiséget (mólban) és G a felhasznált szterin menynyiségét (mólban).

A Mycobacterium génuszhoz tartozó ismert törzsek (továbbiakban: vad törzsek) nem termelik a HPD-t, illetve a 4HP-t főtermékként akkor sem, ha szterin szubsztrátummal végzünk fermentációt. Ezért a találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmus a vad törzsektől egyértelműen megkülönböztethető annál fogva, hogy a találmány szerinti mikroorganizmus a HPD-t, illetve a 4HP-t főtermékként termeli.

Ez a mikroorganizmus a Mycobacterium parafortuitum komplex olyan mutánsa, melyben nincs vagy kevés a HPD-t és/vagy 4HP-t lebontó enzim, illetve az olyan enzim, mely az anyagcserefolyamat későbbi szakaszában aktív. Olyan enzimet sem tartalmaz ez a mutáns számottevő mértékben, mely a metabolikus folyamat azon szakaszában aktív lenne, amelyik szakaszban a szterin átalakul 4AD-vé vagy ADD-vé (pl. 23,24-bisznorkola-l,4-dién-karbonsavvá), így az anyagcserefolyamat főútja a HPD és/vagy a 4HP irányába tolódik el és HPD és/vagy 4HP halmozódik fel.

Ez az új mutáns a Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617, melyet úgy nyerünk, hogy az alaptörzset (Mycobacterium parafortuitum komplex ATCC 25 790) ibolyántúli fénysugárral kezeljük.

Az alaptörzset az angliai NCTC mikroorganizmus gyűjteményben 10 440 nyilvántartási számmal helyezték letétbe, az amerikai ATCC gyűjteményben a letétbe helyezéskor 23 072 számmal vették nyilvántartásba, most 25 790 számmal tartják nyilván (a továbbiakban ezen utóbbi számmal említjük). A mutánst Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617 megnevezéssel helyeztük letétbe, annak nyilvántartási számai:

Fermentation Research Institute-nál:

FERM—P—4258,

Northern Régiónál Research Centernél:

NRRL B—11 389,

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél: DSM 1381.

A taxonómiai besorolás még nem egyértelműen elfogadott, ezért e kérdést röviden áttekintjük, főleg az „Int. J. Syst. Bacteriol., 27 (1977), 75—85” irodalmi forrásra (továbbiakban: id. mű) hivatkozva; egyéb irodalmi forrásokat hivatkozáskor külön feltüntetünk.

A találmány szerint tenyésztett új mutáns alaptörzsét a „Mycobacteríal Taxonorny” tárgyú nemzetközi munkacsoport (IWGMT) második közös' tanulmányában „Mycobacterium parafortuitum komplex’' elnevezéssel szferfepeltetik (H. Saito et al., i. m.). Az újsob, M. Tsukamura által definiált Mycobacterium áurtaú törzs (tí pust örzsea Tsukamura + 358 ATCC 23 366) eredetileg magában foglalja a Tsukamura # 309 ATCC 25 790 törzset [M. Tsukamura, Med. Bioi., Tokyo, 72 (1966), 270—273]. Később Tsukamura új speciesként ismertette a Mycobacterium neoaurum törzset (típustörzse Tsukamura # 3503 A TCC 25 795), mely különbözik a Mycobacterium aurum törzstől; ekkor az ATCC 25 790 törzset még mindig a Mycobacterium aurum törzsként tárgyalta [M. Tsukamura, Med. Bioi., Tokyo, 85 (1972), 10 229—232]. A már említett második közös IWGMT tanulmányban azonban javasolták (H. Saito et al., id. mű 77. c. 1. ábra), hogy az ATCC 25 790 törzs tartozzék a 8. csoportba (megnevezése: M. neoaurum és nem M. aurum), mely nyolc törzsből áll 90%-os egymásközti hasonlósággal, s köztük van a csoport típustörzse: ATCC 25 795). Saito et al. további következtetései: „.. .úgy tűnik, hogy igen jelentős taxonómiai hasonlóság van azon komplexen belül, melyhez M. parafortuitum (Tsukamura), M. diernhoferi (Bönicke és Juhász),

M. aurum (Tsukamura), M. neoaurum (Tsukamura) és a Kanazawa törzsek egy csoportja tartozik. Úgy véljük, hogy nem szabad különválasztani ennyire szorosan rokon, normálisan szaprofita, gyorsan növekvő myeobacteriuraokat, ellenkezőleg, inkább egy komplexnek tekintendők, melyet M. parafortuitum komplexnek nevezünk, amíg csak határozottabb azonosításra nincs lehetőség.”

M. Tsukamura és S. Mizuno [J. Gén. Microbiol., 98 (1977), 511—517] is hasonló következtetésre jutottak, 30 ti.; hogy az M. parafortuitum, az M. aurum és az M. neoaurum az M. parafortuitum species három alspeciesének tekintendők, vagy egy komplexnek, melynek neve: M. parafortuitum komplex.

Az M. parafortuitum komplex morfológiai és fizioló35 giai jellemzőit és azok összehasonlítását a taxonómiailag rokon törzsekével a következő cikkekben levő táblázatok foglalják össze: H. Saito, Kekkaku, 50 (1975), 402, táblázat; H. Saito et al. id. mű 80—81, 2. táblázat; M. Tsukamura és S. Mizuno id. mű 3. táblázat. Mint már mondottuk, ésszerűnek tűnik az alaptörzs (Tsukamura # 309, ATCC 25 790) taxonómiai helyzetét úgy meghatározni, hogy azt a Mycobacterium parafortuitum komplexhez soroljuk, a már említett második közös IWGMT tanulmány alapján.

Az M. parafortuitum komplex jellemzői a következők : gram-pozitív, saválló, nem mozgékony, nem spóraképző, pálcaalakú, gyorsnövésű, szkotokromogén, Runyon IV. csoportjához sorolható (lásd Sykes and Skinner: Actinomycetales; Charectenstics and practical 50 importance. Academic Press, London—New York, 1973, 52—53). Ami a taxonómiai tulajdonságokat illeti, az ATCC 25 790 alaptörzsből leszármaztatott MCI— 0617 mutáns az alaptörzstől alig különbözik; abban különböznek, hogy agar közegen az előbbi durva felületű kolóniákat alkot. így tehát az MCI—0617 törzs az M. parafortuitum komplexhez számítható, mert — mint azt már említettük — az alaptörzset az M. parafortuitum komplexhez soroltuk.

Megállapítható, hogy a találmány szerinti új mutáns különbözik mind a Mycobacterium sp. NRRL B—3683 (továbbiakban csak: B—3683) törzstől, mind a Mycobacterium sp. NRRL B—3805 (továbbiakban csak: B—3805) törzstől, melyeket a 3 759 791 és a 3 684 657 lsz. USA szabadalmi leírások, mint 4AD-t és ÁDD-t termelő mutáns törzseket ismertettek (nemrég a

-2180021

Β—3805 speciest azonosították és Mycobacterium vaccae-ként említették a 105 289/1977 számmal közzétett japán szabadalmi bejelentésben).

E törzsek taxonómiai összehasonlítására nézve a következő forrásokra hivatkozunk:

R. E. Buchanen és N. E. Gibbons (közös kiadv.), 1974. „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,

8. kiadás”, 659—696. old., Wiiliams and Wilkins Co. Baltimore; H. Saito, 1975, Kekkaku, 50, 402; H. Saito et al., 1977. Int. J. Syst. Bacteriol., 27, 80—81; valamint M. Tsukamura és S. Mizuno, 1977. J. Gén. Microbiol., 98, 515. Az MCI—0617 törzs mind a B—3805 törzstől, mind a B—3683 törzstől különbözik nemcsak taxonómiai vonatkozásban, de fiziológiai vonatkozásban is (ti. abban, hogy lebontja ADD-t, 4AD-t és 9a-OH-4AD-t); ezeken a szubsztrátumokon ugyanis a B—3805 törzs alig szaporodik, a B—3683 törzs pedig egyáltalán nem.

Már említettük, hogy az ATCC 25 790 alaptörzsből származtatott MCI—0617 mutáns az M. parafortuitum komplexhez sorolható, továbbá, hogy e mutáns taxonómiailag élesen elhatárolható valamennyi ismert, ADD-t és 4AD-t termelő mutáns törzstől.

A találmány szerinti eljárásnál alkalmazható szteroic szubsztrátumok lehetnek szterinek, azok 3-helyzetü észter-, illetve éterszármazékai, valamint az ezeknek oxidációja során keletkező l,4-dién-3-on, illetve 4-én-3-on szerkezetű köztitermékek.

A szubsztrátum lehet pl. koleszterin, sztigmaszterir, kampeszterin, szitoszterin, ergoszterin, brasszikaszterir, fukoszterin, lanoszterin, agnoszterin, dihidrolanoszterin és dihidroagnoszterin. Különösen előnyös kiindulási anyag a koleszterin, kampeszterin és szitoszterin.

A találmány szerinti eljárás kiindulási anyaga lehet továbbá a szterinek szervetlen savakkal, pl. kénsavval, vagy szerves savakkal, pl. zsírsavakkal képzett 3-helyzetű észterszármazéka, előnyösen pl. koleszteril-oleát, koleszteril-palmitát vagy koleszteril-szulfát.

Kiindulási anyagként alkalmazható 3-helyzetű éterszármazékot pl. úgy kapunk, hogy szterinek 3(3-hídroxilcsoportjához alkilén-oxidot adunk; ilyen éterszérmazék a polioxietilén-ko1eszteril-éter.

Természetesen következik ebből, hogy kiindulási anyagként alkalmazható gyapjúzsír vagy lanolin, melyek tartalmazzák a szterinek fentiekben leírt észterszármazékait; továbbá koleszterin tartalmú gyapjú alkohol, melyet lanolin hidrolízisével kapunk, úgyszintén az éterszármazékok közül a polioxietilén-lanolin-alkohol-éter, melyet úgy kapunk, hogy gyapjú alkoholt etilén-oxiddal reagáltatunk.

További kiindulási anyagok lehetnek egyes szterintartalmú természetes és mesterséges termékek, pl. o'ajhulladék, mely halolaj vagy tintahalolaj alkáliával végzett mosása után marad vissza, továbbá növényi olajok szagtalanított habja vagy üledéke, úgyszintén tallolaj.

Az ilyen 3-helyzetű észter- vagy éterszármazékok oxidációjának valamely l,4-dién-3-on, illetve 4-én-3-on szerkezetű köztitermékét is lehet kiindulási anyagként használni, pl. koleszt-4-én-3-ont, koleszta-l,4-dién-3-ont vagy koleszta-4,22-dién-3-ont.

A találmány szerinti eljárás előnyös foganatosítási módja szerint a reakció során olyan tápközeget alkalmazunk, mely legalább 0,1 súlyszázalékban glicerid(c k)et tartalmaz.

A tápközeghez adott gliceridek lehetnek monogliceridek, diglíceridek és trigliceridek.

Alkalmazható egyetlen glicerid is, mely azonos zsírsavrészeket tartalmaz, vagy glicerid elegy, mely két vagy 5 három különböző zsírsav részt tartalmaz. A zsírsavrészek lehetnek telített és telítetlen zsírsavrészek. Hidrofilia szempontjából előnyösek azok a zsírsavrészek, melyek szénatomszáma 26-ig terjed.

Egyedüli gliceridként alkalmazhatók monogliceridek, 10 pl. a-monoacetin, β-monoacetin, a-monopalmitin, β-monopalmitin, a-monosztearin, β-monosztearin, a-monoolein, β-monoolein stb.; továbbá diglíceridek, pl. α,α'-diacetin, a, β-diacetin, α,χ'-dipalmitin, α,β-dipalmitin, α,α'-disztearin, a, β-disztearin, α,a'-dióiéin, α,β15 -dióiéin stb.; valamint trigliceridek, pl. triacetin, trilaurin, trimirisztin, tripalmitin, trisztearin, trióiéin stb.

Az alkalmazható glicerid elegyekre példaként említhető az l-aceto-2,3-dipalmitin, l-palmito-2,3-dicaprin, l-lauro-2-miriszto-3-palmitin, 2-oIeo-l,3-dipaImitin és 20 2-sztearo-l,3-diolein. A találmány szerinti eljárásban a gliceridek helyett zsírok is alkalmazhatók.

Mind a fentiekben, mind a továbbiakban és az igénypontokban a „zsír” kifejezésen e leírásban növényi zsírokat és olajokat, valamint állati zsírokat és olajokat 25 értünk, függetlenül azok fizikai állapotától.

Növényi eredetű, alkalmazható zsírok pl. a lenmagolaj, perilla (fekete csalán) olaj, tungolaj (kínai faolaj), szezámolaj, kukoricacsíra olaj, repcemagolaj, gyapotmagolaj, sáfrányolaj, szójababolaj, szójalecitin, kamé30 liaolaj, rizskorpaolaj, olívaolaj, ricinusolaj, földi mogyoró olaj, kókuszdió olaj, pálmaolaj és pálmamagolaj.

Állati eredetű, alkalmazható zsírok pl. a halolaj, bálnaolaj, marhafaggyú, háj, birkafaggyú, marha pataolaj és csukamájolaj.

A fent felsorolt, a természetben előforduló zsírokat nem szükséges meghatározott mértékig tisztítani, de előnyös, ha alkalmazás előtt eltávolítjuk a mikrobiológiai oxidáció szempontjából káros szennyezéseket.

Növényi eredetű zsírok közül előnyösen alkalmaz40 hatók pl. az ehető olajok, mint az olívaolaj, szójababolaj, szójalecitin, gyapotmagolaj, kukoricacsíra olaj, szezámolaj, repcemagolaj, földi mogyoróolaj, kaméliaolaj, pálmaolaj, kókuszdió olaj stb.

Különösen célszerű a gyapotmagolaj, szójababolaj, 45 repcemagolaj és pálmaolaj alkalmazása, mert beszerzésük állandóan biztosítható.

Az állati eredetű zsírok közül előnyösen alkalmazható a háj és a faggyúolaj.

Valamely gliceridtartalmú anyag önmagában is alkal50 mazható, de alkalmazható két vagy több gliceridtartalmú anyag elegye is, melyek lehetnek azonos fajtájúak vagy eltérő fajtájúak.

Ha a gliceridtartalmú anyag(ok)ból csak kis mennyiséget alkalmazunk, a HPD és/vagy 4HP kitermelés csak 55 csekély mértékben nő. Mégsem előnyös túl sok gliceridtartalmú anyag alkalmazása, mert az inhibitálást okoz és a gliceridtartalmú anyagok összetömörödnek. Ezért általában annyi gliceridtartalmú anyagot adunk a tenyésztési közeghez, hogy az utóbbiban a gliceridtartal60 mú anyag(ok) aránya mintegy 0,1—10 súlyszázalék, előnyösen mintegy 0,2—7 súlyszázalék, leginkább 0,3— 4 súly százalék legyen.

Olajos növények magvait és virágait adhatjuk a tenyésztési közeghez a fent említett mértékű glicerid kon65 centráció elérésére.

-318.0021

Ilyenek pl. a lenmag, szójabab, repcemag, gyapotmag, szezám, földi mogyoró, pórsáfrány, kukorica és rizskorpa.

Ha a gliccridtartalmú anyaggal együtt növényi olajos lisztet is adunk a tenyésztési közeghez, az kedvezően hat ki a HPD és/vagy 4HP termelésére és növeli a HPD- és/vagy 4HP-hozamot.

Mind a fentiekben, mind a továbbiakban és az igénypontokban a „növényi olajos liszt” kifejezésen e leírásban növényi zsír-, illetve olajgyártás olyan maradékanyagait értjük, amelyek olajos magvak, illetve termények extrakciója után maradtak vissza zúzott állapotban. Ezekben a lisztekben — az alkalmazott kivonó eljárástól függően — különböző arányban maradnak vissza proteinok és zsírok, s az így nyert növényi olajos lisztek bármelyike alkalmazható.

Általában a kereskedelmi forgalomban kapható növényi olajos lisztek alkalmazása előnyös.

Az alkalmazható növényi olajos lisztek közül pl. említhető a szójababolajos liszt, lenmagolajos liszt, perilla olajos liszt, repcemagolajos liszt, gyapotmagolajos liszt, szezámolajos liszt, földi mogyoróolajos liszt, pórsáfrányolajos liszt, tungok'jos liszt, zsírtalanított kukoricaliszt, kaméliaolajos liszt, zsírtalanított rizskorpa, olívaolajos liszt, kókuszdióolajos liszt és pálmaolajos liszt.

Célszerű a növényi olajos liszteket olyan finomságára őrölni, mely a mikroorganizmusok általi jó asszimilációt lehetővé teszi.

Valamely növényi olajos liszt önmagában is, de más növényi olajos lisztekkel kombinálva is alkalmazható.

Ha a növényi olajos liszt(ek)ből csak kis mennyiséget alkalmazunk, a HPD és/vagy 4HP kitermelés csak csekély mértékben nő. Másfelől viszont túl sok növényi olajos liszt alkalmazása növeli a fermentációs tápközeg viszkozitását és nehezíti annak keverését. Ezért általában annyi növényi olajos lisztet adunk a tápközeghez, hogy az utóbbiban a koncentráció általában mintegy 0,5—20 súlyszázaléknyi, előnyösen mintegy 1—15 súlyszázaléknyi, leginkább mintegy 1,5—10 súlyszázaléknyi legyen.

A gliceridtartalmú anyagon és a növényi olajos liszten kívül szénforrásokat, nitrogénforrásokat és szervetlen anyagokat is adunk a tenyésztési közeghez.

Ilyen szénforrások pl. a szénhidrogének; alkoholok, pl. metanol, etanol; szerves savak, pl. borostyánkősav, ecetsav stb., valamint ezek sói; továbbá szénhidrátok, pl. keményítő, malátacukor, nádcukor, glükóz, ramnóz stb.

A tenyésztési közegekbe keverhetők: szénforrásokat, nitrogénforrásokat és más tápanyagokat tartalmazó természetes tápanyagok.

Ilyen természetes tápanyagok pl. a melaszok, beleértve a legnagyobb szénatomszámú melaszokat és a xilóz melaszokat; sajtolt cukornád, kukoricacső, lucerna, kukorica áztatólé, ilyen részeket tartalmazó desztillációs maradékok, mieki (aminosavak elegyének vizes oldata, melyet szójababolajos liszt HCl-dal végzett hidrolízise útján nyernek), halliszt,,élesztő, korpa, húskivonat, élcsztőkivonat, burgonyakivonat, malátakivonat, sikér, pepton, glutamátok, aszparagin, glicin, kazein, kazein-hidrolizátuip és fölözött tej.

A tápközeghez adható, alkalmas szervetlen,anyagok pl. nitrogénforrások, mint ammóniiimTSzulfát, ammónium-klorid stb.; kálium- és .foszforforrások, pl. dikálium-hidrogén-foszfát; vas, réz, magnézium, mangán, kobalt, horgany, kalcium stb. sói; továbbá természetes termények sűrítményei, pl. melaszok.

Más komponensek is lehetnek jelen a tápközegben, pl. vitaminok, ha a fő komponensek hatékonyságát nem 5 zavarják.

A tápközeg konkrét összetétele az alkalmazott mikroorganizmustól függ. Szénforrások, nitrogénforrások, kálium, foszfor és magnézium a tápközegben kritikus komponensek.

Szükség szerint habzásgátló reagenst, pl. polioxi-alkilén-glikolt is adhatunk .a tápközeghez, de arra nincs mindig szükség.

A tápközeg tartalmazhat felületaktív anyagot. Ez nem követelmény, de általában felületaktív anyag jelenléte 15 javítja a tápközeg kezelhetőségét.

Az alkalmazható felületaktív anyag lehet pl. nemionos vagy anionos felületaktív anyag, mint polioxí-etilén-szorbit-monosztearát, szorbit-monopalmitát vagy polietilén-glikol-monosztearát.

Általában az inkubációs hőmérséklet 20—40 °C közötti tartományban van. Az inkubációs hőmérséklet előnyös tartománya: 30—35 °C.

A tenyésztési közeg pH-ját általában 5—10, előnyösen 6—9 közötti értékre állítjuk. Minthogy a találmány sze25 rinti eljárásban olyan mikroorganizmust alkalmazunk, mely a Mycobacterium génuszhoz tartozik, a pH lehet 10 körüli érték, amint az a technika állásából jól ismert.

Általában a szteroid szubsztrátumot a tenyésztési közeggel együtt sterilizáljuk, de azt az inkubálás meg30 kezdése útin is adhatjuk a tápközeghez, sőt adagokban is hozzáadhatjuk.

A szterin szubsztrátumot — annak nedves hőn vagy száraz hőr: végzett sterilizálása után — bármely alkalmas módon adhatjuk hozzá, az lehet poralakú, továbbá 35 alkalmas oldószerben, pl. dimetilformamidban feloldva, vagy lehet szuszpenzió, melyet úgy állítunk elő, hegy a szubsztrátumot ultrahangos kezeléssel diszpergáljuk.

A szterin szubsztrátumot és a felületaktív anyagot cél40 szerűen egyidejűleg adjuk hozzá, mert ezzel növeljük a szterin szubsztrátum emulgálásának mértékét.

Az inkubáció időtartama nem kritikus. Általában a képződő HPD és/vagy 4HP mennyisége a szterin szubsztrátum hozzáadása után három nappal hirtelen 45 megnő. Ezután a képződő HPD és/vagy 4HP mennyisége az inkubációs idővel arányosan, fokozatosan nő. 20 napot meghaladó inkubációs időnek azonban alig van gazdasági haszna.

Amikor a fermentáció végbement, a képződött HPD-t és/vagy 4HP-t a fermentációs táptalajból hagyományos módon ny erhetjük vissza. így pl. a nyers HPD-t és/vagy 4HP-t úgy kapjuk, hogy extraháljuk — vízzel nem elegyedő — szerves oldószerrel, pl. etil-acetáttal, melyből a kinyerendő HPD és 4HP mennyiségének többszörösét alkalmazzuk, majd az oldószert eltávolítjuk az extraktumból. Ha szükség van a HPD, a 4HP, a szterol szubs.ztráium ps a mellékterrpékek elkülönítésére, a^t pszlop-kromatografálással végezhetjük, amihez szijikagélt, alumínium-oxidot, vagy porózus gyantát aíkal60 mázunk adszorbensként, eluensként pedig petróleum-étert, benzolt, kloroformot, étert, acetont, metanolt, gtiEacetátot stb. Az elkülönített HPD-t vagy flHP-t tovább tisztíthatjuk alkalmas oldószerből, pl. ,lQ%-p.s .etanoí-Jiexánból yajó ,isrpét§lt,átkristályo,sítással.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy a

-4180021

HPD-t és/vagy a 4HP-t legalább 50, általában legalább mólszázalékos kitermeléssel kapjuk, a felhasznált szterin mennyiségéhez viszonyítva.

Ezen túlmenően annyiból is gazdaságilag előnyös a találmány szerinti eljárás, hogy a szubsztrátum nagy koncentrációja (pl. I—4%) melletti inkubálás esetén a HPD és/vagy 4HP kitermelése emelkedik.

Találmányunkat részletesebben néhány példával ismertetjük, melyekre azonban találmányunk nem korlátozódik.

Az alábbi példákban adott elemzéseket a szterinek, ι azok származékai, a HPD, a 4HP, a visszamaradt szterinek és a melléktermék szteroidok tekintetében gázkromatográfiával végeztük. A példákban adott százalékok — ha nincs eltérő dimenzió feltüntetve — súlyszázalékok.

2. példa

Megismételjük az 1. pcidát azzal az eltéréssel, hogy az 1. táblázatban szereplő különböző szterineket alkalmazzuk kiindulási szterinekként koleszterin helyett.

1. táblázat

	Termék (g)
HPD	4HP	maradék szubsztrátum
β-szitoszterin +kampeszterin (2 : 1 elegy)	1,88	0,12	0,67
koleszt-4-én-3-on	1,33	0,08	1,48
koleszta-l,4-dién-3-on	2,13	0,02	0,85
koleszteril-olcát	0,29	0,03	3,10

1. példa l,0/o glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont és a fennmaradó részben vizet tartalmazó oltóanyag tápközeget (pH 7,2) készítünk. Ebből az oltóanyag tápközegből 100 ml mennyiséget töltünk 500 ml űrtartalmú rázólombikba. A lombikot és annak tartalmát autoklávban 15 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A közeget oltókacsnyi mennyiségű Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617 tenyészettel inokuláljuk, majd az inokulált közeget 72 órán át 30 °C hőmérsékleten vibrációs rázógépen rázzuk, percenként 120 — 7 cm kitérésű — lökettel.

Tíz (10) 500 ml űrtartalmú rázólombik mindegyikébe 50 ml főfermentációs tápközeget töltünk, melynek összetétele:

4% szójababolajos liszt 2% halolaj gyártási melléktermék

0,2% K₂HPO₄ 0,2% NaNO₃

0,1 % MgSO₄ · 7 H₂O 1,0% koleszterin

A lombikokat és tartalmukat autoklávban 20 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Mindegyik lombikot inokuláljuk a fentiek szerint kapott oltóanyag tápközeg 2 ml-nyí mennyiségével. A fő fermentációt 30 °C hőmérsékleten kezdjük vibrációs rázógépen, percenként 120 — 7 cm kitérésű — lökettel. Az inkubálás kezdetétől számított 160 óra után az inkubálást befejezzük. A kombinált fermentációs táptalajt kétszer extraháljuk 2 1 etil-acetáttal. A kombinált extraktumból az oldhatatlan anyagokat, pl. sejteket kiszűrjük; az extraktum szteroid tartalma az elemzés tanúsága szerint: 0,05 g visszamaradt koleszterin szubsztrátum, 2,65 g HPD és 0,22 g 4HP.

Eszerint a HPD és a 4HP kitermelése — a felhasznált szterinhez viszonyítva — 85%-os. A melléktermékek között van 0,03 g ADD. Az extraktumot szilikagélen kromatografáljuk, majd 20%-os etil-acetát-n-hexánnal eluáljuk, így elkülönítjük a HPD-t, a 4HP-t és a visszamaradt szubsztrátumot és a melléktermékeket. A HPD, illetve 4HP frakciók mindegyikét dúsítjuk, majd tisztítjuk az oldószer bepárlásával, ezután kétszer átkristályosítjuk 10%-os etanol-heptánból, így nyerünk tiszta kristályos alakban 2,45 g HPD-t és 0,17 g 4HP-t.

Olvadáspontjuk, tömegspektrogramjuk, NMR és IR számuk megegyezik az irodalomban található értékekkel.

3. példa

Megismételjük az 1. példát azzal az eltéréssel, hogy a következő összetételű vizes fő fermentációs tápközeget alkalmazzuk:

6% őrölt szójabab 1% élesztő

0,25% K₂HPO₄ 0,1 % MgSO₄.7 H₂O valamint koleszterin a 2. táblázat szerinti koncentrációban.

Az elemzés eredményét a 2. táblázat mutatja.

2. táblázat

Koleszterin koncentráció (súlyszázalék)	HPD (g)	4HP (g)	Maradék koleszterin (g)
0,2	0,68	0,06	0,0
0,5	1,35	0,10	0,0
0,8	2,57	0,13	0,15
1,0	2,81	0,18	0,40

4. példa

Az 1. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy 5 1 űrtartalmú rázólombikba töltünk 800 ml tápközeget, mely tartalmaz 1,0% glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont, 0,5% Tween—80 felületaktív anyagot (a Kao Atlas Co., Ltd. védjegye), 1,0% koleszterint és a fennmaradó részben vizet; továbbá, hogy a fő fermentációt 30 °C-on végezzük vibrációs rázógépen, percenként 100 — 7 cm kitérésű — lökettel, 150 órán át, miután a lombikot az oltóanyag tápközeg 20 ml-nyi mennyiségével inokuláltuk. A kapott etil-acetát extraktum elemzése kimutatja 0,90 g HPD és 0,76 g 4HP jelenlétét. Az átalakulatlan koleszterin-maradék mennyisége 4,8 g.

5. példa

A következő összetételű oltóanyag tápközeget készítjük:

1,0% glükóz 1.0% húskivonat a fenn1,0% pepton maradó rész víz

-511

500 ml űrtartalmú lombikba 100 ml mennyiséget töltünk az oltóanyag tápközegből. A lombikot és annak tartalmát autoklávban sterilizáljuk 15 percen át 120 °C hőmérsékleten. A közeget oltókacsnyi Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617 kultúrával inokuláljuk és az inokulált közeget 72 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten vibrációs rázógépen, percenként 120 — 7 cm kitérésű — löketet alkalmazva.

Tíz (10) 500 ml urtartalmú rázólombik mindegyikébe ml fő fermentációs tápközeget (pH 7,0) töltünk, melynek összetétele:

5% szójababolajos liszt

0,2% K₂HPO₄

0,1% MgSO₄.7 H₂O és a fennmaradó rész víz.

A lombikokat és azok

1,0% gyapotmag olaj

0,2% NaN0₃

0,8% koleszterin tartalmát autoklávban sterili15 záljuk 20 percen át 120 °C hőmérsékleten. Mindegyik lombikot a fentiek szerint kapott oltóanyag tápközeg 2 ml-nyi mennyiségével inokuláljuk. A fő fermentációt 30 °C hőmérsékleten kezdjük vibrációs rázógépen, percenként 120 — 7 cm kitérésű — löketet alkalmazva. Az inkubálás kezdetétől számított 150 óra után leállítjuk az inkubálást. A kombinált fermentációs talajt 2 1 etil-acetáttal kétszer extraháljuk. Az oldhatatlan anyagokat, pl. sejteket kiszűrjük, az extraktum HPD-, illetve 4HP-tartalmát gázkromatográfiás elemzéssel határozzuk meg. Az eredményeket a 3. táblázat mutatja. Az extraktumot szilikagélen kromatografáljuk, 20%-os etil-acetát-n-hexánnal eluáljuk, így elkülönítjük a kapott HPD-t és 4HP-t, a koleszterin szubsztrátumot és a melléktermékeket. A HPD és 4HP frakciókat 10%-os etanol-heptánból való átkristályosítással tisztíthatjuk.

A fent leírt inkubációt megismételjük azzal az eltéréssel, hogy a koleszterol szubsztrátum helyett alkalmazunk (2:1 arányú) β-szitoszterin és kampeszterin elegyet, koleszt-4-én-3-ont, koleszta-l,4-dién-3-ont vagy koleszteril-oleátot.

Az eredményeket ugyancsak mutatja a 3. táblázat. Összehasonlíthatóság céljából mindenkor mutatjuk azokat az eredményeket is, melyeket akkor kapunk, ha gyapotmagolajat nem adunk hozzá.

Az alkalmazott gyapotmagolaj közel 100%-os gliceridelegy. Ez a további példákban alkalmazott olajokra szintén érvényes.

3.táblázat

Szubsztrátum	Hozzáadott szubsztrátum	Termék (g)	Maradék szubsztrátum (g)
HPD	4HP
koleszterin	nincs	0,62	0,04	2,68
	gyapotmagolaj	2,36	0,14	0,13
szitoszterin+ kampeszterin	nincs	0,43	0,03	3,12
	gyapotmagolaj	1,63	0,08	0,45
koleszt-4-én-3-on	nincs	0,44	0,02	3,25
	gyapotmagolaj	1,16	0,08	.2,05
koleszta-1,4-dién-3-on	nincs	0,57	0,01	3,05
	gyapotmagolaj	1,89	0,03	0,65
koleszteril-oíeát	nincs	0,11	0,01	3,65
	gyapotmagolaj	0,28	0,03	3,20

6. példa

Az 5. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy különféle glicerideket és olajokat adunk a fő fermentációs közeghez gyapotmagolaj helyett.

Az eredményeket a 4. táblázat mutatja.

4. táblázat

Olaj	HPD-hozam (g)	4HP-hozam (8)
Nincs	0,62	0,04
Olívaolaj	2,15	0,13
Kukoricacsíraolaj	2,20	0,17
Rizskorpaolaj	2,18	0,13
Pálmaolaj	2,45	0,19
Kókuszdió olaj	2,35	0,13
Szójababolaj	2,36	0,14
Szezámolaj	2,15	0,12

45	Olaj	HPD-hozam (g)	4HP-hozam (g)	*
	Földi mogyoró-olaj	2,09	0,12
50	Lenmagolaj	2,09	0,12
	Szardíniaolaj	2,50	0,21
	Háj	2,20	0,12
	Trióiéin	2,09	0,12
	Tripalmitin	2,33	0,13
55	a-monosztearin	1,72	0,10
	α,α'-disztearin	1,75	0,10

₆₀ 7. példa

Az 5. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy az 1%-nyi gyapotmagolaj helyett trisztearint alkalmazunk különböző koncentrációkban. Az eredményeket az 5. 65 táblázat mutatja:

-6180021

5. táblázat

A trisztearin koncentrációja (súlyszázalék)	Termék
HPD(g)	4HP(g)
0	0,62	0,04
0,10	0,98	0,07
0,2	1,15	0,07
0,3	1,43	0,08
0,5	1,75	0,10
1,0	2,40	0,15
1,5	2,61	0,15
2,0	2,55	0,16
3,0	1,55	0,08
4,0	1,21	0,07
7,0	0,80	0,05
10,0	0,70	0,05
8. példa
Az 5. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott fő fermentációs tápközeg összetétele a
következő:
2% glükóz	0,2% (NH₄)₂SO₄
0,15% K₂HPO₄	0,1% MgSO₄.7 H₂O
1,0% pálmaolaj	1,0% élesztő
4% növényi olajos liszt a fennmaradó rész víz

Az eredményeket a 6. táblázat mutatja:

6. táblázat

Növényi olajos liszt	Termék (g)
HPD	4HP
Nincs	0,42	0,07
Gyapotmagolajos liszt	2,17	0,12
Szójababolajos liszt	2,25	0,20
Repcemagolajos liszt	1,60	0,13
Szezámolajos liszt	2,01	0,21
Pórsáfrányolajos liszt	0,95	0,11

9. példa

Az 5. példát megismételjük azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott fő fermentációs közeg a következő: 2% halolaj gyártási melléktermék 0,2% NaNO₃

0,2% K₂HPO₄ 0,8% koleszterin

0,1% MgSO₄.7 H₂O

6,0% őrölt szójabab (mintegy 17% gliceridtartalom) a fennmaradó rész víz

A fentiek szerinti eljárást megismételjük azzal az eltéréssel, hogy az őrölt szójabab helyett 3,0% őrölt föld mogyorót (mintegy 35% gliceridtartalom), 2,5% őrölt repcemagot (mintegy 40% gliceridtartalom) vagy 2,5% őrölt szezámot (mintegy 40% gliceridtartalom) alkalmazunk.

Az eredményeket a 7. táblázat mutatja:

7. táblázat

Olajos mag · Olajos virág	Termék (g)
HPD	4HP
5
Nincs	0,82	0,09
Szójabab	2,67	0,25
Földimogyoró	2,48	0,20
Repcemag	2,02	0,20
10 Szezám	1,89	0,18

Miután teljes részletességgel leírtuk a találmányt, szakember számára nyilvánvaló, hogy a megadott példákhoz képest számos változtatás és módosítás képzel15 hető el anélkül, hogy azok folytán a találmányi gondolattól ejtérnénk.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás 20a-hidroxi-metil-pregna-l,4-dién-3-on, 20a-hidroxi-metil-pregn-4-én-3-on vagy ezek elegyének előállítására mikroorganizmus alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy tenyésztjük a Mycobacterium parafor25 tuitum komplex (ATCC 25790, ill. 25795) önmagában ismert módon kialakított mutánsát, előnyösen a Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617 törzset és valamely szterin(származék) szubsztrátumot e tenyészettel inokulált tápközegben reagáltatunk.

30
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kiindulási anyagként valamely szterint, annak C₃ észterszármazékát, C₃ éterszármazékát vagy ezek l,4-dién-3-on, illetve 4-én-3-on szerkezetű oxidációs származékait alkalmazzuk szubszt35 rátumként.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reagensként alkalmazott mutánst, előnyösen a Mycobacterium parafortuitum komplex MCI—0617 törzset oly módon alakít-

40 juk ki, hogy e mutáns alaptörzsét (ATCC 25790, ill. 25795) ibolyántúli fénysugárral kezeljük és az így kapott mutánst izoláljuk, abból inokulumot készítünk és azzal inokuláljuk az oltóanyag tápközeget.
4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás

45 foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakcióhoz olyan tápközeget alkalmazunk, mely legalább egy gliceridet tartalmaz, s melynek glicerid koncentrációja legalább 0,1 súlyszázalék.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja,

50 azzal jellemezve, hogy olyan tápközeget alkalmazunk, mely a gliceriden kívül legalább egyfajta növényi olajos lisztet is tartalmaz.
6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakció-

55 hoz alkalmazott tápközeg pH 5—10, előnyösen 6—9 közötti értékre, az inkubációs hőmérsékletet 20—40, előnyösen 30—35 °C-ra állítjuk be és 3—20 nap közötti ideig inkubáljuk.