CN105861612A - 一种雄烯二酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种雄烯二酮的制备方法，属于生物转化技术领域，制备方法是通过分枝杆菌转化植物甾醇生成雄烯二酮，在生物转化的体系中添加原凹土及改性凹土，其中原凹土及改性凹土的添加量为0.5～10g/L，本发明方法是在原凹土及改性凹土介质中，利用分枝杆菌催化植物甾醇侧链降解反应，生成雄烯二酮，能够有效提高底物在水溶液中的分散度，提高底物的利用率和反应速率，并在一定程度上解除底物和产物抑制，提高产物的转化率，反应条件温和，转化装置简单，原料来源充足，制备过程简单，生产成本低，对环境污染危害小，同时可以降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物催化领域，尤其涉及到一种雄烯二酮的制备方法。
背景技术
甾体激素类药物是一类重要的医药产品，在世界范围内其产值仅次于抗生素，居第二位。大部分的甾体激素类药物的生产都是以雄烯二酮(雄甾-4-烯-3,17-二酮，Androstenedione，简称AD)为起始原料的，AD是合成甾体激素类药物不可替代的中间体。既可以用化学方法从野生药材“穿地龙”中植物提取合成AD，也可以通过降解自然界丰富的动植物甾醇用微生物发酵的方法获得AD。微生物选择性降解植物甾醇侧链生成AD，能替代复杂的多步化学合成法，并减轻目前由于薯蓣皂素为原料造成的资源紧缺。但植物甾醇(phytosterol，PS)为疏水性化合物，溶解度很低，易聚集在水相表面，而甾体转化酶属于胞内酶，底物只有扩散进入细胞才能与酶接触而进行转化反应，这就导致植物甾醇与转化酶不能很好接触，造成转化率偏低，发酵时间长等问题。
凹凸棒土又称凹土(attapulgite，AT)，别名坡缕石(palygorskite)，是一种以含水富镁硅酸盐为主层链状过渡结构的粘土矿物质，是一种具链层状结构的含水富镁硅酸盐粘土矿物。AT独特的链层状晶体结构，赋予了AT许多性质，主要包括吸附性、载体性、催化性、分散 性和流变性等。用热活化、酸化、碱化、有机改性、混合法对原凹土进行改性可以使其疏松多孔，比表面积增加，吸附性能和分散性能也随之提高，因而对其改性有较高的社会效益和经济效益。
本发明首先提出了将凹土及改性凹土，运用到微生物降解植物甾醇侧链生成AD的反应模型中，利用凹土的分散性、吸附性和载体性来提高底物转化速率和转化率。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种在凹土及改性凹土介质中利用分歧杆菌催化降解甾体化合物植物甾醇侧链生成AD的新方法，该方法在一定程度上提高了底物转化速率和转化率，具有操作简便，绿色环保，价格低廉的优点。
本发明采用的技术方案是：一种雄烯二酮的制备方法，利用分枝杆菌对植物甾醇进行微生物转化生成雄烯二酮，微生物转化体系中添加凹土。
优选的，凹土是原凹土或改性凹土。
优选的，改性凹土为酸改性凹土、硅烷偶联剂改性凹土、碱改性凹土和表面活性剂改性凹土中的一种。
其中，酸改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到酸溶液中，酸溶液为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种，超声振荡，离心水洗至中性，干燥后研磨成细粉。
其中，硅烷偶联剂改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到pH3.5的醋酸水溶液中，再加入0.1％的硅烷偶联剂，硅烷偶联剂为3- 氨基丙基三乙氧基硅烷KH550，超声振荡，离心水洗至无硅烷偶联剂，干燥后研磨成细粉。
其中，碱改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到碱溶液中，碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，超声振荡，离心水洗至中性，干燥后研磨成细粉。
其中，表面活性剂改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到含有0.1g/L的表面活性剂改性溶液中，表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，超声振荡后，离心水洗至无表面活性剂，干燥后研磨成细粉。
优选的，所述凹土的添加量为0.5～10g/L。
优选的，凹土的最适添加量为1～5g/L。
优选的，微生物转化体系包括：转化培养基，活化的菌种种子培养液，植物甾醇和凹土；其中，植物甾醇投料量为0.5～30g/L，活化的菌种种子培养液接种量为7％；微生物转化条件为：转化温度为29～30℃，摇床转速为120～140r/min，转化时间为120～168h。
本发明具有的优点和积极效果是：
1、本发明方法是在原凹土及改性凹土介质中，利用分枝杆菌催化植物甾醇侧链降解反应，生成雄烯二酮，制备过程中无需加入有机溶剂，降低了对环境具有严重破坏作用的有机溶剂的使用，反应条件温和，转化装置简单，原料来源充足，制备过程简单，生产成本低，对环境污染危害小，同时可以降低生产成本。
2、本发明提供了在原凹土及改性凹土介质中AD制备的工艺，能够有效提高底物在水溶液中的分散度，提高底物的利用率和反应速 率，并在一定程度上解除底物和产物抑制，提高产物的转化率，具有一定的工业化应用前景，对于我国制药行业有重要意义。
3、本发明提供的在原凹土及改性凹土介质中AD制备的工艺，AD几乎可以合成所有的甾体药物，对推动我国制药行业的发展有着重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
以下实验所用主要材料来源：Mycobacterium neoaurum TCCC11979，天津科技大学微生物菌种保藏管理中心。
缩写词含义：
AT——凹土
PS——植物甾醇
AD——雄烯二酮(雄甾-4-烯-3,17-二酮，Androstenedione)
ADD——雄甾二烯二酮(雄甾-1,4-二稀-3,17-二酮，Androsta-diene-dione)
1.改性凹土的制备：
(1)酸改性凹土：将4g原凹土加入到100mL的4mol/L的酸溶液中，酸溶液为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种，超声振荡30min，离心水洗至中性，60℃干燥8h，研磨成细粉，备用。
(2)硅烷偶联剂改性凹土：将4g原凹土加入到100mL的pH 3.5的醋酸水溶液中，再加入0.1mL硅烷偶联剂，硅烷偶联剂为3-氨基 丙基三乙氧基硅烷KH550，超声振荡30min，离心水洗至无硅烷偶联剂，60℃干燥8h，研磨成细粉，备用。
(3)碱改性凹土：将4g原凹土加入到100mL的4mol/L的碱溶液中，碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或其他碱溶液中的一种，超声振荡30min，离心水洗至中性，60℃干燥8h，研磨成细粉，备用。
(4)表面活性剂改性凹土：将4g原凹土加入到100mL的含有0.01g表面活性剂改性溶液中，表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，超声振荡后，离心水洗至无表面活性剂，60℃干燥8h，研磨成细粉，备用。
2.菌种活化培养：将Mycobacterium neoaurum TCCC11979菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，将种子菌液以2％的接种量接种到装有30mL种子液体培养基的三角瓶中，于29℃，220r/min培养36h左右，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3.植物甾醇微生物转化：将活化的种子培养液以7％的接种量转 接于装有含有0.5-30g/L植物甾醇及0.5-10g/L改性凹土的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中，于29～30℃，120～140r/min振荡培养120～168h得到发酵液。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.0～pH 7.4。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
实施例1：添加酸改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1酸改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL硫酸溶液中，硫酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离心后弃上清，将下层固体水洗至中性，60℃干燥8h，研磨成细粉，即为硫酸改性凹土H2SO4-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL 种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有5g/L植物甾醇及5g/L的硫酸改性凹土H2SO4-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸亚铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH7.2。
添加硫酸改性凹土H2SO4-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸亚铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇5，硫酸改性凹土H2SO4-AT 5，pH 7.2。
为了验证改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇5，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于29℃环境下，140r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表1所示，72h后，添加酸改性凹土H2SO4-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为25.18±0.99％，是对照组(6.49±0.31％)的3.88倍；120h后，添加酸改性凹土H2SO4-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为34.84±0.62％，是对照组(10.29±0.12％)的3.38倍；168h后，添加酸改性凹土H2SO4-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为37.15±1.07％，是对照组(15.07±0.15％)的2.46倍。
表1微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例2：添加酸改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1酸改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL盐酸溶液中，盐酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离心后弃上清，将下层固体水洗至中性，60℃干燥8h，研磨成细粉，即为盐酸改性凹土HCl-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有3g/L植物甾醇及5g/L的盐酸改性凹土HCl-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁
按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.2。
添加盐酸改性凹土HCl-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸亚铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇3，盐酸改性凹土HCl-AT 5，pH 7.2。
为了验证改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇3，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于29℃环境下，120r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表2所示，72h后，添加酸改性凹土HCl-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为29.21±0.11％，是对照组(8.43±0.41％)的3.46倍；120h后，添加酸改性凹土HCl-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为37.85±0.44％，是对照组(12.94±0.19％) 的2.92倍；168h后，添加酸改性凹土HCl-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为41.11±0.78％，是对照组(15.97±0.04％)的2.57倍。
表2微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例3：添加酸改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1酸改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL磷酸溶液中，磷酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离心后弃上清，将下层固体水洗至中性，60℃干燥8h，研磨成细粉，即为磷酸改性凹土H3PO4-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、 柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有5g/L植物甾醇及3g/L的磷酸改性凹土H3PO4-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.2。
添加磷酸改性凹土H3PO4-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇5，磷酸改性凹土H3PO4-AT 3，pH 7.2。
为了验证改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇5，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于29℃环境下，140r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2 min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表3所示，72h后，添加酸改性凹土H3PO4-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为21.42±1.02％，是对照组(6.49±0.31％)的3.30倍；120h后，添加酸改性凹土H3PO4-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为29.76±1.11％，是对照组(10.29±0.12％)的2.89倍；168h后，添加酸改性凹土H3PO4-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为33.08±0.28％，是对照组(15.07±0.15％)的2.19倍。
表3微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例4：添加酸改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1酸改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL硝酸溶液中，硝酸浓度为4mol/L，超声振荡30min，离心后弃上清，将下层固体水洗至中性，60℃干 燥8h，研磨成细粉，即为硝酸改性凹土HNO3-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有1g/L植物甾醇及3g/L的硝酸改性凹土HNO3-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.2。
添加硝酸改性凹土HNO3-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇1，硝酸改性凹土HNO3-AT 3，pH 7.2。
为了验证改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇1，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于29℃环境下，140r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表4所示，72h后，添加酸改性凹土HNO3-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为30.07±0.60％，是对照组(13.01±0.41％)的2.31倍；120h后，添加酸改性凹土HNO3-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为41.89±0.89％，是对照组(25.87±0.19％)的1.62倍；168h后，添加酸改性凹土HNO3-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为45.12±0.40％，是对照组(28.34±0.04％)的1.59倍。
表4微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例5：添加碱改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1碱改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL的4mol/L的氢氧化钠溶液中，超声振荡30min，离心水洗至中性，60℃干燥8h，研磨成细粉，即为氢氧化钠改性凹土NaOH-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、 柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有1g/L植物甾醇及1g/L的氢氧化钠改性凹土NaOH-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2L，柠檬酸铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.2。
添加氢氧化钠改性凹土NaOH-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇1，碱改性凹土NaOH-AT 1，pH 7.2。
为了验证改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇1，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于30℃环境下，120r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min， 柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表5所示，72h后，添加氢氧化钠改性凹土NaOH-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为25.19±0.87％，是对照组(13.01±0.41％)的1.93倍；120h后，添加氢氧化钠改性凹土NaOH-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为34.88±0.62％，是对照组(25.87±0.19％)的1.35倍；168h后，添加氢氧化钠改性凹土NaOH-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为39.62±1.07％，是对照组(28.34±0.04％)的1.39倍。
表5微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例6：添加碱改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1碱改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL的4mol/L的氢氧化钾溶液中，超声振荡30min，离心水洗至中性，60℃干燥8h，研磨成细粉，即为碱改性凹土KOH-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种 转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有5g/L植物甾醇及3g/L的碱改性凹土KOH-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.2。
添加碱改性凹土KOH-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇5，碱改性凹土KOH-AT 3，pH 7.4。
为了验证碱改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2， 柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇5，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于30℃环境下，120r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表6所示，72h后，添加碱改性凹土KOH-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为20.94±0.91％，是对照组(6.49±0.31％)的3.23倍；120h后，添加碱改性凹土KOH-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为29.32±0.22％，是对照组(10.29±0.12％)的2.84倍；168h后，添加碱改性凹土KOH-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为34.17±1.37％，是对照组(15.07±0.15％)的2.26倍。
表6微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例7：添加硅烷偶联剂改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1硅烷偶联剂改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL的pH 3.5的醋酸水溶液中，再加入0.1mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷KH550，超声振荡30min，离心水洗至无硅烷偶联剂，60℃干燥8h，研磨成细粉，即为硅烷偶联剂改性凹土KH550-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有1g/L植物甾醇及5g/L的硅烷偶联剂改性凹土KH550-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2L，柠檬酸铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.2。
添加硅烷偶联剂改性凹土KH550-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇1，硅烷偶联剂改性凹土KH550-AT 5，pH 7.0。
为了验证硅烷偶联剂改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇1，pH 7.0。
将两组微生物转化体系一起放置于29℃环境下，140r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min， 柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表7所示，72h后，添加硅烷偶联剂改性凹土KH550-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为34.88±0.20％，是对照组(13.01±0.41％)的2.68倍；120h后，添加硅烷偶联剂改性凹土KH550-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为47.03±0.95％，是对照组(25.87±0.19％)的1.82倍；168h后，添加硅烷偶联剂改性凹土KH550-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为52.81±0.88％，是对照组(28.34±0.04％)的1.86倍。
表7微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例8：添加表面活性剂改性凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1表面活性剂改性凹土的制备：
将4g原凹土加入到100mL的含有0.01g十六烷基三甲基溴化铵溶液中，超声振荡后，离心水洗至无表面活性剂，60℃干燥8h，研磨成细粉，即为表面活性剂改性凹土CTAB-AT。
2菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
3植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有3g/L植物甾醇及5g/L的表面活性剂改性凹土CTAB-AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10g/L，柠檬酸2g/L，柠檬酸铁按0.05g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，pH 7.2。
添加表面活性剂改性凹土CTAB-AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇3，表面活性剂改性凹土CTAB-AT 5，pH 7.2。
为了验证表面活性剂改性凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10L，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇3，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于29℃环境下，130r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
4.雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
5比对结果：
如表8所示，72h后，添加表面活性剂改性凹土CTAB-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为30.22±0.79％，是对照组(8.43±0.41％)的3.58倍；120h后，添加表面活性剂改性凹土CTAB-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为38.39±1.32％，是对照组(12.94±0.19％)的2.96倍；168h后，添加表面活性剂改性凹土CTAB-AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为42.83±0.27％，是对照组(15.97±0.04％)的2.68倍。
表8微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
实施例9：添加原凹土制备雄烯二酮的方法，实验过程如下：
1菌种活化培养：
将Mycobacterium neoaurum TCCC11979(新金色分枝杆菌)菌种转接于新鲜斜面培养基上，29℃培养2～4d，用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种种子，使种子菌液OD600值控制在1.0±0.2，在250mL三角瓶中将种子菌液以2％的接种量接种到30mL种子液体培养基中，29℃条件下，220r/min培养36h，测菌体OD600值为1.0±0.2得到种子培养液。
其中，斜面培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、硫酸镁0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、硝酸铵2、碳酸钙10、甘油20、葡萄糖5、琼脂20。
种子液体培养基成分为(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10。
2植物甾醇微生物转化：
将活化的种子培养液以7％的接种量转接于装有含有5g/L植物甾醇及5g/L的原凹土AT的50mL发酵培养基的250mL挡板瓶中。
其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH 7.2。
添加原凹土AT的微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇20，原凹土AT 5，pH 7.2。
为了验证原凹土对制备雄烯二酮AD的促进效果，同时设立对照组实验：
其中，对照组微生物转化体系为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇5，pH 7.2。
将两组微生物转化体系一起放置于29℃环境下，140r/min振荡培养168h得到两组发酵液。
3雄烯二酮AD摩尔生成率的检测：
用1mL的乙酸乙酯超声萃取发酵液0.5h，离心(12000×g，2min)，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL eppendorf管中，自然风干后加1mL的流动相，离心(12000×g，2min)后进行HPLC分析。色谱条件：Phenomenex C18柱，流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
4比对结果：
如表9所示，72h后，添加原凹土AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为18.34±1.08％，是对照组(6.49±0.31％)的2.82倍；120h后，添加原凹土AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔 生成率为23.45±0.61％，是对照组(10.29±0.12％)的2.27倍；168h后，添加原凹土AT的微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率为25.37±0.77％，是对照组(15.07±0.15％)的1.68倍。
表9微生物转化体系中雄烯二酮AD摩尔生成率
以上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种雄烯二酮的制备方法，利用分枝杆菌对植物甾醇进行微生物转化生成雄烯二酮，其特征在于：微生物转化体系中添加凹土。
2.根据权利要求1所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述凹土是原凹土或改性凹土。
3.根据权利要求2所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述改性凹土为酸改性凹土、硅烷偶联剂改性凹土、碱改性凹土和表面活性剂改性凹土中的一种。
4.根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述酸改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到酸溶液中，所述酸溶液为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种，超声振荡，离心水洗至中性，干燥后研磨成细粉。
5.根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述硅烷偶联剂改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到pH 3.5的醋酸水溶液中，再加入0.1％的硅烷偶联剂，所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷KH550，超声振荡，离心水洗至无硅烷偶联剂，干燥后研磨成细粉。
6.根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述碱改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到碱溶液中，所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，超声振荡，离心水洗至中性，干燥后研磨成细粉。
7.根据权利要求3所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述表面活性剂改性凹土的改性步骤为：将原凹土加入到含有0.1g/L的表面活性剂改性溶液中，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，超声振荡后，离心水洗至无表面活性剂，干燥后研磨成细粉。
8.根据权利要求1-7中任意所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述凹土的添加量为0.5～10g/L。
9.根据权利要求8所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述凹土的最适添加量为1～5g/L。
10.根据权利要求8所述的雄烯二酮的制备方法，其特征在于：所述微生物转化体系包括：转化培养基，活化的菌种种子培养液，植物甾醇和凹土；其中，所述植物甾醇投料量为0.5～30g/L，所述活化的菌种种子培养液接种量为7％；微生物转化条件为：转化温度为29～30℃，摇床转速为120～140r/min，转化时间为120～168h。
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