DE2625333C2 - Verfahren zur Herstellung von 17-Hydroxyandrosta-1,4-dien-3-on und/oder Androsta-1,4-dien-3,17-dion durch mikrobiologische Oxidation von Sterinen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 17-Hydroxyandrosta-1,4-dien-3-on und/oder Androsta-1,4-dien-3,17-dion durch mikrobiologische Oxidation von Sterinen

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DE2625333C2 DE2625333A DE2625333A DE2625333C2 DE 2625333 C2 DE2625333 C2 DE 2625333C2 DE 2625333 A DE2625333 A DE 2625333A DE 2625333 A DE2625333 A DE 2625333A DE 2625333 C2 DE2625333 C2 DE 2625333C2
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Description

n-Hydroxyandrosta-M-dienO-on, auch als 1-Dehydrotestosteron (DHT) bezeichnet, und Androsta-1.4-dien-3,17-dion (ADD) entstehen bei der mikrobiologischen Oxidation von,Slerinen, allerdings in schlechten Ausbeuten, weil die Oxidation nicht auf der Stufe dieser Verbindungen stehen bleibt.
In der US-Ps 33 88 042 ist die mikrobiologische Oxidation von Sterinen zu ADD in einem Kulturmediun und in Gegenwart eines Chelatisierungsmittels beschrieben, das mit Eisen- und Kupfeirionen Chelate bildet. 30 Bei diesem Verfahren wird die weitere Oxidation von ADD vermieden, doch fand das Verfahren keinen Eingang in die Technik wegen der unbefriedigenden Ausbeuten und Umsätze.
Bekanntlich werden zur mikrobiologischen Oxidation von Steroiden Kulturmedien verwendet, die als Kohlenstoffquelle Fette und Öle enthalten. In Beispiel 1 der US-PS 27 56 179 ist die mikrobiologische Oxidation von Progesteron zu ADD und L HT unter Verwendung eines Kulturmediums mit einem Gehalt von 0,22 Ge-35 wichtsprozent Sojabohnenöl und etwa 1,5 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl beschrieben. In Beispiel 1 der US-PS 28 42 566 ist die mikrobiologische Oxidation von 6a-Methyl-ll-ketoprogcsteron zu l-Dehydro-6amethyladrenosteron und l-Dehydro-off-methyl-l 1-kctotestosteron in einem Nährmedium beschrieben, das etwa 0,1 Gewichtsprozent Specköl enthält. In Beispiel 4 A der US-PS 29 81 659 ist die mikrobiologische Oxidation von Progesteron-20-äthylenketal zu l-Dehydroprogesteron-20-äthylenketa! in einem Nährmedium beschrieben, das etwa 1,5 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl und etwa 0,25 Gewichtsprozent Sojabohnenöl enthält. In Beispiel 5 A ist die mikrobiologische Oxidation von Progesteron-20-äthylenketal zu 1-Dehydroprogesteron-20-äthylenketal in einem Nährmedium beschrieben, das etwa 0,22 Gewichtsprozent Sojabohnenöl oder etwa 0,2 Gewichtsprozent Specköl enthält. In Beispiel III der US-PS 30 10 876 ist die mikrobiologische Oxidation von Reichsteins Substanz S (Cortexolon) zu Kendalls Verbindung F (Cortisol) in einem Nährmedium beschrieben, das etwa 0,27 Gewichtsprozent (10 ml/3,8 Liter) Sojabohnenöl enthält. Die in der US-PS 3047 469 beschriebene Erfindung betrifft die Dehydrierung des Rings A von Steroiden, die in diesem Ring vollständig oder partiell gesättigt sind, in einem Nährmedium, das etwa 0,22 Gewichtsprozent Sojabohnenöl enthält. Die in der US-PS 35 36 586 beschriebene Erfindung betrifft die 1-Dehydrierung und 16-Hydroxylierung eines in der 1,2-Stellung ge sättigten Steroids, das in der 16-Stellung ein Wasserstoffatom trägt, in einem Nährmedium, das etwu 0,22 Gewichtsprozent Sojabohnenö! und etwa 1,5 bis 2,0 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl enthält. In der JP-AS 16 147/1971 ist in Beispiel 4 die mikrobiologische Oxidation von Cholesterin zu ADD und Androst-4-en-3,17-dion in einem Nährmedium beschrieben, das etwa 0,1 Gewichtsprozent Sojabohnenöi enthält. In der JP-AS 29 193/1971 ist in Beispiel 1 die Verwendung eines Nährmediums mit 0,2 Gewichtsprozent Soja tohncnöl bei der mikrobiologischen Oxidation von Lithocholsäure zu ADD und Androst-4-en-3,17-dion be- schrieben. Schließlich ist in der Zeitschrift Biotechnology and Bioengineering, Bd. 11 (1969), Seiten 1255 bis 1270, die Verwendung eines etwa 0,22 Gewichtsprozent Sojabohnenöl und etwa 1,5 bis 2,0 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl enthaltenden Nährmediums bei der mikrobiologischen Oxidation von9cr-Fluor-l Iß, 17,21 -trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21-acetat zu9a-Fluor-l l./J,16a\I7,2l-tetrahydroxypregna-l,4-dien-3,20-dion(Tri-
6ö amcinolon) beschrieben.
Experimentell wurde festgestellt, daß der Zusatz derart geringer Mengen an Glycerid bzw. glyceridhaltigem Material bei der mikrobiologischen Oxidation von Sterinen bzw. Steroiden nur eine geringe Erhöhung der Ausbeute an DlIT und ADD zur Folge hat. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von I7-Hydroxy androsta-l,4-dien-3-on und/oder Androsta-l,4-dien-3,l7-dion durch mikrobiologische Oxidation von Sterinen oder deren J4-3-Keto- oder .dM-3-Ketoderivaten in einem Kulturmedium, das einen Chelatbildner für F.isen- und Kupferionen enthält, unter Zusatz eines oder mehrerer Glyceride, Fette, Öisamen und/oder Ölfrüchten, zu schaffen, das die genannten Steroide in hoher Ausbeute und Konzentration liefert. Die Lösung dieser
Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß bei Durchführung der Fermentation in einem Kulturmedium, das Glyceride, Fette, Ölsamen oder Ölfrüchte in einer Menge entsprechend 0,3 bis 4,0 Gewichtsprozent Glyceride, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums, enthält, DHT und ADD in hoher Ausbeute und Konzentration entstehen.
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
In Fig. 1 ist die Konzentration (mg/50 ml) von Cholesterin (A), Cholest-4-en-3-on (B), Cholesta-l,4-dien-3-on (C), DHT (D) und ADD (E) gegen die Fermentationszeit in Stunden aufgetragen.
Nach der US-PS 33 88 042 verläuft die mikrobiologische Oxidation von Stcrinen vermutlich nach folgendem Reakxionsschema:
R R
HO
A/
Sterin
4-En-3-on-Derivat des Sterir -;
l,4-Dien-3on-Derivat des Sterins
OH
Androst-4-en-3,17-dion
ADD
In den allgemeinen Formeln bedeutet R eine Seitenkette mit 8 bis IO Kcn'enstofTatomen.
Die im crfindungsgemüßen Verfahren verwendeten Ausgangssteroide sind Sterine, ihre jM-Keto- und <dM-3-Ketoderivate. Sterine weisen in der 3-Stellung eine Hydroxylgruppe, in der 5-Stellung eine Doppelbindung, in der I7-Stellung eine Seitenkette mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen und in einigen Fällen in der 7-Stellung eine Doppelbindung auf. Spezielle Beispiele für diese Sterine sind Cholesterin. Stigmasterin ramne-
sterin, Sitosterin, Ergosterin, Brassicasterin und Fucosterin. Besonders bevorzugte Ausgangssleroide sind Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin und Sitosierin. Als Ausgangsstcroide können auch die entsprechenden JJ-3-Keto- und z<ll4-3-Ketoderivate eingesetzt werden. Die Konzentration des Ausgangsstcroiüs im Kulturmedium ist nicht kritisch. Im allgemeinen beträgt sie etwa 0,05 bis 5 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 0,1 bis 3 Gewichtsprozent.
Erfindungsgemäß wird dem Kulturmedium mindestens ein Glycerid, Fett, Ölsamen oder Ölfrüchte in einer Menge entsprechend 0,3 bis 4,0 Gewichtsprozent Glycerid zugesetzt. Spezielle Beispiele für die verfahrensgemäß eingesetzten Glyceride sind Monoglyceride, Diglyceride und Triglyceride. Es können einheitliche Glyceride und auch gemischte Glyceride mit zwei oder drei unterschiedlichen Fettsäureresten verwendet
if, werden. Die Fettsäurereste können sich von ungesättigten und/oder gesättigten Fettsäuren ableiten. Vorzugsweise enthalten die Fettsäurereste höchstens 26 Kohlenstoffatome. Spezielle Beispiele für verwendbare Monoglyceride sind σ-MonoacetinjS-Monoacetin, a-Monopalmitin, /f-Monopalmilin, a-Monoslearin.^-Mono.stearin, or-Monoolein undjS-Monoolein, Diglyceride, wie a.a-Diacetin, a\/J-Diacetin, α,σ'-Dipalmitin, ejJ-Dipalmitin, α,σ'-Distearin. a^-Distearin, α,β-Diolein und aJJ-Dio\tin, sowie deren Triglyceride, wie Triacctin, Trilaurin.
Trimyristin.Tripalmitin.Tristearin und Triolein. Beispiele für gemischte Glyceride sind l-Aceto-2,3-dipalmitin, l-Palmito^-dicaprin, l-Lauro^-myristoO-palmitin, 2-Oleo-l,3-dipalmitin und 2-Stearo-l,3-diolein.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können als Glyceride auch Fette verwendet werden. Der Ausdruck Fette umfaßt pflanzliche Fette und Öle sowie tierische Fette und Öle. Spezielle Beispiele für verwendbare pflanzliche Fette sind Leinöl, Perillaöl, Holzöl, Sesamöl, Maisöl, Rapsöl, Baumwollsamcnöl, Saffloröl, Sojabohncn- öl, Sojalecithin. Kamelienöl, Reisklcienöl, Olivenöl, Ricinusöl, Erdnußöl. Kokosnußöl, Palmöl und PaImkernöl. Besonders bevorzugt auf Grund ihrer Verfügbarkeit sind Baumwollsamenöl, Sojabohnenöl, Rapsöl. Palmöl und Palmkernöl.
Beispiele für tierische Fette sind Fischöl, Walöl, Rindertalg. Speck. Hammeltalg. Rinderklauenöl und Lcberöl. Besonders bevorzugt sind Speck, Fischöl und Walöl.
Anstelle der Glyceride können auch glyceridhaltige Ölsamen oder Ölfrüchte eingesetzt werden. Der Ausdruck »Ölsamen« und »Ölfrüchte« schließt fetthaltige Samen uryj Früchte ein. Spezielle Beispiele für Ölsamen und Ölfrüchte sind Leinsamen, Oliven, Sesam, Rapssamen. Baumwollsamen, Sojabohnen, Erdnüsse und Reiskleie. Die Ölsamen und Ölfrüchte werden so fein gemahlen, datJ sie von den verfahrensgemäß eingesetzten Mikroorganismen gut assimiliert werden können.
.10 Die Glyceride. Fette, Ölsamen und Ölfrüchte können einzeln oder als Gemisch verwendet werden. Sie werden dem Kulturmedium in solcher Menge einverleibt, daß 0,3 bis 4,0. vorzugsweise 0.5 bis 3.5, und insbesondere 0,7 bis 3.0 Gewichtsprozent Glyceride, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums, vorliegen.
Die zuzusetzende Menge der Fette wird auf der Grundlage des Glyceridgehaltes der Fette berechnet. Da jedoch die Glyceride den Hauptbestandteil der Feite ausmachen, ist das Gewicht der Fette nahezu gleich dem Gewicht der Glyceride.
Die Menge der zuzusetzenden glyceridhaltigen Ölsamen oder Ölfrüchte wird ebenfalls auf der Grundlage des Giyceridgehaiies dieser öisamen oder Ölfrüchte berechnet, in der nachstehenden Tunciie ist tier Giyceriugehalt typischer Ölsamen und Ölfrüchte zusammengefaßt.
Der Zusatz von pflanzenölhaltigem Mehl zusammen mit den glyceridhaltigen Substanzen zum Kulturmedium hat eine besonders günstige Wirkung bei der Bildung von DHT und ADD und bewirkt eine beträchtliche Steigerung der Ausbeute. Der Ausdruck »pfianzenölhaltige Mehle« bedeutet die Abfälle pflanzlicher Fette und Öle, nämlich die Rückstände, die bei der Extraktion von ölhaltigen Samen oder Früchten anfallen. Diese Mehle enthalten in Abhängigkeit vom angewandten Extraktionsverfahren unterschiedliche
w Mengen an Proteinen und Fetten. Im erfindungsgemäßen Verfahren können beliebige pfianzenölhaltige Mehle eingesetzt werden. Wegen der leichteren Verfügbarkeit werden die im Handel erhältlichen pflanzenölhaltigen Mehle bevorzugt. Beispiele für derartige Mehle sind Sojabohnenmehl, Leinsamenmehl, Rapssamenmehl, Baumwollsamenmehl, Sesammehl. Erdnußmehl und Safflormehl.
Ölsamen oder Ölfrucht Cilyccridgehalt, Cicw.-%
Oliven 40-70
Sojabohnen 15-23
Baumwollsamen 16-35
Mais 4- 6
Sesam 35-56
Rapssamen 22-50
Erdnüsse 29-39
Kamelie 35
Ölpalme 51-67
Kokosnußpalme 65-75
Nachstehend isl der (.ilvceridgehall solcher Mehle angegeben:
Glycericlgehall,"/
Sojabohnenmehl 1.2-1.8
Rapssamcnmchl 1,2-1,8
Lcinsumcnmchl 1,2-1,8
Scsunimchl 7-9
Ba um wollsame η mehl weniger als 2
Salllormehl weniger als I
Da der Glyceridgchall dieser Mehle, mit Ausnahme von Sesammehl, sehr gering ist, ist er für die Berechnung des Glyceridgehalts des Nährmediums im allgemeinen vernachlässigbar.
Die zuzusetzende Menge des pflanzenölhaltigen Mehls hängt von der Menge der zugesetzten Glyceride (glyccridhaltige Substanz) ab. Im allgemeinen beträgt die Gewichtsmenge etwa die 0,1- bis 50luche, vorzugsweise die etwa 0,3- bis 301'achc und insbesondere die etwa 0,6- bis 20fache Gewichtsmenge der glyceridhaltigen Substanz. Die Konzentration des pflanzenölhaltigen Mehls im Kulturmedium beträgt im allgemeinen etwa 0,3 bis 15, vorzugsweise etwa 0,6 bis 10 und insbesondere etwa 1 bis 8 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums. Der Zusatz größerer Mengen an Glycerid enthaltenden Substanzen erfordert die Auswahl spezieller Mikroorganismen, die diese Glyceride gut assimilieren.
Bei Verwendung von Mikroorganismen, die Glyceride nur in geringem Ausmaß assimilieren, erfolgt prak- ;o tisch keine mikrobiologische Oxidation. Deshalb müssen im erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen eingesetzt werden, die Sterine und Glyceride in signifikantem Ausmaß zu assimilieren vermögen. Beispiele für diese Mikroorganismen sind Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, Nocardia, Fusarium, Microbacterium, Mycobacterium, Protaminobactcr, Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Serralia, Azotobactcr, Streptomyces, Alkaligenes und Pseudomonas. Spezielle Beispiele für die vorgenannten Mikro- :> Organismen sind Arthrobacter simplex (IAM 1660; DSM 776), Brevibacterium üpolyticum (IAM 1398: DSM 778), Mycobacterium smegmatis (IFO 3083; DSM 751), Protaminobacter alboflavus (ATCC 8458; DSM 762), Nocardia erythropolis (ATCC 4277; DSM 763), Corynebacterium equi (IAM 1038; DSM 777) und Mycobacterium phlei (IFO 3158; DSM 750). Besonders bevorzugt sind Arthrobacter simplex und Brevibacterium lipolyticum.
Die Abkürzung IAM bezeichnet das Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, Tokyo, Japan, und die Abkürzung IFO das Institute for Fermentation, Osaka, Japan.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die vorgenannten Mikroorganismen beschränkt. Es können im übrigen Gemische von zwei oder mehr der Mikroorganismen eingesetzt werden.
Dem Kulturmedium werden außer den glyceridhaltigen Substanzen und/oder pflanzenölhaltigem Mehl Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Verbindungen einverleibt, Beispiele für verwendbare Kohicnsionquciien sind Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine, a-Oiefine, und Xyioi, Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Glycerin und höhere Alkohole, Carbonsäuren, wie Bernsteinsäure, Essigsäure und höhere Fettsäuren und deren Salze, sowie Saccharide, wie Stärke, Maltose, Sucrose, Glucose, und Rhamnose.
Dem Nährmedium können ferner natürliche Kohlenstoffqucllen, Siickstoffquellen und andere Nährstoffe zugesetzt werden. Beispiele für diese natürlichen Quellen sind Melassen, einschließlich Hightcst-Melassen (invertierter Rohrzuckcrsyrup), Raffineriemelassen und Xylosemelassen, Bagasse, Maiskolben, Luzerne, Maisquellwasser, lösliche Rückstände der Alkoholdestillation, Mieki, dh. eine wäßrige Lösung eines Aminosäurengemisches, das bei Hydrolyse von Sojabohnenmehl mit Salzsäure anfällt, Fischmehl, Hefe, Kleien, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Kartoffelextrakt, Malzextrakt, Gluten, Pepton, Glutamate, Asparagin, Glycin, Casein, Caseinhydrolysat und Magermilch.
Beispiele für verwendbare anorganische Verbindungen sind Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, Kalium und Phosphor enthaltende Verbindungen, wie Dikaliumhydrogenphosphat, sowie Salze von beispielsweise Eisen, Kupfer, Magnesium, Kobalt, Zink und Calcium.
Ferner können im Kulturmedium noch andere Bestandteile, wie Vitamine, vorliegen, sofern sie die Wirkung der Hauptbestandteile nicht stören.
Die Zusammensetzung des Kulturmediums hängt von der Art des verwendeten Mikroorganismus ab. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Kalium, Phosphor und Magnesium sind kritische Bestandteile in den Kulturmedien. Erforderlichenfalls kann dem Kulturmedium ein Antischaummittel, beispielsweise ein Polyoxyalkylenglykol, einverleibt werden. Der Zusatz ist jedoch nicht immer erforderlich, da die Glyceride enthaltenden Substanzen auch als Antischaummittel wirken. Das Kulturmedium kann ferner eine grenzflächenaktive Verbindung enthalten. Der Zusatz einer grenzflächenaktiven Verbindung ist nicht unbedingt erforderlich, doch läßt sich das Kulturmedium leichter handhaben. Beispiele fur verwendbare grenzflächenaktive Verbindungen sind Polyoxyäthylensorbitanmonostearat, Sorbitanmonopalmitat und Polyäthylenglykoimonostearat.
Zur Erzielung hoher Ausbeuten an DHT und ADD ist es erforderlich, dem Kulturmedium auch einen Inhibitor zur Oxidation von DHT und ADD zuzusetzen. Betspiele für diese inhibitoren sind Nickel- und Kobaltsalze, sowie Chelatisierungsmittel, die mit Eisen- und Kupferionen Chelate bilden. Spezielle Beispiele für diese Chelatisierungsmittel sind 1,10-Phenanthrolin, 2,2-Dipyridyl, 8-Hydroxychinolin. N-Nitrosophenylhydroxylamin (Cupferron), Isonicotinsäurehydrazid, o-Phenylendiamin und Natrium-N.N'-diäthyldithiocarbamat. Besonders bevorzugt sind iJO-Phenanthroiin, 2,2-Dipyridyi und 8-Hydroxychinoiin.
Die Konzentration des Chelatisierungsmittels im Kulturmedium hängt von dessen Art und der Zusammensetzung des Kulturmediums ab. Im allgemeinen liegt die Konzentration im Bereich von etwa 1 χ 10's bis etwa 1 χ H) 2 molar.
Der Zeitpunkt, zu dem das Chelatisierungsmittel dem Kulturmedium zugesetzt wird, hängt von der Art des verwendeten Mikroorganismus und der Zusammensetzung des Kulturmediums ab. Im allgemeinen wird das Chelatisierungsmittel etwa IO bis 60 Stunden nach Beginn der Fermentation /ugesclzl.
Die Fermentationstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 20 bis 37°C Bei Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter oder der Gattung Brevibacterium liegt die bevorzugte Fermentationstemperatur bei etwa 300C, während bei Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Mycobacte'ium die Fermentationstemperatur vorzugsweise etwa 350C beträgt.
Der anzügliche pH-Wert des Kulturmediums liegt im Bereich von 5 bis 8, vorzugsweise bei etwa 7.
Das Ausgangssteroid wird in üblicher Weise, beispielsweise durch Erhitzen oder durch Behandlung mit Heißdampf sterilisiert und beispielsweise in Form eines Pulvers oder einer Lösung in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, oder in Form einer Suspension, die durch Behandlung mit Ultraschall hergestellt worden ist, in das Kulturmedium eingespeist. Vorzugsweise werden das Ausgangssteroid und die grenzflächenaktive Verbindung gleichzeitig eingespeist, weil hierdurch eine verbesserte Dispergierung des Ausgangssteroids erreicht wird. Der Zeitpunkt der Zugabe des Ausgangssteroids zum Kulturmedium hängt von der Art des verwendeten Mikroorganismus und der Art des Ausgangssteroids ab. Im allgemeinen wird das Ausgangssteroid innerhalb 30 Stunden nach Beginn der Fermentation zugesetzt. Sofern sich der Mikroorganismus nicht gut vermehrt, kann das Ausgangssteroid auch später als 30 Stunden nach Beginn der Fermentation zugesetzt werden. Je nach der Vermehrung des Mikroorganismus kann d;is Ausganossternirl auch in An'eüon /'."»«'S'1·'71 werden.
Die glyceridhaltigen Substanzen und/oder pflanzenölhaltigen Mehle regen das Wachstum der eingesetzten Mikroorganismen in allen Stufen der mikrobiologischen Oxidation an. Deshalb werden sie im allgemeinen zu Beginn der Fermentation zugesetzt. Vermutlich sind die glyceridhaltigen Substanzen und pflanzenölhaltigen Mehle besonders wirksam bei der Oxidation der Seitenkette in der 17-Stellung des Steroids. Dementsprechend wird durch Zusatz der glyceridhaltigen Substanzen und/oder der pflanzenölhaltigen Mehle zum Zeitpunkt der Zugabe des Ausgangssteroids oder innerhalb etwa 50 Stunden nach Beginn der Zugabe des Ausgangssteroids die Ausbeute an DHT und ADD beträchtlich erhöht.
Vorzugsweise werden die glyceridhaltigen Substanzen auch in Anteilen während der Fermentation zugegeben, und die Endkonzentration wird auf den vorstehend angegebenen Bereich eingestellt, weil sie auch als Antischaummittel wirken. Der Ausdruck »Endkonzentration« bedeutet die Konzentration der gesamten Glyceride in den zugesetzten glyceridhaltigen Substanzen im Kulturmedium, obwohl der Anteil der Glyccridc als Folge der Assimilation während der Fermentation abnimmt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren fallen als Produkte DHT und ADD an. Im Hinblick auf den vorstehend angegebenen Mechanismus der Oxidation der Sterine wird ADD vermutlich durch Oxidation der Hydroxylgruppe in 17-Stellung von DHT gebildet. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß die zu Beginn der Fermentation hohe Konzentration an DHT im Verlauf der Oxidation des Ausgangssteroids abnimmt und gleichzeitig die Konzentration an ADD zunimmt. Daraus folgt, daß zur Erzielung hoher Konzentrationen an DHT die Fermentation auf einer frühen Stufe der Oxidation abgebrochen werden muß, während zur Erzielung einer hohen Konzentration an ADD die Fermentation längere Zeit fortgesetzt werden muß.
Die zur Herstellung von DHT oder ADD in hoher Konzentration erforderliche Fermentationszeil hängt vom eingesetzten Mikroorganismus, der Fermentationstemperatur und der Zusammensetzung de« Kulturmediums ab. Zur Er/islung hoher Konzentrationen an DHT wird die Fermentation vorzugsweise etwa 15 bis 35 Stunden nach dem Zeitpunkt der Zugabe des Chelatisierungsmittels abgebrochen. Zur Erzielung hoher Konzentrationen an ADD wird dagegen die Fermentation etwa 35 bis 90 Stunden nach Zusatz des Chelalisierungsmittels beendet. Nach beendeter Fermentation werden das entstandene DHT und ADD nach üblichen Methoden aus der Kulturbrühe isoliert. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Abtrennung der Produkte ist die Extraktion der Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Chloroform, Diäthyläther, Benzol, Toluol oder Äthylacetat. Der erhaltene Extrakt wird eingedampft und der Rückstand durch Umkristallisation aus einem Lösungsmittel, wie Cyclohexan, oder durch Umfällung aus einer Kombination von Lösungsmitteln, wie Xylol und Hexan, gereinigt. Die Produkte können auch an Kieselgel oder Aluminiumoxid getrennt und chromatographisch gereinigt werden. Als Laufmittel kommen beispielsweise Petroläther, Benzol, Chloroform, Diäthyläther oder Methanol in Frage. Die voneinander getrennten Produkte können durch weitere Umkristallisation aus einem Lösungsmittel gereinigt werden. Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Produktanalyse erfolgt durch Gaschromatographie. Die Prozentangaben beziehen sich aufdie integrierten Flächenwertc. Die Prozentangaben in den Beispielen beziehen sich auf Gewichtsprozent, sofern nichts anderes angegeben ist. Die mit * gekennzeichneten Versuche sind Vergleichsversuche.
Beispiel 1
Es wird ein Impfmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
1,0% Hefeextrakt,
1,0% Fleischextrakt,
1,0% Pepton,
Rest Wasser.
Dec pH-Wert des Impfmediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. 100 ml des Impfmediums werden in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 15 Minuten bei 1200C
sterilisiert und sodann abgjkühlt. Danach wird daj Medium mit Arthrobacter simplex (IAM 1660) beimpft und 48 Stunden bei 280C auf einer Drehschüttelmaschine mil einem Hub von 7 cm und 130 Ausschlügen pro Minute inkubiert.
!■"in Hauptfermenlalion.smedium der gleichen Zusammensetzung wie das Impfmediuni, jedoch mit der in Tabelle I angegebenen Menge an Baumwullsamenöl, wird dem Medium bis zur angegebenen Ko-.zetitration > zugesetzt. Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. In einen 500 ml fassenden Schüttelkolben werden 50 ml des Hauptfermentationsmediums gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei 1200C sterilisiert und sodann abgekühlt. Hierauf wird der Kolben mit 2 ml der erhaltenen lmp!Vulturbrühe versetzt und bei 300C auf einer Drehschüttelmaschine mit einem Hub von 7 cm und 130 Ausschlägen pro Minute inkubiert. Ό
20 Stunden nach Beginn der Inkubation werden 150 mg Cholesterin suspendiert in 2 ml Wasser zugegeben. 28 Stunden nach Beginn der Inkubation werden 4,0 mg 2,2'-Dipyridyl zugesetzt. 85 Stunden nach Zusatz des 2,2'-Dipyridils wird die Inkubation abgebrochen. Die Fermentationsbrühe wird mit 150 ml Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird eingedampft, dir Rückstand an Kieselgel chromatographiert und mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (1:1) eluiert. Hierdurch wird ADD von intermediären Oxidationsprodukten und dem Ausgangssteroid abgetrennt. Die ADD-Ausbeute ist in Tabelle I angegeben.
Bei Verwendung eines Gemisches vonjS-Sitosterin und Campesterin (2:1), Stigmasterin, Cho!est~4-en-3-on oder Cholesta-l,4-dien-3-on anstelle von Cholesterin wird das vorstehend beschriebene Verfahren wiederholt.. Außerdem wird das Verfahren ohne Zusatz von Baumwoiisamenoi wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Tabelle I
Versuch Substrat
Konzentration von
Baumwoiisamenoi
üew.-%
ADD-Ausbeule
mg
Restliches
Substrat
mg
I* Cholesterin
2* Cholesterin
3 Cholesterin
4 Cholesterin
5 Cholesterin
6 Cholesterin
7 Cholesterin
8 Cholesterin
9 Cholesterin
10 Cholesterin
11 Cholesterin
12 Sitosterin + Campesterin (2:1)
13 Sitosterin + Campesterin (2:1)
14 Sitosterin + Campesterin (2:1)
15 Sitosterin + Campesterin (2:1)
16 Stigmasterin
17 Stigmasterin
18 Cholest-4-en-3-on
19 Cholest4-en-3-on
20 Cholesta-l,4-<iien-3-on
21 Cholesta-l,4-dien-3-on
0 4,7 53,2
0,15 5,2 45,3
0,3 12,6 25,3
0,5 15,7 18,7
0,7 18,8 7,5
1.0 25,8 0
1,5 27,2 0
2,5 20,8 2,2
3,0 16,4 10,2
3,5 13,5 12.8
4,0 10,0 13,6
0 2,0 75,0
0,3 6,8 50,0
0,5 6,9 48,8
1,5 9,7 35,8
0 1.0 88,8
1,5 4.2 50,3
0 8.4 17,5
1,5 21,3 8,5
0 6,9 12,6
1,5 15,5 10,8
Beispiel 2 Es wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
2,0% Sucrose,
1,0% NaNO1,
1,0% Hefeextrakt, 0,25% K2HPO4,
0,03% MgSO4 · 7 H2O.
Das Nährmedium wird mit der in Tabelle II angegebenen Menge an Fett versetzt. Der Rest des Nährmediums besteht aus Wasser. Der pH-Wert des Nähnnediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt 500 ml des Nähnnediums werden in einen 500 ml fassenden Schüttelfcolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 10 Minuten bei 1200C sterilisiert und sodann abgekühlt Hierauf wird der Kolbenmhalt mit 1 ml einer Impfkuftürbrühe beimpft, die gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist Anstelle von Arthrobacter simplex 0AM 1660) wird jedoch Brevibacterium lipolyticum (IAM 1398) verwendet Das Impfmediurn wird bei 300C auf einer Drehschütteimascbine gemäß Beispiel 1 inkubiert. Nach 15 Stunden werden 200 nag Cholesterin zugesetzt 28 Stunden nach Beginn der Inkubation wird 1,0 mg 1,10-Phenanthrolin zugesetzt. IKe Inkubation wird weitere 70 Stunden fortgesetzt Danach werden die Produkte mit Äthylacetat extrahiert und gemäß Beispiel 1 voneinander getrennt Die ADD-Ausbeute ist in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabelle U
Versuch
Fett
Konzentration Gew.-%
ADD-Ausbeute mg
1* kein Zusatz 0 3 12
2* Sojabohnenöl 0,15 15
3 Sojabohnenöl 0,3 20
4 Sojabohnenöl 0,5 37
5 Sojabohnenöl 1,0 39
6 Sojabohnenöl 2.0 41
7 Sojabohnenöl 3,0 25
8 Sojabohnenöl 4,0 15
9 Sojalecithin 1,0 38
10 Sojaiecithin 2,0 38
11 Sojalecithin 3,0 30
12 Sojalecithin 4.0 18
13 Erdnußöl 2,0 40
14 Sesamöl 2,0 30
15 Olivenöl 2.0 32
16 Maisö! 2,0 33
17 Rapsöl 2,0 38
18 Reiskleicnöl 2,0 35
19 Palmöl 2.0 35
20 Kokosnußö! 2.0 36
21 Baumwollsamcnöl 2,0 40
22 rohes Sojabohnenöl 2,0 32
23 Speck 2,0 29
24 Walöl 2,0 32
25 Ricmusöl 2,0 38
26 Sojabohnenöl + Ricinusöl 2,0 + 0.3 43
Beispiel
Beispiel 2 wird wiederholt, anstelle von 1,10-Phenanthrolin werden jedoch 3,0 mg 8-Hydro)iychinolin verwendet. Anstelle des Fetts wird das in Tabelle III angegebene Glycend in der angegebenen Menge eingesetzt. Die Inkubation wird 28 Stunden nach Beginn der Zugabe des 8-Hydroxychinolins abgebrochen (56 Stunden nach Beginn der Inkubation). Wenn die Inkubation auf dieser frühen Stufe abgebrochen wird, bildet sich neben ADD auch DHT. Nach beendeter Inkubation wird die Fermentationsbrühe gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Tabelle III Glycerid Konzentration Ausbeute DHT
Versuch ADD mg
Gew.-% mg 2
kein Zusatz 0 14 14
I* Tristearin 0,5 19 18
2 Tristearin 1,0 25 16
3 Tristearin 1,5 27 16
4 Tristearin 2,0 23 16
5 Tristearin 3,0 19 5
6 Tristearin 4,0 15 25
7 Triolein 1,5 21 18
8 ff-Monostearin 1,5 27 14
9 ff.ff'-Distearin 14 20 16
10 Tripalmitin 1,5 26
11
In Fig. 1 ist die Beziehung zwischen der Inkubationszeit und der Konzentration an Cholesterin und den entstandenen Oxidationsprodukten in Versuch 4 dieses Beispiels erläutert. 25
Beispiel 4 Es wird ein Impfmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
2,0% n-Paraffine (hauptsächlich Cu-Paraffin),
0,5% Ammoniumsulfat,
0,25% K2HPO,,
0,1% MgSO4-7 H2O,
0.5% Maisquellwasser, Rest Wasser. 35
Der pH-Wert des Impfmediums wird mit Natronlauge auf 7,5 eingestellt. 100 ml des Impfmediums werden in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 15 Minuten bei 12O0C sterilisiert und danach abgekühlt. Hierauf wird das Impfmedium mit Nocardia erythropolis (ATCC 4277) beimpft und 35 Stunden bei 3O0C auf einer Drehschüttelmaschine gemäß Beispiel 1 inkubiert. 40
Es wird ein Hauptfermentationsmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
1,0% Glucose,
0,5% Hereextrakt,
0,5% Malzextrakt, 45
0,5% Fleischextrakt,
0,1% K2HPO4,
0.02% MgSO4 · 7 H2O,
1,0% Rapsöl.
Der Ph-Wert des Mediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eintestellt. 50 mi des Hauptfermentationsmediums werden in einen 500 ml fassenden Schüttelkolbcn gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei I2Ü°C sterilisiert und sodann abgekühlt. Hierauf wird der Kolben mit 2 ml der erhaltenen Impfkulturbrühe beimpft und bei 300C auf einer Drehschüttelmaschine gemäß Beispiel I inkubiert. 20 Stunden nach Beginn der Hauptfermentation werden 150 mg Cholesterin zugesetzt. 28 Stunden nach Beginn der Hauptfermentaiion 55 werden 4,7 mg 2,2-Dipyridyl zugegeben. 70 Stunden nach Beginn der Zugabe des 2,2-Dipyridyls wird die Inkubation abgebrochen und die Kulturbrühe gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 12 mg ADD. Bei der Wiederholung des Versuchs, jedoch ohne Zusatz von Rapsöl, werden 8 mg ADD erhalten.
Beispiel 5 AO Es wird ein Impfmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
1,0% Glucose,
0,3% Fleischextrakt, 65
1,0% Pepton,
0,5% NaCI. Rest Wasser.
Der pH-Wert des Impfmediums wird mit Natronlauge auf 7,2 eingestellt. 100 m! des Impfmediums werden in einen SOO ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei 1200C sterilisiert und sodann abgekühlt. Hierauf wird der Kolben mit Mycobacterium phlei (IFO 3158) beimpft und 70 Stunden bei 35°C auf einer Drehschüttelmaschine gemäß Beispiel 1 inkubiert. 5 Es wird ein Hauptfermentationsmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
2,0% Maisquellwasser, 2,0% Glucose, 0,4% Natriumglutamat, 10 0,2% Asparagin,
0,2% KH2PO4, 1,0% Rapsöl, Rest Wasser.
Der pH-Wert des Mediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. 50 ml des Hauptfennentationsmediums 15 werden in einen 500 ml fassenden SchüUelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei 1200C sterilisiert und sodann abgekühlt. Danach wird der Kolben mit 2 ml der erhaltenen Impfkultur beimpft und bei 35°C auf einer Drehschüttelmaschine gemäß Beispiel 1 inkubiert.
40 Stunden nach Beginn der Hauptfermentation werden 150 mg Cholesterin zugegeben. 48 Stunden nach Beginn der Hauptfermentation werden 6,2 mg 2,2-Dipyridyl zugesetzt. 96 Stunden nach Beginn der Zugabe 2ü des 2,2'-Dißnndyls wird die Fermentation abgebrochen und die Kulturbrühe gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 25 mg ADD.
Bei der Wiederholung des Versuchs, jedoch unter Zusatz von 4,0% Sojabohnenmehl, werden 38 mg ADD erhalten. Bei der Wiederholung des Versuchs, jedoch ohne Zusatz von Rapsöl, werden 20 mg ADD erhalten.
Beispiel 6
Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch werden dem Hauptfermentationsmedium die in Tabelle IV angegebenen Zusätze einverleibt. Anstelle von 1,10-Phenanthrolin wird 2,2'-Dipyridyl verwendet. Die Ölsamen werden in 30 einem hochtourigen Schneidmischer unter Anwendung starker Scherkräfte vermählen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
Tabelle IV Konzentration 2,2-Dipyridyl ADD-Ausbeute
Versuch Zusatz Gew.-'/. mg mg
0 3,9 16
1* kein Zusatz 1.0 3,9 35
2 Rapsöl ί,Ο
2,0 		5,5 50
3 Rapsöl +
Rapssamenmehl 		2,5 5,5 45
4 Rapssamen, gemahlen 1,0 3,9 33
5 Leinöl 1,0
1,0 		5,5 42
6 Leinöl +
Leinsamenmehl 		2,5 5,5 45
7 Leinsamen, gemahlen 1.0 3,9 33
8 Sojabohnenöl 1,0
1,0 		5,5 49
9 Sojabohnenöl +
Sojabohnenmehi 		5,0 5,5 48
10 Sojabohnen, gemahlen 1,0 3,9 37
11 Sesamöl 1,0
2,0 		5,5 45
12 Sesamöl +
Sesammehl 		2.5 5,5 51
13 Sesam, gemahlen
Beispiel 7
Es wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
ι 2,0% Sucrose,
re 1,0% NaNO1,
1,0% Hefeextrakt,
Sä 0,25% K2HPO4,
0,03% MgSO4 · 7 H2O,
3,0% Rapsöl, Rest Wasser.
Tabule V ADD-Ausbeute Zugabe des Rapsöls mg
Zeitpunkt der Std. 47
0 52
20 48
30 45
42 23
70 22
90 22
Kein Zusatz Beispiel 8
10
Der pH-Wert des Nährmediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. 50 ml des Nährmediums werden in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 10 Minuten bei 1200C sterilisiert und danach abgekühlt. Hierauf wird der Kolben mit 1 ml der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Impfkultur beimpft und bei 3O0C auf einer Drehschüttelmaschine gemäß Beispiel 1 inkubiert. 25 Stunden nach Beginn der Inkubation werden 250 mg Cholesterin und 30 Stunden nach Beginn der Inkubation 5,5 mg 2,2'-Dipyridyl zugegeben. Nach der in Tabelle V angegebenen Inkubationszeit wird 1,0 mg Rapsöl zugesetzt. 110 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die Fermentationsbrühe gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das entstandene ADD abgetrennt Der vorstehend beschriebene Versuch wird wiederholt, jedoch wird der Zeitpunkt der Zugabe des Rapsöls variiert. In Tabelle V sind die Ergebnisse zusammengefaßt.
30 35
Es witJ ein Impfmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
1,0% Hefeextrakt, 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, Rest Wasser.
45
Der pH-Wert des Impfmediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. 100 ml des Impfmediums werden in sinen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 15 Minuten bei 1200C sterillisiert und sodann abgekühlt. Danach w!rd das Medium mit Arthrobacter simplex (IAM 1660) beimpft und 48 Stunden bei 280C auf einer Drehschüttelmaschine gemäß Beispiel 1 inkubiert.
Es wird ein Hauptiirmentationsmedium der gleichen Zusammensetzung wie das Impfmedium hergestellt, jedoch werden die in Tabelle VI angegebenen Mengen an Fett und Ölsamenmehl in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestelli. 50 ml des Hauptfermentationsmediums werden in eip-.a 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei 120°C sterilisiert und sodann abgekühlt. Hierauf wird der Kolben mit 2 ml der erhaltenen Impfkulturbrühe beimpft und auf einer Drehschüttelmaschine mit 7 cm Hub geschüttelt. Die Hauptfermentation wird bei 30°C begonnen. 20 Stunden nach Beginn der Inkubation werden 150 mg Cholesterin suspendiert in 2 ml Wasser zugesetzt. 28 Stunden nach Beginn der Inkutration werden 6,2 mg 2,2'-Dipyridyl zugesetzt. 85 Stunden nach Zusatz des 2.2'-Dipyridyls wird die Inkubation abgebrochen und die Fermentationsbrühe mit 150 ml Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird eingedampft, der Rückstand an Kieselgel Chromatographien und mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (1:1) eluicrt. Hierbei wird ADD von intermediären Oxidationsprodukten und dem Ausgangssterori abgetrennt. Die ADD-Ausbeute ist in Tabelle Vl zusammengefaßt.
Der vorstehend beschriebene Versuch wird unter Verwendung eines Gemisches von /?-Sitosterin und Campesterin (2:1), Stigmasterin, Cholest-4-en-3-on und Cholesta-l,4-dien-3-on anstelle von Cholesterin wiederholt.
Der Versuch wird ferner ohne Zusatz von Fett und Siimcnmehl wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.
Il
Tabelle VI
Versuch Substrat l-'elt und Konzen ADD-Aus- Restliches
Ölsuniuiimehl tration beute Substrat
ücw,% mg mg
1 Cholesterin kein Zusatz 0 3 53
2 Cholesterin Leinöl 1,0 26 0
3 Cholesterin Leinsamenmehl 2.0 18 0
4 Cholesterin Leinöl 1,0 55 0
Leinsamenmehl 2,0
5 Cholesterin Sesamöl 1.0 29 0
6 Cholesterin Sesammehl 2,0 20 0
7 Cholesterin Sesamöl 1,0 52 0
C^cinmlmokl 2 0
8* Sitosterin-Campesterin (2:1) kein Zusatz 0 2 70
9 Sitosterin-Campesterin (2:1) Leinöl 1,0 10 40
10 Siiosterin-Campesterin (2:1) Leinsamenmehl 2,0 7 58
η Sitosterin-Campesterin (2:1) Leinöl 1.0 20 22
Leinsamenmehl 2,0
12* Stigmasterin kein Zusatz 0 I 86
13 Stigmasterin Leinöl 1.0 4 50
14 Stigmasterin Leinsamenmehl 2,0 4 50
15 Stigmasterin Leinöl 1.0 9 38
Leinsamenmehl 2,0
16* Cholest-4-en-3-on kein Zusatz 0 5 18
17 Cholest-4-en-3-on Leinöl 1,0 23 4
18 Cholest-4-en-3-on Leinöl 1,0 55 0
Lcinsamcnmch! 2,0
19* Cholesta-1.4-dien-3-on kein Zusatz 0 5 13
20 Cholesta-1,4-dien-3-on Leinöl 1.0 22 0
21 Cholesta-1,4-dien-3-on Leinöl 1,0 53 0
Leinsamenmehl 2,0
Beispiel 9 Beispiel 8 wird mit folgenden Abänderungen wiederholt:
(1) Als Substrat werden 200 mg Cholesterin verwendet.
50 (2) Sojabohnenöl und Sojabohnenmehi werden in den in Tabelle VII angegebenen Mengen zugesetzt. (3) Bei Verwendung von mehr als 8% Sojabohnenmehl werden 7,8 mg 2,2-DipyridyI zugesetzt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VlI zusammengefaßt: 55 Tabelle VII
Versuch Sojabohnenöl Sojabohnenmeh! ADD-Ausbeute
Gew.-·, Gew.-',« mg
1* 0 0 3
2* 0 2.5 15
3* 0.15 2,5 15
4* 0,25 1.5 13
5* 0,25 2,5 16
6 0.30 2,5 29
12
Sdjahnhnciinl 26 25 333 Aim-Aushclc
Fortsetzung (lew.-1 mg
Versuch 0,50 Soiahohnenmchl 41
0,50 liew.-"·. 48
7 0,50 2.5 51
8 0.50 5,0 43
9 0.50 8,0 38
10 0.50 10,0 22
Il 1,0 15,0 36
12 1.0 20,0 45
13 1.0 0 51
14 1.0 0,3 54
15 1,0 0,6 53
16 1,0 1.0 54
17 1,0 2,5 52
18 1,0 5,0 47
19 1.0 8,0 36
20 1.5 10,0 50
21 XO 15,0 25
22 3.0 2,5 26
23 1.0 0 36
24 3,0 0.1 45
25 3,0 0,3 47
26 3.0 0,9 48
27 3,5 1.8 45
28 4,0 2.5 20
29 2,5
30 2.5
Beispiel 10
Ks wird ein Niihimeuium folgender Zusammensetzung hergestellt:
2,0% Sucrose,
1,0% NaNO3,
1,0";. Hefeextrakt,
0,25% K1HPOj,
0,03% MgSO4 · 7 H,O,
Fett und Ölsamenmehl in den in Tabelle VIII angegebenen Konzentrationen, Rest Wasser.
Der pH-Wert des Nährmediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. 50 ml des Nährmediums werden in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei 120°C sterilisiert und sodann abgekühlt. Hierauf wird der Kolben mit 1 ml einer gemäß Beispiel 8 erhaltenen Impfkulturbrühe beimpft, anstelle von Arthrobatter simplex (IAM 1660) wird jedoch Brevibacterium lipolyticum (IAM 1398) verwendet. Das beimpfte Medium wird bei 300C auf einer Drehschüttelmaschine gemäß Beispiel 1 inkubiert. 15 Stunden nach Beginn der Inkubation werden 200 mg Cholesterin zugesetzt. 28 Stunden nach Beginn der Inkubation werden die in Tabelle VIII angegebenen Mengen an 2,2'-Dipyridyl zugegeben. Die Fermentation wird weitere 70 Stunden fortgesetzt. Danach werden die Produkte mit Äthylacetat extrahiert und gemäß Beispiel 8 voneinander getrennt. In Tabelle VIII ist die ADD-Ausbeute angegeben.
Tabelle VIII Konzentration ?.2'-L)irvriiivl ADO-Ausheule
Versuch Fell und Ölsamenmehl Cn·».- mg mi;
0 3.9 16
I* kein Zusatz 1.0 3,9 35
2 Rapsöl 1,0 5.5 50
3 Rapsöl 2,0
Rapssamenmehl 1,0 3,9 33
4 Leinöl 1,0 5,5 42
5 Leinöl 2,0
Leinsamenmehi 1,0 3.9 35
6 Sojabohnenöl 1.0 5.5 49
7 Sojabohnenöl 2,0
Sojabohnenmehi 1.0 3,9 37
8 Sesumöl 1,0 5.5 45
9 Sesamöl 2,0
Sesammehl 1.0 3,9 32
10 Baumwollsamenöl 1,0 5.5 40
11 Baumwollsamenöl 2,0
Baumwollsamenmehl 1,0 3.9 37
12 Erdnußöl 1.0 5.5 50
13 Erdnußöl 2,0
Erdnußiiichl Beispiel Il
Beispiel 10 wird wiederholt, jedoch werden die in Tabelle IX angegebenen Verbindungen eingesetzt. Anstelle von 2,2-Dipyridyl wird 1,10-Phenanthrolin verwendet. Die Inkubation wird 28 Stunden nach Zusatz des ί,ϊϋ-Phenanthroiins (56 Stunden nach Beginn der Inkubation) abgebrochen. Nach Abbruch der Inkubation auf dieser frühen Stufe wird neben ADD auch DHT gebildet. Die Ausbeuten an DHT und ADD sind in Tabelle IX angegeben.
Tabelle IX
Versuch Zusatz Konzentration I.IO-Phcnanthrolin Ausbeute DHT
ADD (mg)
Gew.-".:. mg (mg I
1* kein Zusatz 0 1,3 7 4
2 Triolein 1,0 1,3 24 25
Leinsamenmehl 2,0
3 Triolein 1,0 1,3 22 25
Sojabohnenmehl 2,0
4 Triolein 1.0 1,3 25 23
Sesammehl 2.0
5 Triolein 1,0 1,3 21 28
Rapssamenmehl 2,0
6 ff-Monopalmitin 1,0 23 21
Sesammehl 2,0
7 a-Monopalmitin 1,0 1.3 21 17
Erdnußmehl 2,0
8 σ-Monopalmitin 1,0 !.3 19 21
BaumwoJlsamenmehl 2,0
9 ff-Monopalmitin 1,0 1,3 19 23
Sojabohnenmehl 2,0
14
l'ortsel/uim
/lisa!/
Koii/cntriilii'ii I. lO-l'hciiiinlhrnlm \ii-«hciilt.·
ADD DIM
'. Ίί·Ά- mi; ιπιμι (ηιμι
in* Palmöl
Ka I)SSU men mc hl
Il Palmöl
Rapssamenmehl
12 Palmöl
Rapssamenmehl
1.5 Palmöl
Rapssamenmehl
14 Palmöl
K.l p>S.l 11 IC [ 111 HJ ί 1 i
15 Palmöl
Rapssamenmehl
ld Palmöl
Rapssamenmehl
17 Palmöl
Rapssamenmehl
IS Palmöl
Rapssamenmi hl
I1) Palmöl
Rapssamenmehl
211 Palmöl
Rapssamenmehl
21 Speck
Sesam mehl
0,25 ι..;
2,0
0.3
2.0
0,5 1.3
2.0
1.0 1.3
1.0 U
(',I)
I .H 1.3
i.o
1.0 1.3
2.0
I.o 1.3
5.0
i.o 1.6
10,0
1,0 1.6
15.0
1.0 1,6
20.0
1.0 1.3
2.0
10
ld ι:>
18 10
18 14
20 20
T) 24
22 26
21 20
18 17
15 12
20 28
Beispiel 12
Is wird ein Nährmedium folgender /usammensel/ung hergestellt
2,0''., iVlaisnuellwasser.
2,0% Cjlucose, 0.4",;. Nalriumglutamat.
0,2% Asparagin.
0.21;.. KM-PO4,
l'elt und Ölsamenmehl in dei in Tahellc \ angegebenen Menge. Resl Wasser.
Der ρM-Wcrl des Nährmediums wird mit Natronlauge aul'7,0 eingestellt. 50 ml des Nährmediums werden in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei 1200C sterilisiert. Hierauf wird der Kolben mit 2 ml einer gemäß Beispiels erhaltenen impfkiilturbrühe beimpft. Das beimpfte Nahrmedium wird bei 35°C auf einer Drehsehüttelmaschine gemäß Beispiel 1 inkubiert. 40 Stunden nach Beginn der Inkubation werden 150 mg Cholesterin und 48 Stunden nach Beginn der Inkubation 4.2 mg 8-Hydroxychinolin zugegeben. 60 Stunden nach Zusatz des 8-HydroxyehinoIins wird die Fermentation abgebrochen und das entstandene ADD gemäß Beispiel 1 isoliert. Die ADD-Ausbeute ist in Tabelle X angegeben.
Tabelle X
Versuch
Felt und Ölsamenmehl
Konzentration Ciew.-*.
ADD-Ausbeutc mc
1* kein Zusatz Beispiel 0 13 12
2 Leinöl
Leinsamenmehl		 0,5
2,0		 26
3 Rapsöl
Rapssamenmehl		 0.5
2,0		 33
4 Baumwollsamenöl
Baumwollsamenmehl		 0.5
2,0		 27
5 Baumwollsamenöl
Sesammehl		 0,5
2.0		 32
6 Baumwollsamenöl
Erdnußmehl		 0.5
2,0		 24
7 Baumwollsamenöl
Sojabohnenmehl		 0,5
2.0		 37
8 Sojabohnenöl
Sojabohnenmehl		 0.5
1.0		 22
9 Sojabchnenöl
Sojabohnenmehl		 0.5
2.0		 35
10 Sojabohnenöl
Sojabohnenmehl		 0,5
5,0		 38
11 Sojabohnenöl
Sojabohnenmehl		 0.5
8.0 		26
12 Sojabohnenöl
Sojabohnenmehl		 0,5
10.0		 19
T.s wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:
2.0"A Maisciuellwusscr,
2.0".· Glucose.
0.4% Natriumglutamal.
0.2% Asparagin.
0.2". KM;PO4.
Fett und Ölsamenmehl in der in Tabelle Xl angegebenen Menge, Rest Wasser.
Der pH-Wert des Nährmediums wird mit Natronlauge auf 7.0 eingestellt. 50 ml des Nährmediums werden in einen 500 ml fassenden Kolben gegeben. Der Kolben und sein Inhalt wird 20 Minuten bei 1200C sterilisiert. Nach dem Abkühlen *-.ird der Kolben mit 2 ml einer gcmiiU Beispiel 5 erhaltenen Impfkulturbrühe beimpft. Als Mikroorganismus wird Protaminobactcr alhoflavus (ATCC 8458) verwendet. Die Inkubation wird 50 Stunden bei 300C auf einer Drehschültelmaschinc gemiiH Beispiel I durchgeführt. 25 Stunden nach Beginn der Inkubation werden 200 mg Cholesterin und 33 Stunden nach Beginn der Inkubation 6,2 mg 2.2'-Dipyridyl zugesetzt. 95 Stunden nach Beginn der Inkubation wird die l-'ermcntationsbrühe gemäli Beispiel I aufgearbeitet und das entstandene ADD isoliert. Die Ergebnisse sind in Tabelle Xl /usammengclaHI.
Tabelle XI
Vers uv h I-etl unü Olsamenmchl Konzentration ADIJ-Ausbeutc
tie»-.-". ms
!* kein Zusal/ 0 4
2 Sojaboh.icnöl 0,5 (>
3 Rapssamenöl 0,5 6
4 Sojabohnenmehl 3,0 9
5 Rapssamenmehl 3,0 9
6 Sojabohnenöl
.Sojabohnenmehl		 0,5
3,0		 12
7 Rapsöl
Rapssamenmehl		 0,5
3,0		 13
llier/u I Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Hersteilung von 17-Hydroxyandrosta-l,4-dien-3on und/oder Androsta-I,4-dien-3,17-djon durch mikrobiologische Oxidation von Sterinen oder deren J1O-KeIo- oder Δ M-3-Ketoderivalen in einem Kulturmedium, das einen Chelatbildner für Eisen- und Kupferionen enthält, unter Zusatz eines oder mehrerer Glyceride, Fette, Öisamen und/oder Ölfrüchte, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem Kulturmedium durchführt, das Glyceride, Fette, Öisamen und/oder Ölfrüchte in einer Menge entsprechend 0,3 bis 4,0 Gewichtsprozent Glycerid, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums, enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium mit 0,5 bis 3,5 Gewichtsprozent Glyceriden einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium mit 0,7 bis 3,0 Gewichtsprozent Glyceriden einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium einsetzt, das zusätzlich zu dem glyceridhaltigen Stoff ein pflanzenölhaltiges Mehl mit geringem Glyceridgehalt, das bei der Extraktion von ölhaltigen Samen oder Früchten erhalten worden ist, nämlich Sojabohnenmehl, Leinsamenmehl, Rapssamenmehl, Baumwollsamenmehl, Sesammehl, Erdnußmehl oder Safflormehi, enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das pflanzenölhaltige Mehl in der 0,6- bis POfachen Gewichtsmenge der glyceridhaltigen Substanz einsetzt und die Konzentration des pflan-
zenölbilagen Mehls im Kulturmedium 1 bis 8 Gewichtsprozent beträgt.
DE2625333A 1975-06-06 1976-06-04 Verfahren zur Herstellung von 17-Hydroxyandrosta-1,4-dien-3-on und/oder Androsta-1,4-dien-3,17-dion durch mikrobiologische Oxidation von Sterinen Expired DE2625333C2 (de)

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