CN110305798A - 一株曲霉菌的用途及由该曲霉菌制备的化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株曲霉菌的用途及由该曲霉菌制备的化合物及其用途。该曲霉菌的菌株号为CPCC400735，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.12376。曲霉CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物在浓度为4mg/mL时对HIV‑1的抑制率为99.9％。式1至4所示的化合物在浓度为100μM时对HIV‑1的抑制率均在96％以上,IC50值2.4‑32.6μM。本发明的曲霉CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物和式1至式4所示的化合物对HIV‑1具有较强的抑制活性，并且毒性较小。

Description

一株曲霉菌的用途及由该曲霉菌制备的化合物及其用途
本申请是申请号为201610424586.3、申请日为2016年06月15日、发明创造名称为“一株产生抗HIV活性物质的曲霉菌及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一株曲霉菌的用途及由该曲霉菌制备的化合物及其用途。
背景技术
HIV(Human Immunodeficiency Virus)病毒，中文全称人类免疫缺陷病毒，属于逆转录病毒的一种。HIV病毒侵入宿主细胞后，会严重破坏宿主机体免疫功能，从而引起严重的机会性感染以致引起以恶性疾病为特征的继发性免疫缺陷，即为获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)。首例艾滋病病例于1981年在美国被发现，随后开始在全球范围内迅速传播，目前已成为人类健康的重大威胁之一。HIV病毒可分为HIV-1型和HIV-2型，两者基因组具有很大的差异，其中HIV-1是引起全球性艾滋病蔓延的主要病原体。
化学治疗仍然是目前最重要的HIV-1治疗手段，至今有26种化合物实体进入临床应用。按其作用机制分类，这些上市药物中主要是逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，总计达到22种。而其他作用机制的仅有4种，包括2种整合酶抑制剂和2种病毒进入抑制剂。随着抗HIV药物的不断研发应用，特别是依靠联合药物治疗方式对艾滋病患者进行治疗，已可以有效降低病毒载量，显著延长患者生存时间，但是耐药性、不良反应及患者的依从性等问题仍常引起临床治疗的失败。因此，仍需要持续开发新的抗HIV-1药物以供临床应用。
微生物种类庞大，具有丰富类型的代谢产物，是寻找高效低毒抗HIV活性物质的一个重要来源。通过建立筛选模型快速筛选出产抗HIV活性物质的菌株，继而从其代谢产物中寻找具有抗HIV活性的化合物或具有一定活性的化合物为先导,进行结构简化和修饰,揭示作用机理和构效关系,是发现新抗HIV药物的有效途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制HIV。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一株曲霉。
本发明所提供的曲霉(Aspergillus sp.)，其菌株号为CPCC400735(又称CPCC400735)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.12376。
上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735可以分生孢子、菌丝或含有分生孢子和/或菌丝的菌丝体的形式存在。
上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735在制备HIV抑制剂中的应用、上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735在制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物中的应用、由上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735得到的HIV抑制剂、由上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735制备得到的治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物均属于本发明的保护范围。
上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物也属于本发明的保护范围。
上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物是将上述曲霉(Aspergillussp.)CPCC400735在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质。
上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物中，所述微生物培养基可为曲霉培养基(能培养曲霉的培养基)，其可为固体培养基、半固体培养基或液体培养基。所述微生物培养基可为稻米培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基或其他本领域专业人员熟知的真菌发酵培养基等。上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC 400735的培养物中，所述稻米培养基可由稻米和水制成，也可由稻米、水和无机盐制成，也可由稻米、水和氮源制成，也可由稻米、水、氮源和无机盐制成。所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基可由马铃薯、葡萄糖、琼脂和水制成，也可由马铃薯、葡萄糖、琼脂、水和无机盐制成，也可由马铃薯、碳源、琼脂、水和氮源制成，也可由马铃薯、碳源、琼脂、氮源和无机盐制成。所述其他本领域专业人员熟知的真菌发酵培养基可由某一种或几种速效、迟效碳源、某一种或几种速效、迟效氮源、水和/或无机盐等制成。
上文中，所述稻米可为大米或糙米。大米或糙米均是稻谷的制品。稻谷是指没有去除水稻谷壳的果实，稻谷由谷壳、果皮、种皮、外胚乳、糊粉层、胚乳和胚构成。糙米是指稻谷脱去谷壳，保留稻谷其它各部分的制品；大米是指仅保留胚乳，而将稻谷其余部分全部脱去的制品。碳源是微生物生长一类营养物，是含碳化合物，包括糖类、油脂、有机酸及有机酸酯和小分子醇等速效、迟效碳源。氮源是指提供微生物营养所需氮元素的物质，包括花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和硝酸盐等速效、迟效氮源。
上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物中，所述培养的温度可为20-30℃，培养时间可为10-40天。
本发明还提供了一种HIV抑制剂。
本发明所提供的一种HIV抑制剂的活性成分是用甲醇从上述曲霉(Aspergillussp.)CPCC400735的培养物中提取得到的溶于甲醇的物质。
本发明还提供了该HIV抑制剂的制备方法，包括用甲醇从上述曲霉(Aspergillussp.)CPCC400735的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，将所述物质作为HIV抑制剂的活性成分。
本发明还提供了一种治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物。
本发明所提供的治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的活性成分是用甲醇从上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物中提取得到的溶于甲醇的物质。
本发明还提供了该治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的制备方法，包括用甲醇从上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，将所述物质作为治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的活性成分。
本发明还提供了另一种HIV抑制剂。
本发明所提供的另一种HIV抑制剂的活性成分，是式Ⅱ所示的化合物：
所述R为
本发明还提供了制备HIV抑制剂的方法，包括用甲醇从上述曲霉(Aspergillussp.)CPCC400735的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，再从所述物质中提取得到式Ⅱ所示的化合物，将式Ⅱ所示的化合物作为HIV抑制剂的活性成分。
本发明还提供了另一种治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物。
该治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物，其活性成分是式Ⅱ所示的化合物。
本发明还提供了制备该治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的方法，包括用甲醇从上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，再从所述物质中提取得到式Ⅱ所示的化合物，将式Ⅱ所示的化合物作为治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的活性成分。
本发明还提供了制备式Ⅱ所示的化合物的方法。
本发明所提供的制备式Ⅱ所示的化合物的方法，包括用甲醇从上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物中提取得到的溶于甲醇的物质，再从所述物质中提取得到式Ⅱ所示的化合物。
本发明还提供了9)-12)的方法：
9)治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征的方法，包括给受体动物施用用甲醇从上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735中提取得到溶于甲醇的物质，进行治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征；
10)抑制HIV感染动物的方法，包括给受体动物施用用甲醇从上述曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735培养物中提取得到溶于甲醇的物质以抑制HIV感染动物；
11)治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征的方法，包括给受体动物施用式Ⅱ所示的化合物进行治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征；
12)抑制HIV感染动物的方法，包括给受体动物施用式Ⅱ所示的化合物以抑制HIV感染动物。
上述方法中，从所述物质中提取得到式Ⅱ所示的化合物具体可包括A1)-A4)中的相应步骤：
A1)将所述物质用水分散，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，除去乙酸乙酯相中的乙酸乙酯，得到浸膏；
A2)将所述浸膏进行硅胶柱层析分离，硅胶柱层析中所用的洗脱程序是先用氯仿洗脱2个柱体积；再进行13个柱体积的如下线性梯度洗脱：所用的流动相是由氯仿和甲醇组成的混合液，线性梯度洗脱流动相中氯仿和甲醇的体积比由20:1线性降至7:1；最后再用甲醇洗脱两个柱体积；收集第0.9至第3.6个柱体积洗脱出的液体，将其命名为Fr.4-12，收集第4.5至第5.1个柱体积洗脱出的液体，将其命名为Fr.16-17；
A3)将Fr.4-12进行硅胶柱层析，该硅胶柱层析中所用的洗脱程序是进行6个柱体积的如下线性梯度洗脱：所用的流动相是由石油醚和丙酮组成的混合液，线性梯度洗脱中的流动相中的石油醚和丙酮的体积比由8:1线性降至5:1；收集第3.2至第4.5个柱体积洗脱出的液体，将其命名为Tubes 27-37；
A4)将Tubes 27-37进行制备型高效液相色谱分离，该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm；流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为4∶1；流速为4.0mL/min，收集保留时间为23.9min的洗脱峰，将其命名为tubes27-37-P2；将tubes 27-37-P2进行制备型高效液相色谱分离；该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm；流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为4∶1；流速为4.5mL/min，收集保留时间为23.9min的洗脱峰，得到式Ⅱ中R为的化合物(即式1所示的化合物)；
A5)将Tubes 27-37进行制备型高效液相色谱分离，该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm；流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为4∶1；流速为4.0mL/min，收集保留时间为44.6min的洗脱峰，将其命名为tubes27-37-P6；将tubes 27-37-P6进行制备型高效液相色谱分离；该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm；流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为4∶1；流速为5mL/min，收集保留时间为37.7min的洗脱峰，得到式Ⅱ中R为的化合物(即式2所示的化合物)；
A6)将Fr.16-17进行硅胶柱层析，该硅胶柱层析中所用的洗脱程序是用由氯仿和甲醇组成的氯仿和甲醇的体积比10:1的混合液体作为流动相进行洗脱，收集第0至0.2个柱体积洗脱出的液体，将其命名为tubes 1-3，收集第0.2个柱体积至第0.9个柱体积洗脱出的液体，将其命名为Tubes 4-13；将Tubes 4-13进行开放ODS柱层析分离，该开放ODS柱层析分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为50μm，该开放ODS柱层析分离所用的层析柱直径为4cm，高为16cm，层析柱体积为201mL；该开放ODS柱层析分离所用的洗脱程序是两步洗脱，第一步洗脱用由甲醇和水组成的甲醇和水的体积比为11:9的混合液体作为流动相洗脱4个柱体积，完成第一步洗脱；第二步洗脱：完成第一步洗脱后，用甲醇作为流动相进行洗脱，收集甲醇洗脱出的第0至第0.5个柱体积洗脱出的液体，将其命名为Tubes4-13-ODS-9。将Tubes 4-13-ODS-9和tubes 1-3合并进行名称为式4所示的化合物-5制备分离的制备型高效液相色谱分离，该名称为式4所示的化合物-5制备分离的制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该名称为式4所示的化合物-5制备分离的制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm；流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为3∶1；流速为4.0mL/min；收集保留时间为18.2min的洗脱峰得到P2，收集保留时间为22.2min的洗脱峰得到P3，将P2和P3再进行所述名称为式4所示的化合物-5制备分离的制备型高效液相色谱分离，P2的制备型高效液相色谱分离中收集保留时间为18.2min的洗脱峰得到式Ⅱ中R为(即式4所示的化合物)；P3的制备型高效液相色谱分离中收集保留时间为22.2min的洗脱峰得到式Ⅱ中R为的化合物(即式3所示的化合物)。
上述式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐、式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备HIV抑制剂中的应用、以式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分的HIV抑制剂均属于本发明的保护范围。
上文中，所述HIV均可为HIV-1型的HIV，所述获得性免疫缺陷综合征可由HIV-1引起。
上文中，所述动物可为哺乳动物，如人。
上文中，所述HIV抑制剂和所述治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物，除含有活性成分外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。
实验证明，曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物在浓度为4mg/mL时对HIV-1的抑制率为99.9％。从上述甲醇提取物中分离的式1至式4所示的化合物在浓度为100μM时对HIV-1的抑制率分别为99.84％、99.99％、98.60％和96.82％,式1至式4所示的化合物的IC50值分别为2.4μM,4.5μM，22.1μM和32.6μM。本发明的曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物和式1至式4所示的化合物对HIV-1具有较强的抑制活性，并且毒性较小。
保藏说明
菌种名称：曲霉(Aspergillus sp.)
菌株编号：CPCC400735
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年5月5日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12376
附图说明
图1为式4所示的化合物的结构。
图2为式2所示的化合物的结构。
图3为式1所示的化合物的结构。
图4为式3所示的化合物的结构。
图5为式4所示的化合物的1H-NMR谱。
图6为式4所示的化合物的13C-NMR谱。
图7为式4所示的化合物的HSQC谱。
图8为式4所示的化合物的HMBC谱。
图9为式4所示的化合物的1H-1H COSY谱。
图10为式4所示的化合物的NOESY谱。
图11为式4所示的化合物的Rh2(OCOCF3)4诱导CD谱。
图12为式4所示的化合物的Mo(Ac)4诱导CD谱。
图13为式2所示的化合物的1H-NMR谱。
图14为式2所示的化合物的13C-NMR谱。
图15为式2所示的化合物的HSQC谱。
图16为式2所示的化合物的HMBC谱。
图17为式2所示的化合物的1H-1H COSY谱。
图18为式2所示的化合物的NOESY谱。
图19为式1所示的化合物的1H-NMR谱。
图20为式1所示的化合物的13C-NMR谱
图21为式1所示的化合物的HSQC谱。
图22为式1所示的化合物的HMBC谱。
图23为式1所示的化合物的1H-1H COSY谱。
图24为式1所示的化合物的NOESY谱。
图25为式1所示的化合物的C-23至C-33结构片段中的六元醚环的相对构型。
图26为式3所示的化合物的1H-NMR谱。
图27为式3所示的化合物的13C-NMR谱。
图28为式3所示的化合物的HSQC谱。
图29为式3所示的化合物的HMBC谱。
图30为式3所示的化合物的1H-1H COSY谱。
图31为式3所示的化合物的NOESY谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂17g，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，121℃条件下灭菌20分钟，得到PDA培养基。
下述实施例中的pNL4-3Luc(R-E-)和pHIT/G(Zhang et al.Retrovirology(2016)13:13)公众可从NIH或申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的分离与鉴定
1.1菌株分离
菌株CPCC400735分离自南五味子(Kadsura longipedunculata)的茎中。采集南五味子植株装入自封袋内，带回实验室处理。称取1g南五味子茎，用75％酒精漂洗30s，无菌水清洗3次，用无菌剪刀将茎剪碎，放进灭过菌的研钵内并加石英砂进行研磨。将研磨液加入装有9mL无菌水的离心管中，样品浓度为10-1，摇匀后，依次配成10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释液。分别吸取不同梯度稀释液200μL，分别涂布到PDA平板上，吹干后倒置于25℃培养箱中培养3-5天，将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰箱中保存。取编号为CPCC400735的菌株进行下述鉴定。
1.2菌株鉴定
1.2.1菌株形态观察
将菌株CPCC400735用接种针挑至PDA培养基平板中央，28℃培养箱中培养。菌株CPCC400735在PDA培养基上生长良好，培养5-7天时菌落呈浅黄色，质地丝绒状至絮状，较厚，具或不具辐射状沟纹；菌落反面黄褐色，分生孢子多或少，初为浅黄褐色，近于淡粉褐色，老后变深，近于粉红肉桂色，分生孢子头初为辐射形，后呈疏松柱形，分生孢子头的顶囊球状，顶囊由初生小梗融合层和瓶梗的融合重叠层所覆盖，瓶梗产生分生孢子链，分生孢子球形或近球形，壁光滑。鉴于上述形态特征，初步鉴定菌株CPCC400735为曲霉属真菌。
1.2.2分子生物学鉴定
提取菌株CPCC400735的基因组DNA，PCR扩增18S rRNA基因，并测序。将所得序列(序列表中的序列1)与GenBank数据库中序列进行比对，结果表明菌株CPCC400735与曲霉(Aspergillus sp.)的相似性为99％，因此，结合之前的形态特征，确定菌株CPCC400735为曲霉属真菌。
曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735已于2016年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12376。下文简称曲霉(Aspergillussp.)CPCC400735。
实施例2、利用曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735制备HIV-1抑制剂
本实施例利用曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735制备了5种HIV-1抑制剂，其中的一种HIV-1抑制剂是曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物(用甲醇从曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物中提取得到的溶于甲醇的物质)，另外4种HIV-1抑制剂是式Ⅱ所示的通式化合物
其结构式具体如式1至式4所示(表1)。
表1、式Ⅱ所示通式化合物的取代基
上述5种HIV-1抑制剂的具体制备方法如下：
1、制备曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735的培养物
曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735在PDA斜面28℃培养5天，然后挑取菌丝块接种于装有100ml种子培养基(其组成为：葡萄糖2％，蔗糖1％，黄豆粉0.2％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.03％，聚乙二醇0.25％，硝酸钠0.3％，硫酸铵0.3％，余量为水，pH 6.0。121℃灭菌20分钟，得到种子培养基)的500ml三角瓶中，28-30℃震荡培养2天作为种子液。然后，将种子液10ml接入装有大米培养基的500ml三角瓶(500ml三角瓶装有80g大米，加入100ml去离子水浸泡，121℃灭菌20分钟得到大米培养基)中，28℃培养40天，得到曲霉(Aspergillussp.)CPCC400735固体发酵培养物。
2、制备曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物
取2000g步骤1的曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735固体发酵培养物用玻璃棒将其搅碎，加入4L甲醇，在28℃提取3次，每次30min，合并甲醇提取液，用旋转蒸发仪(温度：40℃，转数：70转)旋转蒸发除去甲醇提取液中甲醇，得到的物质即为曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物。
3、制备式1至式5所示的化合物
3.1、将步骤2的曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物用水分散，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，用旋转蒸发仪(温度：40℃，转数：70转)旋转蒸发除去乙酸乙酯相中的乙酸乙酯，得到浸膏。取50g浸膏用甲醇溶解后进行硅胶柱层析分离。硅胶柱层析中所用的硅胶是硅胶H，所用的硅胶柱的规格为6.5×20cm，柱体积为663mL。硅胶柱层析中所用的洗脱程序是先用氯仿洗脱2个柱体积；再进行13个柱体积的如下线性梯度洗脱：所用的流动相是由氯仿和甲醇组成的混合液，线性梯度洗脱流动相中氯仿和甲醇的体积比由20:1线性降至7:1；最后再用甲醇洗脱两个柱体积。从洗脱程序开始不间断收集洗脱出的液体，每管收集200ml(200ml/流份)，连续收集56个流份，记为：Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、……、Fr.56，TLC检测指导合并相同流份，最后得到12个合并组分：Fr.1-3，Fr.4-12(将Fr.4至Fr.12这9个流份合并得到，是第0.9至第3.6个柱体积洗脱出的液体)，Fr.13-14，Fr.15，Fr.16-17(将Fr.16和Fr.17这2个流份合并得到，是第4.5至第5.1个柱体积洗脱出的液体)，Fr.18-21，Fr.22-25，Fr.26-31，Fr.32-34，Fr.35-42，Fr.43-54，Fr.55-56。
3.2、将步骤3.1得到的Fr.4-12进行加压硅胶柱层析。加压硅胶柱层析中所用的硅胶是硅胶H，所用的硅胶柱的规格为4×13cm(直径为4cm，高为13cm)，柱体积为163mL。加压硅胶柱层析中所用的洗脱程序是进行6个柱体积的如下线性梯度洗脱：所用的流动相是由石油醚和丙酮组成的混合液，线性梯度洗脱中的流动相中的石油醚和丙酮的体积比由8:1线性降至5:1。从洗脱程序开始不间断收集洗脱出的液体，每管收集20ml(20ml/流份)，连续收集43个流份，记为：Tube.1、Tube.2、Tube.3、……、Tube.43。将Tube.27至Tube.37这11个流份混合，得到名称为Tubes 27-37的组分(是第3.2至第4.5个柱体积洗脱出的液体)。
将Tubes 27-37进行制备型高效液相色谱分离(RP-C18液相制备分离)。该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm。流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为4∶1；流速为4.0mL/min。得到6个制备组分，其名称分别为tubes 27-37-P1(tR(保留时间)为6.0min)，tubes 27-37-P2(tR为23.9min)，tubes27-37-P3(tR为27.0min)，tubes 27-37-P4(tR为31.2min)，tubes 27-37-P5(tR为34-42min)，tubes27-37-P6(tR为44.6min)。
将tubes 27-37-P2进行制备型高效液相色谱分离(RP-C18液相制备分离)。该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm。流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为4∶1；流速为4.5mL/min。收集tR(保留时间)为23.9min的洗脱峰，用旋转蒸发仪(温度：40℃，转数：70转)旋转蒸发除去甲醇和水，得到5.0mg的式1所示的化合物。
将tubes 27-37-P6进行制备型高效液相色谱分离(RP-C18液相制备分离)。该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm。流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为4∶1；流速为5.0mL/min。收集tR(保留时间)为37.7min的洗脱峰，用旋转蒸发仪(温度：40℃，转数：70转)旋转蒸发除去甲醇和水，得到14.7mg的式2所示的化合物。
3.3、将步骤3.1得到的Fr.16-17进行加压硅胶柱层析。加压硅胶柱层析中所用的硅胶是硅胶H，所用的硅胶柱的规格为4×12cm(直径为4cm，高为12cm)，柱体积为151mL。加压硅胶柱层析中所用的洗脱程序是用由氯仿和甲醇组成的氯仿和甲醇的体积比10:1的混合液体作为流动相进行洗脱，从洗脱程序开始不间断收集洗脱出的液体，每管收集10ml(10ml/流份)，连续收集18个流份，记为：Tube.1、Tube.2、Tube.3、……、Tube.18。TLC指导合并得到四个合并组分：tubes 1-3(将Tube.1至Tube.3这3个流份混合，得到名称为tubes1-3的组分，是第0至0.2个柱体积洗脱出的液体)，tubes 4-13(将Tube.4至Tube.13这10个流份流份混合，得到名称为tubes 4-13的组分，是第0.2个柱体积至第0.9个柱体积洗脱出的液体)，tubes 14-18。将Tubes 4-13再进行开放ODS柱层析分离。该开放ODS柱层析分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为50μm，该开放ODS柱层析分离所用的层析柱直径为4cm，高为16cm，层析柱体积为201mL。该开放ODS柱层析分离所用的洗脱程序是两步洗脱，第一步洗脱用由甲醇和水组成的甲醇和水的体积比为11:9的混合液体作为流动相洗脱4个柱体积，完成第一步洗脱；第二步洗脱：完成第一步洗脱后，用甲醇作为流动相进行洗脱，从第二步洗脱开始收集该第二步洗脱洗脱出的第1-100ml这100ml液体(用甲醇洗脱出的第0至第0.5个柱体积洗脱出的液体)，将其命名为Tubes 4-13-ODS-9。将Tubes 4-13-ODS-9和tubes 1-3合并进行制备型高效液相色谱分离(RP-C18液相制备分离)。该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm。流动相为甲醇和水组成的混合液体，流动相中甲醇和水的体积比为3∶1；流速为4.0mL/min。得到二个制备组分P2(tR为18.2min)和P3(tR为22.2min)。然后，P2和P3分别在该相同液相制备条件下进行制备型高效液相色谱分离进一步纯化。
P2的制备型高效液相色谱分离收集tR(保留时间)为18.2min的洗脱峰，用旋转蒸发仪(温度：40℃，转数：70转)旋转蒸发除去甲醇和水，得到52.0mg的式4所示的化合物。
P3的制备型高效液相色谱分离收集tR(保留时间)为22.2min的洗脱峰，用旋转蒸发仪(温度：40℃，转数：70转)旋转蒸发除去甲醇和水，得到52.0mg的式3所示的化合物。
3.4式1至式4所示的化合物的理化性质
式1至式4所示的化合物均为棕色固体，均易溶于甲醇、乙醇，DMSO等溶剂中，难溶于水。式1至式5所示的化合物在硅胶薄层层析用氯仿-甲醇-水(体积比70:15:2)溶剂体系展开Rf值为0.5-0.7，在254nm和365nm荧光显色均明显，香草醛硫酸显色显棕红色。
3.5式1至式4所示的化合物的结构解析
式4所示的化合物的HRESIMS(负离子)离子峰：m/z 623.2900[M-H]-提示其分子式为C35H44O10。综合分析1H NMR(图5)，13C NMR(图6)和HSQC谱(图7)，推测化合物中应含有两个酮羰基，一个酯羰基，16个烯碳(其中12个为季碳，4个为叔碳，且有三个碳连接氧原子)和16个sp2杂化的碳(其中三个连接氧原子)。在氢谱中可见特征信号：δ14.29(1H，s)，13.07(1H，s)，11.97(1H，brs)，10.69(1H，brs)，6.79(1H，s)，6.52(1H，t)，4.90(1H，t)，4.79(1H，t)，2.80(3H，s)，2.52(1H，d)，2.11(3H，s)，1.39(3H，s)，1.24(3H，s)，0.98(3H，s)，0.92(3H，s)。从以上特征氢信号出发，在HMBC谱(图8)中可以发现以下相关信号：δ14.29(13-OH)与165.8(C-13)，102.0(C-3)，200.6(C-2，弱)相关；δ2.11(H-14)与107.2(C-12)，162.9(C-11)，165.8(C-13)相关；δ13.07(C-7-OH)与163.3(C-7)，118.0(C-8)，106.1(C-5)，202.8(C-2，弱)相关；δ6.79(8-H)与106.1(C-5)，112.8(C-10)，26.1(C-15)，163.3(C-7)，202.8(C-6，弱)相关；δ2.80(H-15)与112.8(C-7)，118.0(C-8)，149.0(C-9)相关；δ2.52(H-16)与81.2(C-1)，200.6(C-2)，202.8(C-6)，115.4(C-17)，139.6(C-18)相关；δ4.79(H-17)与15.6(C-35)，39.2(C-19)，41.2(C-16)相关；δ1.24(H-35)与39.2(C-19)，115.4(C-17)，139.6(C-18)相关；δ4.90(H-17)与15.3(C-34)，25.9(C-20)，38.0(C-19)相关；δ1.39(H-34)与38.0(C-23)，124.2(C-21)，133.7(C22)相关；δ6.51(H-25)与23.9(C-27)，24.4(C-24)，38.0(C-23)，168.6(C-33)相关；δ3.00(H-29)与23.9(C-27)，71.5(C-30)，26.2(C-31)，24.6(C-32)相关；δ0.98(H-31)与24.6(C-32)，71.5(C-30)，77.3(C-29)相关；δ0.92(H-32)与26.2(C-31)，71.5(C-30)，77.3(C-29)相关。在1H-1H COSY谱(图9)中可找到以下相关信号：δ2.52(H-16)与4.79(H-17)相关；δ1.60(H-19)与1.51(H-20)相关；δ1.51(H-20)与4.90(H-21)相关；δ1.93(H-23)与2.18(H-24)相关；δ2.18(H-24)与6.51(H-25)相关；δ3.00(H-24)与1.10(H-28b)相关；δ1.52H(H-28a)与2.38(H-27a)，2.09(H-27b)相关；δ1.10H(H-28b)与2.38(H-27a)，2.09(H-27b)相关。根据以上信息，可以确定式4所示的化合物的平面结构，碳氢数据归属见表2。NOESY谱(图10)中相关信号：δ4.79(H-17)与1.60(H-19)相关；δ4.90(H-21)与1.93(H-23)相关；δ2.18(H-24)与2.09(H-27b)相关，确定结构中三个双键均为反式(E)构型。结构中C-1和C-29位两个手性碳的构型分别利用Rh2(OCOCF3)4诱导CD谱(图11)和Mo(Ac)4诱导CD谱(图12)鉴定。在式4所示的化合物的Rh2(OCOCF3)4诱导CD谱中，在347nm处显示为负Cotton效应，根据文献(Lorenzo DB,Gennaro P,Carmela P,et al.Determinationof Absolute Configuration of Acyclic 1,2-Diols with Mo2(OAc)4.1.Snatzke’sMethod Revisited[J].J.Org.Chem.2001,66:4819-4825)报道的构型判定规则，C-1位的绝对构型应该为R。在式4所示的化合物的Mo(Ac)4诱导CD谱中，在317nm处显示为负Cotton效应，根据文献[32](Jadwiga Frelek,Wojciech J.Szczepek.[Rh2(OCOCF3)4]as anauxiliary chromophore in chiropticalstudies on steroidal alcohols[J].Tetrahedron:Asymmetry,1999,10:1507-1520)报道的构型判定规则，C-29位的绝对构型应该为R。最终式4所示的化合物的被鉴定为如图1所示结构。
式2所示的化合物的HRESIMS(负离子)离子峰：m/z 575.7247[M-H]-提示其分子式为C35H44O7。式2所示的化合物的1H和13C NMR谱分别如图13和14所示。式2所示的化合物与式1所示的化合物的C-1～C-22结构片段的核磁数据基本一致，而C-23～C-33结构片段的核磁数据有较大差异。HMBC谱中(图16)：δ5.02(H-25)与38.0(C-23)，25.3(C-24)，34.5(C-27)，58.0(C-33)相关；δ3.86(H-33)与125.2(C-25)，139.0(C-26)，34.5(C-27)相关；δ5.02(H-29)与34.5(C-27)，17.5(C-32)相关；δ1.58(H-31)与124.4(C-29)，134.0(C-30)相关，δ1.50(H-32)与124.4(C-29)，134.0(C-30)相关。在1H-1H COSY向谱中(如图17)：δ5.02(H-25)与2.00(H-24)相关；δ2.00(H-24)与1.82(H-23)相关；δ5.02(H-29)与1.98(H-28)相关；δ1.98(H-28)与1.96(H-27)相关，根据以上信息可确定C-23至C-33片段的结构。综合分析1H-1HCOSY，HSQC(图15)和HMBC谱，确证式2所示的化合物的平面结构，并对碳氢信号进行归属(表2)。NOESY谱(图18)中相关信号：δ4.77(H-17)与1.59(H-19)相关；δ4.84(H-21)与1.82(H-23)相关；δ2.00(H-24)与3.86(H-33)，提示17(18)双键为反式(E)构型，21(22)双键为反式(E)构型，25(26)双键为顺式(Z)构型。根据生物合成途径推测，式2所示的化合物的C-1的绝对构型应与式4所示的化合物相同，其构型为R。式2所示的化合物的1H NMR(图19)，13C NMR(图22)，碳氢数据归属见表2。因此，式2所示的化合物的被鉴定为如图2所示的结构。
式1所示的HRESIMS(负离子)离子峰：m/z 653.7920[M-H]-提示其分子式为C37H50O10。式1所示的化合物的1H和13C NMR谱分别如图19和20和表2所示，对比式1所示的化合物与式2所示的化合物的1H和13C NMR数据发现，二者C-1至C-22结构片段相同，而C-23至C-33结构片段的差异较大。HMBC谱中(图22)：δ0.95(H-32)与70.4(C-30)，83.6(C-29)相关；δ1.01(H-31)与70.4(C-30)，83.6(C-29)相关；δ3.24(H-36)和δ3.23(H-37)分别与106.0(C-33相关)；δ4.12(H-33)与77.2(C-25)，43.0(C-26)，23.0(C-27)相关；δ2.76(H-29)与23.0(C-27)相关；δ3.02(H-25)与34.6(C-23)相关。在1H-1H COSY谱中(图23)：δ4.12(H-33)与1.37(H-26)相关，δ1.37(H-26)分别与3.02(H-25)和1.75(H-27a)，1.22(H-27b)相关；3.02(H-25)与1.25(H-24b)相关；1.70(H-24a)与1.98(H-23a)相关。根据化合物的不饱和度和分子式推测,C-23至C-33结构片段中存在一个环状结构，根据HMBC谱中δ2.76(H-29)与77.2(C-27)相关和δ3.02(H-29)与83.6(C-29)相关信息，确定该结构片段中是C-25和C-29位通过单氧键连接形成醚环。根据以上信息可以确定C-23至C-33片段的结构。综合分析1H-1HCOSY，HSQC(图21)和HMBC谱，确定式1所示化合物的平面结构，并对碳氢信号进行归属(表2)。NOESY谱(图24)中相关信号：δ4.77(H-17)与1.60(H-19)相关；δ4.86(H-21)与1.88(H-23b)相关，提示17(18)双键和21(22)双键为反式(E)构型。根据生物合成途径推测，式1所示的化合物的C-1的绝对构型应与式4所示的化合物相同，其构型为R。结构中的C-25，C-26和C-29三个均为手性碳，其绝对构正在通过ECD计算中。根据NOESY谱中的相关信号，确定C-23至C-33结构片段中的六元醚环的相对构型(图25)。最终，式1所示的化合物的被鉴定为如图3所示的结构。
式3所示的化合物的HRESIMS(负离子)离子峰：m/z 609.3094[M-H]-提示其分子式为C35H46O9。式3所示的化合物的1H和13C NMR谱分别如图26和27所示。与式4所示的化合物相比，式3所示的化合物较其少了一个氧原子，多了2个氢原子。对比二者碳谱数据，式3所示的化合物比式4所示的化合物少了一个酯羰基碳原子信号，多了一个连氧原子的饱和碳原子信号δ58.2，而其他碳谱数据基本一致，提示式3所示的化合物的C-33位可能是一个羟甲基。综合分析1H-1H COSY(图30)，HSQC(图28)和HMBC谱(图29)，鉴定了式3所示化合物的平面结构，并对碳氢信号进行归属(表2)。NOESY(图31)谱中相关信号：δ4.78(H-17)与1.59(H-19)相关；δ4.85(H-21)与1.83(H-23)相关；δ2.00(H-24)与3.85(H-33)，提示17(18)双键为反式(E)构型，21(22)双键为反式(E)构型，25(26)双键为顺式(Z)构型。根据生物合成途径推测，式1所示的化合物的C-1和C-29的绝对构型应与式4所示的化合物相同，其构型均为R。因此，式3所示的化合物被鉴定为如图4所示的结构。
表2、式1至式4所示的化合物的核磁数据(1H NMR 600MHz；13C NMR 150MHz；DMSO-d6)
4、对HIV-1的抑制活性
(1)细胞培养及转染：293T细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基中。6孔板每孔接种细胞数为4×105个，培养24h后转染，转染试剂Lipofectamine 2000，根据使用说明进行转染；SupT1细胞(SUP-T1细胞，人T淋巴瘤细胞)培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃的5％CO2培养箱中静置培养。
(2)HIV-1假病毒的制备：按细胞浓度为1.5×105个/ml的量将293T细胞在转染前一天接种于6孔板，于2mL培养基中培养24h进行转染。质粒用量为：六孔板中每孔转染pNL4-3Luc(R-E-)300ng和pHIT/G质粒210ng，转染试剂为Lipofectamine2000，按转染试剂说明进行转染。48小时后收取上清，过0.45μm的滤膜，收集病毒液即得到VSV-G包被的HIV-1假病毒。
(3)病毒感染性的测定：96孔板每孔接种5×105个/ml的SupT1细胞200μL。取10μl所得病毒液感染SupT1细胞。培养48h后，取出50μl细胞悬液，加入等体积2×LuciferaseCell Culture Lysis裂解细胞。使用试剂盒Luciferiase Assay System测定裂解液的荧光素酶(Luciferase)活性。根据报告基因Luciferase活性的大小得出感染性病毒的量。
(4)抗HIV-1活性测定：SupT1细胞浓度为5×105个/ml，直接铺96孔板，每孔200μL，同时加入上述制备的HIV-1假病毒(病毒与细胞的体积比为1:20)。加入样品(样品溶解在DMSO中)，每个样品设3次重复，同时设置空白对照和阴性对照(DMSO)，37℃孵育48h。取50μL细胞悬液，加入2×Luciferase Cell Culture Lysis裂解液50μL，37℃孵育半个小时后，取其中6μL细胞裂解液加入40μL荧光素酶底物，利用Centro XS3LB 960酶标仪测定荧光素酶值(RLUs)，计算样品对HIV的抑制率。
HIV抑制率计算公式如下：
其中，样品为步骤2制备的曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物和步骤3制备的式1至式5所示的化合物这6种HIV-1抑制剂中的任一种。通过样品对HIV-1的抑制率，计算得出式1至式5所示的化合物的IC50(指抑制HIV-1复制减少50％的药物浓度)。
(5)药物毒性检测利用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测药物毒性：SupT1细胞浓度为5×105个/ml，直接铺96孔板，每孔100μL。加入样品(样品溶解在DMSO中)，每个样品设3次重复，同时设置空白对照和阴性对照(DMSO)，37℃孵育48h。取出96孔板，每孔加入10μL CCK-8，37℃继续孵育1个小时后，使用Enspire 2300多功能酶标仪检测各孔在450nm波长处的光吸收值(OD)，计算出样品孔的细胞存活率。细胞存活率计算公式：
其中，样品为步骤3制备的式1至式4所示的化合物这4种HIV-1抑制剂中的任一种。通过样品孔的细胞存活率，计算得出式1至式4所示的化合物的CC50(指致使50％细胞死亡的药物浓度)。
结果表明步骤2制备的曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物在浓度为4mg/mL时对HIV-1的抑制率为99.9％。式1至式4所示的化合物在浓度为100μM时对HIV-1的抑制率分别为99.84％、99.99％、98.60％和96.82％，式1至式4所示的化合物的IC50分别为2.4μM、4.5μM、22.1μM和32.6μM，式1至式3所示的化合物的CC50均大于100μM，式4所示的化合物的CC50为78.6μM(表3)。说明步骤2制备的曲霉(Aspergillus sp.)CPCC400735发酵培养物的甲醇提取物和式1至式4所示的化合物对HIV-1具有较强的抑制活性，并且毒性较小。其中，式1所示的化合物对HIV-1的抑制活性最强，式2所示的化合物对HIV-1的抑制活性弱于式1所示的化合物但强于式3和式4所示的化合物，式3所示的化合物对HIV-1的抑制活性强于式4所示的化合物。
表3、式1至式4所示的化合物的抗HIV-1活性
化合物编号 平均抑制率％(100μM，n＝3) IC<sub>50</sub>(μM) CC<sub>50</sub>(μM)
式1 99.84±0.12 2.4 >100
式2 99.99±0.01 4.5 >100
式3 98.60±0.53 22.1 >100
式4 96.82±0.11 32.6 78.6
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> 一株曲霉菌的用途及由该曲霉菌制备的化合物及其用途
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 569
<212> DNA
<213> 曲霉菌（Aspergillus sp.）
<400> 1
aggctttcga gtgaggtcct cgtggcccac ctcccacccg tgactactgt accactgttg 60
cttcggcggg cccgccagcg tccgctggcc gccggggggc ttctgccccc gggcccgtgc 120
ccgccggaga ccccaacacg aacactgttt ctgaaagcct gtatgaatcc gattctttgt 180
aatcagttaa aactttcaac aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa gaacgcagcg 240
aaatgcgata actaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca 300
ttgcgccccc tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattactg ccctcaagcc 360
cggcttgtat tgggtcctcg tccccctccc cgggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc 420
accgcgtccg gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg ctctgtaggc ccggccggcg 480
ccagcccacg caacaccttt ttttttcagg ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct 540
gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 569

Claims (8)

1.U1)或U2)的应用：
U1)曲霉在制备HIV抑制剂中的应用，所述曲霉为曲霉(Aspergillus sp.)，其菌株号为CPCC400735，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.12376；
U2)曲霉在制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物中的应用，所述曲霉为曲霉(Aspergillus sp.)，其菌株号为CPCC400735，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.12376。
2.P1)或P2)的产品：
P1)由权利要求1中所述的曲霉制备得到的HIV抑制剂；
P2)由权利要求1中所述的曲霉制备得到的治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物。
3.P4)或P5)的产品：
P4)HIV抑制剂，其特征在于：所述HIV抑制剂的活性成分是用甲醇从培养物中提取得到的溶于甲醇的物质，所述培养物是将权利要求1中所述的曲霉在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质；
P5)治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物，其特征在于：所述治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的活性成分是用甲醇从培养物中提取得到的溶于甲醇的物质，所述培养物是将权利要求1中所述的曲霉在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述微生物培养基为曲霉培养基。
5.M1)或M2)的方法：
M1)制备HIV抑制剂的方法，包括用甲醇从权利要求3或4中所述的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，将所述物质作为HIV抑制剂的活性成分；
M2)制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的方法，包括用甲醇从权利要求3或4中所述的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，将所述物质作为治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的活性成分。
6.M4)或M5)的方法：
M4)制备HIV抑制剂的方法，包括用甲醇从权利要求3或4中所述的培养物中提取得到的溶于甲醇的物质，再从所述物质中提取得到式Ⅱ所示的化合物，将式Ⅱ所示的化合物作为HIV抑制剂的活性成分；
所述R为
M5)制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的方法，包括用甲醇从权利要求3或4中所述的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，再从所述物质中提取得到式Ⅱ所示的化合物，将式Ⅱ所示的化合物作为治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物的活性成分；
所述R为
7.下述任一种：
1)权利要求6所述方法中的式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐；
2)权利要求6所述方法中的式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备HIV抑制剂中的应用；
3)权利要求6所述方法中的式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物中的应用；
4)HIV抑制剂，其活性成分为权利要求6所述方法中的式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐；
5)治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物，其活性成分为权利要求6所述方法中的式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐；
7)治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征的方法，包括给受体动物施用用甲醇从权利要求3或4中所述的培养物中提取得到溶于甲醇的物质，进行治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征；
8)抑制HIV感染动物的方法，包括给受体动物施用用甲醇从权利要求3或4中所述的培养物中提取得到的溶于甲醇的物质以抑制HIV感染动物；
9)治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征的方法，包括给受体动物施用权利要求6所述方法中的式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐进行治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征；
10)抑制HIV感染动物的方法，包括给受体动物施用权利要求6所述方法中的式Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐以抑制HIV感染动物。
8.根据权利要求1所述的应用、权利要求2或3所述的产品、权利要求5或6所述的方法或权利要求7所述的1)至5)和7)-10)中的任一种，其特征在于：所述HIV为HIV-1型的HIV，所述获得性免疫缺陷综合征由HIV-1引起。
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