DE2936125A1 - Neue sterinkonzentrate, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung in der fermentativen sterintransformation - Google Patents

Neue sterinkonzentrate, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung in der fermentativen sterintransformation

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DE2936125A1
DE2936125A1 DE19792936125 DE2936125A DE2936125A1 DE 2936125 A1 DE2936125 A1 DE 2936125A1 DE 19792936125 DE19792936125 DE 19792936125 DE 2936125 A DE2936125 A DE 2936125A DE 2936125 A1 DE2936125 A1 DE 2936125A1
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sterol
distillation
fermentative
concentrates
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DE19792936125
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Frank Friedrich Dr. 4020 Mettmann Hill
Joachim Dr. 4010 Hilden Schindler
Alfred Dipl.-Chem. Dr. 4010 Hilden Struve
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Henkel AG and Co KGaA
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Henkel AG and Co KGaA
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

Henkelstraße 67 J HENKELKGaA
Düsseldorf, den 5. September 1979 ZR-FE/Patente
Dr. Ez/HF/Et
Patentanme ldung D 5766
"Neue Sterinkonzentrate, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung in der fermentativen Sterintransformation"
Die Erfindung betrifft neue hellfarbige Sterinkonzenträte sowie ein Verfahren zu ihrer Gewinnung aus Rückständen der Verarbeitung pflanzlicher und/oder tierischer Fette und/oder Öle sowie deren Verwendung bei der fermentativen Sterintransformation zu wertvollen Folgeproduktenj insbesondere Steroidzwischenstufen.
Es besteht ein wachsender Bedarf an Steroidzwischenstufen für die Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe. Dieser Bedarf wird zunehmend aus fermentativ gewonnenen Abbauprodukten von Sterinen gedeckt. Pei einem solchen mikrobiellen Abbau werden die Sterine bisher in reiner oder sehr stark angereicherter Form eingesetzt. Durch Zusatz von Emulgatoren wird für eine geeignete Verteilung der Sterine in der wäßrigen Nährlösung Sorge getragen. Es muß dabei gewährleistet sein, daß die Begleitstoffe der Sterine nicht nur die erwünschte Homogenisierung des Nährmediums bewirken, die Begleitstoffe dürfen auch das Wachstum der Mikroorganismen sowie den gewünschten Sterinabbau nicht stören.
Die Reindarstellung von Sterinverbindungen natürlichen Ursprungs aus pflanzlichen und/oder tierischen Ölen und/oder Fetten, in denen sie als Eegleitstoffe in geringer Konzentration vorliegen, ist an sich ein auf'wendiges Verfahren. Nach der GB-PS ^89 623 werden natürliche
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Fette bzw. Öle der Molekulardestillation unterworfen. Dabei wird eine an Sterinverbindungen angereicherte Fraktion gewonnen,aus der das Sterin durch selektive Lösungsmittel, gegebenenfalls unter vorheriger Verseifung der Begleitstoffe in dieser Fraktion gewonnen werden kann. Auch die GB-PS 4o3 9^8 beschäftigt sich u. a. mit der Destillation von Sterinverbindungen in hohem Vakuum. Hier wird vorgeschlagen, bei der Destillation Schleppmittel zuzusetzen, die im gleichen Siedebereich wie die Sterinverbindungen sieden und mit ihnen zusammen übergehen. Dabei wird gefordert, daß diese Schleppmittel anschließend durch physikalische oder chemische Maßnahmen von den Sterinverbindungen abgetrennt werden können. Ein ähnlicher Vorschlag wird in der US-PS 2 146 891* beschrieben. Hier sollen zur Erleichterung der Vakuumdestillation von hochsiedenden Naturstoffen Schleppmittel verschiedenartigsten Ursprungs zum Einsatz kommen, genannt sind beispielsweise Fettsäuren, Ester wie aliphatische Phthalate, Benzylphthalat, Diglycerintetrapropionat, Mineralölfraktionen, Terpene und dgl. Auch hier ist vorgesehen, das Schleppmittel von dem gemeinsam übergegangenen Naturstoff abzutrennen, wobei es nichts schadet, wenn beschränkte Mengen des Naturstoffes im Schleppmittel verbleiben, da dieses wieder verwendet werden soll.
In der DE-OS 26 56 2o8 wird ein Verfahren zur Isolierung von Sterinen aus Destillationsrückständen der Fettverarbeitung geschildert, bei dem man die Sterine durch Umesterung mit Methanol freisetzt und sie darauf aus dem Umesterungsgemisch durch Adduktbildung mit Calciumchlorid in einem aprotischen Lösungsmittel und unter geringem Zusatz an einem protischen Lösungsmittel isoliert.
Die Erfindung geht demgegenüber von der Aufgabe aus, Sterinverbindungen natürlichen Ursprungs nur in be-
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schränktem Maße in Sterinkonzentraten anzureichern, wobei jedoch diese Konzentrate derart beschaffen sein sollen, daß sie unmittelbar als Einsatzmaterial in der fermentativen Sterinumwandlung geeignet sind. Die Eegleitstoffe der Sterine in den neuen Konzentraten dürfen die fermentative Sterintranformation nicht stören, sie sollen im Sinne der erfindungsgemäßen Aufgabe vielmehr die Durchführung der fermentativen Transformation erleichtern. Nach einem weiteren Aspekt der erfindungsgemäßen Aufgabe sollen dabei als Ausgangsmaterial für die Gewinnung der neuen Sterinkonzentrate die in großer Menge zur Verfügung stehenden Destillationsrückstände der technischen Verarbeitung pflanzlicher und/oder tierischer Fette und/oder öle dienen, die bisher als Abfallsubstanzen weitgehend verworfen worden sind.
Es wurde überraschend gefunden, daß sich aus Fettverarbeitungsrückständen der geschilderten Art durch eine neuartige einfache Kombination von Verfahrensschritten hellfarbige Sterinkonzentrate gewinnen lassen, die bei Steringehalten von nicht mehr als 5o Oew.-ί direkt in die Fermentation eingesetzt werden können und dort als hochwertiges Ausgangsmaterial anzusehen sind.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend in einer ersten Ausführungsforir. ein Verfahren zur Gewinnung eines
2c Sterinverbindungen natürlichen Ursprungs enthaltenden Konzentrats, das als Einsatzmaterial für die fermentative Sterintransforrr.ation geeignot ist, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man Destillationsrückstände aus der Verarbeitung natürlicher Fette und/oder
^0 öle mit einem niederen Alkenol ume~tert} das Reaktionsprodukt der Kurzwegdestillation unterwirft und hierbei eine Hauptfraktion mit einer. Gehalt bis etwa 5o Gew.-?
Sterinverbindungen als Verfahrensprodukt abtrennt.
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Die Menge des im Destillat enthaltenen Sterins beträgt ungefähr 80 - 9o % des ursprünrlich im Aufarbeitungsrückstand vorhandenen Sterins. Die Begleiter des Sterins in den erfindungsgemäß gewonnenen Konzentraten stören die Fermentation nicht, sie verleihen den Konzentrat sogar eine erwünschte gute Emulgierfähigkeit in der wäßrigen Nährlösung. Sie sind als fettcheir.isches Material für die Mikroorganismen mitverdaulich und werden ebenso wie die sonst üblicher Weise zugesetzten fettchemischen Emulgatoren im Laufe der Fermentation mit abgebaut. Die sehr aufwendige ReindPirs te llung von Sterinen für die Fermentation erübrigt sich durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Konzentrate.
Als Ausgangsstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung der hellfarbigen Sterinkonzentrate dienen Destillationsrückstände von Fettsäuren aus der technischen Fettspaltung oder Destillationsrückstände von Fettsäureestern, ζ. B. Methylester, aus der technischen Fettumesterung. Als Ausgangsfette können tierische oder pflanzliche Fette oder auch die Raffinationsabfälle, Dämpferkondensate oder Soapstockfettsäuren vorgelegen haben.
Die Destillationsrückstände werden in der Praxis normalerweise mehrfach gespalten bzw. umgeestert und destilliert, um möglichst hohe Spaltungs- bzw. Umesterungsgrade zu erzielen. Erfindungsgemäß sind insbesondere solche mehrfach umgeesterten bzw. mehrfach gespaltenen Destillationsrückstände als Auspangsmaterial geeignet. In den erfindungsgemäß als Einsatzmaterial bevorzugten Destillationsrückständen liegen die Sterinverbindungen in Konzentrationen von ca. 5-15 Gew.-Ϊ als schwerflüchtige Verbindungen angereichert vor. Sie liegen dabei überwiegend in mit Fettsäure veresterter Form vor. Das gilt
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auch für die Sterine in den Rückständen aus der Umesterung, da bei den hohen Temperaturen der Esterdestillation eine Rückveresterung der zuvor freigesetzten Sterine erfolgt.
Diese Destillationsrückstände sind schwarze Substanzen, die bei Raumtemperatur teils flüssig teils fest, jedoch unterhalb von 5o° C geschmolzen sind. Die Säurezahlen liegen im Falle der Rückstände von Fettsäuredestillationen bei ca. 2o - 8o, die Verseifungszahlen liegen bei ca. 12o - 160. Für Umesterungsrückstände aus der Methylesterdestillation liegen die Säurezahlen unter lo, die Verseifungszahlen bei ca. 1^o - I80. Liegt der Steringehalt eines solchen Rückstandes nicht ausreichend hoch, so kann man ihn im Rahmen der Erfindung durch eine Spaltung mit Wasser bei hoher Temperatur und anschließende Fettsäuredestillation auf die gewünschte Höhe treiben.
In einem für das erfindungsgemafoe Verfahren bedeutsamen ersten Schritt werden die Sterine in den ausgewählten Destillationsrückständen durch Umesterung mit niederen Alkoholen im Autoklaven freigesetzt. Als niedere Alkohole kommen bevorzugt Methanol,Äthanol, Propanol oder auch noch Butanol in Betracht. Eesondere Bedeutung kommt in Rahmen der Erfindung derr Methanol für diesen Verfahrensschritt zu.
Zv:eckn:'ißigerweise liegt das Gewichtsverhältnis von Methanol zum Rückstand für diesen Verfahrensschritt im Bereich von o,5 - 3:1» wobei insbesondere ein Arbeiten mit Mengenverhältnissen von etwa 1:1 geeignet ist. Nach oben ist dieses Verhältnis ^einer echten Beschränkung unterworfen, prin-
jjo zipiell können also beliebig hohe Methanolmengen eingesetzt werden. Die Umsetzung selbst wird im Autoklaven
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vorgenommen, geeignete Verfahrenstemperaturen liegen im Bereich von 180 - 24o° C, vorzugsweise wird bei Temperaturen von 2oo - 22o C gearbeitet.
Die Umesterung wird vorzugsweise unter dem Einfluß von Katalysatoren, und zwar insbesondere alkalischen Katalysatoren durchgeführt. Als Katalysator kann Alkalialkoholat, beispielsweise Natriummethylat oder Alkalihydroxid, beispielsweise KOH, zugesetzt werden, geeignete Mengen des Katalysators sind beispielsweise bis ca. o,5 Gew.-$, bezogen auf die Menge des eingesetzten Destillationsrückstandes· Aber auch ohne Katalysator erfolgt eine Umsetzung, allerdings in einigen Fällen deutlich verlangsamt Die Dauer der Umsetzung beträgt üblicherweise ca. 3 Stunden bei 22o° C, bei l8o° C ca. 6 Stunden.
Nach Ablauf der Reaktion wird der alkalische Katalysator neutralisiert. Geeignet sind hier insbesondere verdünnte Mineralsäuren, beispielsweise verdünnte Schwefelsäure. Aus deir Reaktionsgemisch werden anschließend freier Alkohol und V/asser entfernt. Das kann in einfacher Weise durch Eindampfen bei Temperaturen bis 12o° C erfolgen. Das jetzt vorliegende Rückstandsprodukt wird mit Wasser gewaschen und bei Temperaturen bis 12o° C getrocknet. Es fällt eine bei Raumtemperatur schwer bewegliche Masse oder stark viskose Flüssigkeit an. Bei schwierigen Wäschen kann auch nach der Umsetzung des Destillationsrückstandes mit Methanol durch Zugabe beschränkter Wassermengen eine methanolische Phase abgetrennt und auf weitere Wäschen verzichtet werden.
Das jetzt vorliegende Umesterungsprodukt wird in dem zweiten für das erfindungsgemäße Verfahren beaeutsamen Schritt der Kurzwegdestillation im Hochvakuum unterworfen. Geeignet sind hierzu insbesondere die bekannten Dünnschicht-
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verdampfer. Zur Anwendung kommen dabei bevorzugt solche Dünnschichtverdampfer, bei denen der Weg des Verdampfenden von der Verdampfungsoberfläche des dünnen Substanzfilms bis zum Kondensator relativ kurz ist und größenmäßig beispielsweise im Bereich einiger Zentimeter liegt. Apparativ kann das beispielsweise bekanntlich durch senkrechte coaxiale Anordnung zweier zylindrischer V.randungen erreicht werden. Der innere Zylinder ist dabei als Kühlfinger ausgebildet, während die aufgeheizte Innenseite des äußeren Zylinders als Verdampfungsflache dient. Die herablaufende Substanz wird durch rotierende Wischer auf der Wandung in Form eines gleichmäßigen Filmes verteilt. An der gekühlten Fläche des inneren Zylinders sammelt sich das Destillat und läuft nach unten ab.
Die umgeesterten Rückstände mit den freigesetzten Sterinen werden im Dünnschichtverdampfer zweckmäßigerweise bei Temperaturen von mehr als 2oo C und bei einem Vakuum von weniger als o,5 mbar destilliert. Geeignet sind beispielsweise Destillationstemperaturen im Bereich von 2oo - 3oo C, insbesondere 22o - 28o° C und Drucken von o,öl - o,5 mbar.
Es hat sich weiterhin als häufig zweckmäßig erwiesen, vor der Gewinnung der gewünschten Sterin-Konzentratfraktion eine Vordestillation durchzuführen, bei der eine beschränkte Fenge einer Vorlauffraktion abgetrennt wird. Diese Vordestillation kann in einem Vakuum von ca. o,5 - 1 mbar erfolgen. Es wird dabei im Ten-neraturbereich von etwa 12o - 2oo° C ein Vorlauf im Bereich von ca. 5 - 1Io Gev.-?, bezogen auf den Destilla-
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tionseinsatz - abgetrennt. Hierdurch wird eine hohe Sterinausbeute bei der Hauptdestillation gewährleistet. Technisch können beide Destillationen in zwei hintereinandergeschalteten Verdampfern erfolgen.
Der Vorlauf besteht weitgehend aus Fettsäuremethylestern. Als Haupt fraktion wird dann das erfindungsgemäß gewünschte hellfarbige Sterinkonzentrat aufgefangen.
Diese Sterinkonzentrate sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Sie bestehen bevorzugt im wesentliehen aus bis zu ca. 2»5 Gew.-% Sterinverbindungen,
weiterhin bis zu ca. 5o Gew.-% Fettsäuremethylestern und enthalten darüberhinaus hauptsächlich Hydroxy- und Dihydroxyfettsäuremethylester sowie in sehr geringer Menge Partialglyceride. Eei Verwendung anderer niederer Alkohole in der Umesterungsstufe gelten diese Angaben sinngemäß. Das bei Raumtemperatur halbfeste bis feste Material ist von goldgelber Farbe. Seine Verseifungszahl liegt im allgemeinen im Bereich zwischen 5o and 17o, während die Hydroxylzahl im unverseiften Zustand üblicherweise im Bereich von etwa ^Io - 15o, vorzugsweise im Bereich von 4o - 12o liegen kann. Diese Hydroxylzahl des unverseiften Destillats geht teilweise auf die Sterinverbindungen und teilweise auf die in Mischung damit vorliegenden hydroxylierten Fettsäuremethylester zurück. Durch Verseifung, Isolierung und Identifizierung des Fettsäureanteils kann das belegt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der neuen Sterinkonzentrate gemäß der Erfindung liegt ihr Gehalt an Sterinverbindungen im Bereich von etwa Io - 4o Gew.-?, vorzugsweise im Bereich von etwa 15 - 1Jo Gew.-!S, bezogen auf das Gewicht dieser Destillatfraktion. Häufig enthält der
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Hauptlauf über 2o Gew.-% Sterine, es kann für die anschließende Verwendung des Konzentrats aber auch zweckmäßig sein, wenn der Steringehalt bis etwa 2o Gev.-% beträgt.
Die in Abmischung mit den Sterinen vorliegenden Begleitkomponenten des Sterinkonzentrats sind nicht nur für die anschließende Verwendung des Konzentrats in der fermentativen Sterintransformation unbedenklich, sie haben sich im Gegenteil als überraschend wirksam zur Förderung der mikrobiellen Umwandlung an den Sterinverbindungen erwiesen. Die im Konzentratgerisch vorliegenden hydroxylierten Fettsäureester verleihen dem Konzentrat eine sehr gute Emulgierfähigkeit. Gewünschtenfalls kann dabei der Mengenanteil an hydroxylierten Estern noch angehoben werden. Dies erfolgt zweckmäßig durch destillative Verringerung der Menge der relativ leichter flüchtigen hydroxylfreien Fettsäureester. Auf diese Weise läßt sich die Emulgierfähigkeit des Konzentrats in wäßrigen Nährlösungen weiter verbessern und die im Konzentrat vorliegende Sterinmenge weiter erhöhen. Verbunden ist dair.it dann natürlich auch ein Ansteigen der Hydroxylzahl. Grundsätzlich sind aber schon die einfachen Dünnschichtdestillate mit ca. 2o % Sterinverbindungen sehr gut geeignete Substrate für die fermentative Sterintransforr.ation.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der nach dem geschilderten Verfahren gewonnenen neuen Sterinkonzentrate mit nur beschränkten Gehalten an Sterinverbindungen als Einsatzmaterial in der fermentativen Sterintransformation bei der durch Auswahl bestimmter Mikroorganismen eine gezielte Veränderung an der chemischen Struktur der Sterinver-
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Patentanmeldung ß ^ygg HENKELKGaA
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- Al
bindung vorgenommen wird. In üblicher V/eise werden dabei die ausgewählten Mikroorganismen in einen wäßrigen Nährmedium inkubiert und gezüchtet, wobei die erfindungsgemäßen Sterinkonzentrate der FermenterflUssigkeit zugesetzt werden. Es kann dabei wünschenswert sein, diese Konzentrate als wesentliche oder gar als einzige Kohlenstoffquelle zuzusetzen. Die Fermentation erfolgt üblicherweise unter aeroben Bedingungen. Im einzelnen kann hier auf die umfangreichen Angaben des Standes der Technik verwiesen werden. Genannt sei in diesem Zusammenhang beispielsweise W. Charney und H. L. Herzog, Microbial Transformation of Steroids, Academic Press, New York, 1967. Besondere Bedeutung haben heute Verfahren zum selektiven Seitenkettenabbau an Steroidverbindungen auf mikrobiologischem Vie ge. Eine zusammenfassende Übersicht dieser Arbeiten findet sich in Adv. Appl. Micoribiol. 22.» 29 (1977), 29-58, Christoph K. A. Martin "Microbial Cleavage of Sterol Side Chains".
Besondere Bedeutung kommt der Verwendung der erfindungsgemäßen Sterinkonzentrate bei der Herstellung von 17-C-Steroid-^ -Propionsäureverbindungen durch selektiven Seitenkettenabbau an 17-C-Seitenkettensteroidsubstraten zu, wie sie insbesondere in den älteren Patentanmeldungen der Anmelderin Europäische Patentanmeldung 79 lol 036.6 und österreichische Patentanmeldung 17 o9/79 geschildert wird. Durch diese Verfahren wird insbesondere die Herstellung von 3-0 xo-pregna-^-en-2o-c arbonsäure (Δ -M BNC) und/oder 3-0 xo-pregna-l,'4-dien-2o-c arbonsäure (Δ-1,1* BNC) aus Steroidsubstraten rat längeren Substituenten in 17-C-Stellung auf fermentativen Wege ermöglicht. Als Mikroorganismen werden für diese vorzugsweise inhibitorfreie Arbeitsweise Mutantenstämme eingesetzt, die aus bestimmt ausgewählten V/ildstänmen mit anschließender
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Mutation und Selektion gewonnen worden sind. Geeignete Mikroorganismen-Defektmutantenstfimme für die Verwendung in diesem Zusammenhang sind insbesondere die Stemme ATCC 31385, ATCC 31 456, ATCC 31^57, ATCC 31*159, ATCC 3l46o, DSM 4o35, DSM 14 37, DSM 1^39, DSM l442, DSM 34*13, DSM 1444,und DSM 1445. In einzelnen gelten dabei die Angaben der genannten filteren Anmeldungen der Anmelderin.
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ZR-FE/Patente Beispiel 1
Eingesetzt wurden l.ooo g Rückstand aus der Talgfettsäuregewinnung, der nach dreimaliger Spaltung und Destillation erhalten worden warJ Kennzahlen: Säurezahl 19, Verseifungszahl 124, Hydroxylzahl 18, Jodzahl 65, Cholesteringehalt 14 %.
Zu diesem Rückstand wurden l.ooo g Methanol und 16,7 g 3o %ige methanolische Natriummethylatlösung hinzugefügt. Der Ansatz wurde 3 Stunden lang iir. Autoklaven unter Rühren auf 22o C erhitzt. Der Autoklavenaustrag wurde mit 45,3 g Io %iger wäßriger Schwefelsäure neutralisiert. Außerdem wurden noch loo g Wasser zugefügt. Dabei schied sich eine leichtere methanolische Phase ab. Die schwerere Fettphase wurde abgetrennt und getrocknet: Methanol- und Wasserreste wurden abdestilliert, gegen Ende der Destillation wurde Wasserstrahlvakuum angelegt und die Sumpftemperatur bis 12o° C gesteigert. Erhalten wurden 960 g einer bei Raumtemperatur festen schwarzen Substanz; Säurezahl 4, Verseifungszahl Ho, Hydroxyzahl 69, Jodzahl 64.
9oo g des oben erhaltenen Uniesterungsproduktes wurden im Labor-Dünnschichtverdair.pfer (nach Art einer Kurzwegdestillation: Abstand zwischen Kühlfinger und Wandung mit Substanzfilm 1,7 cm) in zwei Durchgängen destilliert: Im ersten Durchgang wurden bei ca. 12o C/ ca. 1 mbar 4o g flüssiges, fast cholesterinfreies Destillat erhalten. Im zweiten Durchgang wurde bei 24o C/o,4 mbar destilliert. Dabei wurden 57o g goldgelbes Destillat und 24o g schwarzer Rückstand erhalten. In diesem Destillat wurden chroma-· tographisch 21,7 % freies Cholesterin bestimmt. Kennzahlen des Destillats:
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ORIGINAL INSPECTED
Patentanmeldung D 5766
5766 . <lf HENKEL KGaA
6,4 ZR-FE/Patente
127 2936Ί25
Säurezahl 79,4
Verseifungszahl 55,6
Hydroxylzahl
Jodzahl
Die Glycerinanalyse ergab für freies und gebundenes Glycerin: o,l6 %. Aus einer kleinen Probe wurde via Verseifung die Fettsäure isoliert. Deren Kennzahlen waren: Säurezahl 192, Kydroxylzahl 1|8.
Bei drastischer Erhöhung der Destillationstemperaturen ergab sich eine beträchtliche Verschiebung in der Mengenaufteilung:
Vorlaufestillation bei ca. 1 mbar und 2oo° C statt bei 12o° C: 38 % Vorlauf 6,6 $ig an Sterin (Sterinbestimrr.ung nach V. C. Mehlenbacher: The Analysis of Fats and Oils (i960) Seite 592) Hauptlaufestillation bei 27o° C statt bei 24o° C: 28 % Hauptlauf bzw. Konzentrat 23 %ig an Sterir. (Sterinbestimmung nach V. C. Mehlenbacher: The Analysis of Fats and Oils (i960) Seite 592).
Säurezahl 3,6
Verseifungszahl 69,9
Hydroxylzahl 11O.9
Jodzahl 57,7
% Rückstand
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Patentanmeldung D 5766 HENKELKGaA
JQ ZR-FE/Patente
Beispiel 2
Eingesetzt wurden l.ooo g Rückstand aus der Soja-Sonnenblumenfettsäuregewinnung, der nach zweimaliger Spaltung und Destillation erhalten worden war; Kennzahlen: SSurezahl 71,5, Verseifuncszahl l6o, Hydroxylzahl 4,1, Jodzahl Io2, Steringehalt: 9,9 %.
Sterinzusammensetzung: 6o,9 % Sitosterin, 21,1 % Campesterin, 15,4 % Stigmasterin, 2,6 % Chloesterin.
Zu diesem Rückstand wurden l.ooo g Methanol und 16,7 E 3o £ige methanolische Natriummethylatlösung hinzugefügt. Der Ansatz wurde 3 Stunden im Autoklaven unter Rühren auf 22o C erhitzt. Der Autoklavenaustrag wurde mit 45,3 g Io /Siger wäßriger Schwefelsäure neutralisiert. Dann wurde das Methanol unter Rühren abdestilliert bis zu einer Sumpftemperatur von 12o° C. Der Rückstand wurde mehrmals mit Wasser bei 8o° C gewaschen. Die Wasserreste wurden unter Rühren im Wasserstrahlvakuum abdestilliert bis zu einer Sumpftemperatur von 12o C. Erhalten wurden ca. 95o g einer bei Raumtemperatur noch weitgehend flüssigen schwarzen Substanz; Säurezahl 11,7, Verseifungszahl 145, Hydroxylzahl 58, Jodzahl lol.
9oo g des oben erhaltenen Umesterungsproduktes wurden im Labordünnschichtverdampfer (nach Art einer Kurzwegdestillation: Abstand zwischen Kühlfinger und Wandung mit Substanzfilm 1,7 cm) destilliert bei ca. 22o° C/o,4 mm Hg: Dabei wurden 57o g goldgelbes Destillat und 3o5 E schwarzer Rückstand erhalten. In der Destillat wurden mit Digitonin 15,2 % Sterine bestimmt.
Kennzahlen des Df.-f tillats :
3o
Säurezahl 8,1
Verseifungszahl 145,4
Hydroxylzahl 65,3
Jodzahl 96,4
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Patentanmeldung D 5766 HENKELKGaA
ZR-FE/Patente
Beispiel 3
Eingesetzt wurden l.ooo g aus der r.ethanolischen Talgurr.-esterung nach zweimaliger Spaltung und Destillation: Steringehalt 9,1 % (ca. 1 % freies Eterin), Säurezahl 3,3, Verseifungszahl 159, Hydroxylzahl 4o,5, Jodzahl 6l,5.
Der Rückstand wurde wie unter Beispiel 2 beschrieben umgeestert und wie unter Beispiel 1 beschrieben destilliert. Die Destillation lieferte 22o g Vorlauf und 580 g Hauptlauf. Irr. Hauptlauf waren 12,8 % freies Sterin enthalten; Kennzahlen: Sa'urezahl 4, Verseifungszahl I6I, Hydroxylzahl ^7S5a Jodzahl 64.
Beispiel 4
Eingesetzt wurden l.ooo g Rückstand aus der methanolischen Talgumesterung nach zweimaliger Umesterung und Destillation: Steringehalt 7,4 % (ca. 4 % freies Sterin), Sfiurezahl 2, Verseifungszahl I65, Hydroxylzahl l6, Jodzahl 60.
Der Rückstand wurde zunächst 4 Stunden bei 22o C im Autoklaven mit 2.000 g Wasser der Esterspaltung unterworfen. Die Fettphase wurde im Vakuum bei ca. o,l mbar destilliert Bei der Sumpftemperatur 21o C wurde die Destillation abgebrochen, als Destillationsrückstand verblieben ^60 g mit einem Steringehalt von 14,6 %.
Die 46o g Rückstand wurden umgeestert wie unter Beispiel 2 beschrieben. Erhalten wurde ein Produkt mit folgenden Kennzahlen: Säurezahl 15, Verseifungszahl 131, Hydroxylzahl 56, Jodzahl 7o.
Das Umesterungsprodukt wurde wie unter Eeispiel 1 beschrieben im Dünnschichtverdampfer destilliert. Erhalten wurden ein Vorlauf von 5o g und ein hellgelber Hauptlauf
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Patentanmelduno D 5766 HENKELKGaA
ys * η ZR-FE/Patente
von 27o g, der unterhalb von 60 C langsam fest wurde. Im Hauptlauf waren 21 % freies Cholesterin enthalten; Kennzahlen: Säurezahl 9,5, Verseifungszahl 132, Hydroylzahl 63, Jodzahl 59. Die Analyse für freies und gebundenes Glycerin ergab 0,05 %.
Beispiel 5
Eingesetzt wurden l.ooo g Rückstand aus Fischöl nach zweimaliger Spaltung und Destillation: 6,9 % Cholesterin, Säurezahl 72, Verseifungszahl I6I, Hydroxylzahl 19, Jodzahl 152. Dieser Rückstand wurde mit l.ooo g Methanol ohne Katalysator 3 Stunden bei 22o° C umgeestert. Vom Umesterungsprodukt wurde ohne vorherige Wäsche das Methanol abgedampft. Der Eindampfrückstand wurde bei 21Io C/0,1 mbar im Dünnschichtverdampfer destilliert.
Erhalten wurden 696 g Destillat; ί-freies Sterin: 9,3» Säurezahl 1,8, Verseifungszahl 156, Hydroxylzahl 59,5, Jodzahl
Beispiel 6
Die Sterinkonzentrate von Beispiel 1, 2 4 und 5 wurden mit und ohne Verwendung des Emulgators BRIJ 35 (= PoIyhydroxymethylen-monolaurylether, Firma Serva/Heidelberg) fermentiert mit dem Ziel, 2o-Carboxy-l,1<-pregnadien-3-on (= BNC) zu gewinnen. Es kamen dabei Mikroorganismen des Stammes ATCC 31385 zum Einsatz.
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130013/0 672 ORIGINAL INSPECTED
Patentanmeldung
5766
Substrat
(eingestellt auf o,l % Sterin)
Emulgator
(O1I % BRIJ 35 )
HENKEL KGaA
ZR-FE/Patente
BNC-Ausbeute %
aus Beispiel la aus Beispiel la aus Beispiel 4 aus Beispiel 4 aus Beispiel 5 aus Beispiel 5 Cholesterin Cholesterin aus Beispiel 2 aus Beispiel 2 ß-Sitosterin
84 85 77 47 73 67 82 56 62 26 3o
15 + mit Emulgator - ohne Emulgator
Im einzelnen wurde wie folgt gearbeitet:
Vorkultur: Der Stamm Choi 73-WIl, Corynebakterium spec (ATCC 31 385), wird zunächst in loo ir.l steriler Nflhrboullion (1,56 % Pepton, o,28 % Hefeextrakt, 0,56 % NaCl, o,l % D(+)-Glucose, pH 7,2) bei 3o° C auf dem Schüttelinkubator für 48 Std. vorgezüchtet (Frequenz: l4o UpM).
Hauptkultur: 2 VoI % der 48 Std. alten Vorkultur werden eingeimpft in loo ml steriler Nährlösung (5oo ml Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen) folgender Zusammensetzung: o,o5 m K-Na-PO^-Iuffer (pH 7,2), 0,8 % Pepton, o,9 % Hefeextrakt, o,3 % D(+)-Glucose. Nach 42 bis 48 Std. Inkubation bei 3o ' < (Kulturbedingungen wie oben) werden o,l Κ Emulgator und/oder o,l % Sterinsubstrat zugegeben.
/18
130013/0^72
Patentanmeldung D 5766 HENKELKGaA
ZR-FE/Patente
Die sterilisierte Substratsuspension wird vorher durch Ultraschall homogenisiert. Nach 144 Std. Kulturdauer werden die Ansätze geerntet, Proben entnommen, auf pH 2,o eingestellt, 1 : 1 mit Essigester extrahiert und durch quantitative Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Werte der einzelnen VersuchsansStze sind der Tabelle zu entnehmen.
130013/0672 ORIGINAL INSPECTED

Claims (8)

Patentanmeldung τ> c.jf.f. HENKELKGaA Dl°o ZR-FE/Patente -y- "Neue Sterinkonzentrate, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung in der fermentativen Sterintransformation" Patentansprüche
1. J^erfahren zur Gewinnung eines Sterinverbindungen natürlichen Ursprungs enthaltenden Konzentrats, das als Einsatzmaterial für die fermentative Sterintransformation geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Destillationsrückstände aus der Verarbeitung natürlicher Fette und/oder öle mit einem niederen Alkohol umestert, das Reaktionsprodukt der Kurzwegdestillation unterwirft und hierbei eine Hauptfraktion mit einem Gehalt bis etwa 5o Gew.-% Sterinverbindungen als Verfahrensprodukt abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Destillationsrückstände; mit einem Steringehalt von 5-15 Gew.-% einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Destillationsrückstände aus der mehrfachen Fettspaltung in das Verfahren eingesetzt werden.
^t. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3j dadurch gekennzeichnet, daß man die Umesterung der Destillationsrückstände mit Methanol vornimmt.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3 dadurch gekennzeich- net, daß man ein ein- und/oder mehrfach hydroxylierte Fettsäurer.ethylester enthaltendes Produkt mit einer OH-Zahl (unverseift) von ^o - 15o gewinnt, wobei zur Einstellung hoher OH-Zahlen im Produkt ein im wesentlichen nicht hydroxylierte Fettsäuremethylester enthaltender ,„
130013/0672
Patentanmeldung n c7zrr HENKELKGaA
"TfSfSlB
Vorlauf verworfen werden kann.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5> dadurch gekennzeichnet, daß man die Kurzwep;destillation in einem Dünnschichtverdampfer durchführt.
7. Auf destillativem Weg aus methanolisch umgeesterten Rückständen der Fettverarbeitung gewonnene Sterinkonzentrate mit einer Verseifungszahl von 5o - 17o und einer OH-Zahl (unverseift) von 4o - 15o, vorzugsweise ^o 13o, bestehend im wesentlichen aus bis zu ca.5o Gew.-5KSterinverbindungen, bis zu 5o Gew.-/? Methylestern von nicht hydroxylierten Fettsäuren und zum Rest aus ein- und/oder mehrfach hydroxylierten Fettsäuremethylestern neben geringen Mengen Partialglyceriden.
8. Verwendung der nach Ansprüchen 1 bis 6 hergestellten Sterinkonzentrate als Einsatzmaterial in der fermentativen Sterintransformation, insüesondere beim partiellen Seitenkettenabbau von 17-C-Steroidverbindungen.
130013/0672
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