JP2019525756A - Cpf1に基づくゲノム編集の治療適用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2016年7月19日に出願された米国仮特許出願第62/363,888号明細書からの優先権を主張する。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。上述のASCIIコピーは、2017年7月19日に作成され、028193−9250−WO00配列表.txtと称し、サイズは46,056バイトである。
本発明は、NIHおよびArmy/MRMCによりそれぞれ授与された連邦政府補助金(Federal Grant)番号:AR069085およびMD140071の下で政府の支援を受けて行なわれた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に説明されているが、本明細書で説明されたものと類似のまたは等価の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で開示された材料、方法および例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。
本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)は、ジストロフィン遺伝子(例えば、ヒトジストロフィン遺伝子)に特異的であるCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムをコードする。「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」および「CRISPR」は、本明細書で互換的に使用される場合、配列決定された細菌の約40%および配列決定された古細菌の90%のゲノムに見出される複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。CRISPR系は、ある形態の獲得免疫を提供する、侵入ファージおよびプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるCRISPR遺伝子座は、CRISPR介在性の核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な、CRISPR関連(Cas)遺伝子と、ノンコーディングRNAエレメントとの組み合わせを含有する。スペーサーと呼ばれる、外来DNAの短いセグメントは、ゲノムのCRISPRリピート間に組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。
CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムは、Cpf1エンドヌクレアーゼを含むことができる。Cpf1エンドヌクレアーゼは、核酸を開裂するエンドヌクレアーゼである。Cas9が、PAM部位の上流で平滑末端3ヌクレオチドを生成するのに対し、Cpf1エンドヌクレアーゼは、スタッガード式に切断し、PAMから18〜23塩基離れた5ヌクレオチドの5’オーバーハングを生成する。Cpf1エンドヌクレアーゼは、以下のものが挙げられるが、これらに限定されないあらゆる細菌または古細菌の種に由来し得る:野兎病菌(Francisella tularensis)1、野兎病菌亜種ノビシダ(Francisella tularensis subsp.novicida)、プレボテーラ・アルベンシス(Prevotella albensis)、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MC2017 1、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス(Butyrivibrio proteoclasticus)、ペレグリニバクテリア・バクテリウム(Peregrinibacteria bacterium)GW2011_GWA2_33_10、パルクバクテリア・バクテリウム(Parcubacteria bacterium)GW2011_GWC2_44_17、スミセラ属(Smithella sp.)SCADC、アシダミノコッカス属(Acidaminococcus sp.)BV3L6、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MA2020、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム(Candidatus Methanoplasma termitum)、ユウバクテリウム・エリゲンス(Eubacterium eligens)、モラクセラ・ボボクリ(Moraxella bovoculi)237、レプトスピラ・イナダイ(Leptospira inadai)、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006、ポルフィロモナス・クレビオリカニス(Porphyromonas crevioricanis)3、プレボテラ・ディシエンス(Prevotella disiens)またはポルフィロモナス・マカカエ(Porphyromonas macacae)。特定の実施形態では、Cpf1エンドヌクレアーゼは、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006(「LbCpf1」)またはアシダミノコッカス属(Acidaminococcus)(「AsCpf1」)に由来するCpf1エンドヌクレアーゼである。
CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムは、少なくとも1種のCpf1 gRNA、例えば、1種のCpf1 gRNA、2種のCpf1 gRNA、3種のgRNA、などを含む。このgRNAにより、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムのターゲティングが達成される。このCpf1 gRNAは、所望のDNA標的に対するターゲティング特異性を付与するプロトスペーサーをコードする配列を交換することにより、あらゆる所望のDNA配列を標的とすることができる。「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、本明細書で互換的に使用される場合、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムが標的とする標的遺伝子(例えば、ジストロフィン遺伝子)の領域を指す。この標的配列またはプロトスペーサーに先行して、このプロトスペーサーの5’末端にPAM配列が存在する。いくつかの実施形態では、PAM配列は、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)であってもよい。
本発明は、ジストロフィン遺伝子(例えば、ヒトジストロフィン遺伝子)のゲノム編集、ゲノム改変または遺伝子発現の改変のための遺伝子コンストラクトを対象とする。遺伝子コンストラクトは、Cpf1エンドヌクレアーゼ適合性標的などのヒトジストロフィン遺伝子配列を標的とする少なくとも1つのCpf1 gRNAを含む。開示されるgRNAは、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムに含有させることができ、そうしたものとして、Cpf1エンドヌクレアーゼを用いて、ジストロフィン遺伝子内の領域、例えば、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソン51などのエクソン周囲のイントロン領域、スプライス受容部位、および/またはエクソン領域を標的にして、この領域のゲノム欠失を引き起こし、DMD患者由来の細胞において機能性のジストロフィンの発現を回復させるシステムがある。
鎌状細胞貧血(SCA)は、β−グロビン遺伝子の点突然変異に起因し、βサラセミアは、β−グロビン発現の喪失を招く他の突然変異に起因する。BCL11aは、胚および胎児グロビン遺伝子を抑制する転写抑制因子である。BCL11aの完全な喪失は、胚性致死であるが;BCL11aの赤血球特異的エンハンサー領域を破壊することにより、転写抑制因子の存在量を低減し、胎児グロビンレベルを増加して、疾患の表現型を改善することができる。同様に、γ−グロビン(HBG1/2)プロモーターに対する特定の突然変異は、転写抑制および遺伝性高胎児ヘモグロビン(HPFH)の消失をもたらす。Cpf1により産生されるインデルフットプリントが大きいほど、BCL11aのエンハンサー領域またはHBG1/2の抑制領域を効率的に破壊することができる。いくつかの実施形態では、BCL11aのエンハンサー領域を破壊し、胎児グロビンレベルを増加すると共に、SCAの表現型を改善するように、Cpf1 gRNAを設計する。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域は、配列番号29〜35の少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Cpf1 gRNAは、配列番号65〜70のいずれか1つのポリヌクレオチド配列、配列番号65〜70のいずれか1つの断片、またはその相補体を含む。
本発明はまた、そのような遺伝子コンストラクトを含むDNAターゲティング組成物も対象とする。このDNAターゲティング組成物は、上記で説明したようにジストロフィン遺伝子(例えばヒトジストロフィン遺伝子)を標的とする少なくとも1種のCpf1 gRNA(例えば、1種のCpf1 gRNA、2種のCpf1 gRNA、3種のgRNA、など)を含む。この少なくとも1種のCpf1 gRNAは、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除によりスプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。
本発明は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での標的遺伝子のゲノム編集用の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはその組成物を対象とする。この組成物は、改変AAVベクターと、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システム(例えばCpf1 gRNAおよびCpf1エンドヌクレアーゼ)をコードするポリヌクレオチド配列とを含む。この組成物は、活性型のCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達する。本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)を、遺伝性疾患および/または他の骨格筋もしくは心筋の状態(例えばDMD)に関与するジストロフィン遺伝子中での変異の影響の修正または低減で使用することができる。この組成物は、ドナーDNAまたは導入遺伝子をさらに含むことができる。この組成物を、ゲノム編集、ゲノム操作、ならびに遺伝性疾患および/または他の骨格筋もしくは心筋の状態に関与する遺伝子中での変異の影響の修正また低減で使用することができる。
本明細書では、ジストロフィン遺伝子に特異的なCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムが開示されている。このCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムは、Cpf1エンドヌクレアーゼと、ジストロフィン遺伝子を標的とするための少なくとも1種のCpf1 gRNAとを含むことができる。このCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムは、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域または、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除により、スプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。
この組成物はウイルス送達システムも含むことができる。特定の実施形態では、このベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。このAAVベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス(Parvoviridae)科のディペンドウイルス(Dependovirus)属に属する小型ウイルスである。AAVベクターを使用して、様々なコンストラクト構造を使用するCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムを送達することができる。例えば、AAVベクターは、別々ベクター上のまたは同一のベクター上のCpf1エンドヌクレアーゼおよびCpf1 gRNA発現カセットを送達することができる。あるいは、Cpf1エンドヌクレアーゼと最大2つのgRNA発現カセットとの両方を、4.7kbのパッケージング限度内で単一のAAVベクター中で組み合わせることができる。
本開示は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集の方法を対象とする。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。このゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは導入遺伝子を挿入することを含むことができる。変異遺伝子を修正することは、この変異遺伝子を欠失させること、再編集することまたは置き換えることを含むことができる。変異異遺伝子を修正することは、ヌクレアーゼ介在性のNHEJまたはHDRを含むことができる。
本開示の主題は、細胞中で変異遺伝子(例えば変異ジストロフィン遺伝子、例えば変異ヒトジストロフィン遺伝子)を修正し、遺伝性疾患(例えばDMD)に罹患している対象を処置する方法を提供する。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を細胞または対象に投与すること含むことができる。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用の本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達するための本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物の使用により、修復鋳型またはドナーDNA(これらは、遺伝子全体またはこの変異を含む領域を置き換えることができる)と共に、完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質の発現を回復させることができる。CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムを使用して、標的とされるゲノム遺伝子座で部位特異的な二本鎖切断を導入することができる。部位特異的二本鎖切断は、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムが標的DNA配列に結合し、それにより標的DNAの開裂が可能になる場合に生じる。このDNA開裂は天然のDNA修復機構を刺激し得、以下の2つの可能な修復経路のうちの1つをもたらす:相同組換え修復(HDR)経路または非相同末端結合(NHEJ)経路。
内因性の変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、鋳型なしのNHEJ介在性のDNA修復によるものであることができる。標的遺伝子RNAを標的とする一過性の方法とは対照的に、過渡的に発現されたCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムによるゲノム中の標的遺伝子読み枠の修正により、それぞれ改変された細胞およびその後代の全てによって、永久に回復された標的遺伝子発現をもたらすことができる。特定の実施形態では、NHEJはヌクレアーゼ介在性のNHEJであり、このヌクレアーゼ介在性のNHEJは、特定の実施形態では、Cpf1エンドヌクレアーゼにより開始されて二本鎖DNAを切断するNHEJを指す。この方法は、骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集のために、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組換え修復を含むことができる。上に記載した通りの方法は、細胞にドナー鋳型を投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ドナー鋳型は、小型化されたジストロフィンコンストラクト(ミニジストロフィン(「minidys」)と呼ばれる)、変異ジストロフィン遺伝子を修復するための完全に機能性のジストロフィンコンストラクト、または相同組換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の修復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を含むことができる。
本開示はまた、修復鋳型またはドナーDNA(これらは、遺伝子全体、または変異を含有する領域を置き換えることができる)を用いる、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質の発現を修復するための、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムを用いるゲノム編集を対象とする。CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムは、標的とされるゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断を導入するために使用することができる。部位特異的二本鎖切断は、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムが、gRNAを使用して標的DNA配列に結合し、それによって標的DNAの切断が可能になる場合にもたらされる。CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムは、その高速の成功裡かつ効率的な遺伝子改変のおかげで、ゲノム編集の進歩という利点を有する。このDNA切断は、天然のDNA修復機構を刺激し、可能性のある2つの修復経路:相同組換え修復(HDR)または非相同末端結合(NHEJ)経路のうちの1つをもたらすことができる。例えば、ジストロフィン遺伝子に誘導されるCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムは、配列番号36〜64、71〜119のいずれか1つの核酸配列、またはその相補体を有するCpf1 gRNAを含むことができる。
本開示は、必要とする対象を処置する方法を対象とする。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の組織に投与することを含む。特定の実施形態では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。特定の実施形態では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の静脈に投与することを含むことができる。特定の実施形態では、この対象は、変性または衰弱または遺伝性疾患を引き起こす骨格筋または心筋の状態に罹患している。例えば、この対象は、上記で説明したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している。
上記で説明した方法を使用して、ジストロフィン遺伝子を修正して前記変異ジストロフィン遺伝子の完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質発現を回復させることができる。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者におけるDMDの影響(例えば臨床症状/適応症)を低減する方法を提供する。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者においてDMDを処置する方法を提供する。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者においてDMDを予防する方法を提供する。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者においてDMDのさらなる悪化を予防する方法を提供する。
上記で説明した組成物は、本明細書で開示したCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。この遺伝子コンストラクト(例えばプラスミド)は、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システム(例えばCpf1エンドヌクレアーゼおよび/またはCpf1 gRNAのうちの少なくとも1つ)をコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、改変AAVベクターをコードする遺伝子コンストラクトと、本明細書で開示したCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸配列とを含むことができる。この遺伝子コンストラクト(例えばプラスミド)は、このCRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、本明細書で開示した改変レンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。
本開示の主題は、上記で説明した遺伝子コンストラクトを含む組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、使用される投与様式に従って製剤化され得る。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、この医薬組成物は無菌であり、パイロジェンフリーであり且つ粒子状物質フリーである。等張性製剤が好ましくは使用される。一般に、等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。場合によって、等張性溶液(例えばリン酸緩衝生理食塩水)が好ましい。安定剤としてゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、この製剤に血管収縮剤が添加される。
本明細書で提供されるのは、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはその組成物を細胞に送達する方法である。この組成物の送達は、この細胞中で発現され且つこの細胞の表面に送達される核酸分子としてのこの組成物の遺伝子導入または電気穿孔であることができる。この核酸分子を、BioRad Gene Pulser XcellデバイスまたはAmaxa Nucleofector IIbデバイスを使用して電気穿孔することができる。BioRad電気穿孔溶液、Sigmaリン酸緩衝生理食塩水 製品番号D8537(PBS)、Invitrogen OptiMEM I(OM)またはAmaxa Nucleofector溶液V(N.V.)等のいくつかの異なる緩衝液を使用することができる。遺伝子導入は、Lipofectamine 2000等の遺伝子導入試薬を含むことができる。
本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、様々な経路(例えば、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせ)により対象に投与することができる。特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)または組成物を、対象(例えばDMDを罹患している対象)に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する。獣医学的使用の場合、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)または組成物を、通常の獣医学診療に従って、適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、ある特定の動物にとって最も適している投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。この組成物を、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃(microprojectile bombardment gone gun)」、または他の物理的方法(例えば電気穿孔(「EP」)、「水力学的方法」または超音波)により投与することができる。
これらの送達方法および/または送達の経路のいずれかを無数の細胞型(例えば、DMDの細胞に基づく治療用に現在研究中の細胞型)と共に利用することができ、この細胞型として以下が挙げられるがこれらに限定されない:不死化筋芽細胞、例えば野生型およびDMD患者由来の株、例えばΔ48−50 DMD、DMD6594(del48−50)、DMD8036(del48−50)、C25C14およびDMD−7796細胞株、原発性DMD皮膚線維芽細胞、誘導された多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、DMD患者由来のヒト骨格筋芽細胞、CD133+細胞、中胚葉性血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血性幹細胞、平滑筋細胞、およびMyoD形質導入細胞もしくはPax7形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞。ヒト筋原性細胞の不死化を使用して、遺伝的に修正された筋原性細胞のクローンを誘導することができる。細胞をエクスビボで改変して、遺伝的に修正されたジストロフィン遺伝子を含み且つゲノムのタンパク質コード領域中に他のヌクレアーゼ導入変異がない不死化DMD筋芽細胞のクローン集団を単離して増殖させることができる。あるいは、非ウイルスまたは非組込みウイルスの遺伝子導入によるまたは精製タンパク質および細胞浸透モチーフを含むgRNAの直接送達によるCRISPR/Cpf1に基づくシステムのインビボでの一時的な送達により、外因性DNA組込みのリスクが最低限なまたはないインサイチュでの高度に特異的な修正が可能になり得る。
本明細書で提供されるのは、変異ジストロフィン遺伝子を修正するのに使用され得るキットである。このキットは、変異ジストロフィン遺伝子の修正用のCpf1 gRNAと、CRISPR/Cpf1に基づく遺伝子編集システムを使用するための説明書とを少なくとも含む。また、本明細書で提供されるのは、骨格筋中でのまたは心筋中でのジストロフィン遺伝子のゲノム編集に使用され得るキットでもある。このキットは、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中でのゲノム編集用の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物と、前記組成物を使用するための説明書とを含む。
本明細書で説明された本開示の方法の他の適切な改変および適応が容易に適用可能であり且つ認識可能であり、ならびに本開示または本明細書で開示された態様および実施形態の範囲から逸脱することなく適切な等価物を使用して行なわれ得ることが当業者に容易に明らかであるだろう。これまで本開示を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することにより本開示がより明確に理解されるだろう。この実施例は、本開示のいくつかの態様および実施形態を説明することのみを単に意図しており、本開示の範囲を限定するとみなすべきではない。本明細書で言及される全ての学術誌参考文献、米国特許および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ガイドRNA設計および材料調製
アシダミノコッカス属(Acidaminococcus)由来のCpf1は、Addgene非営利プラスミド保管センターから取得した(Feng ZhangからのpY010(pcDNA3.1−hAsCpf1;「AsCPF1プラスミド」)(Addgeneプラスミド♯69982))。AsCPF1プラスミドをケミカルコンピテント大腸菌(E.coli)中に形質転換し、増幅した後、配列を確認した。Cpf1ガイドRNA(Cpf1 crRNAとしても知られる)は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校ゲノムブラウザ(University of California Santa Cruz Genome Browser)プログラムを用いて、ジストロフィンにおいて優勢なエクソン変異上のスプライス部位およびBCL11aのエンハンサーを標的とするように設計し、Integrated DNA Technologies(IDT)からオリゴマーとして注文し、PCRで調製した後、以前記載されているように(Zetsche et al.,Cell 163(3):759−71(2015))カラム精製した。
ジストロフィンスプライス受容体ガイドRNA
スプライス受容体に可能な限り近接した切断領域を標的とすることにより、最上位の高度変異ジストロフィンエクソンを標的とする15のガイドRNAを設計したが、これは、利用可能なPAMの存在によって達成された(表1)。可能であれば、複数のガイドRNAが同じスプライス受容体を標的にするようにした。候補ガイドRNAをインビトロでスクリーニングした。直ちに陽性結果を示したガイドRNAには、エクソン44、エクソン46、エクソン51を標的とするものが含まれる(図2A〜2C)。サーベイヤーヌクレアーゼ消化が、エクソン44スプライス受容体(図2A)、エクソン46スプライス受容体(図2B)、およびエクソン51の3’末端(図2C)を標的とするガイドRNAにおいて検出された。図2Dは、エクソン51のスプライス受容体およびエクソン51の3’末端を標的とするガイドRNAを用いて、遺伝子欠失を引き起こし得ることを明らかにし、これは、エクソン51を標的とするガイドRNAの活性を示している。
エクソン51の適合オーバーハング欠失
適合オーバーハング配列を有するガイドRNAが、シームレス欠失を促進するか否かを決定するために、6つのガイドRNAをイントロン50内で設計し、7つのガイドRNAをイントロン51内で設計する(表2)ことにより、適合オーバーハング欠失を生じさせた。42のユニークなgRNA対(6×7)を、欠失活性、即ち、エクソン51欠失のターゲティングについて試験およびスクリーニングした。このセットには、3つのオーバーハング適合対が含まれた(表2を参照)。7つの対が活性について確認された。図3は、エクソン51の欠失を示す、より小さなバンドを示す代表的な画像である。これらの結果は、ジストロフィン遺伝子の最初のCpf1標的スプライス受容体破壊およびエクソン51の欠失を証明するものである。
患者由来の筋芽細胞におけるエクソン51の標的欠失
エクソン48〜50が欠失した(Δ48〜50)患者由来の筋芽細胞を骨格筋増幅培地中に培養した。標準的実験室手順に従って電気穿孔を実施した。細胞を3日間培養し、患者由来筋芽細胞におけるタンパク質発現(図4)およびSaCas9(黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来のCas9)またはLbCpf1(ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006由来のCPF1)により引き起こされたゲノム欠失(図5)について評価した。図4は、HA標識SaCas9およびLbCpf1のウエスタンブロットが、プラスミドトランスフェクションから72時間後に、抽出タンパク質に発現を示すことを証明する。図5は、標的ゲノム領域にわたるPCRが、SaCas9 gRNAまたはCpf1 crRNAによるバルク処理筋芽細胞において、より小さいバンドを示すことを証明し、これは、エクソン51および周辺イントロン部分の除去と一致する。
BCL11aエンハンサー標的化
鎌状細胞貧血(SCA)における胎児グロビンレベルを増加する有力な候補を設計した。鎌状細胞貧血(SCA)における胎児グロビンレベルを増加する有力な候補を生成する目的で、BCL11aエンハンサー領域(表3)を標的とするように、Cpf1のガイドRNAを設計した。これらの試薬は、BCL11aエンハンサーを破壊するように設計した。これらの試薬はSCA細胞モデルで試験する。
Claims (58)
- ジストロフィン遺伝子を標的とし、配列番号36〜64、71〜119の少なくとも1つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むCpf1ガイドRNA(gRNA)。
- Cpf1エンドヌクレアーゼと、請求項1に記載の少なくとも1種のCpf1 gRNAとを含むDNAターゲティング組成物。
- 第1のCpf1 gRNAと第2のCpf1 gRNAとを含むDNAターゲティング組成物であって、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAは各々が、配列番号36〜64、71〜119の少なくとも1つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、ここで、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAは、異なるポリヌクレオチド配列を含み、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、ジストロフィン遺伝子を標的とする、DNAターゲティング組成物。
- 前記第1のCpf1 gRNAが、配列番号54、配列番号55、または配列番号56に対応するポリヌクレオチド配列を含み、且つ前記第2のCpf1 gRNAが、配列番号62、配列番号63、または配列番号61に対応するポリヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、以下:
(i)配列番号54に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号62に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;
(ii)配列番号55に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号63に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;ならびに
(iii)配列番号56に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号61に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA
からなる群から選択される、請求項3または4に記載のDNAターゲティング組成物。 - Cpf1エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記Cpf1エンドヌクレアーゼが、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する、請求項2または6に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記Cpf1エンドヌクレアーゼが、野兎病菌(Francisella tularensis)1、野兎病菌亜種ノビシダ(Francisella tularensis subsp.novicida)、プレボテーラ・アルベンシス(Prevotella albensis)、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MC2017 1、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス(Butyrivibrio proteoclasticus)、ペレグリニバクテリア・バクテリウム(Peregrinibacteria bacterium)GW2011_GWA2_33_10、パルクバクテリア・バクテリウム(Parcubacteria bacterium)GW2011_GWC2_44_17、スミセラ属(Smithella sp.)SCADC、アシダミノコッカス属(Acidaminococcus sp.)BV3L6、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)MA2020、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム(Candidatus Methanoplasma termitum)、ユウバクテリウム・エリゲンス(Eubacterium eligens)、モラクセラ・ボボクリ(Moraxella bovoculi)237、レプトスピラ・イナダイ(Leptospira inadai)、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006、ポルフィロモナス・クレビオリカニス(Porphyromonas crevioricanis)3、プレボテラ・ディシエンス(Prevotella disiens)およびポルフィロモナス・マカカエ(Porphyromonas macacae)からなる群から選択される細菌種に由来する、請求項7に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記Cpf1エンドヌクレアーゼが、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006(LbCpf1)またはアシダミノコッカス属(Acidaminococcus)(AsCpf1)に由来する、請求項6〜8のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記Cpf1エンドヌクレアーゼが、配列番号124または配列番号125を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項6〜9のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物。
- 請求項1に記載のCpf1 gRNAまたは請求項2〜10のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のCpf1 gRNA、請求項2〜10のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、または請求項10に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
- Cpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項12に記載のベクター。
- 以下:
(a)第1のCpf1ガイドRNA(gRNA)、
(b)第2のCpf1 gRNA、および
(c)TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する少なくとも1種のCpf1エンドヌクレアーゼ
をコードするベクターであって、
前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、配列番号36〜64、71〜119の少なくとも1つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、異なるポリヌクレオチド配列を含むベクター。 - 前記ベクターが、前記ヒトDMD遺伝子のエクソン51に隣接する第1および第2イントロンに第1および第2二本鎖を形成するように構成される、請求項14に記載のベクター。
- 前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、以下:
(i)配列番号54に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号62に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;
(ii)配列番号55に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号63に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;ならびに
(iii)配列番号56に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号61に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA
からなる群から選択される、請求項14または15に記載のベクター。 - 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項12〜16のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項17に記載のベクター。
- 前記ベクターが、前記第1のCpf1 gRNA、前記第2のCpf1 gRNA、および/または前記Cpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む、請求項12〜18のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記組織特異的プロモーターが、筋肉特異的プロモーターである、請求項19に記載のベクター。
- 請求項1に記載のCpf1 gRNA、請求項2〜10のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド、または請求項12〜20のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項1に記載のCpf1 gRNA、請求項2〜10のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項12〜20のいずれか一項に記載のベクター、または請求項21に記載の細胞を含むキット。
- ジストロフィン遺伝子においてエクソン51を含むセグメントを欠失させるための組成物であって、前記組成物が、以下:
(a)第1のCpf1ガイドRNA(gRNA)をコードするポリヌクレオチド配列と、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第1のCpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第1のベクター、および
(b)第2のCpf1 gRNAをコードするポリヌクレオチド配列と、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第2のCpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第2のベクター
を含み、
ここで、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAは、配列番号36〜64、71〜119の少なくとも1つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、異なるポリヌクレオチド配列を含み、前記第1のベクターおよび前記第2のベクターは、それぞれが前記ヒトDMD遺伝子のエクソン51に隣接する第1のイントロンおよび第2のイントロン中で第1および第2の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン51を含むセグメントが欠失される組成物。 - 前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、以下:
(i)配列番号54に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号62に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;
(ii)配列番号55に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号63に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;ならびに
(iii)配列番号56に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号61に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA
からなる群から選択される、請求項23に記載の組成物。 - 前記第1のCpf1エンドヌクレアーゼおよび前記第2のCpf1エンドヌクレアーゼが、同じである、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記第1のCpf1エンドヌクレアーゼおよび前記第2のCpf1エンドヌクレアーゼが、異なる、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記第1のCpf1エンドヌクレアーゼおよび/または前記第2のCpf1エンドヌクレアーゼが、ラクノスピラセ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacterium)ND2006(LbCpf1)および/またはアシダミノコッカス属(Acidaminococcus)(AsCpf1)由来のCPF1エンドヌクレアーゼである、請求項25または26に記載の組成物。
- 前記第1のCpf1エンドヌクレアーゼおよび/または前記第2のCpf1エンドヌクレアーゼが、配列番号124または配列番号125を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項25〜27のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1のベクターおよび/または前記第2のベクターが、ウイルスベクターである、請求項23〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1のベクターおよび/または前記第2のベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項29に記載の組成物。
- 前記AAVベクターが、AAV8ベクターまたはAAV9ベクターである、請求項30に記載の組成物。
- 前記ジストロフィン遺伝子が、ヒトジストロフィン遺伝子である、請求項23〜31のいずれか一項に記載の組成物。
- 薬剤に使用するための請求項23〜32のいずれか一項に記載の組成物。
- デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するための請求項23〜32のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項23〜34のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。
- 対象中で変異ジストロフィン遺伝子を編集するゲノム用の修飾アデノ随伴ウイルスベクターであって、請求項1に記載のCpf1 gRNAをコードする第1のポリヌクレオチド配列と、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識するCpf1エンドヌクレアーゼをコードする第2のポリヌクレオチド配列とを含む修飾アデノ随伴ウイルスベクター。
- 細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、前記方法は、細胞に、請求項1に記載のCpf1 gRNA、請求項2〜10のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項12〜20のいずれか一項に記載のベクター、請求項23〜34のいずれか一項に記載の組成物、または請求項36に記載の修飾アデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子の修正が、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合または相同組換え修復を含む、請求項37に記載の方法。
- 対象中で変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、前記方法は、前記対象に、請求項1に記載のCpf1 gRNA、請求項2〜10のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項12〜20のいずれか一項に記載のベクター、請求項23〜34のいずれか一項に記載の組成物、または請求項36に記載の修飾アデノ随伴ウイルスベクターを含むゲノム編集組成物を投与することを含む方法。
- 前記ゲノム編集組成物が、前記対象に、筋肉内、静脈内、またはそれらの組み合わせで投与される、請求項39に記載の方法。
- 前記ゲノム編集が、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合または相同組換え修復を含む、請求項39または40に記載の方法。
- 変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、前記方法は、前記対象に、請求項1に記載のCpf1 gRNA、請求項2〜10のいずれか一項に記載のDNAターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項12〜20のいずれか一項に記載のベクター、請求項23〜34のいずれか一項に記載の組成物、または請求項36に記載の修飾アデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む方法。
- 細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、前記細胞に、以下:
(a)第1のCpf1ガイドRNA(gRNA)をコードするポリヌクレオチド配列と、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第1のCpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第1のベクター、および
(b)第2のCpf1 gRNAをコードするポリヌクレオチド配列と、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第2のCpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第2のベクター
を投与することを含み、
ここで、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、配列番号36〜64、71〜119の少なくとも1つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記ベクターは、それぞれが前記ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51に隣接する第1および第2のイントロン中で第1および第2の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン51を含むセグメントが欠失されて、細胞中で前記変異ジストロフィンを修正する方法。 - 前記第1のCpf1 gRNAおよび第2のCpf1 gRNAが、以下:
(i)配列番号54に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号62に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;
(ii)配列番号55に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号63に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;ならびに
(iii)配列番号56に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号61に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA
からなる群から選択される、請求項43に記載の方法。 - 前記変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドン、破壊された読み枠、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位を含む、請求項43または44に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドンおよび切断型遺伝子産物をもたらすフレームシフト変異を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子が、前記読み枠を破壊する1つまたは複数のエクソンの欠失を含む、請求項43または44に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子の修正が、未成熟終止コドンの欠失、破壊された読み枠の修正、またはスプライス受容部位の破壊もしくはスプライス供与体配列の破壊によるスプライシングの調節を含む、請求項43〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子が、エクソン51の欠失を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子の修正が、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合または相同組換え修復を含む、請求項43〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、筋芽細胞である、請求項43〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象に由来する、請求項43〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、前記方法は、前記対象に、
(a)第1のCpf1ガイドRNA(gRNA)をコードするポリヌクレオチド配列と、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第1のCpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第1のベクター、および
(b)第2のCpf1 gRNAをコードするポリヌクレオチド配列と、TTTA(配列番号120)、TTTG(配列番号121)、TTTC(配列番号122)、またはTTTT(配列番号123)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第2のCpf1エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第2のベクター
を投与することを含み、
ここで、前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAは、配列番号36〜64、71〜119の少なくとも1つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記第1ベクターおよび前記第2のベクターは、それぞれが前記ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51に隣接する第1および第2のイントロン中で第1および第2の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン51を含むセグメントが欠失されて、前記対象を処置する方法。 - 前記第1のCpf1 gRNAおよび前記第2のCpf1 gRNAが、以下:
(i)配列番号54に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号62に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;
(ii)配列番号55に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号63に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA;ならびに
(iii)配列番号56に記載のポリヌクレオチド配列を含む第1のCpf1 gRNA、および配列番号61に記載のポリヌクレオチド配列を含む第2のCpf1 gRNA
からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。 - 前記対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している、請求項53または54に記載の方法。
- 前記第1のベクターおよび第2のベクターが、前記対象に、筋肉内、静脈内、またはそれらの組み合わせで投与される、請求項53〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ腫/白血病11A(BCL11a)遺伝子のエンハンサーを標的とし、配列番号65〜70の少なくとも1つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むCpf1ガイドRNA(gRNA)。
- 細胞中でB細胞リンパ腫/白血病11A遺伝子のエンハンサーを破壊する方法であって、前記方法が、前記細胞に、請求項57に記載の少なくとも1種のCpf1 gRNAおよびCpf1エンドヌクレアーゼを投与することを含む方法。
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