CN109055350A - 一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法 - Google Patents

一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法，首先把选取好的菌落用玻璃珠打碎，制成孢子悬液，从中吸取单孢子悬液1ml稀释作对照，另取滤液加入双碟中，其中双碟有事先配制好的含有硫酸二乙酯的培养基；用紫外线均匀照射30min，用黑布罩住，用无菌水稀释后，均匀涂布于平皿，形成单菌落，移入恒温箱中培养，8天后菌落长好，挑取分生孢子单菌落接入斜面培养8天；成熟后的菌落接入摇瓶进行初筛，选取效价单位高于出发菌种3％的10个斜面，转接斜面，培养成熟后，再进行摇瓶复筛；选取复筛后单位较高的5个斜面，将对应编号的斜面埋沙土，进行保藏。本发明能够进一步提高发酵单位，使菌种保持优良特性。

Description

一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法
技术领域
本发明属于灰黄霉素菌种的诱变方法技术领域，具体的说是涉及一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法。
背景技术
灰黄霉素为抗生素类原料药，中文别名灰霉素、微晶灰黄霉素，灰黄霉素成品为白色或类白色的微细粉末，其主要针对毛发癣菌、小孢子菌、表皮癣菌等浅表部真菌具有良好抗菌作用，灰黄霉素适用于各种癣病的治疗，包括头癣、须癣、体癣、股癣、足癣和甲癣。现有技术中大量制备灰黄霉素的方法中一般都是以灰黄霉素发酵液为原料，经过一系列的制备步骤，浓缩结晶得到灰黄霉素重结晶体，最后灰黄霉素重结晶体经过丁醇洗涤、乙醇洗涤、干燥、超微粉碎等步骤得到灰黄霉素原料药。现有技术中灰黄霉素发酵液中的灰黄霉素菌种不够优良，菌种问题会直接影响到灰黄霉素成品原料药的品质和产量，所以要想改进灰黄霉素的制备方法，提高产量，必须从源头入手，即需要采用高品质的灰黄霉素菌种来制备灰黄霉素发酵液。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种能够提高发酵单位、使菌种保持优良特性的通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法，该诱变灰黄霉素菌种的方法具体包括如下步骤：
a、首先把选取好的灰黄霉素菌落用玻璃珠打碎，制成孢子悬液，从孢子悬液中吸取单孢子悬液1ml，稀释作对照，另取孢子滤液加入双碟中，其中双碟中放置有事先配制好的含有硫酸二乙酯的培养基；
b、然后用紫外线对双碟中的孢子滤液均匀照射20～30min，照射完紫外线后用黑布罩住双碟；
c、紫外照射后细胞产生复活作用，以极快的速度将双碟中的孢子滤液用无菌水稀释，用无菌水稀释后的孢子滤液均匀涂布于平皿，耙匀，形成单菌落，移入温度设定为28℃±1℃的恒温箱中培养；
d、恒温箱中培养8天后菌落长好，菌落外观美观、大小均匀、孢子雪白、厚实丰满，形成单菌落；
e、再挑取分生孢子单菌落接入斜面培养8天，培养后的成熟菌落大小均匀、厚实、孢子丰满，进行编号；
f、将步骤e中的成熟菌落接入摇瓶进行初筛，选取效价单位高于出发菌种3％的10～15个斜面，转接斜面，并编号；
g、用已选取编号的斜面，通过挖块进行摇瓶复筛，选取复筛后效价高的5～6个对应斜面孢子，埋沙土保藏备用。
其中步骤b中紫外线照射的步骤为：先开动转盘，使紫外线照射均匀，再打开双碟，进行紫外线诱变照射，照射时间为25min，照射完毕后关掉紫外线及转盘，盖上双碟。
本发明的有益效果是：本发明为了克服现有技术中存在的不足，进一步提高发酵单位，使菌种保持优良特性，特采用硫酸二乙酯加紫外照射对灰黄霉素的菌种进行诱变。采用本发明诱变方法诱变出的灰黄霉素菌种在用于制备灰黄霉素时，能够大幅度降低生产成本，同时节约了能源，有效提高劳动生产率，很好的克服了现有技术中灰黄霉素发酵液中菌种不够优良的缺陷。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细描述。
实施例1：一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法，该诱变灰黄霉素菌种的方法具体包括如下步骤：a、首先把选取好的灰黄霉素菌落用玻璃珠打碎，制成孢子悬液，从孢子悬液中吸取单孢子悬液1ml，稀释作对照，另取孢子滤液加入双碟中，其中双碟中放置有事先配制好的含有硫酸二乙酯的培养基；b、然后用紫外线对双碟中的孢子滤液均匀照射20min，先开动转盘，使紫外线照射均匀，再打开双碟，进行紫外线诱变照射，照射完毕后关掉紫外线及转盘，照射完紫外线后用黑布罩住双碟；c、紫外照射后细胞产生复活作用，以极快的速度将双碟中的孢子滤液用无菌水稀释，用无菌水稀释后的孢子滤液均匀涂布于平皿，耙匀，形成单菌落，移入温度设定为28℃的恒温箱中培养；d、恒温箱中培养8天后菌落长好，菌落外观美观、大小均匀、孢子雪白、厚实丰满，形成单菌落；e、再挑取分生孢子单菌落接入斜面培养8天，培养后的成熟菌落大小均匀、厚实、孢子丰满，进行编号；f、将步骤e中的成熟菌落接入摇瓶进行初筛，选取效价单位高于出发菌种3％的10个斜面，转接斜面，并编号；g、用已选取编号的斜面，通过挖块进行摇瓶复筛，选取复筛后效价高的5个对应斜面孢子，埋沙土保藏备用。
实施例2：一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法，该诱变灰黄霉素菌种的方法具体包括如下步骤：a、首先把选取好的灰黄霉素菌落用玻璃珠打碎，制成孢子悬液，从孢子悬液中吸取单孢子悬液1ml，稀释作对照，另取孢子滤液加入双碟中，其中双碟中放置有事先配制好的含有硫酸二乙酯的培养基；b、然后用紫外线对双碟中的孢子滤液均匀照射30min，照射完紫外线后用黑布罩住双碟；c、紫外照射后细胞产生复活作用，以极快的速度将双碟中的孢子滤液用无菌水稀释，用无菌水稀释后的孢子滤液均匀涂布于平皿，耙匀，形成单菌落，移入温度设定为27℃的恒温箱中培养；d、恒温箱中培养8天后菌落长好，菌落外观美观、大小均匀、孢子雪白、厚实丰满，形成单菌落；e、再挑取分生孢子单菌落接入斜面培养8天，培养后的成熟菌落大小均匀、厚实、孢子丰满，进行编号；f、将步骤e中的成熟菌落接入摇瓶进行初筛，选取效价单位高于出发菌种3％的15个斜面，转接斜面，并编号；g、用已选取编号的斜面，通过挖块进行摇瓶复筛，选取复筛后效价高的6个对应斜面孢子，埋沙土保藏备用。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法，其特征在于：所述诱变灰黄霉素菌种的方法具体包括如下步骤：
a、首先把选取好的灰黄霉素菌落用玻璃珠打碎，制成孢子悬液，从孢子悬液中吸取单孢子悬液1ml，稀释作对照，另取孢子滤液加入双碟中，其中双碟中放置有事先配制好的含有硫酸二乙酯的培养基；
b、然后用紫外线对双碟中的孢子滤液均匀照射20～30min，照射完紫外线后用黑布罩住双碟；
c、紫外照射后细胞产生复活作用，以极快的速度将双碟中的孢子滤液用无菌水稀释，用无菌水稀释后的孢子滤液均匀涂布于平皿，耙匀，形成单菌落，移入温度设定为28℃±1℃的恒温箱中培养；
d、恒温箱中培养8天后菌落长好，菌落外观美观、大小均匀、孢子雪白、厚实丰满，形成单菌落；
e、再挑取分生孢子单菌落接入斜面培养8天，培养后的成熟菌落大小均匀、厚实、孢子丰满，进行编号；
f、将步骤e中的成熟菌落接入摇瓶进行初筛，选取效价单位高于出发菌种3％的10～15个斜面，转接斜面，并编号；
g、用已选取编号的斜面，通过挖块进行摇瓶复筛，选取复筛后效价高的5～6个对应斜面孢子，埋沙土保藏备用。
2.根据权利要求1所述的一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法，其特征在于：步骤b中紫外线照射的步骤为：先开动转盘，使紫外线照射均匀，再打开双碟，进行紫外线诱变照射，照射时间为25min，照射完毕后关掉紫外线及转盘，盖上双碟。
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