JP2022520783A - Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ分子およびその使用 - Google Patents

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Abstract

例えば、ゲノムＤＮＡ配列における変異に起因する異常なＲＮＡスプライシングを修正するのに有用な、および成熟ｍＲＮＡにおけるエクソン包含を防止するのに有用な操作型Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。【選択図】なし

Description

１． 関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８０４，５９１号の優先権の利益を主張し、米国仮特許出願の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられている。
２． 配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子出願されており、かつ全体が参照により本明細書に組み入れられている配列表を含有する。２０２０年２月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＡＬＡ－００２ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名づけられ、サイズが１３５，２４５バイトである。
３． 背景
遺伝子変異は、多数の欠損症、障害、および疾患状態の原因である。一塩基対変化から大規模な染色体欠陥に及ぶ１６，０００個を超える変異が、少なくとも６，０００個の異なる状態に寄与することが知られている。デュシェンヌ型筋ジストロフィー、βサラセミア、血友病、鎌状赤血球症、筋萎縮性側索硬化症、家族性高コレステロール血症、嚢胞性線維症、アッシャー症候群ＩＩ型は、遺伝子変異により引き起こされるよりよく知られた疾患状態のうちの一部である。
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、およそ２，５００件の出生に１件の割合で遺伝する致死性常染色体劣性遺伝疾患である。ＣＦは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子における変異の結果であり、ＣＦＴＲ遺伝子は全ての上皮細胞の頂端膜に発現し、それゆえに、多数の器官に影響を及ぼす遺伝子である。ＣＦ患者における死亡の主な原因は気道の細菌感染であり、それは慢性肺疾患、最終的には呼吸不全を誘発する。
現在のＣＦ処置は治癒させるものではなく、慢性細菌感染を攻撃し、または気道閉塞を軽減することなどの臨床症状の低減のみに限られている。限られた数のＣＦＴＲ遺伝子変異の有害効果は、ＣＦＴＲ修正物質および増強物質などの最近開発された小分子の使用により減らすことができる。しかしながら、増強物質処置の成功は、残留ＣＦＴＲタンパク質に強く依存し、その残留ＣＦＴＲタンパク質はしばしば非常に少量で、かつ患者間で変動しやすい。さらに、現在の処置の使用による症状の緩和は、ＣＦを患っている人に一時的な軽減をもたらすだけである；患者は、不快な処置、その後つかの間の解放という繰り返されるサイクルを経験しなければならない。加えて、現在の処置は、繰り返し投与により憎悪し得る副作用を伴う。
遺伝子治療の最近の進歩にも関わらず、ＣＦおよび他の遺伝子に基づいた疾患状態についての治癒的解決へはほとんど前進していない。ＣＦの場合、現在の遺伝子治療は、ＣＦＴＲ遺伝子の欠陥を補償しようとする試みにおいて、ＣＦＴＲ遺伝子の機能性コピーの患者への、典型的には肺を介しての、送達に基づいている。そのような治療は、よくても非効率的であり、弱い肺伝達、一過性かつ低レベルの遺伝子発現、肺上皮細胞の迅速な代謝回転、および投与されたＣＦＴＲ遺伝子発現が治療有効レベルより下に降下する時に依然として残る疾患症状により妨害される。
ＵＳＨ２Ａ遺伝子における変異は、アッシャー症候群ＩＩ型を引き起こし得る。アッシャー症候群ＩＩ型は、聴力および視力の喪失により特徴づけられる。アッシャー症候群ＩＩ型についての処置選択肢。アッシャー症候群ＩＩ型についての現在の処置は治癒させるものではない。その代わりに、現在の処置は聴力および視力の喪失を管理することを含む。したがって、嚢胞性線維症、アッシャー症候群ＩＩ型、ならびにデュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、および筋萎縮性側索硬化症などの他の遺伝子疾患についての新しい処置および療法のかなりの必要性が依然としてある。
４． 概要
本開示は、ターゲティング配列およびループドメインを含有するように操作されたＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を提供する。Ｃａｓ１２ａタンパク質と組み合わせた、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子は、例えば、プレｍＲＮＡ分子の異常なスプライシングを、プレｍＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列を編集することにより修正または改変するために、用いることができる。本開示は、ＣＦＴＲ遺伝子におけるスプライシング変異のアレル特異的修復が、そのスプライシング変異の近傍をターゲットする単一のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡの使用により達成することができるという発見に、一部、基づいている。予想外にも、ＣＦＴＲ遺伝子におけるスプライシング変異に起因するスプライシングエラーの効率的な修正が、本明細書に記載されているようなＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを用いる場合、その変異自体の欠失または修正を必要としないことが発見された。それどころか、理論によって縛られるものではないが、スプライシング修正は、その変異の修正ではなく、その変異に近接したスプライシング制御エレメント内またはその近くにおけるヌクレオチドの欠失から獲得され得ると考えられる。そのヌクレオチドの欠失は、結果として、その変異の近くのスプライシング制御エレメントの除去または不活性化を生じることができるが、場合によっては、その変異自体を欠失させることができる。さらに、スプライシング変異を修復するために単一のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを用いるストラテジーは、驚くべきことに、遺伝子欠失を誘導するためにｓｇＲＮＡと組み合わせてＣａｓ９を用いる従来のアプローチより優れていることが見出されている。ＣＦＴＲ遺伝子に関して例示されるゲノム編集アプローチは、遺伝子疾患に関連した様々な他の遺伝子におけるスプライシング欠陥を修正するために適用することができ、加えて、中途停止コドンなどの有害な変異を有するエクソンのエクソンスキッピングを通してなど、機能性タンパク質の発現を回復させるために適用することができる。
したがって、本開示は、変異体スプライス部位をコードするゲノム配列をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子を提供する。図１および図２に示されているように、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子はそれぞれ、（ａ）ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよび（ｂ）ループドメインを含む。図１および図２でさらに示されているように、ターゲティング配列は、ゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応し、標的ドメインは、Ｃａｓ１２ａタンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接している。標的ドメインは、例えば、真核生物、例えば哺乳動物のゲノムＤＮＡ配列中にあり得る。好ましくは、標的ドメインは、ヒトゲノム配列中にある。ヒトゲノム配列は、遺伝子疾患、例えば、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子に関連した遺伝子内にあり得る。
ある特定の態様において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、（例えば、図１Ａおよび２Ａに概略的に示されているように）スプライス部位を含み、または（例えば、図１Ｂおよび２Ｂに概略的に示されているように）スプライス部位に近接する標的ドメインに対応するターゲティング配列を有する。
スプライス部位は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける変異によって活性化され、または導入される潜在性スプライス部位（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）であり得る。ゲノムＤＮＡにおける変異は、（例えば、図１Ａおよび１Ｂに概略的に示されているように）標的ドメイン内または（例えば、図２Ａおよび２Ｂに概略的に示されているように）標的ドメインの近くであり得る。
潜在性スプライス部位におけるプレｍＲＮＡ分子のスプライシングは、結果として、疾患表現型を生じ得、潜在性スプライス部位の活性を、ゲノムＤＮＡをＣａｓ１２ａタンパク質と組み合わせたＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡで編集することにより低下させると、正常なスプライシングを回復させることができる。例えば、ＣＦＴＲ変異３２７２－２６Ａ＞Ｇ、３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ、ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ、およびＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇは結果として嚢胞性線維症を生じ、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、正常なＣＦＴＲスプライシングを回復させるために用いることができる。
ターゲティング配列に変異を含めると、ゲノムＤＮＡのアレル特異的切断を可能にすることができる。たいていのＣａｓ１２ａタンパク質のプロトスペーサードメインは、典型的には２３ヌクレオチド長であり、したがって、（野生型アレルとは対照的に）変異を含有する染色体の特異的切断は、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列から１～２３ヌクレオチド離れている標的ドメインを選択することにより達成することができる。
あるいは、スプライス部位はカノニカルスプライス部位であり得る。カノニカルスプライス部位の活性を、ゲノムＤＮＡをＣａｓ１２ａタンパク質と組み合わせたＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡで編集することにより低下させることは、例えば、有害な変異（例えば、切り詰め型タンパク質を生じる、例えばエクソンにおける、変異）を有する遺伝子においてエクソンスキッピングを引き起こすために、用いることができる。一般的に、変異は標的ドメインの外側にある。エクソンをスキップすることにより、変化しているが、まだなお機能する可能性があるタンパク質の産生を達成することができる。例えば、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０における変異は、その遺伝子によりコードされるジストロフィンタンパク質の中途切り詰めを引き起こし得るが、エクソン５１のエクソンスキッピングはそのリーディングフレームを回復させ、機能性ジストロフィンタンパク質の発現を回復させることができる（Amoasii et al., 2017, Science Translational Medicine, 9(418):eaan8081参照）。本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、例えば、エクソン５０における変異を有するＤＭＤ遺伝子を、エクソン５１がスキップされるように編集し、それにより、機能性ジストロフィンタンパク質の発現を回復させるために用いることができる。
スプライス部位の活性は、ゲノム配列を含有する細胞へのＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の導入により、Ｃａｓ１２ａタンパク質が、スプライス部位の近く（例えば、スプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点）においてゲノムＤＮＡを切断するようにデザインされたＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを用いることにより低下させることができる。切断されたゲノムＤＮＡの修復中に導入されるインデルは、スプライス部位の活性を（部分的または完全に）低下させることができる。特定のＣａｓ１２ａタンパク質により認識されるＰＡＭ配列（例えば、ＡｓＣａｓ１２ａについてＴＴＴＶ）の知識、Ｃａｓ１２ａタンパク質が切断する場所（例えば、ＡｓＣａｓ１２ａについて、標的ドメイン配列を有する鎖上のＰＡＭ配列後１９番目の塩基の後ろ、および相補鎖上のＰＡＭ配列後２３番目の塩基の後ろ）の知識、およびゲノムＤＮＡにおけるＰＡＭ配列に対するスプライス部位の位置の知識を用いて、ターゲティング配列を、ゲノム配列を含有する細胞へのｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の導入により、Ｃａｓ１２ａがゲノムＤＮＡを、スプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断するように選択することができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列によりコードされるスプライス部位から４０ヌクレオチド内（例えば、４～３８ヌクレオチド）にあるＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列に隣接した標的ドメインに対応するターゲティング配列を有する。
ターゲットすることができるゲノムＤＮＡの例示的な特徴および本開示のｇＲＮＡ分子の例示的な特徴は、以下の、セクション６．２および６．３ならびに番号付けされた実施形態１～２８３に記載されている。本開示のｇＲＮＡと共に用いることができる例示的なＣａｓ１２ａタンパク質は、以下のセクション６．４に記載されている。
本開示はさらに、本開示のｇＲＮＡをコードする核酸および核酸を含有する細胞を提供する。ｇＲＮＡをコードする例示的な核酸および例示的な細胞の特徴は、以下の、セクション６．５ならびに番号付けされた実施形態２８４～２８７および３０２～３０５に記載されている。
本開示はさらに、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを含有するシステムおよび粒子を提供する。例示的なシステムおよび粒子は、以下のセクション６．６および番号付けされた実施形態２９６～３０１に記載されている。
本開示はさらに、細胞を変化させるために本開示のｇＲＮＡ、システム、および粒子を用いる方法を提供する。本開示の方法は、例えば、遺伝子疾患、例えば嚢胞性線維症または筋ジストロフィーを有する対象を処置するために、用いることができる。細胞を変化させる例示的な方法は、以下のセクション６．７および番号付けされた実施形態３０６～３７６に記載されている。
５．図面の簡単な説明
図が例示的であり、かつこの開示の範囲を限定しないことは理解されるべきである。図１～６は、必ずしも一定の縮尺で描かれてはいない。
標的ドメインにおける変異を有するゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す図であり、ゲノムＤＮＡが、標的ドメイン内に（図１Ａ）または標的ドメインの外側に（図１Ｂ）スプライス部位をコードする。ゲノムＤＮＡにおいて、ＰＡＭ配列は格子区域により示されている；標的ドメインは点の付いた区域により示されている；変異はアスタリスク（＊）により示されている；スプライス部位は二方向矢印により示されている。ｇＲＮＡにおいて、ループドメインは点線により示されている；ターゲティング配列を含むプロトスペーサードメインは破線で示されている。 標的ドメインの外側に変異を有するゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す図であり、ゲノムＤＮＡが、標的ドメイン内に（図２Ａ）または標的ドメインの外側に（図２Ｂ）スプライス部位をコードする。ゲノムＤＮＡにおいて、ＰＡＭ配列は格子区域により示されている；標的ドメインは点の付いた区域により示されている；変異はアスタリスク（＊）により示されている；スプライス部位は二方向矢印により示されている。ｇＲＮＡにおいて、ループドメインは点線により示されている；ターゲティング配列を含むプロトスペーサードメインは破線で示されている。 潜在性３’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す図である。図３Ａは、カノニカル３’スプライス部位の上流にある潜在性３’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す。カノニカル３’スプライス部位ではなく潜在性３’スプライス部位におけるスプライシングは、成熟ｍＲＮＡにおいて正常より長いエクソン配列を生じる。正常より長いエクソン配列の追加のヌクレオチドは、図において薄い陰影によって表され、正常なエクソン配列のヌクレオチドは図において濃い陰影によって表されている。ＰＡＭ配列（またはそれの相補体）は四角で囲まれている。変異は太字の下線が引かれた文字列で示されている。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号２９４～２９６および２９５を開示する。図３Ｂは、潜在性５’スプライス部位の上流にある潜在性３’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す。潜在性３’スプライス部位および潜在性５’スプライス部位におけるスプライシングは、成熟ｍＲＮＡにおける偽エクソン配列の包含を生じる。偽エクソンのヌクレオチドは、図において薄い陰影によって表されている。ＰＡＭ配列（またはそれの相補体）は四角で囲まれている。変異は太字の下線が引かれた文字列で示されている。図１Ａ～１Ｂの上部および下部において概略的に示されているように、ｇＲＮＡはゲノムＤＮＡのいずれかの鎖をターゲットするようにデザインすることができる。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号２９７、２９５、２９８、および２９５を開示する。 図３－１の続きである。 カノニカル３’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す図である。エクソンヌクレオチドは、図において薄い陰影により表されている。ＰＡＭ配列（またはそれの相補体）は四角で囲まれている。Ｃａｓ１２ａおよびカノニカル３’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡでゲノムＤＮＡを編集することによりカノニカル３’スプライス部位の活性を低下させることは、成熟ｍＲＮＡにおけるエクソンの包含を防止するために用いることができる。図の上部および下部において概略的に示されているように、ｇＲＮＡはゲノムＤＮＡのいずれかの鎖をターゲットするようにデザインすることができる。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号２９９、２９５、３００、および２９５を開示する。 潜在性５’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す図である。図５Ａは、潜在性３’スプライス部位の下流にある潜在性５’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す。潜在性３’スプライス部位および潜在性５’スプライス部位におけるスプライシングは、成熟ｍＲＮＡにおける偽エクソンの包含を生じる。偽エクソンのヌクレオチドは、図において薄い陰影によって表されている。ＰＡＭ配列（またはそれの相補体）は四角で囲まれている。変異は太字の下線が引かれた文字列で示されている。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３０１および３０２を開示する。図５Ｂは、カノニカル５’スプライス部位の下流にある潜在性５’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す。カノニカル５’スプライス部位ではなく潜在性５’スプライス部位におけるスプライシングは、正常より長いエクソンを生じる。正常より長いエクソンの追加のヌクレオチドは、図において薄い陰影によって表され、正常なエクソンのヌクレオチドは図において濃い陰影によって表されている。ＰＡＭ配列（またはそれの相補体）は四角で囲まれている。変異は太字の下線が引かれた文字列で示されている。図５Ａ～５Ｂの上部および下部において概略的に示されているように、ｇＲＮＡはゲノムＤＮＡのいずれかの鎖をターゲットするようにデザインすることができる。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３０３および３０４を開示する。 図５－１の続きである。 カノニカル５’スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを示す図である。エクソンヌクレオチドは、図において薄い陰影により表されている。ＰＡＭ配列（またはそれの相補体）は四角で囲まれている。Ｃａｓ１２ａおよびカノニカル５’スプライス部位をターゲットするｇＲＮＡでゲノムＤＮＡを編集することによりカノニカル５’スプライス部位の活性を低下させることは、成熟ｍＲＮＡにおけるエクソンの包含を防止することができる。図の上部および下部において概略的に示されているように、ｇＲＮＡはゲノムＤＮＡのいずれかの鎖をターゲットするようにデザインすることができる。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３０５および３０４を開示する。 野生型（ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴ）かまたは３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異型（ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ）のいずれかのエクソン１９から２０に渡るＣＦＴＲ領域に対応するおよそ１．３Ｋｂ配列を含有するＣＦＴＲミニ遺伝子の概略図を示す。エクソンは四角として、イントロンは線として示されている；予想されるスプライスされた転写産物は、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異の存在または非存在に従って、右側に表されている。下方パネルは、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異（太字で標識されている）の近くのヌクレオチド配列およびイントロン－エクソン境界、ならびに標的ｃｒＲＮＡ位置（下線が引かれており、ＰＡＭ配列はより太い下線によって描かれている）を示す。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３０６および３０７を開示する。 ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴおよびｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ ＣＦＴＲミニ遺伝子モデルにおけるイントロン１９スプライシングの確証を示す図である。図８Ａ：ＲＴ－ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分析による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされたＣＦＴＲ野生型（ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴ）および変異型（ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子モデルのスプライシングパターン。黒塗り矢印は異常なスプライシングを示す；白抜き矢印は正しいスプライシングを示す。図８Ｂ：図８Ａからのミニ遺伝子スプライシング産物のサンガーシーケンシングクロマトグラム。垂直線はエクソン間の境界を表す。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３０８および３０９を開示する。 ＡｓＣａｓ１２ａ ＤＮＡ編集によるＣＦＴＲ３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子モデルにおける変化したイントロン１９スプライシングの修正を示す図である。図９Ａ：ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ対照（Ｃｔｒ）または３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異に特異的なＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ（＋１１および－２）での処理後のＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ細胞におけるＲＴ－ＰＣＲにより分析されたスプライシングパターン。黒塗り矢印は異常なスプライシングを示す；白抜き矢印は正しいスプライシングを示す。ｎ＝２の独立した実行の代表的なデータ。図９Ｂ：図９Ａのような濃度測定により測定された正しいスプライシングのパーセンテージ。図９Ｃ：図９Ａのように処理された細胞におけるＴＩＤＥにより分析された編集効率。データは、ｎ＝２の独立した実行からの平均値±ＳＥＭである。図９Ｄ：ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１により引き起こされたインデル。ｃｒＲＮＡ＋１１を用いて編集された細胞由来の３２７２－２６Ａ＞Ｇ座位を、増幅し、ミニ遺伝子バックボーンにおいてクローニングし、サンガーシーケンシングし（３４個の異なるクローン、左パネル）、またはスプライシングパターンを可視化するために図９Ａのように分析した。ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴおよびｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇを参照として用いた。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３１０～３３８を開示する。 ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１編集の標的特異性を示す図である。示されているように、Ｃａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１または＋１１／ｗｔのレンチウイルス形質導入後のＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴまたはＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ細胞（図１０Ａ）およびＣａｃｏ－２細胞（図１０Ｂ）におけるＴＩＤＥ分析による編集効率。データは、ｎ＝２の独立した実行からの平均値±ＳＥＭである。図１０Ｃ：ｃｒＲＮＡ＋１１のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３３９～３４０を開示する。 ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１切断後の修復パターンを示す図である。図１１Ａ～Ｃ：ｎ＝３の独立した実行からのＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１編集後のＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ細胞からのＴＩＤＥ分析によるインデルスペクトル。図１１Ｄ：ミニ遺伝子プラスミドへクローニングされ、かつＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトされた編集部位のスプライシングパターンを示すＲＴ－ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動。 ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１またはｃｒＲＮＡ＋１１／ｗｔ ＤＮＡ編集後の変化していないＷＴ ＣＦＴＲスプライシングを示す図である。ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴまたはＡ＞Ｇミニ遺伝子（図１２Ａ）およびＷＴ ＣＦＴＲ配列を有するＣａｃｏ－２細胞（図１２Ｂ）におけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１または＋１１／ｗｔ編集後のＲＴ－ＰＣＲ産物分析。細胞に、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１または＋１１／ｗｔを有するレンチウイルスベクターを形質導入し、ピューロマイシンで１０日間、選択した。画像は、２つの独立した実行を示す。 ３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異型ＣＦ患者オルガノイドにおけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１ゲノム編集分析を示す図である。図１３Ａ：ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ対照（Ｃｔｒ）もしくは３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異に特異的なＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ（＋１１）、またはＣＦＴＲ ｃＤＮＡのレンチウイルス形質導入（１４日間）後の３２７２－２６Ａ＞ＧオルガノイドにおけるＲＴ－ＰＣＲによるスプライシングパターン分析。黒塗り矢印は異常なスプライシングを示す；白抜き矢印は正しいスプライシングを示す。異常なスプライシングのパーセンテージ（ｍＲＮＡへの２５ヌクレオチド（ｎｔ）挿入の％）を、クロマトグラム分解分析により測定した。図１３Ｂ：図１３Ａのようにレンチウイルス形質導入後のＴ７Ｅ１アッセイにより測定された３２７２－２６Ａ＞Ｇオルガノイドにおける編集効率。図１３Ｃ：３２７２－２６Ａ＞ＧオルガノイドのＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１形質導入後のＣＦＴＲオンターゲット座位のディープシーケンシング分析（ｎ＝２の独立した実行からの平均）。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３１０および３４１～３５４を開示する。図１３Ｄ：図１３Ｃからの編集された、および編集されていない３２７２－２６Ａ＞ＧまたはＷＴアレルのディープシーケンシングリードのパーセンテージ。図１３Ｅ：オルガノイドモデルにおけるＣＦＴＲ依存性膨潤の概略図。図１３Ｆ：フォルスコリン誘発性膨潤（ＦＩＳ）アッセイ前（Ｔ＝０分）および後（Ｔ＝６０分）のカルセイン標識３２７２－２６Ａ＞Ｇオルガノイドの代表的な共焦点画像。スケールバー＝２００μｍ。図１３Ｇ：示されているように、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ Ｃｔｒ、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１、またはＣＦＴＲ ｃＤＮＡのレンチウイルス形質導入後のオルガノイド面積の定量化。各ドットは、４つの独立した実行からの各ウェル（ウェルあたりのオルガノイドの数：２５～３００個）において分析された平均オルガノイド面積を表す。図１３Ｈ：ＦＩＳアッセイ前（Ｔ＝０分）および後（Ｔ＝６０分）のオルガノイド面積の倍数変化であり、各ドットは、ｎ＝４の独立した実行からの各ウェル（ウェルあたりのオルガノイドの数：２５～３００個）において分析された平均増加オルガノイド面積を表す。データは、平均値±ＳＤである、＊＊Ｐ＜０．０１。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．有意でない。 図１３－１の続きである。 図１３－１の続きである。 図１３－１の続きである。 図１３－１の続きである。 ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１でのゲノム編集後の３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異型ＣＦ患者のオルガノイドのＣＦＴＲスプライシングおよび機能の特徴づけを示す図である。図１４Ａ：図３ＡからのＲＴ－ＰＣＲ産物のクロマトグラム。上方パネルは、３２７２－２６Ａ＞Ｇ／４２１８ｉｎｓＴオルガノイドのｍＲＮＡ転写産物の混合集団を表し、下方パネルは、これらのオルガノイドにおけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１編集後の転写産物を示す。垂直線の右側の列は、エクソン１９－エクソン２０接合部の後ろのクロマトグラム面積を示す。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３５５および３５６を開示する。図１４Ｂ～１４Ｃ：クロマトグラムデコンボリューション分析を用いて、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１切断前（図１４Ｂ）および後（図１４Ｃ）の変異型スプライシング（イントロン１９由来の＋２５ｎｔの包含）の量を評価した。図１４Ｄ：ｎ＝４の独立した実行のＦＩＳアッセイ；各線は１ウェルを表す（ｎ＝２５～３００）。データは平均値±ＳＤである。 図１４－１の続きである。 ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン２２、３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔ変異を包含するイントロン２２の一部分、およびエクソン２３を有する、ＣＦＴＲ野生型（ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴ）および３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔ（ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ）ミニ遺伝子の概略図である。エクソンは四角として、イントロンは線として示されている；予想されるスプライスされた転写産物は、３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異の存在または非存在に従って、右側に表されている。下方パネルは、３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異（太字で標識されている）の近くのヌクレオチド配列およびＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４標的位置（下線が引かれており、ＰＡＭ（ＣＴＴＴ）はより色の濃い下線が引かれている）を示す。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３５７および３５８を開示する。 ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴおよびｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ ＣＦＴＲミニ遺伝子モデルにおけるイントロン２２スプライシングの確証を示す図である。図１６Ａ：ＲＴ－ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分析による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた、ＣＦＴＲ野生型（ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴ）および変異型（ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ）ミニ遺伝子モデルのスプライシングパターン。黒塗り矢印は異常なスプライシングを示す；白抜き矢印は正しいスプライシングを示す；Δはオルタナティブスプライシング産物を示す。図１６Ｂ：図１６Ａからのミニ遺伝子スプライシング産物のサンガーシーケンシングクロマトグラム。垂直線はエクソン間の境界を表す。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３５９および３６０を開示する。 ミニ遺伝子モデルおよびヒト腸管患者由来オルガノイドにおけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４編集による３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔスプライシング欠陥の修正を示す図である。図１７Ａ：ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ対照（Ｃｔｒ）または３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異に特異的なＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ（＋１４）での処理後のＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ細胞におけるＲＴ－ＰＣＲにより分析されたスプライシングパターン。黒塗り矢印は異常なスプライシングを示す；白抜き矢印は正しいスプライシングを示す；Δはミニ遺伝子スプライシング人工産物を示す。図１７Ｂ：ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４または＋１４／ＷＴをレンチウイルス性に形質導入されたＣａｃｏ－２細胞を、ＳＹＮＴＨＥＧＯ ＩＣＥ編集分析によりＣＦＴＲイントロン２２における編集について分析した。データは、ｎ＝２の独立した実行からの平均値±ＳＥＭである。図１７Ｃ：ｃｒＲＮＡ＋１４のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析。 ミニ遺伝子モデルおよびヒト腸管患者由来オルガノイドにおけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４編集による３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔスプライシング欠陥の修正を示す図である。図１８Ａ：３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ患者由来腸管オルガノイドに、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ対照（Ｃｔｒ）またはｃｒＲＮＡ＋１４をレンチウイルス性に形質導入し、ＳＹＮＴＨＥＧＯ ＩＣＥによりイントロン２２編集について分析した。図１８Ｂ：ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４またはＣＦＴＲ ｃＤＮＡを形質導入されたカルセイン標識３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔオルガノイドの共焦点画像。スケールバー ２００μｍ。図１８Ｃ：図１８Ｂにおける場合のオルガノイド面積の定量化；各ドットは各ウェル（ウェルあたりのオルガノイドの数：３～３０個）において分析されたオルガノイドの平均面積を表す。データは、平均値±ＳＤである。＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意でない。 ＣＦＴＲ３８４９＋１０ｋｂＣ＞ＴオルガノイドのＡｓＣａｓ１２ａ編集を示す図である。オルガノイド試料におけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４編集のＳＹＮＴＨＥＧＯ ＩＣＥ分析。予測される修復結果は、それらの存在量と共に表されている。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３６１～３７６、３７５、３７７～３８４、３６２～３６４、３７０、３８５、３８０、３７９、３６８、３６９、３８６、３７２、３８７、３８４、３７３、３７１、３８８、３８１、３８９、および３９０を開示する。 ミニ遺伝子モデルおよびＣＦ患者由来オルガノイドにおける３８４９＋１０ｋｂスプライシング欠陥のＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ修正を示す図である。図２０Ａ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされたｐＭＧ３８４９＋１０ＫｂＣ＞ＴにおけるＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡペアのスクリーニング。ＲＴ－ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。Δは、ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴまたはＣ＞Ｔのオルタナティブスプライシング産物を示す。図２０Ｂ：ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡペアの切断後のｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔにおけるターゲットされた欠失のアガロースゲル電気泳動分析。図２０Ｃ：ＲＴ－ＰＣＲ産物、および図２０Ｄ：ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡレンチウイルスベクターを形質導入され、かつ１０日間のピューロマイシン選択後のＣａｃｏ－２細胞におけるターゲットされた欠失。図２０Ｅ：アガロースゲル電気泳動により分析された患者オルガノイドにおける編集。図２０Ｆ：０．２５、０．５、または１ＲＴＵのＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡｓ－９５／＋１１９を形質導入されたＴ＝０分におけるカルセイン標識ＣＦ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔオルガノイドの共焦点画像。スケールバー＝２００μｍ。図２０Ｇ：定常状態オルガノイド面積の定量化；各ドットは１つのウェル（ｎ＝３～３０）からのオルガノイドの平均面積を表す。データは、平均値±ＳＤである。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。図２０Ｈ：ｇＲＮＡ－９５およびｇＲＮＡ＋１１９のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号３９１～４０４および３９６を開示する。 図２０－１の続きである。 ３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子のスプライシング修正についてのＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡおよびＡｓＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ機能スクリーニングを示す図である。図２１Ａ～２１Ｂ：ＣＦＴＲ３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子の正しいスプライシングパターンを回復させる能力に基づいた、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ（図２１Ａ）およびＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ（図２１Ｂ）スクリーニング。ヌクレアーゼ、およびシングルまたはペアでのｇＲＮＡを、ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトした。ＲＴ－ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴを、正しいイントロン１９スプライシングについての参照として用いた。図２１Ｃおよび図２１Ｄ：ＰＣＲにより測定された、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ（図２１Ｃ）およびＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ（図２１Ｄ）での切断後の３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子におけるターゲットされた欠失のアガロースゲル電気泳動分析。大きい方のバンドは編集されていないミニ遺伝子配列を表し、小さい方のバンドは予想される欠失産物である。図２１Ｅ：ＲＴ－ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動。図２１Ｆ：３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子の安定的なゲノム組込みを有するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ細胞）における、図２１Ｂから選択されたＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡペアについてのターゲットされた欠失のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動。図２１Ｇ：図９ＡからのＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１編集後の、３２７２－２６Ａ＞Ｇ組込みミニ遺伝子からの正しいイントロン１９スプライシングのサンガーシーケンシングクロマトグラム。垂直線は、エクソン１９と２０の間の境界を表す。図は配列番号４０５を開示する。 図２１－１の続きである。 ミニ遺伝子を表す部分的プラスミド配列を示す図である。図２２Ａ：ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞ＧＷＴ（配列番号４０６）。図２２Ｂ：ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ（配列番号４０７）。図２２Ｃ：ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴ（配列番号４０８）。図２２Ｄ：ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ（配列番号４０９）。 図２２－１の続きである。 実施例１１においてＵＳＨ２Ａスプライシングを模倣するために利用されたＵＳＨ２Ａミニ遺伝子モデルの概略図である。そのミニ遺伝子は、ＵＳＨ２Ａエクソン４０およびエクソン４１、加えて、ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異の存在下で偽エクソン４０（ＰＥ４０）を生じるイントロン４０の部分を含む。強い構成的ＣＭＶプロモーターにより駆動されるタンパク質タグを、発現を助けるために構築物の５’末端および３’末端に挿入した。野生型および変異型ミニ遺伝子におけるスプライシング産物は、図の下部に示されている。 実施例１１において作製された２つのミニ遺伝子のＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション後、ＲＴ－ＰＣＲにより検出された野生型および変異型ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子についてのスプライシング産物を示す、代表的なアガロースゲルを示す図である。変異型ミニ遺伝子により産生された転写産物は、ＰＥ４０の包含によって、より大きい。 ＵＳＨ２Ａ偽エクソン４０（ＰＥ４０）を編集するためのＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ標的ドメイン（実施例１１）を概略的に示す図である。ＰＥ４０は、薄い灰色で強調されている。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異の位置もまた示されている。図は、登場の順番に、それぞれ、配列番号４１０および４１１を開示する。 一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＣａｓ１２ａによるＵＳＨ２Ａスプライシングの修正（実施例１１）を示す図である。図２６Ａ：示されているように、示されたｇＲＮＡと組み合わせたＡｓＣａｓ１２ａ、および野生型または変異型ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子のＨＥＫ２９３への一過性トランスフェクション後に得られたスプライシング産物のＲＴ－ＰＣＲ分析を示す代表的なアガロースゲル。ＡｓＣａｓ１２ａおよび非ターゲティング性スクランブルｇＲＮＡをコードするベクターをトランスフェクトされた細胞が対照として示されている。下方のバンドが正しくスプライスされた産物に対応し、一方、上方のバンドが異常なＰＥ４０を含む。ＮＴＣ：鋳型なしの対照。図２６Ｂ：図２６Ａのデータの濃度測定分析により得られた、ＡｓＣａｓ１２ａおよび示されたｇＲＮＡと共の、野生型および変異型ミニ遺伝子のＨＥＫ２９３への同時トランスフェクション後６日目に生じた正しいスプライシング産物のパーセンテージ。データは、ｎ＝２の生物学的に独立した研究についての平均値±ＳＥＭとして提示されている。図２６Ｃ：示されているように、示されたｇＲＮＡと組み合わせたＬｂＣａｓ１２ａ、および野生型または変異型ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子のＨＥＫ２９３への一過性トランスフェクション後に得られたスプライシング産物のＲＴ－ＰＣＲ分析を示す代表的なアガロースゲル。ＬｂＣａｓ１２ａおよび非ターゲティング性スクランブルｇＲＮＡをコードするベクターをトランスフェクトされた細胞が対照として示されている。下方のバンドが正しくスプライスされた産物に対応し、一方、上方のバンドが異常なＰＥ４０を含む。ＮＴＣ：鋳型なしの対照。図２６Ｄ：図２６Ｃのデータの濃度測定分析により得られた、ＬｂＣａｓ１２ａおよび示されたｇＲＮＡと共の、野生型および変異型ミニ遺伝子のＨＥＫ２９３への同時トランスフェクション後６日目に生じた正しいスプライシング産物のパーセンテージ。データは、ｎ＝２の生物学的に独立した研究についての平均値±ＳＥＭとして提示されている。 図２６－１の続きである。 図２６－１の続きである。 ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３クローンにおけるＬｂＣａｓ１２ａによるＵＳＨ２Ａスプライシングの修正を示す図である。図２７Ａ：示されているように、ガイド１またはガイド３のいずれかと共にＬｂＣａｓ１２ａを発現するレンチウイルスベクターでの形質導入後１０日目における、ＨＥＫ２９３安定クローン１におけるＵＳＨ２Ａ野生型ミニ遺伝子、ならびにＨＥＫ２９３安定クローン４および６におけるＵＳＨ２Ａ変異型ミニ遺伝子のＲＴ－ＰＣＲにより検出されたスプライシングパターンを示す代表的なアガロースゲル。図２７Ｂ：ガイド１かまたはガイド３のいずれかと共にＬｂＣａｓ１２ａをコードするレンチウイルスベクターでの、ＵＳＨ２Ａ変異型ミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３クローン４および６の形質導入後１０日目に得られた図２７Ａのデータにおける濃度測定により測定された正しいスプライシング産物のレベル。図２７Ｃ：ＴＩＤＥ分析により測定された場合の、ＬｂＣａｓ１２ａおよび示されたｇＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターでの、野生型かまたは変異型のいずれかのＵＳＨ２Ａミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３クローンの形質導入後１０日目におけるインデル形成。組み込まれた野生型ミニ遺伝子を有するＨＥＫ２９３クローン（クローン１）に関するデータは、これらの研究条件において各ｇＲＮＡのアレル特異性を評価するために報告されている。図２７Ｂおよび図２７Ｃにおいて、データは、ｎ＝２の生物学的に独立した研究についての平均値ＳＥＭとして提示されている。 図２７－１の続きである。 ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子におけるＬｂＣａｓ１２ａにより生じたインデルプロファイル（実施例１１）を示す図である。図２７において行われたように、ＬｂＣａｓ１２ａおよびガイド１（図２８Ａ～図２８Ｂ）またはガイド３（図２８Ｃ～図２８Ｄ）をコードするレンチウイルスベクターでの形質導入後のＨＥＫ２９３ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ ＵＳＨ２Ａクローン４および６から得られたサンガーシーケンシングリードから計算されたインデルプロファイル。クロマトグラム分析は、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥウェブツールを用いて実施され、１％以上の計算された頻度を有するインデルだけを報告している。存在する場合、ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異は円で強調されている。全て、登場の順に、それぞれ、図２８Ａは、配列番号４１２～４２８を開示し、図２８Ｂは配列番号４１２、４１３、４１６、４２９、４１４、４２４、４１８、４３０、４３１、４２８、４２０、４３２、４３３、４１９、４２１、４１５、および４３４を開示し、図２８Ｃは、配列番号４３５～４４９を開示し、図２８Ｄは、配列番号４３５、４３７、４３６、４３９、４４０、４３８、４４１、４４２、４４４、および４５０～４５３を開示する。 図２８－１の続きである。 図２８－１の続きである。 図２８－１の続きである。
６． 詳細な説明
本開示は、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を提供し、例えば、Ｃａｓ１２ａタンパク質と組み合わせて、ゲノムＤＮＡ配列における変異に起因した異常なＲＮＡスプライシングを修正するために、または別の例として、（例えば、エクソンスキッピングが有利である場合）成熟ｍＲＮＡにおけるエクソンの包含を防止するために用いることができる。
一態様において、本開示のｇＲＮＡは、ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むように操作される。ターゲティング配列は、ゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応し、標的ドメインは、Ｃａｓ１２ａタンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している。
ターゲットすることができるゲノムＤＮＡの例示的な特徴および本開示のｇＲＮＡ分子の例示的な特徴はセクション６．２および６．３に記載されている。本開示のｇＲＮＡと共に用いることができる例示的なＣａｓ１２ａタンパク質は、セクション６．４に記載されている。
本開示はさらに、本開示のｇＲＮＡをコードする核酸および核酸を含有する宿主細胞を提供する。ｇＲＮＡをコードする例示的な核酸および例示的な宿主細胞の特徴はセクション６．５に記載されている。
本開示はさらに、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを含有するシステムおよび粒子を提供する。例示的なシステムおよび粒子はセクション６．６に記載されている。
本開示はさらに、細胞を変化させるために本開示のｇＲＮＡ、システム、および粒子を用いる方法を提供する。本開示の方法は、例えば遺伝子疾患を処置するために、有用であり得る。細胞を変化させる例示的な方法はセクション６．７に記載されている。
６．１． 定義
２つのヌクレオチド配列（例えば、標的ドメインとＰＡＭ）に言及する場合の「隣接する」とは、その２つのヌクレオチド配列が、その２つの配列の間に介在するヌクレオチドなしに隣同士であることを意味する。
「Ｃａｓ１２ａタンパク質」は、野生型または操作型Ｃａｓ１２ａタンパク質を指す。Ｃａｓ１２ａタンパク質は、当技術分野においてＣｐｆ１タンパク質とも呼ばれている。
ターゲティング配列と標的ドメインに言及する場合の「対応する」とは、ターゲティング配列が、３つより多くないヌクレオチドミスマッチを伴って、標的ドメインの相補体と相補的であることを意味する。一部の実施形態において、ターゲティング配列は、２つより多くないヌクレオチドミスマッチを伴って、標的ドメインの相補体と相補的である。他の実施形態において、ターゲティング配列は、１つより多くないヌクレオチドミスマッチを伴って、標的ドメインの相補体と相補的である。他の実施形態において、ターゲティング配列は、ヌクレオチドミスマッチを伴わずに、標的ドメインの相補体と相補的である。
ゲノムＤＮＡ配列の領域に関連した、「破壊された」とは、その領域がインデルによって変化していることを意味する。
この開示に関連した、「インデル」とは、Ｃａｓ１２ａタンパク質によって切断されているゲノムＤＮＡ配列の（例えば、非相同末端結合または相同組換え修復による）修復中に導入される、ゲノムＤＮＡ配列における挿入および欠失を指す。
「ループドメイン」とは、Ｃａｓ１２ａタンパク質により認識されるステム－ループ構造を含む本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡの構成要素である。ループドメインは、Ｃａｓ１２ａタンパク質により認識される天然に存在するステム－ループ配列のヌクレオチド配列を含み得、またはＣａｓ１２ａタンパク質により認識されるステム－ループ構造を形成する操作型ヌクレオチド配列を含み得る。例えば、Zetsche et al., 2015, Cell 163:759-771参照。
この開示に関連した、「変異」とは、野生型ゲノムＤＮＡ配列の変化を指す。変異は、野生型ゲノムＤＮＡ配列に対しての、１つもしくは複数のヌクレオチドにおける変化（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））、欠失、または挿入であり得る。欠失または挿入である変異は、例えば、１ヌクレオチドから１０６ヌクレオチドまで（例えば、１～１０５ヌクレオチド、１～１０４ヌクレオチド、１～１０３ヌクレオチド、１～１００ヌクレオチド、または１～１０ヌクレオチド）の欠失または挿入であり得る。
「プロトスペーサードメイン」とは、ターゲティング配列を含有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子の領域を指す。プロトスペーサードメインはｃｒＲＮＡと呼ばれる場合もある。
この開示に関連した、「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」は、ゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインの５’側にある、一般的に４ヌクレオチド長の、ゲノムＤＮＡ配列を指し、それは、そのＰＡＭを認識するＣａｓ１２ａタンパク質によるゲノムＤＮＡの切断に必要とされる。例示的なＰＡＭ配列はＴＴＴＶであり、それは野生型ＡｓＣａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａについてのＰＡＭ配列である。
本明細書で用いられる場合、「スプライス部位」とは、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）分子におけるイントロン／エクソン接合部を指す。スプライス部位は、イントロンの５’末端に位置するスプライス部位である「５’スプライス部位」（ドナースプライス部位とも呼ばれる）、またはイントロンの３’末端に位置するスプライス部位である「３’スプライス部位」（アクセプタースプライス部位とも呼ばれる）であり得る。「カノニカルスプライス部位」におけるプレｍＲＮＡのスプライシングは、本明細書では「正常なスプライシング」と呼ばれる。潜在性スプライス部位で起こるプレｍＲＮＡスプライシングは、本明細書では「異常なスプライシング」と呼ばれる。潜在性スプライス部位は、野生型プレｍＲＮＡ分子内に存在し得るが、一般的に、変異によって活性化されない限り、休止中であり、または低レベルでのみ用いられる。潜在性スプライス部位はまた、変異によって生成され得る。
「標的ドメイン」は、Ｃａｓ１２ａタンパク質による切断のためにターゲットされるゲノムＤＮＡ配列を指す。
「ターゲティング配列」は、標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子の領域を指す。
ゲノムＤＮＡ配列に関連した、「野生型」とは、種、例えばホモサピエンスにおいて、優勢であるゲノムＤＮＡ配列を指す。
６．２． ゲノム編集のためのゲノムＤＮＡ配列
本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ａタンパク質と共に、哺乳動物ゲノム配列などの真核生物ゲノム配列をターゲットするようにデザインすることができる。好ましくは、ターゲットされるゲノム配列は、ヒトゲノム配列である。関心対象となるゲノム配列は、典型的には、発現が結果として疾患表現型を生じる変異型遺伝子をコードするゲノム配列である。例えば、疾患表現型は、プレｍＲＮＡの異常なスプライシングを引き起こす変異に起因する疾患表現型、またはエクソンにおける変異（例えば、ゲノム配列によりコードされるｍＲＮＡへ停止コドンを導入する変異）に起因する疾患表現型であり得る。
ターゲットすることができる例示的なゲノムＤＮＡ配列には、バリアント嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子（例えば、嚢胞性線維症に関連している）、バリアントジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーに関連している）、バリアントヘモグロビンサブユニットβ（ＨＢＢ）遺伝子（例えば、βサラセミアに関連している）、バリアントフィブリノゲンβ鎖（ＦＧＢ）遺伝子（例えば、無フィブリノゲン血症に関連している）、バリアントスーパオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子（例えば、筋萎縮性側索硬化症に関連している）、バリアントキノイドジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＱＤＰＲ）遺伝子（例えば、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症に関連している）、バリアントα－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）遺伝子（例えば、ファブリー病に関連している）、バリアント低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子（例えば、家族性高コレステロール血症に関連している）、バリアントＢＲＣＡ１相互作用タンパク質１（ＢＲＩＰ１）遺伝子（例えば、ファンコニー貧血に関連している）、バリアント凝固因子ＩＸ（Ｆ９）遺伝子（例えば、血友病Ｂに関連している）、バリアント２９０ｋＤａ中心体タンパク質（ＣＥＰ２９０）遺伝子（例えば、レーバー先天性黒内障に関連している）、バリアントコラーゲンＩＩ型、α１（ＣＯＬ２Ａ１）遺伝子（例えば、スティックラー症候群に関連している）、バリアントアッシャリン（usherin）（ＵＳＨ２Ａ）遺伝子（例えば、アッシャー症候群ＩＩ型に関連している）、およびバリアント酸性α－グルコシダーゼ（ＡＡＧ）遺伝子（例えば、糖原病ＩＩ型に関連している）が挙げられる。これらの遺伝子の異なるバリアントにおける（および本明細書に記載されているようなＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをデザインするために用いることができる）例示的な標的ドメインは、セクション６．３．４に記載されている。
６．２．１． プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
一般的なＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａの両方）の使用への一つの制約は、標的ドメインがＰＡＭ配列に極めて接近している（例えば、ＰＡＭ配列に隣接している）という必要条件である。Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ゲノムＤＮＡを切断する時、互い違いの切断を生じる；ＡｓＣａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａの場合、標的ゲノム配列のＤＮＡ切断は、標的ドメイン配列を有する鎖上におけるＰＡＭ配列後１９番目の塩基の後ろ、および相補鎖上におけるＰＡＭ配列後２３番目の塩基の後ろで起こる。したがって、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡのデザインは、ゲノムＤＮＡにおけるＰＡＭ配列の位置および利用可能性によって制約される。しかしながら、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質により認識されるＰＡＭ配列とは異なるＰＡＭ配列を認識するＣａｓ１２ａバリアントがデザインされており（セクション６．４参照）、Ｃａｓ１２ａでの編集のためにターゲットされ得る可能性があるゲノムＤＮＡ配列の数を拡大している。
ＡｓＣａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａにより認識されるＰＡＭはＴＴＴＶであって、ここで、ＶがＡ、Ｃ、またはＧであり、一方、ＦｎＣａｓ１２のＰＡＭはＮＴＴＮであって、ここで、Ｎが任意のヌクレオチドである。例えば、ＴＹＣＶ（ここで、ＹがＣまたはＴであり、かつＶがＡ、Ｃ、またはＧである）；ＣＣＣＣ；ＡＣＣＣ；ＴＡＴＶ（ここで、ＶがＡ、Ｃ、またはＧである）；およびＲＡＴＲのうちの１つまたは複数を認識する、代替のＰＡＭ配列を認識する操作型Ｃａｓ１２ａタンパク質がデザインされている。これらのＰＡＭ配列を認識するＣａｓ１２ａタンパク質はセクション６．４に記載されている。
６．２．２． スプライス部位
本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位に近接し、またはそれを含むゲノムＤＮＡ配列をターゲットする。スプライス部位は、ゲノムＤＮＡがＣａｓ１２ａタンパク質によって切断され得るように、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列に極めて近接している必要がある。例えば、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、そのｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、Ｃａｓ１２ａが、ゲノムＤＮＡによってコードされるスプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点（例えば、１０ヌクレオチドまでの地点または１０～１５ヌクレオチドの地点）でゲノムＤＮＡを切断するように、デザインすることができる。切断されたゲノムＤＮＡの修復中に生じたインデルは、スプライス部位の活性の（例えば、部分的または完全な）低下を引き起こし、それにより、ゲノムＤＮＡによりコードされるプレｍＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。スプライス部位は、潜在性スプライス部位（例えば、疾患表現型において生じているもの）またはカノニカルスプライス部位（例えば、疾患を引き起こす変異を含有するエクソンの上流にある）であり得る。スプライス部位（潜在性またはカノニカル）は、５’スプライス部位または３’スプライス部位であり得る。スプライス部位は、セクション６．３．２で、より詳細に記載されている。
６．３． Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ
一態様において、本開示は、ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含む操作型Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を提供する。ターゲティング配列はゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応し、標的ドメインはＣａｓ１２ａタンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している。
ある特定の態様において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、スプライス部位を含む標的ドメイン（図１に概略的に示されている）またはスプライス部位に近接する標的ドメイン（図２に概略的に示されている）に対応するターゲティング配列を有する。
スプライス部位は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける変異により活性化または導入される潜在性スプライス部位であり得る。潜在性スプライス部位におけるプレｍＲＮＡ分子のスプライシングは、結果として疾患表現型を生じ得、ゲノムＤＮＡをＣａｓ１２ａタンパク質と組み合わせたＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡで編集することにより、潜在性スプライス部位の活性を低下させることは、正常なスプライシングを回復させることができる。（例えば、変異がＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列から１～２３ヌクレオチドの地点にある場合）ターゲティング配列において変異を含めることは、ゲノムＤＮＡのアレル特異的切断を可能にすることができる。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列から１～２０ヌクレオチド、１～１５ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、５～１５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、または１５～２３ヌクレオチドの地点にある変異を有する標的ドメインに対応するターゲティング配列を有する。
あるいは、スプライス部位はカノニカルスプライス部位であり得る。ゲノムＤＮＡをＣａｓ１２ａタンパク質と組み合わせたＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡで編集することによりカノニカルスプライス部位の活性を低下させることは、例えば、有害な変異（例えば、停止コドンを導入し、またはその他の場合オープンリーディングフレームに影響する変異）を有する遺伝子におけるエクソンのエクソンスキッピングを引き起こすために、用いることができる。エクソンスキッピングを通して、変化したがまだなお機能する可能性があるタンパク質の産生を達成することができる。
ゲノムＤＮＡは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡをスプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点（例えば、スプライス部位から１０ヌクレオチドまでの地点または１０～１５ヌクレオチドの地点）で切断するようにデザインされたＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを用いることにより、スプライス部位に接近した地点を編集され得る（例えば、その結果、スプライス部位の活性が部分的または完全に低下する）。
Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡを切断する時、それは互い違いの切断を生じる。例えば、ＡｓＣａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａタンパク質は、ゲノムＤＮＡを、標的ドメイン配列を有する鎖上におけるＰＡＭ配列後１９番目の塩基の後ろ、および相補鎖上におけるＰＡＭ配列後２３番目の塩基の後ろで切断する。「Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断する」という表現および類似した句（例えば、異なる数のヌクレオチドを列挙すること）に関して、ヌクレオチドのカウントがスプライス部位に最も近いオーバーハングから実施されるべきであることは、理解されるべきである。さらに、「Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断する」という表現および類似した句は、Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡをスプライス部位で切断する実施形態を包含することは理解されるべきである。したがって、「Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断する」という表現は、Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡを、スプライス部位で、スプライス部位から１ヌクレオチドの地点、スプライス部位から２ヌクレオチドの地点、スプライス部位から３ヌクレオチドの地点、スプライス部位から４ヌクレオチドの地点、スプライス部位から５ヌクレオチドの地点、スプライス部位から６ヌクレオチドの地点、スプライス部位から７ヌクレオチドの地点、スプライス部位から８ヌクレオチドの地点、スプライス部位から９ヌクレオチドの地点、スプライス部位から１０ヌクレオチドの地点、スプライス部位から１１ヌクレオチドの地点、スプライス部位から１２ヌクレオチドの地点、スプライス部位から１３ヌクレオチドの地点、スプライス部位から１４ヌクレオチドの地点、またはスプライス部位から１５ヌクレオチドの地点で切断する実施形態を包含する。
特定のＣａｓ１２ａタンパク質により認識されるＰＡＭ配列（例えば、ＡｓＣａｓ１２ａについてＴＴＴＶ）の知識、Ｃａｓ１２ａタンパク質が切断する場所（例えば、ＡｓＣａｓ１２ａについて、ＰＡＭから１９ヌクレオチド後および２３ヌクレオチド後）の知識、およびゲノムＤＮＡにおけるＰＡＭ配列に対するスプライス部位の位置の知識を用いて、ターゲティング配列は、ゲノム配列を含有する細胞へのｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の導入により、Ｃａｓ１２ａタンパク質がゲノムＤＮＡを、スプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断するように選択することができる。例えば、ＡｓＣａｓ１２ａタンパク質と共に用いられるｇＲＮＡをデザインする場合、スプライス部位は、ＴＴＴＶ配列後４番目のヌクレオチドの後ろからＴＴＴＶ配列後３８番目のヌクレオチドの後ろまでにあり得る。
一部の実施形態において、本開示は、ターゲティング配列が、スプライス部位から４０ヌクレオチド内（例えば、４～３８ヌクレオチド、５～３５ヌクレオチド、５～２５ヌクレオチド、５～１５ヌクレオチド、５～１０ヌクレオチド、１０～３５ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、１０～１５ヌクレオチド、１５～３５ヌクレオチド、１５～２５ヌクレオチド、２０～３５ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、または２５～３５ヌクレオチド）の地点にあるＰＡＭ配列に隣接した標的ドメインに対応する。
本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、一般的に、４０～４４ヌクレオチド長（例えば、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、または４３ヌクレオチド）であるが、他の長さのｇＲＮＡもまた企図される。例えば、ｇＲＮＡの５’末端を伸長すること（例えば、Park et al., 2018, Nature Communications, 9:3313に記載されているように）は、遺伝子編集有効性を増強するのに役立ち得る。追加として、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、任意で、化学修飾することができ、それは、例えば、ｇＲＮＡの血清中安定性を増強するのに有用であり得る（例えば、Park et al., 2018, Nature Communications, 9:3313参照）。
６．３．１ プロトスペーサードメイン
本開示のｇＲＮＡは、ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインを含む。一部の実施形態において、プロトスペーサードメイン配列とターゲティング配列は同じである。他の実施形態において、プロトスペーサードメイン配列とターゲティング配列は異なる（例えば、プロトスペーサードメインはターゲティング配列の５’側および／または３’側に１ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを含む場合）。
プロトスペーサードメインは、一部の実施形態において、１７～２６ヌクレオチド長（例えば、１７～２０ヌクレオチド、１７～２３ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、または２０～２４ヌクレオチド）であり得る。一部の実施形態において、プロトスペーサードメインは１７ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは１８ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは１９ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは２０ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは２１ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは２２ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは２３ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは２４ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは２５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プロトスペーサードメインは２６ヌクレオチド長である。
ターゲティング配列はゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応する。好ましくは、ターゲティング配列と標的ドメインの相補体との間にミスマッチがないが、少数（例えば、１つまたは２つ）のミスマッチを有する実施形態が構想される。ターゲティング配列は、一部の実施形態において、１７～２６ヌクレオチド長（例えば、２０～２４ヌクレオチド長）であり得る。一部の実施形態において、ターゲティング配列は１７ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は１８ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は１９ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は２０ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は２１ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は２２ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は２３ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は２４ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は２５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、ターゲティング配列は２６ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、プロトスペーサードメイン配列とターゲティング配列は同じである。
ターゲティング配列は、必ずしもそうとは限らないが、変異（例えば、一塩基多型）を有する標的ドメインに対応する。一部の実施形態において、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列から１～２３ヌクレオチド（例えば、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列から１～２０ヌクレオチド、１～１５ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、５～１５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、または１５～２３ヌクレオチド）の地点に変異を有する標的ドメインに対応するターゲティング配列を有する。変異を有する標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ａ／Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ複合体が野生型アレルより優先的に変異体アレルを切断することができ、それにより、変異体アレルのみのゲノム編集を生じ得るような、アレル特異性を有し得る。
理論によって縛られるものではないが、切断後のゲノムＤＮＡの修復中の変異の欠失、修正、または他の変化がスプライス部位の活性を低下させるのに必要ではないことが考えられる。したがって、本開示のｇＲＮＡは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入が結果として変異の欠失、修正、または他の変化を生じない場合でさえも、スプライス部位の活性を低下させるのに有効であり得る。したがって、一部の実施形態において、本開示のｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する集団細胞への導入により、ゲノムＤＮＡのＣａｓ１２ａタンパク質による切断が必ずしも、生じたインデルの全部において、変異を欠失させたり、修正したり、またはその他の場合変化させたりするわけではない。例えば、変異は、生じたインデルの５０％以下（例えば、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、または１０％～２０％）において欠失し、修正され、またはその他の場合変化し得る。
６．３．２． スプライス部位
６．３．２．１． 潜在性スプライス部位
潜在性スプライス部位は、スプライソソームと相互作用する潜在能力を有する非カノニカルスプライス部位である。ｍＲＮＡをコードするＤＮＡにおける変異（例えば、スプライス部位変異）または転写中のエラーは、通常スプライスされない、転写産物の一部における潜在性スプライス部位を生成または活性化し得る。潜在性スプライス部位の生成または活性化は、結果として、異常なスプライシング、および場合によっては、疾患表現型を生じ得る。したがって、一部の実施形態において、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは潜在性スプライス部位をターゲットする。一部の実施形態において、標的ドメインは潜在性スプライス部位を含む。他の実施形態において、標的ドメインは潜在性スプライス部位を含まない。潜在性スプライス部位は５’潜在性スプライス部位または３’潜在性スプライス部位であり得る。
一部の実施形態において、潜在性スプライスは、ゲノムＤＮＡ配列における変異により生成または活性化されるものである。変異は、例えば、一塩基多型、挿入（例えば、１～１０ヌクレオチドまたは１～１００ヌクレオチド）、または欠失（例えば、１～１０ヌクレオチドまたは１～１００ヌクレオチド）であり得る。一部の実施形態において、変異は一塩基多型である。
潜在性スプライス部位をコードするゲノムＤＮＡ配列を有する細胞へのＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の導入により、ゲノムＤＮＡは、正常なスプライシングが回復するように編集され得る。例えば、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡがＣａｓ１２ａタンパク質と共に、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞の集団へ（例えば、インビトロで）導入された場合、正常なスプライシングは、細胞の一部分、例えば、細胞の少なくとも１０％（例えば、細胞の１０％～２０％）、細胞の少なくとも２０％（例えば、細胞の２０％～３０％）、細胞の少なくとも３０％（例えば、細胞の３０％～４０％）、細胞の少なくとも４０％（例えば、細胞の４０％～５０％）、細胞の少なくとも５０％（例えば、細胞の５０％～６０％）、細胞の少なくとも６０％（例えば、細胞の６０％～７０％）、または細胞の少なくとも７０％（例えば、細胞の７０％～８０％または細胞の７０％～９０％）において回復し得る。理論によって縛られるものではないが、少数の細胞であっても、正常なスプライシングの回復は、いくつかの遺伝子疾患、例えば、ＣＦ、家族性高コレステロール血症２型、脊髄性筋萎縮症、血友病、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するために有利であり得ると考えられる。例えば、ＣＦを有する対象について、対象の肺細胞の少なくとも１０％において正常なスプライシングを回復させることが、その患者の症状を軽減するのに十分であると考えられる。
６．３．２．１．１． 潜在性３’スプライス部位
本開示のｇＲＮＡによりターゲットされる潜在性スプライス部位は、潜在性３’スプライス部位、例えば、変異によって生成または活性化されるスプライス部位であり得る。潜在性３’スプライス部位は、例えば、３’カノニカルスプライス部位の上流または５’潜在性スプライス部位の上流にあり得る。
潜在性３’スプライス部位が３’カノニカルスプライス部位の上流にある場合、３’カノニカルスプライス部位ではなく潜在性３’スプライス部位におけるスプライシングが、結果として、伸長したエクソンを生じる（図３Ａに概略的に示されている）。正常なスプライシングは、潜在性３’スプライス部位の活性を低下させることにより回復することができる。
潜在性３’スプライス部位が５’潜在性スプライス部位の上流にある場合、潜在性３’スプライス部位および潜在性５’スプライス部位におけるスプライシングは、成熟ｍＲＮＡにおける偽エクソンの包含を生じる（図３Ｂに概略的に示されている）。正常なスプライシングは、偽エクソンがプレｍＲＮＡスプライシング中にスキップされるように潜在性３’スプライス部位の活性を低下させることにより回復することができる。
潜在性３’スプライス部位の活性を低下させることは、例えば、そのスプライス部位を破壊し、潜在性３’スプライス部位の上流の分岐部位（本明細書では「潜在性３’スプライス部位の分岐部位」と呼ばれる）を破壊し、または潜在性３’スプライス部位の上流のポリピリミジントラクト（本明細書では「潜在性３’スプライス部位のポリピリミジントラクト」と呼ばれる）を破壊することにより、達成することができる。したがって、潜在性３’スプライス部位の活性を低下させることは、例えば、そのスプライス部位、分岐部位、またはポリピリミジントラクトをターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを用いることにより達成することができる。
６．３．３．１．２． 潜在性５’スプライス部位
本開示のｇＲＮＡによりターゲットされる潜在性スプライス部位は、例えば変異によって生成または活性化されている、潜在性５’スプライス部位であり得る。潜在性５’スプライス部位は、例えば、潜在性３’スプライス部位の下流または５’カノニカルスプライス部位の下流にあり得る。
潜在性５’スプライス部位が潜在性３’スプライス部位の下流にある場合、潜在性３’スプライス部位および潜在性５’スプライス部位におけるスプライシングは、成熟ｍＲＮＡにおける偽エクソンの包含を生じる（図５Ａに概略的に示されている）。潜在性５’スプライス部位がカノニカル５’スプライス部位の下流にある場合、カノニカル５’スプライス部位ではなく潜在性５’スプライス部位におけるスプライシングが、結果として、成熟ｍＲＮＡにおける正常より長いエクソンを生じる（図５Ｂに概略的に示されている）。どちらの場合においても、正常なスプライシングは、潜在性５’スプライス部位の活性を低下させることにより回復することができる。
潜在性５’スプライス部位の活性を低下させることは、例えば潜在性５’スプライス部位または周囲の配列（例えば、その潜在性スプライス部位の５’側３ヌクレオチド地点から潜在性５’スプライス部位の３’側８ヌクレオチド地点まで）を破壊することにより、達成することができる。
６．３．２．２． カノニカルスプライス部位
本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、カノニカルスプライス部位をターゲットすることができる。ターゲットされるカノニカルスプライス部位はカノニカル３’スプライス部位または５’カノニカルスプライス部位であり得る。
カノニカル３’スプライス部位または５’カノニカルスプライス部位の活性を低下させることは、エクソンスキッピングを引き起こすために用いることができる。カノニカル３’スプライス部位のターゲティングは図４に概略的に示されており、カノニカル５’スプライス部位のターゲティングは図６に概略的に示されている。エクソンスキッピングは、例えば、有害な変異を有するエクソンをスキップするために、有用であり得る。エクソンスキッピングは、例えば、ｍＲＮＡ分子、例えば、ジストロフィンタンパク質の中途切り詰めを引き起こすエクソンにおける変異を有するＤＭＤプレｍＲＮＡ内におけるリーディングフレームを回復させるために、用いることができる。
カノニカル３’スプライス部位の活性を低下させることは、例えば、そのスプライス部位を破壊し、カノニカル３’スプライス部位の上流の分岐部位（本明細書では「カノニカル３’スプライス部位の分岐部位」と呼ばれる）を破壊し、またはカノニカル３’スプライス部位の上流のポリピリミジントラクト（本明細書では「カノニカル３’スプライス部位のポリピリミジントラクト」と呼ばれる）を破壊することにより、達成することができる。カノニカル５’スプライス部位の活性を低下させることは、例えばカノニカル５’スプライス部位または周囲の配列（例えば、そのカノニカルスプライス部位の５’側３ヌクレオチド地点からカノニカル５’スプライス部位の３’側８ヌクレオチド地点まで）を破壊することにより、達成することができる。
６．３．３． ループドメイン
Ｃａｓ１２ａは単一ｇＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、ｇＲＮＡが、直列反復配列を有する単一ループドメイン、例えば、２０ヌクレオチド長のループドメインを含む。Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡを、ループドメインの構造的特徴と配列特異的特徴の組合せによって認識する。本開示のｇＲＮＡのループドメインは、典型的には、少なくとも１６ヌクレオチド長、例えば、１６～２０ヌクレオチド長、１６～１８ヌクレオチド長、１８～２０ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ループドメインは２０ヌクレオチド長である。典型的には、ループドメインは、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡのプロトスペーサードメインの５’側にある。
ループドメインは、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質またはそのバリアントと会合するステム－ループ配列を含み得る。例えば、Ｃａｓ１２ａタンパク質と会合する能力がある様々なループドメインのステム－ループ配列を記載する、全体が参照により本明細書に組み入れられた、Zetsche, et. al, 2015, Cell, 163:759-771を参照。例示的なループドメインには、
Figure 2022520783000001
から選択されるヌクレオチド配列を含むループドメインが挙げられる。
一部の実施形態において、ループドメインは、
Figure 2022520783000002
から選択されるヌクレオチド配列を含み、またはそれからなる。一部の実施形態において、ループドメインは、ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）を含み、またはそれからなり、それはＡｓＣａｓ１２ａと会合するループドメイン配列である。一部の実施形態において、ループドメインは、ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＡＧＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３１）を含み、またはそれからなり、それはＬｂＣａｓ１２ａと会合するループドメイン配列である。
Ｃａｓ１２ａタンパク質と会合し、かつ本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡのループドメインに用いることができる追加のステム－ループ配列は、全体が参照により本明細書に組み入れられた、Feng, et. al, 2019, Genome Biology, 20:15に記載されている。Feng, et. al, 2019, Genome Biology, 20:15に記載され、かつ本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡのループドメインに含まれ得る例示的なヌクレオチド配列には、ＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＧＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３４）、ＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＧＵＧＵＡＧＡ（配列番号３５）、ＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３６）、およびＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＵＡＧＡＵ（配列番号３７）が挙げられる。
上記のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有するループドメインもまた用いることができる。例えば、ループドメインのＲＮＡ二重鎖を保存するループドメイン配列における変異を用いることができる。例えば、Zetsche, et. al, 2015, Cell, 163:759-771参照。
６．３．４． 例示的な標的ドメインおよびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ
様々な遺伝子における標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、本明細書に記載されているようにデザインすることができる。例えば、標的ドメインは、バリアントＣＦＴＲ遺伝子、バリアントＤＭＤ遺伝子、バリアントＨＢＢ遺伝子、バリアントＦＧＢ遺伝子、バリアントＳＯＤ１遺伝子、バリアントＱＤＰＲ遺伝子、バリアントＧＬＡ遺伝子、バリアントＬＤＬＲ遺伝子、バリアントＢＲＩＰ１遺伝子、バリアントＦ９遺伝子、バリアントＣＥＰ２９０遺伝子、バリアントＣＯＬ２Ａ１遺伝子、バリアントＵＳＨ２Ａ遺伝子、またはバリアントＧＡＡ遺伝子内にあり得る。下記の標的ドメインは、例えば本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ（例えば、下記の標的ドメインに対応するターゲティング配列およびセクション６．３．３に記載されているようなループドメインを含むＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ）をデザインするために、用いることができる。そのようなＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡの正常なスプライシングを回復させるために適切なＣａｓ１２ａタンパク質と共に用いることができる。このセクションに記載された特定の変異に関する追加の詳細は、ＤＢＡＳＳデータベース（ｗｗｗ．ｄｂａｓｓ．ｏｒｇ．ｕｋ）に見出すことができる。
一部の実施形態において、標的ドメインは、ＣＦＴＲ遺伝子、例えば、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異、３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異、ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異を有するＣＦＴＲ遺伝子内にある。３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異は、潜在性３’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、一方、３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異、ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異、およびＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異はそれぞれ、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こす。これらの変異のそれぞれは、嚢胞性線維症と関連している。
３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異を有するＣＦＴＲ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＣＡ（配列番号３８）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異を有するＣＦＴＲ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＧＧＧＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＴＡ（配列番号３９）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異を有するＣＦＴＲ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＡＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＡ（配列番号４０）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異を有するＣＦＴＲ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＣＡ（配列番号４１）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異を有するＣＦＴＲ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡＡ（配列番号４２）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異を有するＣＦＴＲ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡ（配列番号４３）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインはＤＭＤ遺伝子、例えば、ＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異、ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異、ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ１＋３６８４６Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ２＋５５９１Ｔ＞Ａ変異、またはＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子内にある。ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ１＋３６８４６Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ２＋５５９１Ｔ＞Ａ変異、およびＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異はそれぞれ、潜在性３’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、一方、ＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異およびＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異はそれぞれ、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こす。これらの変異のそれぞれは筋ジストロフィーに関連している。
ＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴ（配列番号４４）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＣＡ（配列番号４５）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＴＧＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴ（配列番号４６）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＡＴ（配列番号４７）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＧＴＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号４８）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧ（配列番号４９）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴ（配列番号５０）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴ（配列番号５１）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣ（配列番号５２）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ２＋５５９１Ｔ＞Ａ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＡＴＡＧＧＴＴＧＡＡ（配列番号５３）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧ（配列番号５４）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号５５）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣ（配列番号５６）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異を有するＤＭＤ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣ（配列番号５７）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＤＭＤのエクソン５０における変異を有するＤＭＤ遺伝子においてエクソン５１のエクソンスキッピングを引き起こすために編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＣＴ（配列番号５８）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＤＭＤのエクソン５０における変異を有するＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のエクソンスキッピングを引き起こすための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴ（配列番号５９）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＤＭＤのエクソン５０における変異を有するＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のエクソンスキッピングを引き起こすための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴ（配列番号６０）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＤＭＤのエクソン５０における変異を有するＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のエクソンスキッピングを引き起こすための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧ（配列番号６１）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＤＭＤのエクソン５０における変異を有するＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のエクソンスキッピングを引き起こすための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴ（配列番号６２）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＨＢＢ遺伝子、例えば、ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異、ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ２＋７４５Ｃ＞Ｇ変異を有するＨＢＢ遺伝子内にある。これらの変異のそれぞれは、５’潜在性スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、βサラセミアに関連している。
ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＣ（配列番号６３）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＣ（配列番号６４）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＡ（配列番号６５）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡ（配列番号６６）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＧＴ（配列番号６７）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧＧＴＴ（配列番号６８）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ（配列番号６９）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＧＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡ（配列番号７０）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ２＋７４５Ｃ＞Ｇ変異を有するＨＢＢ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＧＧＴ（配列番号７１）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＦＧＢ遺伝子、例えば、ＩＶＳ６＋１３Ｃ＞Ｔ変異を有するＦＧＢ遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、無フィブリノゲン血症に関連している。ＩＶＳ６＋１３Ｃ＞Ｔ変異を有するＦＧＢ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＴＡＣＣＴ（配列番号７２）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ６＋１３Ｃ＞Ｔ変異を有するＦＧＢ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＡ（配列番号７３）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＳＯＤ１遺伝子、例えば、ＩＶＳ４＋７９２Ｃ＞Ｇ変異を有するＳＯＤ１遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、筋萎縮性側索硬化症に関連している。ＩＶＳ４＋７９２Ｃ＞Ｇ変異を有するＳＯＤ１遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＣＴＡＡＣＣＴＴＡＧＴ（配列番号７４）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＱＤＰＲ遺伝子、例えば、ＩＶＳ３＋２５５２Ａ＞Ｇ変異を有するＱＤＰＲ遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症に関連している。ＩＶＳ３＋２５５２Ａ＞Ｇ変異を有するＱＤＰＲ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡ（配列番号７５）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＧＬＡ遺伝子、例えば、ＩＶＳ４＋９１９Ｇ＞Ａ変異を有するＧＬＡ遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、ファブリー病に関連している。ＩＶＳ４＋９１９Ｇ＞Ａ変異を有するＧＬＡ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＣＡＴＧＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＴＡ（配列番号７６）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＬＤＬＲ遺伝子、例えば、ＩＶＳ１２＋１１Ｃ＞Ｇ変異を有するＬＤＬＲ遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、家族性高コレステロール血症に関連している。ＩＶＳ１２＋１１Ｃ＞Ｇ変異を有するＬＤＬＲ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＧＧＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号７７）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＢＲＩＰ１遺伝子、例えば、ＩＶＳ１１＋２７６７Ａ＞Ｔ変異を有するＢＲＩＰ１遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、ファンコニー貧血に関連している。ＩＶＳ１１＋２７６７Ａ＞Ｔ変異を有するＢＲＩＰ１遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＡＣＣＴＴＴＧＡＡ（配列番号７８）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、Ｆ９遺伝子、例えば、ＩＶＳ５＋１３Ａ＞Ｇ変異を有するＦ９遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、血友病Ｂに関連している。ＩＶＳ５＋１３Ａ＞Ｇ変異を有するＦ９遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣ（配列番号７９）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ５＋１３Ａ＞Ｇ変異を有するＦ９遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡ（配列番号８０）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＣＥＰ２９０遺伝子、例えば、ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を有するＣＥＰ２９０遺伝子内にある。この変異は、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、レーバー先天性黒内障に関連している。ＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を有するＣＥＰ２９０遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴ（配列番号８１）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、例えば、ＩＶＳ２３＋１３５Ｇ＞Ａ変異を有するＣＯＬ２Ａ１遺伝子内にある。この変異は、潜在性３’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、スティックラー症候群に関連している。ＩＶＳ２３＋１３５Ｇ＞Ａ変異を有するＣＯＬ２Ａ１遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号８２）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子、例えば、ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異、ＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異、またはｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子内にある。ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異は、潜在性３’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、アッシャー症候群ＩＩ型に関連している。ＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異は、アッシャー症候群に関連し、潜在性５’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こす。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異は、アッシャー症候群ＩＩ型に関連したディープイントロン変異であり、潜在性５’スプライス部位および潜在性３’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こす。
ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＡ（配列番号８３）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣ（配列番号８４）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号８５）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡ（配列番号８６）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＣ（配列番号８７）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号８８）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号８９）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号９０）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＣＣＡＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＡ（配列番号９１）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号９２）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡ（配列番号９３）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。この段落における同定された配列は、潜在性５’スプライス部位に近接したＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するために用いることができる。
ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＧＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧ（配列番号９４）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴ（配列番号９５）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号９６）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＡＣＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号９７）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。この段落における同定された配列は、潜在性３’スプライス部位に近接したＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するために用いることができる。
他の実施形態において、標的ドメインは、ＧＡＡ遺伝子、例えば、ＩＶＳ１－１３Ｔ＞Ｇ変異またはＩＶＳ６－２２Ｔ＞Ｇ変異を有するＧＡＡ遺伝子内にある。これらの変異のどちらも、潜在性３’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こし、糖原病ＩＩ型に関連している。
ＩＶＳ１－１３Ｔ＞Ｇ変異を有するＧＡＡ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣ（配列番号９８）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ１－１３Ｔ＞Ｇ変異を有するＧＡＡ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＴＧＣ（配列番号９９）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ１－１３Ｔ＞Ｇ変異を有するＧＡＡ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣ（配列番号１００）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
ＩＶＳ６－２２Ｔ＞Ｇ変異を有するＧＡＡ遺伝子を編集するための例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、配列ＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧ（配列番号１０１）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ６－２２Ｔ＞Ｇ変異を有するＧＡＡ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ＡＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡ（配列番号１０２）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。ＩＶＳ６－２２Ｔ＞Ｇ変異を有するＧＡＡ遺伝子を編集するための別の例示的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＴＴＧＧＣ（配列番号１０３）を含み、またはそれからなる標的ドメインに対応するターゲティング配列を有し得る。
６．４． Ｃａｓ１２ａタンパク質
Ｃａｓ１２ａタンパク質は、いくつかの細菌種、例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）、バチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）、ラクノスピラセア・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）（例えば、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＮＣＢＩ参照配列 ＷＰ＿０５１６６６１２８．１）、アシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６（例えば、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＮＣＢＩ参照配列 ＷＰ＿０２１７３６７２２．１）、アクロバクター・ブツレリ（Arcobacter butzleri）Ｌ３４８（例えば、ＡｂＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＪＡＩＱ０１００００３９．１）、アガトバクター・レクタリスストライン（Agathobacter rectalisstrain）２７８９ＳＴＤＹ５８３４８８４（例えば、ＡｒＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＣＺＡＪ０１０００００１．１）、バクテロイデス・オラルタクソン（Bacteroidetes oraltaxon）２７４ ｓｔｒ． Ｆ００５８（例えば、ＢｏＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＮＺ＿ＧＧ７７４８９０．１）、ブチリビブリオ種（Butyrivibrio sp.）ＮＣ３００５（例えば、ＢｓＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＮＺ＿ＡＵＫＣ０１００００１３．１）、カンジダテ・ディビジョン（Candidate division）ＷＳ６バクテリウム（bacterium）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３７＿６ ＵＳ５２＿Ｃ０００７（例えば、Ｃ６Ｃａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＬＢＴＨ０１０００００７．１）、ヘルココッカス・クンツィイ（Helcococcus kunzii）ＡＴＣＣ ５１３６６（例えば、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＪＨ６０１０８８．１／ＡＧＥＩ０１００００２２．１）、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Lachnospira pectinoschiza）株２７８９ＳＴＤＹ５８３４８３６（例えば、ＬｐＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＣＺＡＫ０１０００００４．）、オリバクテリウム種（Oribacterium sp.）ＮＫ２Ｂ４２（例えば、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＮＺ＿ＫＥ３８４１９０．１）、シュードブチリビブリオ・ルミニス（Pseudobutyrivibrio ruminis）ＣＦ１ｂ（例えば、ＰｒＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＮＺ＿ＫＥ３８４１２１．１）、プロテオカテラ・スフェニスシ（Proteocatella sphenisci）ＤＳＭ ２３１３１（例えば、ＰｓＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＮＺ＿ＫＥ３８４０２８．１）、シュードブチリビブリオ・キシラニボランスストライン（Pseudobutyrivibrio xylanivoransstrain）ＤＳＭ １０３１７（例えば、ＰｘＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＦＭＷＫ０１０００００２．１）、スネタチア・アムニーストライン（Sneathia amniistrain）ＳＮ３５（例えば、ＳａＣａｓ１２ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＣＰ０１１２８０．１）、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）、およびレプトトリキア・シャーイイ（Leptotrichia shahii）から単離されている。本開示のシステム、粒子、および方法に用いられるＣａｓ１２ａタンパク質は、例えば、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質、例えば、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、または本明細書に記載された別の野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質であり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａタンパク質はＡｓＣａｓ１２ａである。他の実施形態において、Ｃａｓ１２ａタンパク質はＬｂＣａｓ１２ａである。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによる遺伝子編集の成功は、少なくとも一部、最も少ないオフターゲット効果、例えば非ターゲティングＤＮＡの編集を有する、Ｃａｓタンパク質の標的配列に対する特異性に依存する。Ｃａｓ１２ａタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１２ａタンパク質の、標的ＤＮＡかまたは非標的ＤＮＡのいずれかのＤＮＡバックボーンとの接触を方向づけることに関与するアミノ酸残基における１つまたは複数の変異の導入により、野生型タンパク質と比較して特異性の増加を示すように操作することができる。Ｃａｓ１２ａタンパク質のＤＮＡに対する結合親和性を低下させることは、Ｃａｓ１２ａタンパク質の、非標的ＤＮＡ配列に対して識別する能力を増加させることによりＣａｓ１２ａタンパク質忠実度を向上させることができる。一部の実施形態において、本開示のシステム、粒子、および方法に用いられるＣａｓ１２ａタンパク質は、例えば、操作型Ｃａｓ１２ａタンパク質、例えば、その野生型タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を有する操作型ＬｂＣａｓ１２ａまたは操作型ＡｓＣａｓ１２ａであり得る。
例示的な操作型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質は、米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号明細書に記載されており、その米国特許出願公開の内容は、全体が参照により本明細書に組み入れられている。操作型ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質には、米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号明細書の配列番号１（ＮＣＢＩ参照配列 ＷＰ＿０５１６６６１２８．１に対応する）または配列番号１０のアミノ酸配列であって、任意で、変異、例えば、米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号明細書の配列番号１０の配列における１つまたは複数の位置、例えば、位置Ｓ１８６、例えば位置Ｎ２５６、例えば位置Ｎ２６０、例えば位置Ｋ２７２、例えば位置Ｋ３４９、例えば位置Ｋ５１４、例えば位置Ｋ５９１、例えば位置Ｋ８９７、例えば位置Ｑ９４４、例えば位置Ｋ９４５、例えば位置Ｋ９４８、例えば位置Ｋ９８４、もしくは位置Ｓ９８５、もしくはそれらの組合せ、または米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号明細書の配列番号１におけるそれらと類似した位置、例えば、米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号明細書の配列番号１の位置Ｓ２０２、例えば位置Ｎ２７４、例えば位置Ｎ２７８、例えば位置Ｋ２９０、例えば位置Ｋ３６７、例えば位置Ｋ５３２、例えば位置Ｋ６０９、例えば位置Ｋ９１５、例えば位置Ｑ９６２、例えば位置Ｋ９６３、例えば位置Ｋ９６６、例えば位置Ｋ１００２、もしくは位置Ｓ１００３、もしくはそれらの任意の組合せにおける天然アミノ酸の異なるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、またはセリンでの置き換えを含む、アミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、操作型ＬｂＣａｓ１２ａは変異Ｇ５３２Ｒ／Ｋ５９５ＲおよびＧ５３２Ｒ／Ｋ５３８Ｖ／Ｙ５４２Ｒを含む。
例示的な操作型ＡｓＣａｓ１２ａタンパク質は米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号に記載されており、その米国特許出願公開の内容は、全体が参照により本明細書に組み入れられている。操作型ＡｓＣａｓ１２ａタンパク質には、米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号明細書の配列番号２（ＮＣＢＩ参照配列 ＷＰ＿０２１７３６７２２．１に対応する）または配列番号８のアミノ酸配列であって、任意で、変異、例えば、米国特許出願公開第２０１８／００３０４２５号明細書の配列番号２の配列における１つまたは複数の位置、例えば、配列番号２の位置Ｎ１７８、例えば位置Ｓ１８６、例えば位置Ｎ２７８、例えば位置Ｎ２８２、例えば位置Ｒ３０１、例えば位置Ｔ３１５、例えば位置Ｓ３７６、例えば位置Ｎ５１５、例えば位置Ｋ５２３、例えば位置Ｋ５２４、例えば位置Ｋ６０３、例えば位置Ｋ９６５、例えば位置Ｑ１０１３、例えば位置Ｑ１０１４、もしくは例えば位置Ｋ１０５４、またはそれらの組合せにおける天然アミノ酸の異なる天然アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、またはセリンでの置き換えを含む、アミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。
追加の操作型ＬｂＣａｓ１２ａおよびＡｓＣａｓ１２ａタンパク質は、米国特許出願公開第２０１９／００１０４８１号明細書に記載されており、その米国特許出願公開の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられている。そのような操作型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、例えば、野生型ＬｂＣａｓ１２ａまたは野生型ＡｓＣａｓ１２ａのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。操作型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、米国特許出願公開第２０１９／００１０４８１号明細書に記載された変異の１つまたは複数を含み得る。
操作型Ｃａｓ１２ａタンパク質は、米国特許出願公開第２０１９／００１０４８１号明細書に記載されているように、例えば、異種性機能性ドメイン、例えば、転写活性化ドメイン、転写サイレンサーもしくは転写抑制ドメイン、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素、ヒストンサブユニットを修飾する酵素、シトシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼ、アデノシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼ、内因性ＤＮＡ修復もしくは塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を阻害もしくは増強する酵素、ドメイン、もしくはペプチド、または生物学的テザーを含む、融合タンパク質であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによる遺伝子編集の成功はまた、少なくとも一部、Ｃａｓタンパク質のそれのＰＡＭ配列に対する特異性に依存する。野生型ＬｂＣａｓ１２ａおよびＡｓＣａｓ１２ａタンパク質は、ＰＡＭ配列ＴＴＴＶ（ここで、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）を認識する。Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ（ＲＲ Ｃａｓ１２ａ）およびＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒ（ＲＶＲ Ｃａｓ１２ａ）変異を有する操作型ＡｓＣａｓ１２ａタンパク質は、Gao et.al, 2017, Nat Biotechnol., 35(8):789-792に記載されており、野生型Ｃａｓ１２ａと比較して、変化したＰＡＭ特異性を有する。表１は、様々なＣａｓ１２ａタンパク質により認識されるＰＡＭ配列を示す。Feng, et. al, 2019, Genome Biology, 20:15もまた参照。
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６．５． 核酸および宿主細胞
本開示は、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードする核酸は、例えば、プラスミドまたはウイルスゲノム（例えば、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするように改変されたレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスゲノム）であり得る。プラスミドは、例えば、ウイルス粒子、例えばレンチウイルス粒子を産生するためのプラスミド、または細菌細胞（例えば、大腸菌（E. coli））もしくは真核細胞（例えば、酵母）においてＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡコード配列を増殖するためのプラスミドであり得る。
一部の実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はさらに、Ｃａｓ１２ａタンパク質、例えばセクション６．４に記載されたＣａｓ１２ａタンパク質をコードすることができる。本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードするために用いることができる例示的なプラスミドは、ＡｓＣａｓ１２ａをコードする、ｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ８４７３９）である。Ｃａｓ１２ａタンパク質をコードするプラスミドが、異なるＣａｓ１２ａタンパク質、例えばセクション６．４に記載されているようなＣａｓ１２ａバリアント、またはラクノスピラセア・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）もしくはフランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）などの異なる種由来のＣａｓ１２ａタンパク質をコードするように改変され得ることを当業者は理解しているだろう。
Ｃａｓ１２ａタンパク質をコードする核酸は、コドン最適化することができ、例えば、少なくとも１つのまれなコドンまたはあまり見られないコドンが、宿主細胞においてよく見られるコドンによって置き換えられている。例えば、コドン最適化された核酸は、例えば哺乳動物発現系における発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を指示することができる。
本開示の核酸、例えばプラスミドは、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの転写終結シグナル）などの１つまたは複数の制御エレメントを含み得る。そのような制御エレメントは、例えば、Goeddel, 1990, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.に記載されている。制御エレメントには、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を命令するもの、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば、組織特異的制御配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主に、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）などの関心対象となる所望の組織における、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）における発現を命令し得る。制御エレメントはまた、細胞周期依存的または発生段階依存的様式などの時間依存的様式で発現を命令し得、それはまた、組織または細胞型特異的である場合もあるし、ない場合もある。一部の実施形態において、本開示の核酸は、例えばＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を別々に発現するために、１つもしくは複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つもしくは複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つもしくは複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例には、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意で、ＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意で、ＣＭＶエンハンサーと共に）（例えば、Boshart et al, Cell, 1985, 41:521-530参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。例示的なエンハンサーエレメントには、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ－グロビンのエクソン２と３の間のイントロン配列が挙げられる。発現ベクターのデザインが宿主細胞の選択、望まれる発現のレベルなどの因子に依存し得ることは、当業者により理解されているだろう。
本開示はまた、本開示の核酸を含む宿主細胞を提供する。
そのような宿主細胞は、例えば、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよび任意でＣａｓ１２ａタンパク質をコードするウイルス粒子を産生するために用いることができる。宿主細胞はまた、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよび任意でＣａｓ１２ａタンパク質を含有するベシクルを作製するために（例えば、Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質ではなく、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むベシクルを作製するためにMontagna et al., 2018, Molecular Therapy: Nucleic Acids, 12:453-462に記載された方法を適応させることにより）用いることができる。例示的な宿主細胞には、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞が挙げられる。例示的な哺乳動物宿主細胞には、ＢＨＫ－２１、ＢＳＲＴ７／５、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｃａｃｏ－２、Ｂ－５０または任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞株などのヒト細胞株が挙げられる。宿主細胞は、操作型宿主細胞、例えば、ウイルスまたはベシクル産生を制御するためにリプレッサー（例えば、ＴｅｔＲ）などのＤＮＡ結合タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であり得る（Petris et al., 2017, Nature Communications, 8:15334参照）。
宿主細胞はまた、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡコード配列を増殖するために用いることができる。宿主細胞は真核生物または原核生物であり得、それには、例えば、酵母（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、細菌（例えば、大腸菌（E. coli）またはバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis））、昆虫Ｓｆ９細胞（例えば、バキュロウイルス感染ＳＦ９細胞）、または哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト２９３細胞、およびサルＣＯＳ－７細胞）が挙げられる。
６．６． Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡを含有するシステム、粒子、および細胞
本開示はさらに、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムを提供する。システムは、本明細書に記載されているようなＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡがＣａｓ１２ａタンパク質と複合体形成しているリボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）を含み得る。Ｃａｓ１２ａタンパク質は、例えば、セクション６．４に記載されたＣａｓ１２ａタンパク質であり得る。本開示のシステムはさらに、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質と複合体形成したゲノムＤＮＡを含み得る。したがって、本開示は、ターゲティング配列を含む本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ、対応する標的ドメインおよびＣａｓ１２ａ ＰＡＭを含むゲノムＤＮＡ、ならびにＰＡＭを認識するＣａｓ１２ａタンパク質を含み、全てがお互いと複合体形成している、システムを提供する。
本開示のシステムは、細胞内（その細胞がインビボにあろうが、エクスビボにあろうが、インビトロにあろうがに関わらず）、または細胞外に存在し得る。
本開示はさらに、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを含む粒子を提供する。粒子はさらに、Ｃａｓ１２ａタンパク質、例えば、セクション６．４に記載されたＣａｓ１２ａタンパク質を含み得る。例示的な粒子には、リポソーム、ベシクル、および金ナノ粒子が挙げられる。一部の実施形態において、粒子は一種類のｇＲＮＡのみを含有する。
本開示はさらに、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを含む細胞および細胞集団（例えば、１０個以上、５０個以上、１００個以上、１，０００個以上、または１億個以上の細胞を含む集団）を提供する。そのような細胞および集団はＣａｓ１２ａタンパク質をさらに含み得る。一部の実施形態において、そのような細胞および集団は単離され、例えば、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡを含有しない細胞から単離される。
本開示の細胞集団は、本開示のシステムによる遺伝子編集が起こった細胞、または本開示のシステムの構成要素が発現しているが、遺伝子編集は起こっていない細胞、またはそれらの組合せであり得る。細胞集団は、例えば、細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％が本開示のシステムによる遺伝子編集を受けている集団を含み得る。
Ｃａｓ１２ａタンパク質を含む本開示のシステム、粒子、細胞、および細胞集団において、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡのターゲティング配列が対応する標的ドメインに隣接したＰＡＭを認識する能力があるＣａｓ１２ａタンパク質であるべきである。例えば、標的ドメインに隣接したＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、例えば、野生型ＡｓＣａｓ１２ａまたは野生型ＬｂＣａｓ１２ａであり得る。別の例として、ＰＡＭ配列がＴＹＣＶ、ＣＣＣＣ、またはＡＣＣＣである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲである。さらに別の例として、ＰＡＭ配列がＴＡＴＶまたはＲＡＴＲである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質はＡｓＣａｓ１２ａ ＲＶＲであり得る。
６．７． 細胞を変化させる方法
本開示はさらに、細胞を変化させる方法であって、細胞を本開示のシステムまたは粒子と接触させることを含む方法を提供する。
細胞を、本開示のシステムもしくは粒子またはコード核酸とインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることができる。
細胞を本開示のシステムまたは粒子と接触させることは、ゲノムＤＮＡによりコードされたスプライス部位の活性が低下するように細胞のゲノムＤＮＡの編集を生じ得る。スプライス部位の活性を低下させることは、例えばスプライス部位が潜在性スプライス部位である場合、細胞において異常なスプライシングを低下させ、かつ正常なスプライシングを回復させることができ、または例えばスプライス部位がカノニカルスプライス部位である場合、エクソンスキッピングを促進することができる。
本明細書で用いられる場合、用語「接触させること」は、本開示のシステムの１つもしくは複数の構成要素（またはシステムがインサイチューで構築されるように細胞において発現するコード核酸）を細胞へ導入することにより、例えば、１つもしくは複数のコードプラスミドを細胞へ導入することにより、細胞を本開示の構築されたシステムもしくは粒子と直接的に接触させることか、または細胞を、細胞から取り込まれ得る１つもしくは複数のウイルス粒子と接触させることのいずれか、またはそれらの組合せを指す。システムの構成要素が核酸として導入される場合、好ましくは、その核酸が、細胞において発現し、かつ本開示のシステムへ構築されるのを可能にする調節エレメントが含まれる。
したがって、細胞を本開示のシステムと接触させることは、例えば、システムを細胞へ物理的送達方法、ベクター送達方法（例えば、プラスミドまたはウイルス）、または非ウイルス送達方法により導入することを含み得る。例示的な物理的送達方法には、マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードするプラスミドを細胞へ注入し、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ、およびＣａｓ１２ａタンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞へ注入し、またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むＲＮＰを細胞へ注入することによる）、エレクトロポレーション（例えば、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードするプラスミドを細胞へ導入するための、またはＣａｓ１２ａタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを細胞へ導入するための）、および水力学的送達（例えば、高圧注入を用いて、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードするプラスミドを細胞へ導入し、またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むＲＮＰを細胞へ導入すること）が挙げられる。例示的なウイルス送達方法には、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードするウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルス）と細胞を接触させることが挙げられる。例示的な非ウイルス送達方法は、システムを含有する粒子、例えば、セクション６．６に記載されているような粒子と細胞を接触させることを含む。Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を関心対象となる細胞または組織へ送達するための様々な方法は、米国特許第９，７９０，４９０号明細書に記載されており、その米国特許の内容は、全体が参照により本明細書に組み入れられている。インビトロ、エクスビボ、およびインビボで細胞へＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを送達するためのいくつかのインビトロ、エクスビボ、およびインビボの技術を概説する、Lino et al., 2018, Drug Delivery, 25(1):1234-1257も参照。そのような技術は、本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を送達するために適応することができる（例えば、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の代わりに本開示のＣａｓ１２ａシステムを用いることにより）。
細胞は、遺伝子疾患を有する対象からもたらされ得（例えば、幹細胞）、または遺伝子疾患を有する対象から導かれ得る（例えば、対象の細胞から導かれた誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞）。
例えば、細胞は、ＣＦＴＲ遺伝子における変異、例えば、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異、３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異、ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＤＭＤ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異、ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異、ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ２＋５５９１Ｔ＞Ａ変異、もしくはＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異、またはエクソン５０における変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＨＢＢ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異、ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ２＋７４５Ｃ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＦＧＢ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ６＋１３Ｃ＞Ｔ変異、ＩＶＳ４＋７９２Ｃ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ３＋２５５２Ａ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＧＬＡ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ４＋９１９Ｇ＞Ａ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＬＤＬＲ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ１２＋１１Ｃ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＢＲＩＰ１遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ１１＋２７６７Ａ＞Ｔ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、Ｆ９遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ５＋１３Ａ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＣＥＰ２９０遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ２３＋１３５Ｇ＞Ａ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異、ＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異、またはｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
別の例として、細胞は、ＧＡＡ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ１－１３Ｔ＞Ｇ変異またはＩＶＳ６－２２Ｔ＞Ｇ変異を有するヒト細胞であり得る。前述の変異を修正するのに有用なシステムへの組み入れのための例示的なｇＲＮＡは、セクション６．３．４に記載されている。
細胞の本開示のシステムまたは粒子との接触は、インビトロ、エクスビボで実施され得、またはインビボで実施され得る（例えば、遺伝子疾患を有し、そのような疾患についての処置を必要としている対象を処置するために）。インビトロまたはエクスビボで実施される場合、本開示の方法は、例えば遺伝子疾患についての処置を必要としている対象を処置するために、その接触した細胞を対象に導入するステップをさらに含み得る。
システムは、任意の適切な送達媒体によって送達することができる。送達媒体の例には、ウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス）および粒子（ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノカプセル、ベシクル、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲル、およびミセル）が挙げられる。
例示的なウイルス送達媒体には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルスについての製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶについての製剤、用量）、および米国特許第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドについての製剤、用量）からの、ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ、およびアデノウイルスを含む臨床試験および臨床試験に関する刊行物からの製剤ならびに用量を用いる、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型またはＩＩ型、パルボウイルス、細網内皮症ウイルス、および他のウイルスのベクター型を挙げることができる。ウイルスは、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで細胞に感染し、形質導入することができる。
ウイルス送達媒体はまた、エクスビボおよびインビトロでの送達方法に用いることができ、形質導入された細胞は、治療を必要としている対象に投与することができる。エクスビボおよびインビトロ適用について、形質導入される細胞は、治療を必要としている対象から得られた幹細胞、または作製された幹細胞（例えば、対象の線維芽細胞から作製された誘導多能性幹細胞）であり得る。
あるいは、送達媒体は粒子であり得る。本開示の範囲内の粒子送達システムは、任意の形で提供され得、その形には、固体粒子、半固体粒子、エマルジョン粒子、またはコロイド粒子が挙げられるが、それらに限定されない。適切な場合、本明細書において粒子またはナノ粒子になされる言及は、交換可能であり得ることは理解されているだろう。Ｃａｓ１２ａタンパク質ｍＲＮＡおよびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、粒子または脂質エンベロープを用いて同時に送達され得る；例として、例えば複合体としての、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質は、Ｄａｈｌｍａｎら、国際公開第２０１５０８９４１９号パンフレットおよびそれに引用された文書におけるような粒子によって送達することができる。
Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の送達は、リポソームを用いて実施することができる。リポソームは、内側の水性コンパートメントおよび相対的に不透過性の外側の親油性リン脂質二分子膜を囲む、単層または多層の脂質二分子膜で構成される球状ベシクル構造である。リポソームは、それらが生体適合性で、無毒性であり、親水性と親油性の両方の薬物分子を送達し、それらのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、かつそれらのカーゴを生体膜および血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送することができるという理由から、薬物送達担体としてかなりの注目を集めている。リポソームは、いくつかの異なる型の脂質から作製することができる；しかしながら、リン脂質が、薬物担体としてのリポソームを作製するのに最もよく用いられる。リポソーム形成は、脂質フィルムが水溶液と混合された時、自発的であるが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、または押し出し装置を用いることにより振盪という形で力を加えることによって促進することができる（例えば、概説としてSpuch and Navarro, 2011, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, doi:10.1155/2011/469679参照）。
対象への投与について、システム、送達媒体、および形質導入細胞は、静脈内に、非経口的に、腹腔内に、皮下に、筋肉注射により、経皮的に、鼻腔内に、粘膜に、必要としている対象の細胞、組織、もしくは器官への、直接的注射、定位注射により、ミニポンプ注入システムにより、対流、カテーテル、または他の送達方法により、投与することができる。そのような送達は、単回投与かまたは複数回投与のいずれかであり得る。
そのような用量はさらに、例えば、担体（水、食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝食塩水）、薬学的に許容される賦形剤、および／または当技術分野において知られた他の化合物を含有し得る。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、参照により本明細書に組み入れられているREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)において入手できる。
投与の頻度は、患者または対象の年齢、性別、全体的な健康、他の状態、および対処することになっている特定の疾患、状態、または症状を含む通常の因子に依存して、医学的または獣医学的実践者（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。
本開示の方法に用いられる特定の細胞型および送達方法は、例えば、編集されるべき特定の遺伝子に基づいて、選択することができる。例えば、ＤＭＤは、進行性筋変性および筋力低下により特徴づけられ、かつジストロフィンタンパク質を不活性化するスプライシング欠陥により引き起こされる遺伝性障害である。骨格筋における高レベルの発現を達成し得る、筋肉クレアチンキナーゼおよびデスミンプロモーターの調節下でのジストロフィン遺伝子におけるスプライシング欠陥を修正するのに適した本開示のｇＲＮＡ（例えば、配列が実施例７に例示されているｇＲＮＡ）をコードするようにゲノムが操作されている組換えＡＡＶ（例えば、Naso et al., 2017, BioDrugs. 31(4): 317-334参照）が、ＤＭＤを患っている対象へ筋肉内に送達され得る。嚢胞性線維症を患っている対象を処置するための本開示のｇＲＮＡ分子を用いることについての例証的実施形態は下記である。
６．７．１． 嚢胞性線維症を有する対象を処置する例示的な方法
嚢胞性線維症は、上皮細胞を冒し、一部の実施形態においては、本方法において接触させられることになっている細胞は、ＣＦＴＲ変異を有する対象由来の上皮細胞、例えば、肺上皮細胞、例えば、気管支上皮細胞または肺胞上皮細胞であり得る。接触は、エクスビボで実施することができ、接触した細胞を、接触ステップ後に対象の身体へ戻すことができる。他の実施形態において、接触ステップは、インビボで実施することができる。
嚢胞性線維症を有する対象由来の細胞は、例えば、表皮、呼吸樹、肝胆樹、胃腸管、生殖器官、または他の器官から採取することができる。ある実施形態において、細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞へ再プログラムされる。ある実施形態において、ｉＰＳ細胞は、気道上皮、肺上皮、粘膜下腺、粘膜下管、胆管上皮、胃腸上皮、膵管細胞、生殖器系上皮、精巣上体細胞、および／または肝胆樹の細胞、例えばクララ細胞、例えば線毛細胞、例えば杯細胞、例えば基底細胞、例えば腺房細胞、例えば気管支肺胞上皮幹細胞、例えば肺上皮細胞、例えば鼻上皮細胞、例えば気管上皮細胞、例えば気管支上皮細胞、例えば腸管内分泌細胞、例えばブルンネル腺細胞、例えば精巣上体上皮へ分化する。ある実施形態において、細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子は、本明細書に記載された方法を用いて修正される。ある実施形態において、細胞は、対象における適切な部位、例えば、気道、肺樹、胆管系、胃腸管、膵臓、肝胆樹、および／または生殖器官へ再導入される。
一部の実施形態において、自己幹細胞が、エクスビボで処理され、気道上皮、肺上皮、粘膜下腺、粘膜下管、胆管上皮、胃腸上皮、膵管細胞、生殖器系上皮、精巣上体細胞、および／または肝胆樹の細胞、例えばクララ細胞、例えば線毛細胞、例えば杯細胞、例えば基底細胞、例えば腺房細胞、例えば気管支肺胞上皮幹細胞、例えば肺上皮細胞、例えば鼻上皮細胞、例えば気管上皮細胞、例えば気管支上皮細胞、例えば腸管内分泌細胞、例えばブルンネル腺細胞、例えば精巣上体上皮へ分化し、対象へ移植され得る。他の実施形態において、異種性幹細胞が、エクスビボで処理され、気道上皮、肺上皮、粘膜下腺、粘膜下管、胆管上皮、胃腸上皮、膵管細胞、生殖器系上皮、精巣上体細胞、および／または肝胆樹の細胞、例えばクララ細胞、例えば線毛細胞、例えば杯細胞、例えば基底細胞、例えば腺房細胞、例えば気管支肺胞上皮幹細胞、例えば肺上皮細胞、例えば鼻上皮細胞、例えば気管上皮細胞、例えば気管支上皮細胞、例えば腸管内分泌細胞、例えばブルンネル腺細胞、例えば精巣上体上皮へ分化し、対象へ移植され得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載された方法は、例えば噴霧器を用いる、吸入による、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）の嚢胞性線維症を有する対象への送達を含む。他の実施形態において、本明細書に記載された方法は、静脈内投与による、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）の送達を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載された方法は、肺組織への実質内注射による、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）の送達を含む。他の実施形態において、本明細書に記載された方法は、気管、気管支樹、および／または肺胞への実質内、肺胞内、気管支内、気管内注射による、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）の送達を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載された方法は、以下の部位のいずれかへの静脈内、実質内、または他の直接的な注射または投与による、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）の送達を含む：門脈循環、肝臓実質、膵臓、膵管、胆管、空腸、回腸、十二指腸、胃、腸上部、腸下部、胃腸管、精巣上体、または生殖器官。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）は、例えば、吸収を助けるための促進剤を含むまたは含まない、噴霧器を用いて、または鼻腔用スプレーもしくは吸入器を用いて、ＡＡＶにより、例えば嚢胞性線維症を有する対象へ、送達される。一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）は、センダイウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、または他の改変型もしくは非改変型ウイルス送達粒子により、例えば対象へ、送達される。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）は、噴霧器もしくはジェット噴霧器、鼻腔用スプレー、または吸入により、例えば対象へ、送達される。一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）は、例えば吸収を助けるための促進剤を含むまたは含まない噴霧器による送達のために、エアロゾル化カチオン性リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、非脂質ポリマー複合体、または乾燥粉末に製剤化される。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質（またはＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸）は、リポソームＧＬ６７Ａにより、例えば嚢胞性線維症を有する対象へ、送達される。ＧＬ６７Ａは、例えば、ｗｗｗ．ｃｆｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｃｌｉｎｉｃａｌ／ａｒｔｉｃｌｅ／ＧＬ６７Ａ＿ｐＧＭ１６９＿＿Ｏｕｒ＿ｆｉｒｓｔ＿ｃｌｉｎｉｃａｌ＿ｔｒｉａｌ＿ｐｒｏｄｕｃｔ；Eastman et al., 1997, Hum Gene Ther. 8(6):765-73に記載されている。
６．８． 実施例
[実施例１]
６．８．１． 細胞におけるＣＦＴＲ３２７２－２６Ａ＞Ｇスプライシング変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ修正
ＣＦＴＲ３２４２－２６Ａ＞Ｇ変異は、ＣＴＦＲ遺伝子のエクソン２０内の２５ヌクレオチドの異常な包含を引き起こす新しいアクセプタースプライス部位を生成する点変異である。生じたｍＲＮＡは、中途終止コドンおよび結果としての、切り詰め型非機能性ＣＦＴＲタンパク質の発現を生じる、ＣＦＴＲにおけるフレームシフトを含有する。スプライシング変異を修正するための様々なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡと組み合わせたＡｓＣａｓ１２ａを用いるゲノム編集ストラテジーを調べた。
６．８．１．１． 材料および方法
６．８．１．１．１． オリゴヌクレオチド：ガイドＲＮＡ
３２７２－２６Ａ＞Ｇスプライシング変異を有するＣＦＴＲ遺伝子をターゲットするＡｓＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを、ミスマッチなしで、表２に示された標的ドメインに対応するプロトスペーサードメインを有するようにデザインした。各ｇＲＮＡを、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）からなるループドメインを有するようにデザインした。ｇＲＮＡは、それらのプロトスペーサードメインに従って、例えばｃｒＲＮＡ＋１１と、この実施例で呼ばれる。
Figure 2022520783000004
６．８．１．１．２． 他のオリゴヌクレオチド
ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、クローニング、部位特異的変異誘発、およびシーケンシングのためのオリゴヌクレオチドをデザインし、かつ調製した。これらのオリゴヌクレオチドは表３に列挙されている。
Figure 2022520783000005
６．８．１．１．３． ＣＦＴＲ３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異についてのＷＴおよびミニ遺伝子プラスミドの調製
ミニ遺伝子プラスミドモデルを、エクソン１９、２０、およびイントロン１９を包含する領域に対応するＣＦＴＲ遺伝子のスプライシングパターンを模倣するように作製した。プラスミドｐＭＧ３２７２－２６ＷＴは、野生型アレルを含有した；プラスミドｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇは変異型アレルを含有した（図７参照）。
ＣＦＴＲ３２７２－２６座位を表す野生型ミニ遺伝子を、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））へクローニングした。プライマー１ｆ、２ｆ、および３ｒを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム由来のエクソン１９、２０、およびイントロン１９の野生型配列のＣＦＴＲ ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡを、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））へクローニングして、エクソン１９、２０、およびイントロン１９の野生型アレルを含有するプラスミドプラスミドｐＭＧ３２７２－２６ＷＴを作製した。プライマー４ｍｆおよび５ｍｒを用いて、ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴに存在する野生型ミニ遺伝子の部位特異的変異誘発を実行して、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異を生じさせ、プラスミドｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇを生成した。
以前に記載されているように（Shalem, O., et al., 2014, Science, 343:84-87）、ガイドＲＮＡをコードする配列を、市販のプラスミドｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ８４７３９）へ、ＢｓｍＢＩ制限部位を用いてクローニングした。そのレンチウイルスに基づいたプラスミドは、ＲＮＡ誘導性Ｃａｓ１２ａタンパク質とｇＲＮＡの、単一ウイルス粒子における標的細胞への同時送達を可能にする（図２２Ａおよび図２２Ｂ参照）。
６．８．１．１．４． 細胞株
ヒト結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ－２）、ヒト胎児由来腎臓細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、およびＨＥＫ２９３細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
６．８．１．１．５． トランスフェクション
Ｃａｃｏ－２、ＨＥＫ２９３Ｔ、およびｐＭＧ３２７２－２６ＷＴ（細胞株ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴ）または３２７２－２６Ａ＞Ｇ（細胞株ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を調製した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０Ｕ／ｍｌ抗生物質（ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。
細胞を、２４ウェルプレートに１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体形成した、Ｂｇｌ－ＩＩにより直線化されたミニ遺伝子プラスミドｐＭＧ３２７２－２６ＷＴまたはｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇの１００ｎｇ、およびＡｓＣａｓ１２ａタンパク質配列とｇＲＮＡ配列の両方をコードするプラスミドｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａの７００ｎｇをトランスフェクトした。１６時間のインキュベーション後、細胞培地を交換した。トランスフェクトされたＣａｃｏ－２細胞を１０μｇ／ｍｌピューロマイシンに曝露することにより選択を実行し、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３細胞を、２μｇ／ｍｌピューロマイシンへの曝露により選択した。トランスフェクションからおよそ４８時間後に加えられた５００μｇ／ｍｌのＧ４１８の添加によりプラスミド組込みを選択した。単一細胞クローンを単離し、ミニ遺伝子構築物の発現について特徴づけた。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションから３日後、収集した。
６．８．１．１．６． レンチウイルスベクター産生
レンチウイルス粒子は、１０ｃｍプレート中８０％コンフルエンシーでＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生された。１０μｇのトランスファーベクターｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａプラスミド、３．５μｇのＶＳＶ－Ｇ、および６．５μｇのΔ８．９１パッケージングプラスミドを、細胞へＰＥＩを用いてトランスフェクトした。一晩のインキュベーション後、培地を完全ＤＭＥＭと交換した。ウイルス粒子を含有する上清を、４８時間後、収集し、０．４５μｍ ＰＥＳフィルターに通して濾過した。レンチウイルス粒子を、２０％スクロースクッションでの４℃、１５００００ｘｇ、２時間の超遠心分離により濃縮および精製した。レンチウイルス粒子のペレットを、ＯｐｔｉＭＥＭ中に再懸濁し、アリコートを－８０℃で保存した。ベクター力価を、ＳＧ－ＰＥＲＴ方法を用いて逆転写酵素単位（ＲＴＵ）として測定した（Casini, A., et al., 2015, J. Virol. 89:2966-2971参照）。
６．８．１．１．７． 形質導入
形質導入研究について、ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴ、ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ、およびＣａｃｏ－２細胞を、１２ウェルプレート中、３×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。一晩のインキュベーション後、細胞に３ ＲＴＵのレンチウイルスベクターを形質導入した。４８時間後、細胞を、ピューロマイシン（ＨＥＫ２９３について２μｇ／ｍｌまたはＣａｃｏ－２細胞について１０μｇ／ｍｌ）で選択し、形質導入から１０日後、収集した。
６．８．１．１．８． 転写産物分析
それぞれ、変化しているかまたは正しいかのいずれかの、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における変異型または野生型ミニ遺伝子により生じたスプライシングパターンを、ＲＴ－ＰＣＲおよびシーケンシング分析により評価した（Beck, S., et al., 1999, Hum. Mutat., 14:133-144参照）。
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を用いて、収集された細胞からＲＮＡを抽出し、ＤＥＰＣ－ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、製造会社のプロトコールに従って、５００ｎｇのＲＮＡからｃＤＮＡを得た。標的領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるＰＣＲにより増幅した。
６．８．１．１．９． ヌクレアーゼ誘導性ゲノム変異の検出
ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて抽出し、標的座位を、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるＰＣＲにより増幅した。単一ｇＲＮＡの切断から生じる任意のインデルを評価するために、精製ＰＣＲ産物をシーケンシングし、ＴＩＤＥ（表３プライマー７ｆおよび８ｒ；Brinkman, E.K., et al., 2014, Nucleic Acids Res., 42: 1-8参照）またはＳＹＮＴＨＥＧＯ ＩＣＥソフトウェア（Hsiau, T., et al., 2018, bioRxiv, Jan. 20, 1-14参照）を用いて、分析した。いくつかの研究において、ＤＮＡ編集をまた、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、および以前に記載されているように（Petris, G., et al., 2017, Nat. Commun. 8:1-9参照）、測定した。
６．８．１．１．１０． ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ
およそ２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１μｇのｌｅｎｔｉ Ｃａｓ１２ａプラスミドｐＹ１０８および最初のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑプロトコール（Tsai, S. Q., et al., 2015, Nat. Biotechnol., 33:187-198参照）に従ってデザインされた１０ｐｍｏｌのｄｓＯＤＮをトランスフェクトした。トランスフェクションから１日後、細胞を剥離し、２μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択した。トランスフェクションから４日後、細胞を収集し、ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造会社の使用説明書に従い、ゲノムＤＮＡを抽出した。単離されたゲノムＤＮＡを超音波処理し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ超音波処理デバイス（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いて５００ｂｐの平均長さへ剪断した。ライブラリー調製、シーケンシング、および分析を、当業者に知られた方法を用いて実行した（例えば、Montagna, C., et al., 2018, Mol. Ther. Nucleic Acids, 12:453-462；Casini, A., et al., 2018, Nat. Biotechnol., 36:265-271参照）。
６．８．１．１．１１． 標的ディープシーケンシング
ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１または対照（ＣＴＲ）での形質導入から１４日後、トランスフェクトされた細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから、関心対象となる座位（３２７２－２６Ａ＞Ｇ／４２１８ｉｎｓＴ）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ならびにプライマー７ｆおよび８ｒを用いて増幅した。アンプリコンに、Ｎｅｘｔｅｒａ ｉｎｄｅｘｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いるＰＣＲによりインデックスを付与し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量化し、ほぼ等モル濃度でプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ試薬キットＶ３－１５０サイクル（１５０ｂｐシングルリード）を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑシステムでシーケンシングした。シーケンシング生データ（ＦＡＳＴＱファイル）を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏオンラインツール（Pinello, L., et al., 2016, Nat. Biotechnol., 34:695-697参照；ウィンドウサイズ＝３、最小平均リードクオリティ（ｐｈｒｅｄ３３スケール）＝３０、最小シングルｂｐクオリティ（ｐｈｒｅｄ３３スケール）＝１０）を用いて分析した。
６．８．１．２． 結果
ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇのスプライシングパターンを、デザインされたｇＲＮＡとの同時トランスフェクション後、評価した。様々なｇＲＮＡと組み合わせたＡｓＣａｓ１２ａによる編集後、正しくスプライシングされた産物のレベルの増加が生じた（図２１Ｂ）。ｇＲＮＡペアにより誘導された欠失の分析により、ＡｓＣａｓ１２ａによる欠失は生じなかったことが示された（図２１Ｄ）。
より生理学的なクロマチンコンテキスト内において、選択されたｇＲＮＡとのＡｓＣａｓ１２ａの活性をさらに確証するために、ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子を安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／３２７２－２６Ａ＞Ｇ）におけるＣＦＴＲイントロン１９のスプライシング修正を試験した。ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１は、ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ導入遺伝子から多数の正しい転写産物の形成（＞６０％）（図９Ａ～Ｂおよび図２１Ｇ）および効率的なＤＮＡ編集（およそ７０％；図９Ｃ）を生じた。
ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１での編集後の組込みミニ遺伝子のＴＩＤＥ分析により、欠失の不均一なプールが明らかにされた（図１１Ａ～Ｃ）。その引き出されたスプライシング産物を分析するために、編集されたバリアントをｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子へクローニングした。編集された部位の配列分析により、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異の持続と共に、クロマトグラムデコンボリューション（図１１Ａ～Ｃ）においても観察することができた高頻度の１８ヌクレオチド欠失が示された（図９Ｄ）。特に、スプライシング分析により、頻度の高い１８ヌクレオチド欠失（９／３４クローン）が正しいスプライシングを完全に回復したことが明らかにされた（図９Ｄおよび図１１Ｄ）。残りの編集された部位の大部分は、低頻度（１／３４クローン）で起こり、正しいスプライシングを生じた；少数例において、追加の転写産物が観察された（図１１Ｄ）。要約すれば、（ｃｒＲＮＡ＋１１プロトスペーサードメインを有する）単一ｇＲＮＡと組み合わせたＡｓＣａｓ１２ａは、ミニ遺伝子モデルにおいて３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異の上流に小さい欠失を生成し、ＣＦスプライシング欠陥の効率的な回復を生じた。分析された編集事象の７０％近くが、細胞における正常なスプライシングの効果的な回復に寄与した。
ＣＦ患者の大多数は、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異について複合ヘテロ接合性である。したがって、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１の潜在的なオフターゲット効果、例えば、野生型アレル内の潜在的な改変を評価することは重要であった。ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１の切断性質を、ｐＭＧ３２７２－２６ＷＴかまたはｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇのいずれかを発現する安定発現株（それぞれ、ＨＥＫ２９３／３２７２－２６ＷＴ細胞およびＨＥＫ２９３／３２７２－２６Ａ＞Ｇ細胞）において分析した。図１０Ａに示されているように、ｃｒＲＮＡ＋１１の切断効率は、ＨＥＫ２９３／３２７２－２６Ａ＞Ｇにおいて検出された８０％近くからＨＥＫ２９３／３２７２－２６ＷＴにおける７．５％未満へ下落した。したがって、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１のオンターゲット効果、すなわち、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異への効果は、野生型またはオフターゲットのアレルと比較して少なくとも１０倍の示差的な切断を示した。ＣＦＴＲ３２７２－２６ＷＴ配列をターゲットするｃｒＲＮＡ＋１１／ｗｔを用いる相補的な研究において、ＡｓＣａｓ１２ａは、ＨＥＫ２９３／３２７２－２６ＷＴ細胞における高い切断効率（およそ９０％）およびＨＥＫ２９３／３２７２－２６Ａ＞Ｇ細胞における低いインデル形成（１５％未満）を示した（図１０Ａ）。総合すれば、これらの研究は、ｃｒＲＮＡ＋１１プロトスペーサードメインを有する選択されたｇＲＮＡと共のＡｓＣａｓ１２ａによる高いアレル識別を実証している。
レンチウイルスベクターにより野生型イントロンへ送達されるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１の特異性を、野生型ＣＦＴＲ遺伝子を内因性に発現するＣａｃｏ－２上皮細胞においてさらに確認した。非特異的切断を非常に好むことが実証されている長期ヌクレアーゼ発現（形質導入から１０日後）（Petris, G., et al., 2017, Nat. Commun. 8:1-9）は、ＴＩＤＥバックグラウンドレベルより上のいかなる非特異的ＣＦＴＲ編集も生じなかった（約１％；Brinkman, E. K., et al., 2014, Nucleic Acids Res. 42:1-8参照）；一方、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１／ｗｔは、ＣＦＴＲ遺伝子を効率的に編集した（８０％より高い；図１０Ｂ）。
潜在性野生型イントロン切断後のスプライシング変化を排除するために、スプライシングパターンをＨＥＫ２９３／３２７２－２６ＷＴ細胞およびＣａｃｏ－２細胞において評価した。ｃｒＲＮＡ＋１１／ｗｔまたはｃｒＲＮＡ＋１１のいずれと組み合わせてもＡｓＣａｓ１２ａ処理後、大きな変化は観察されなかった（図１２Ａ～Ｂ）。
ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１編集の特異性をまた、ゲノムワイド調査、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによりオフターゲット切断に関して試験した（Nissim-Rafinia, M. et al., 2000, Hum. Mol. Genet. 9:1771-1778、Kashima, T. et al., 2007, Hum. Mol. Genet. 16, 3149-3159）。ＨＥＫ２９３／３２７２－２６Ａ＞Ｇ細胞におけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１ゲノム編集のオフターゲットプロファイリング（Tsai, S. Q., et al., 2015, Nat. Biotechnol. 33:187-198; Kleinstiver, B. P., et al., 2016, Nat. Biotechnol. 34:869-874）は、３２７２－２６Ａ＞Ｇ ＣＦＴＲ座位の独占的編集により実証されているように、非常に高い特異性を示し、一方、第２のアレルまたは任意の他のゲノム座位における非特異的切断は検出することができなかった（図１０Ｃ）。
[実施例２]
６．８．２． オルガノイドにおける３２７２－２６Ａ＞Ｇスプライシング変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ修正
ヒトオルガノイドは、翻訳研究のための生理学的に近いモデルを表す（Fatehullah, A., et al., 2016, Nat. Cell Biol., 18:246-254）。ＣＦ患者由来の腸管オルガノイドは、ＣＦＴＲ活性および機能回復を評価するための価値のあるツールである（Dekkers, J. F., et al., 2013, Nat. Med., 19:939-945；Dekkers, J. F., et al., 2016, Sci. Transl. Med. 8:344ra84；Sato, T., et al., 2011, Gastroenterology, 141:1762-1772）。
３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異について複合ヘテロ接合性のヒト腸管オルガノイド（３２７２－２６Ａ＞Ｇ／４２１８ｉｎｓＴ）において、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１によるＣＦ表現型のレスキュー能力について調べた。
６．８．２．１． 材料および方法
６．８．２．１．１． ヒト腸管オルガノイド培養および形質導入
３２７２－２６Ａ＞Ｇスプライシング変異について複合ヘテロ接合性であると決定されたヒト嚢胞性線維症対象のヒト腸管オルガノイド（３２７２－２６Ａ＞Ｇ／４２１８ｉｎｓＴ；ｎ＝１、ＣＦ－８６）を培養した（Dekkers, J. F., et al., 2013, Nat. Med., 19:939-945参照）。
培養オルガノイドを、トリプシン０．２５％ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて単一細胞へ分離した。およそ３～４×１０４個の単一細胞を２５μｌのレンチウイルスベクター（０．２５～１ＲＴＵ）と共に再懸濁し、３７℃で１０分間、インキュベートした（Vidovic, D., et al., 2016, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 193:288-298参照）。等体積のマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を細胞とベクターの溶液に加え、その混合物を９６ウェルプレートにプレーティングした。３７℃で７分間のマトリゲル液滴の重合後、細胞を、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤（Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｙ０５０３）を含有する１００μｌの完全オルガノイド培地（Dekkers, J. F., et al., 2013, Nat. Med., 19:939-945）で３日間、覆って、単一の幹細胞の最適な成長を保証した（Sato, T., et al., 2011, Gastroenterology, 141:1762-1772参照）。培地を、オルガノイド分析の日まで２～３日ごとに交換した。
６．８．２．１．２． 腸管オルガノイドにおけるフォルスコリン誘発性膨潤（ＦＩＳ）アッセイおよびＣＦＴＲ活性の分析
ウイルスベクター形質導入から１４日後、オルガノイドを、０．５μＭ ｃａｌｃｅｉｎ－ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３－１００ＭＰ）と３０分間、インキュベートし、５×対物レンズを用いる生細胞共焦点顕微鏡法により分析した（ＬＳＭ８００、Ｚｅｉｓｓ；Ｚｅｎ Ｂｌｕｅソフトウェア、バージョン２．３）。オルガノイドの定常状態面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてＡｎａｌｙｓｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅアルゴリズムにより、各オルガノイドの絶対面積（ｘｙ面、μｍ２）を計算することにより決定した。１５００μｍ未満の面積を有するオルガノイド粒子は、欠陥があるとみなされ、分析から排除された。データは、異なる実行ごとに平均化され、平均値±ＳＤを表すボックスプロットでプロットされた。
ＦＩＳアッセイを、５μＭのフォルスコリンでのオルガノイドの刺激により実施した。フォルスコリンのオルガノイドへの効果を、生細胞共焦点蛍光顕微鏡法により１画像を１０分ごとに取得して、３７℃で６０分間、分析した。各時点における各オルガノイドの面積（ｘｙ面）を、上記のようにＩｍａｇｅＪを用いて計算した。統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６における通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により実施した。オルガノイドのサイズの差は、Ｐ＜０．０５において統計的に異なるとみなされた。
６．８．２．２． 結果
ｃｒＲＮＡ対照および未処理オルガノイドにおけるＣＦＴＲイントロン１９のスプライシングパターンは、２つの転写産物バリアントを示した（図１３Ａ）；バリアントのサイズおよび存在量の差は、オルガノイドにおける３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異についてのヘテロ接合性および以前のデータ（Beck, S., et al., 1999, Hum. Mutat. 14:133-144）と一致している。ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１のレンチウイルス送達は、３２７２－２６Ａ＞Ｇアレルにより生じた変化型スプライシング産物（＋２５ｎｔ）のほとんど完全な消失を示し、異常なイントロン１９スプライシングの効率的な修正を示した（図１３Ａおよび図１４Ａ～Ｂ）。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイにより評価されたＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１により誘導されたインデルの数は、観察されたスプライシングの回復（図１３Ａ）と一致した、ＣＦＴＲ座位のおよそ３０％編集を示した（図１３Ｂ）。
ディープシーケンシング分析により、ＣＦＴＲ座位における４０．２５％インデル（３２７２－２６Ａ＞Ｇアレル内の３９．７７％および他のアレル内の０．４８％、図１３Ｃ）が明らかにされ、したがって、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイで観察されたＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１の高い効率が確認された（図１３Ｂ）。さらなる配列分析により、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異を含むシーケンシングリードの８４．９％が可変長の欠失を含有し、一方、野生型アレル（３２７２－２６ＷＴ）に対応するシーケンシングリードは、０．９％インデルのみを含有し、したがって、９４倍のアレル識別を示した（図１３Ｄ）。
以前の報告（van Overbeek, M., et al., 2016, Mol. Cell, 63, 63:633-646）と一致して、かつ観察された編集の不均一性にも関わらず、患者のオルガノイドにおける修復事象は、ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇモデルにおいて観察されたものとほぼ類似し、１８ヌクレオチド欠失が、観察された最も頻度の高い修復であった（図１３Ｃを図９Ｄと比較）。特に、この１８ヌクレオチド欠失、加えて、他の報告されたインデル（全ＤＮＡ修復事象の０．５％より上の頻度を有する；（図１３Ｃ））の大部分は、ｐＭＧ３２７２－２６モデルにおいてクローニングされた時、スプライシング修正を生じた（図９Ｄ）。
腸管オルガノイドにおける管腔形成（膨潤）は、ＣＦＴＲアニオンチャネルの活性に依存し（Dekkers, J. F., et al., 2013, Nat. Med. 19, 939-945；図１３Ｅに図式化されている）、したがって、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１ゲノム編集後にＣＦＴＲ機能の回復を測定するために用いることができる。ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１処理から１４日後、患者のオルガノイドは、対照および未処理の試料の管腔と比較して２．５倍の管腔面積の増加を示し、ＣＦＴＲ３２７２－２６Ａ＞Ｇアレルの修復後のチャネル機能の回復を示した（図１３Ｆ～Ｇ）。興味深いことには、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１での処理とＷＴ ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの形質導入との間のオルガノイドサイズの有意差はなく（図１３Ｇ）、遺伝子型を編集し、かつ３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異の表現型を逆転させるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１システムの顕著な効率をさらに実証した。
ＣＦＴＲ活性を評価するために用いられる別のアッセイは、フォルスコリン誘発性膨潤（ＦＩＳ）アッセイである（Dekkers, J. F., et al., 2013, Nat. Med., 19, 939-945；図１３Ｆ～Ｈ）。オルガノイド膨潤アッセイ研究（図１３Ｇ）と一致して、ＦＩＳアッセイは、ＷＴ ＣＦＴＲ ｃＤＮＡのレンチウイルス送達で得られた結果と類似して、ＡｓＣａｓ１２ａ編集されたオルガノイド面積の２．８倍の増加を明らかにした（図１３Ｈおよび図１４Ｃ）。
ＣＦＴＲオルガノイドにおける３２７２－２６Ａ＞Ｇ欠陥のＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１改変は、イントロン１９スプライシング欠陥の効率的な修復を生じ、内因性ＣＦＴＲタンパク質の完全な回復をもたらした。
[実施例３]
６．８．３． 細胞におけるＣＦＴＲ３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔスプライシング変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ修正
ＣＦＴＲ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異は、ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン２２の内部に新規のドナースプライス部位を生成し、８４ヌクレオチドの新しい潜在性エクソンの挿入をもたらし、それは、インフレーム停止コドン、および結果として、切り詰め型非機能性ＣＦＴＲタンパク質の産生を生じる。そのスプライシング変異を修正するために様々なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡと組み合わせたＡｓＣａｓ１２ａを用いるゲノム編集ストラテジーを調べた。
６．８．３．１． 材料および方法
６．８．３．１．１． オリゴヌクレオチド：ガイドＲＮＡ
３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔスプライシング変異を有するＣＴＦＲ遺伝子をターゲットするＡｓＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを、表４に示された標的ドメインにミスマッチなしで対応するプロトスペーサードメインを有するようにデザインした。野生型配列をターゲットするＡｓＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡもまたデザインした。各ｇＲＮＡは、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）からなるループドメインを有するようにデザインされた。ｇＲＮＡは、この実施例において、それらのプロトスペーサードメインに従って、例えば、ｃｒＲＮＡ＋１４と呼ばれる。
Figure 2022520783000006
６．８．３．１．２． 他のオリゴヌクレオチド
ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、クローニング、部位特異的変異誘発、およびシーケンシングのためのオリゴヌクレオチドをデザインおよび調製した。これらのオリゴヌクレオチドは表５に列挙されている。
Figure 2022520783000007
Figure 2022520783000008
６．８．３．１．３． ＣＦＴＲ３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔ変異についてのＷＴおよびミニ遺伝子プラスミドの調製
ミニ遺伝子プラスミドモデルを、エクソン２２、２３、およびイントロン２２の一部を包含する領域に対応するＣＦＴＲ遺伝子のスプライシングパターンを模倣するように作製した。プラスミドｐＭＧ３８４９＋１０ＫｂＷＴは野生型アレルを含有した；プラスミドｐＭＧ３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔは変異型アレルを含有した（図１５）。
ＣＦＴＲ３８４９＋１０ｋｂ座位を表す野生型ミニ遺伝子を、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。プライマー９ｆ、１０ｆ、１１ｆ、１２ｒ、１３ｒ、および１４ｒを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム由来のエクソン２２、２３、およびイントロン２２の一部の野生型配列のＣＦＴＲ ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡを、プラスミドｐｃＤＮＡ３へクローニングして、エクソン２２、２３、およびイントロン２２の一部の野生型アレルを含有するプラスミドｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴを作製した。プライマー１５ｍｆおよび１６ｍｒを用いて、ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴに存在する野生型ミニ遺伝子の部位特異的変異誘発を実行して、３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔ変異を生じさせ、プラスミドｐＭＧ３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔを生成した。
上記のように、ＢｓｍＢＩ制限部位を用いて、ガイドＲＮＡをコードする配列（表４）を、ｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ８４７３９）を作製する市販のプラスミドへクローニングした（図２２Ｃおよび図２２Ｄ参照）。
６．８．３．１．４． 細胞株
ヒト結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ－２）、ヒト胎児由来腎臓細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、およびＨＥＫ２９３細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
６．８．３．１．５． トランスフェクション
実施例１に記載されているように、Ｃａｃｏ－２、ＨＥＫ２９３Ｔ、およびｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴ（細胞株ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴ）または３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ（細胞株ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を調製し、培養した。
細胞を、２４ウェルプレートに１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体形成した、Ｂｇｌ－ＩＩにより直線化されたミニ遺伝子プラスミドｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴまたはｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔの１００ｎｇ、およびＣａｓヌクレアーゼ配列とｇＲＮＡ配列の両方をコードするプラスミドｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａの７００ｎｇをトランスフェクトした。細胞培養、トランスフェクション、およびプラスミド組込みについての選択を、実施例１に記載されているように実行した。単一細胞クローンを単離し、ミニ遺伝子構築物の発現について特徴づけた。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションから３日後、収集した。
６．８．３．１．６． レンチウイルスベクター産生
レンチウイルス粒子は、実施例１に記載されているように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生された。
６．８．３．１．７． 形質導入
形質導入研究について、実施例１に記載されているように、ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴ、ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ、およびＣａｃｏ－２細胞を、１２ウェルプレート中、３×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、形質導入した。
６．８．３．１．８． 転写産物分析
それぞれ、変化しているかまたは正しいかのいずれかの、変異型または野生型ミニ遺伝子により生じたスプライシングパターンを、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＲＴ－ＰＣＲおよびシーケンシング分析により評価した（Beck, S., et al., 1999, Hum. Mutat., 14:133-144参照）。前に記載されているように、ＲＮＡを抽出し、標的領域をＲＴ－ＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチドは表５に列挙されている。
６．８．３．１．９． ヌクレアーゼ誘導性ゲノム変異の検出
実施例１に記載されているように、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的座位をＰＣＲにより増幅した。精製ＰＣＲ産物をシーケンシングし、ＴＩＤＥ（表４プライマー１８ｆおよび１９ｒ；Brinkman, E.K., et al., 2014, Nucleic Acids Res., 42: 1-8参照）またはＳＹＮＴＨＥＧＯ ＩＣＥソフトウェア（Hsiau, T., et al., 2018, bioRxiv, Jan. 20, 1-14参照）を用いて、分析した。いくつかの研究において、ＤＮＡ編集をまた、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、および以前に記載されているように（Petris, G., et al., 2017, Nat. Commun. 8:1-9参照）、測定した。
６．８．３．１．１０． ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ
およそ２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１μｇのｌｅｎｔｉ Ｃａｓ１２ａプラスミドｐＹ１０８および最初のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑプロトコール（Tsai, S. Q., et al., 2015, Nat. Biotechnol., 33:187-198参照）に従ってデザインされた１０ｐｍｏｌのｄｓＯＤＮをトランスフェクトした。細胞培養、ゲノムＤＮＡ抽出および剪断、ライブラリー構築、シーケンシング、ならびに分析を、当業者に知られた方法を用いて実行した（実施例１；また、Montagna, C., et al., 2018, Mol. Ther. Nucleic Acids, 12:453-462；Casini, A., et al., 2018, Nat. Biotechnol., 36:265-271も参照）。
６．８．３．１．１１． 標的ディープシーケンシング
ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４または対照（ＣＴＲ）での形質導入から１４日後、ヒト腸管オルガノイドから抽出されたゲノムＤＮＡから、関心対象となる座位（３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ／Ｆ５０８）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ならびにプライマー１８ｆおよび１９ｒを用いて増幅した。実施例１に記載されているように、アンプリコンに、ＰＣＲによりインデックスを付与し、定量化し、プールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑシステムにおいてシーケンシングし、シーケンシング生データ（ＦＡＳＴＱファイル）を分析した。
６．８．３．２． 結果
エクソン２２、イントロン２２の一部、およびエクソン２３を含有するミニ遺伝子モデル（ｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＷＴおよびｐＭＧ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ；図１５参照）は、ＣＦＴＲスプライシング欠陥の模倣に成功した（図１６Ａ～Ｂ）。ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４での編集は、ミニ遺伝子モデルにおける３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔスプライシング障害を修正した（図１７Ａ）。Ｃａｃｏ－２細胞におけるＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４のレンチウイルス形質導入は、ｗｔ ＣＦＴＲ遺伝子において、ほぼバックグラウンドレベル（３．５％）でインデルを生じた。対照的に、同じ領域における野生型配列をターゲットするＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４／ｗｔは、ほぼ７０％のＣＦＴＲ編集を生じた。これらのデータは、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４の変異体アレルへの特異性を実証している（図１７Ｂ）。
ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４特異性をさらに検証するために、およびゲノムワイドのオフターゲット活性を調べるために、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した。その研究により、ＣＦＴＲ座位または任意の他のオフターゲット部位における配列リードの完全な欠如が明らかにされた；自発性ＤＮＡ切断に対応する全６３１個のシーケンシングリードは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑアッセイの適切な遂行を示していた（図１７Ｃ）。
[実施例４]
６．８．４． オルガノイドにおけるＣＦＴＲ３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔスプライシング変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ修正
３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異について複合ヘテロ接合性のヒト腸管オルガノイド（３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ／ΔＦ５０８）において、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１によるＣＦ表現型のレスキュー能力について調べた。
６．８．４．１． 材料および方法
６．８．４．１．１． ヒト腸管オルガノイド培養および形質導入
３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔ変異について複合ヘテロ接合性であると決定されたヒト嚢胞性線維症対象のヒト腸管オルガノイド（３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ／Ｆ５０８；ｎ＝１、ＣＦ－１１０）を培養した（Dekkers, J. F., et al., 2013, Nat. Med., 19:939-945参照）。培養されたオルガノイドを、前の実施例２に記載されているように、処理および形質導入した。
６．８．４．１．２． 腸管オルガノイドにおけるフォルスコリン誘発性膨潤（ＦＩＳ）アッセイおよびＣＦＴＲ活性の分析
ウイルスベクター形質導入から１４日後、オルガノイドを、０．５μＭ ｃａｌｃｅｉｎ－ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３－１００ＭＰ）と３０分間、インキュベートし、５×対物レンズを用いる生細胞共焦点顕微鏡法により分析した（ＬＳＭ８００、Ｚｅｉｓｓ；Ｚｅｎ Ｂｌｕｅソフトウェア、バージョン２．３）。オルガノイドの定常状態面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてＡｎａｌｙｓｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅアルゴリズムにより、各オルガノイドの絶対面積（ｘｙ面、μｍ２）を計算することにより決定した。３０００μｍ未満の面積を有するオルガノイド粒子は、欠陥があるとみなされ、分析から排除された。データは、異なる実行ごとに平均化され、平均値±ＳＤを表すボックスプロットでプロットされた。上記のように、ＦＩＳアッセイはオルガノイドの刺激により実施され、分析は生細胞共焦点蛍光顕微鏡法により実行され、統計解析が実施された。
６．８．４．２． 結果
ＣＦＴＲ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔスプライシング欠陥の効率的かつ正確な修正が、患者オルガノイドにおいて、単一アレル特異的ｃｒＲＮＡと組み合わされたＡｓＣａｓ１２ａを用いることにより得られた。ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１４のレンチウイルス送達はＣＦＴＲ座位において３１％インデルを生じ（図１８Ａおよび図１９）、その結果、野生型ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ遺伝子添加後に観察されたレスキューに匹敵するオルガノイド膨潤のレスキューを生じた（図１８Ｂ～Ｃ）。
[実施例５]
６．８．５． 細胞におけるＣＦＴＲ３２７２－２６Ａ＞Ｇスプライシング変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ編集の比較
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、遺伝子編集のための一般的に好まれる伝統的なシステムであり、ＣＦＴＲ３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異を編集する、複数のｓｇＲＮＡを利用するＳｐＣａｓ９システムの能力を、単一のｇＲＮＡを利用するＡｓＣａｓ１２ａシステムと比較することは興味深いことであった。
６．８．５．１． 材料および方法
３２７２－２６Ａ＞Ｇスプライシング変異を有するＣＦＴＲ遺伝子をターゲットするＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡをデザインした。標的ドメインは表６に示されている。
Figure 2022520783000009
ｓｇＲＮＡをコードする配列を、ＳｐＣａｓ９を発現するｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ４９５３５）へＢｓｍＢＩ制限部位を用いてクローニングした。レンチウイルス粒子産生、形質導入、およびＣＦＴＲ遺伝子編集分析を、実施例１のように実施した。
６．８．５．２． 結果
ｐＭＧ ３２７２－２６Ａ＞Ｇのスプライシングパターンを、ＳｐＣａｓ９と組み合わせてデザインされたｓｇＲＮＡとのそれの同時トランスフェクション後に評価した（図２１Ａ）。少なくとも４つのｓｇＲＮＡペアと共にＳｐＣａｓ９を用いた正しいスプライシング産物のレベルの増加（図２１Ａ）が観察された。ｓｇＲＮＡペアにより誘導された欠失の分析により、ＡｓＣａｓ１２ａについて観察された結果（図２１Ｄ）とは対照的に、バンドがＳｐＣａｓ９で切断されたことが示された（図２１Ｃ）。
予想外にも、ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇミニ遺伝子を安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／３２７２－２６Ａ＞Ｇ）におけるＣＦＴＲイントロン１９のスプライシング修正が試験された時、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡペアの全部が、スプライシング欠陥を修正することができず、染色体レベルにおける非効率的な切断を示唆した（図２１Ｅ～Ｆ）。対照的に、ＡｓＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ＋１１は、ｐＭＧ３２７２－２６Ａ＞Ｇ導入遺伝子からの多数の正しい転写産物の形成（＞６０％）（図９Ａ～Ｂおよび図２１Ｇ）および効率的なＤＮＡ編集（およそ７０％；図９Ｃ）を生じ、明らかに、ＡｓＣａｓ１２ａのより優れたパフォーマンスを示した。
[実施例６]
６．８．６． 細胞およびオルガノイドにおけるＣＦＴＲ３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔスプライシング変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ編集の比較
細胞およびオルガノイドにおけるＣＦＴＲ３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔ変異を編集する、複数のｓｇＲＮＡを利用するＳｐＣａｓ９システムの能力を、単一のｇＲＮＡを利用するＡｓＣａｓ１２ａシステムと比較した。
６．８．６．１． 材料および方法
３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔスプライシング変異を有するＣＦＴＲ遺伝子をターゲットするＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡをデザインした。標的ドメインは表７に示されている。
Figure 2022520783000010
ｓｇＲＮＡをコードする配列を、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ４９５３５）へクローニングした。レンチウイルス粒子産生、形質導入、細胞に基づいたＣＦＴＲ遺伝子編集研究、およびオルガノイド研究を、実施例３および４のように実施した。
６．８．６．２． 結果
３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異を、２つのｓｇＲＮＡと共のＳｐＣａｓ９により欠失させるより従来的なストラテジーを、ＨＥＫ２９３細胞およびＣａｃｏ－２細胞において実行した（図２０Ａ～Ｄ）。ｓｇＲＮＡの選択ペアは、ＳｐＣａｓ９－ｓｇＲＮＡペアでの切断後、様々なターゲットされた欠失を生じ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において２１％～５６％、およびＣａｃｏ－２細胞において３５％～７０％の範囲の％欠失であった。
患者由来のオルガノイドにおいて、ｓｇＲＮＡ－９５／＋１１９が、効率的なイントロン欠失およびスプライシング修正を得るための最良のｓｇＲＮＡペアであると思われた。それにも関わらず、患者オルガノイドにおいて、ＣＦＴＲ３８４９＋１０ｋｂ座位欠失の最大３３％が、オルガノイドの面積の増加を誘発し、それは、野生型ＣＦＴＲ ｃＤＮＡのレンチウイルス送達後に測定された面積より有意に低い（図２０Ｅ～Ｇ）。加えて、ｓｇＲＮＡプールはＣａｓ９オフターゲット活性を最小にするようにインシリコでデザインされたが（Doench, J. G., et al., 2016, Nat. Biotechnol., 34:184-191）、ｓｇＲＮＡ＋１１９についてのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑアッセイにより、ゲノム全体で１１個の望ましくないオフターゲット部位が明らかにされた（図２０Ｈ）。
対照的に、ＣＦＴＲ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔスプライシング欠陥の修正が、３２７２－２６Ａ＞Ｇバリアントのスプライシング修復（実施例２）と同様に、患者オルガノイドにおいて単一のアレル特異的ｃｒＲＮＡと組み合わされたＡｓＣａｓ１２ａを用いることにより効率的かつ正確に得られた（実施例４）。ＡｓＣａｓ１２ａストラテジーは、複数のｓｇＲＮＡと組み合わせて得られる従来のＳｐＣａｓ９誘導性遺伝子欠失より優れていると判明した。
[実施例７]
６．８．７． ＣＥＰ２９０ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ修正
６．８．７．１． 材料および方法
６．８．７．１．１． ｇＲＮＡデザイン
ＣＥＰ２９０ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）に関連している。ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を有するＣＥＰ２９０遺伝子における標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子を、ターゲティング配列と標的ドメインの相補体との間にミスマッチを伴わないようにデザインする（表８）。Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子における標的ドメインの５’側のループドメインは、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）からなる。
Figure 2022520783000011
標準ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅアセンブリを用いて、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲをコードするように操作されたｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａへクローニングして、ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲおよびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするプラスミドを提供する。ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲおよびスクランブル切り詰め型ｇＲＮＡをコードするｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａプラスミドもまた、対照としての使用のために調製する。
６．８．７．１．２． ミニ遺伝子作製
ＣＥＰ２９０イントロン２５（フォワードＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＧＧＣ）（配列番号１６８）および２７（リバースＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＡＡＧＴＡＣＡＧＧ）（配列番号１６９）に位置するプライマーを用いたＰＣＲを、健康な個体由来のゲノムＤＮＡに実施し、ＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲベクターへＧａｔｅｗａｙシステムを用いてクローニングする。部位特異的変異誘発により、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を、プライマーｍｕｔ ｆｏｒ（ＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴＡＣＣＴＡＴＣＣＣ）（配列番号１７０）およびｍｕｔ ｒｅｖ（ＧＧＧＡＴＡＧＧＴＡＴＧＡＧＡＴＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧ）（配列番号１７１）を用いて導入する。Garanto, et al., 2015, Int J Mol Sci, 16(3):5285-5298に記載されているように、両方のｐＤＯＮＲベクター（変異体および野生型（ＷＴ））をシーケンシングし、デスティネーションベクターｐＣｉ－Ｎｅｏ－Ｒｈｏ－スプライシングベクター（以前に記載されているように（Shafique, S. et al., 2014, PLoS One, 9:e100146）、サイトメガロウィルス最初期プロモーターの調節下のＲＨＯのエクソン３と５の間の目的のＣＥＰ２９０断片のクローニングを可能にする）へクローニングし、ｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＷＴ ＩＶＳ２６＋１６５５ＡまたはｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＬＣＡ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇミニ遺伝子構築物を作製する。
６．８．７．１．３． 細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、およびｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＷＴ ＩＶＳ２６＋１６５５ＡまたはｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＬＣＡ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０Ｕ／ｍｌ抗生物質（ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ ＣＯ２加湿雰囲気下で培養する。
Burnight, et al., 2014, Gene Ther. 21:662-672およびMaeder et al., 2019, Nature Medicine, doi: 10.1038/s41591-018-0327-9に記載されているようなＩＶＳ２６患者線維芽細胞を入手し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸、および１５％ウシ胎仔血清を追加したＧｉｂｃｏ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中で維持する。
６．８．７．１．４． トランスフェクションおよび形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションは、２４ウェルプレート内に播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１５０，０００細胞／ウェル）において実施される。細胞に、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用いて、ミニ遺伝子プラスミドの１００ｎｇならびにＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲおよびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするプラスミドの７００ｎｇをトランスフェクトする。
ミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞および患者線維芽細胞の形質導入
安定なミニ遺伝子細胞株（ＨＥＫ２９３／ＣＥＰ２９０ ＷＴ ＩＶＳ２６＋１６５５ＡおよびＨＥＫ２９３／ＣＥＰ２９０ ＬＣＡ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ）は、ＨＥＫ２９３細胞における直線化ミニ遺伝子プラスミド（ｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＷＴ ＩＶＳ２６＋１６５５ＡまたはｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＬＣＡ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ）のトランスフェクションにより作製される。細胞を、トランスフェクションから４８時間後、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択する。単一細胞クローンを単離し、ミニ遺伝子構築物の発現について特徴づける。
レンチウイルス粒子は、１０ｃｍプレート中８０％コンフルエンシーでＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生される。１０μｇのトランスファーベクター（ｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲ）プラスミド、３．５μｇのＶＳＶ－Ｇ、および６．５μｇのΔ８．９１パッケージングプラスミドを、ＰＥＩを用いてトランスフェクトする。一晩のインキュベーション後、培地を完全ＤＭＥＭと交換する。ウイルス上清を、４８時間後、収集し、０．４５μｍ ＰＥＳフィルターに通して濾過する。レンチウイルス粒子を、２０％スクロースクッションでの４℃、１５０，０００ｘｇ、２時間の超遠心分離により濃縮および精製する。ペレットを、適切な体積のＯｐｔｉＭＥＭ中に再懸濁する。アリコートを－８０℃で保存する。ベクター力価を、ＳＧ－ＰＥＲＴ方法を用いて逆転写酵素単位（ＲＴＵ）として測定する（Casini, A., et al., 2015, J. Virol. 89:2966-2971参照）。形質導入研究について、ミニ遺伝子構築物を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞およびＩＶＳ２６患者線維芽細胞を、１２ウェルプレート内に播種し（３００，０００細胞／ウェル）、播種の次の日、細胞に１～５ＲＴＵのレンチウイルスベクターを形質導入する。およそ４８時間後、細胞を、ピューロマイシン（２～１０μｇ／ｍｌ）で選択し、形質導入から１０～１４日後、収集する。
６．８．７．１．５． ＲＴ－ＰＣＲおよび転写分析
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを抽出し、ＤＥＰＣ－ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁する。５００ｎｇのＲＮＡおよびＲｅｖｅｒｔＡｉｄ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造会社のプロトコールに従って、ｃＤＮＡを得る。標的領域を、ＣＥＰ２９０ミニ遺伝子についてのプライマーｅｘ２６ｆｏｒ（ＴＧＣＴＡＡＧＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣ（配列番号１７２））およびｅｘ２７ｒｅｖ（ＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＡＡＧＧＡＧ（配列番号１７３））を用いるＰｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でのＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ産物を１～２％アガロースゲル上で分離する。正しく、および異常にスプライスされたＣＥＰ２９０を表す断片をゲルから切り取り、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ単離キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）を用いて精製し、シーケンシングする。
６．８．７．２． 結果
ミニ遺伝子転写産物は、トランスフェクションから２～３日後、分析され、ｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＷＴ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａおよびプラスミド、それぞれについて正しい、および異常なスプライシングを示す。１２８ｂｐの潜在性エクソンの大量の包含もまた、スクランブル切り詰め型ｇＲＮＡを有するｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲで処理された対照細胞において観察されるが、この異常なスプライシングは、ＣＥＰ２９０ ｇＲＮＡで処理された、トランスフェクトされた細胞において減少している。これらの結果は、ｐＭＧ ＣＥＰ２９０ ＬＣＡ ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇミニ遺伝子を安定的にトランスフェクトされ、かつＣＥＰ２９０ ｇＲＮＡ／ＡｓＣａｓ１２ａレンチウイルスベクターを形質導入されたＨＥＫ２９３細胞において再現され、遺伝子編集効率に比例したスプライシング修正を示している。ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ転写産物は、ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇの形質導入から１０～１４日後、分析され、一次患者線維芽細胞は、対照に比べて、野生型転写産物が有意に増加し、かつ変異体転写産物が減少していることを示している。
[実施例８]
６．８．８． ＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ修正
６．８．８．１． 材料および方法
６．８．８．１．１． ｇＲＮＡデザイン
ＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異は、潜在性５’スプライス部位および潜在性３’スプライス部位における異常なスプライシングを引き起こすディープイントロン変異である。その変異は、アッシャー症候群ＩＩ型に関連している（Slijkerman et al., 2016, Mol. Ther. Nucleic Acids, 5(10):e381）。表９に示されたＵＳＨ２Ａにおける標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子を、ターゲティング配列と標的ドメインの相補体との間にミスマッチを伴わないようにデザインする。この実施例におけるＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子を潜在性５’スプライス部位（表９に列挙された上位４つの標的ドメイン）または潜在性３’スプライス部位（表９に列挙された下位４つの標的ドメイン）の近くにおいて編集するようにデザインされる。Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子における標的ドメインの５’側のループドメインは、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）からなる。
Figure 2022520783000012
標準ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅアセンブリを用いて、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲ、ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＶＲ、または標的ドメインの上流のＰＡＭ配列を認識する他のＣａｓ１２ａタンパク質をコードするように操作されたｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａプラスミドへクローニングして、Ｃａｓ１２ａタンパク質および単一Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするプラスミドを提供する。Ｃａｓ１２ａタンパク質およびスクランブル切り詰め型ｇＲＮＡをコードするｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａプラスミドもまた、対照としての使用のために調製する。
６．８．８．１．２． ミニ遺伝子作製
以前に記載されているように（Yariz, et al., 2012, Am J Hum Genet, 91:872-882）、ｐＣＩ－ＮＥＯベクターにおけるＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位へクローニングされたエクソン３～５を包含するＲＨＯのゲノム領域を含有するプラスミド（Gamundi, et al., 2008, Hum Mutat 29:869-878）を、Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステムに適応させる。Slijkerman et al., 2016, Mol. Ther. Nucleic Acids, 5(10):e381に記載されているように、Ｇａｔｅｗａｙクローニングテクノロジーを用いて、７２２ｂｐの５’－フランキングイントロン配列および６３６ｂｐの３’－フランキングイントロン配列と共に１５２ｂｐヒトＵＳＨ２Ａ偽エクソン４０（ＰＥ４０、野生型および変異体）を挿入して、ｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０ｗｔおよびｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０Ａ＞Ｇを得る。
６．８．８．１．３． 細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、およびｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０ｗｔまたはｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０Ａ＞Ｇを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０Ｕ／ｍｌ抗生物質（ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ ＣＯ２加湿雰囲気下で培養する。
複合ヘテロ接合性ＵＳＨ２Ａ変異を有するＵＳＨ２患者の一次線維芽細胞を、２０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆ７５２４）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ８６３６）、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ４３３３）を追加したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄ０８１９）中で培養する。
６．８．８．１．４． トランスフェクションおよび形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションは、２４ウェルプレート内に播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１５０，０００細胞／ウェル）において実施される。細胞に、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用いて、ミニ遺伝子プラスミドの１００ｎｇ、ならびにＣａｓ１２ａタンパク質およびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするプラスミドの７００ｎｇをトランスフェクトする。
ミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞および患者線維芽細胞の形質導入
安定なミニ遺伝子細胞株（ＨＥＫ２９３／ｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０ｗｔおよびＨＥＫ２９３／ｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０Ａ＞Ｇ）は、ＨＥＫ２９３細胞における直線化ミニ遺伝子プラスミド（ｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０ｗｔまたはｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０Ａ＞Ｇ）のトランスフェクションにより作製される。細胞を、トランスフェクションから４８時間後、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択する。単一細胞クローンを単離し、ミニ遺伝子構築物の発現について特徴づける。
レンチウイルス粒子は、１０ｃｍプレート中８０％コンフルエンシーでＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生される。１０μｇのトランスファーベクタープラスミド（Ｃａｓ１２ａタンパク質およびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａプラスミド）、３．５μｇのＶＳＶ－Ｇ、および６．５μｇのΔ８．９１パッケージングプラスミドを、ＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトする。一晩のインキュベーション後、培地を完全ＤＭＥＭと交換する。ウイルス上清を、４８時間後、収集し、０．４５μｍ ＰＥＳフィルターに通して濾過する。レンチウイルス粒子を、２０％スクロースクッションでの４℃、１５０，０００ｘｇ、２時間の超遠心分離により濃縮および精製する。ペレットを、適切な体積のＯｐｔｉＭＥＭ中に再懸濁する。アリコートを－８０℃で保存する。ベクター力価を、ＳＧ－ＰＥＲＴ方法により逆転写酵素単位（ＲＴＵ）として測定する（Casini, A., et al., 2015, J. Virol. 89:2966-2971参照）。形質導入研究について、ミニ遺伝子構築物を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞およびＵＳＨ２患者線維芽細胞を、１２ウェルプレート内に播種し（３００，０００細胞／ウェル）、播種の次の日、細胞に１～５ＲＴＵのレンチウイルスベクターを形質導入する。およそ４８時間後、細胞を、ピューロマイシン（２～１０μｇ／ｍｌ）で選択し、形質導入から１０～１４日後、収集する。
６．８．８．１．５． ＲＴ－ＰＣＲおよび転写分析
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を用いて、ＲＮＡを抽出し、ＤＥＰＣ－ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁する。５００ｎｇのＲＮＡおよびＲｅｖｅｒｔＡｉｄ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造会社のプロトコールに従って、ｃＤＮＡを得る。標的領域を、プライマーミニ遺伝子ＵＳＨ２Ａフォワード（ＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴ）（配列番号１８４）およびリバース（ＡＧＧＴＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣ（配列番号１８５））を用いるＰｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でのＰＣＲにより増幅する。線維芽細胞におけるスプライシング修正実験について、ＵＳＨ２Ａ ｃＤＮＡの一部が、標準ＰＣＲ条件下で、Ｑ５ポリメラーゼ、ならびにエクソン３９および４２、それぞれについてデザインされたプライマー５’－ＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＣＴＣＣ－３’（配列番号１８６）および５’－ＧＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１８７）を用いて増幅される。ＰＣＲ産物を１～２％アガロースゲル上で分離する。正しく、および異常にスプライスされたＵＳＨ２Ａを表す断片をゲルから切り取り、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ単離キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）を用いて精製し、シーケンシングする。
６．８．８．２． 結果
ミニ遺伝子転写産物は、トランスフェクションから２～３日後、分析され、ｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０ｗｔプラスミドまたはｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０Ａ＞Ｇプラスミド、それぞれについて、正しい、および異常なスプライシングを示す。１５２ｂｐ ＰＥ４０の潜在性エクソンの大量の包含もまた、Ｃａｓ１２ａタンパク質およびスクランブル切り詰め型ｇＲＮＡで処理された対照細胞において観察されるが、この異常なスプライシングは、ＵＳＨ２Ａ ＰＥ４０ターゲティングｇＲＮＡのうちの少なくともいくつかで処理された細胞において減少している。結果は、ｐＭＧ ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０Ａ＞Ｇミニ遺伝子を安定的にトランスフェクトされ、かつＵＳＨ２Ａ ＰＥ４０ターゲティングｇＲＮＡ／ＡｓＣａｓ１２ａタンパク質レンチウイルスベクターを形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において確認され、遺伝子編集効率に比例したスプライシング修正を示している。ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡ転写産物は、ＵＳＨ２患者線維芽細胞の形質導入から１０～１４日後、分析され、対照に比べて、野生型転写産物が有意に増加し、かつ変異体転写産物が減少していることを示している。
[実施例９]
６．８．９． ＤＭＤのエクソン５１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ媒介性エクソンスキッピング
６．８．９．１． 材料および方法
６．８．９．１．１． ｇＲＮＡデザイン
ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０における変異は、ジストロフィンタンパク質の中途切り詰めを引き起こし得る。エクソン５１のエクソンスキッピングは、そのリーディングフレームを回復させ、かつ機能性ジストロフィンタンパク質の発現を回復させ得る（Amoasii et al., 2017, Science Translational Medicine, 9(418):eaan8081参照）。表１０に示されたＤＭＤにおける標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子を、ターゲティング配列と標的ドメインの相補体との間にミスマッチを伴わないようにデザインする。Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子における標的ドメインの５’側のループドメインは、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）からなる。
Figure 2022520783000013
標準ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅアセンブリを用いて、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＲ、ＡｓＣａｓ１２ａ ＲＶＲ、または標的ドメインの上流のＰＡＭ配列を認識する他のＣａｓ１２ａタンパク質をコードするように操作されたｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａへクローニングして、Ｃａｓ１２ａタンパク質および単一Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするプラスミドを提供する。Ｃａｓ１２ａタンパク質およびスクランブル切り詰め型ｇＲＮＡをコードするｐＹ１０８ ｌｅｎｔｉＡｓＣａｓ１２ａプラスミドもまた、対照としての使用のために調製する。
６．８．９．１．２． ミニ遺伝子作製
プラスミドｐＣＩ（Alanis et al., 2012, Hum. Mol. Genet. 21:2389-2398）は、ＤＭＤ Δｅｘ５０のミニ遺伝子をクローニングするために用いられる。ＤＭＤ遺伝子からエクソン５０を排除し、かつ含まれるエクソン４９、５１、５２に隣接するイントロン４９、５０、および５１の約２００ｂｐを含むミニ遺伝子は、筋肉細胞またはＨＥＫ２９３細胞由来のＤＭＤの標的エクソン４９～５２のＰＣＲ増幅およびクローニングにより得られる。最終ミニ遺伝子アセンブリ（ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅアセンブリに用いられる標準クローニング部位についての配列を排除する）に必要な遺伝子領域のＰＣＲ増幅に有用なプライマーペアは以下である：１）エクソン４９ ｆｏｒ ＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＣ（配列番号１９４）およびイントロン４９ ｒｅｖ ＧＣＣＴＴＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧ（配列番号１９５）；２）イントロン５０ ｆｏｒ ＴＧＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＡＴＴＧＣＴ（配列番号１９６）およびイントロン５１ ｒｅｖ ＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧＣＡ （配列番号１９７）；３）イントロン５１ ｆｏｒ ＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＣＣＴＧＴ（配列番号１９８）およびエクソン５２ ｒｅｖ ＴＴＣＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣＴ（配列番号１９９）。
６．８．９．１．３． 細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０Ｕ／ｍｌ抗生物質（ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ ＣＯ２加湿雰囲気下で培養する。
６．８．９．１．４． トランスフェクション
トランスフェクションは、２４ウェルプレート内に播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１５０，０００細胞／ウェル）において実施される。細胞に、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用いて、ミニ遺伝子プラスミドの１００ｎｇならびにＣａｓ１２ａタンパク質およびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするプラスミドの７００ｎｇをトランスフェクトする。
６．８．９．２． 結果
トランスフェクションから２～３日後に分析されたミニ遺伝子転写産物は、対照細胞において、予想された、エクソン５１を含むスプライシングパターンを示す。イントロン５０－エクソン５１接合部に極めて接近した、またはそれを含む標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するｇＲＮＡをコードするプラスミドをトランスフェクトされた細胞において、エクソン５１包含の減少が観察される。
[実施例１０]
６．８．１０． 様々な遺伝子欠陥の修正
６．８．１０．１． 材料および方法
表１１に示された標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子を、ターゲティング配列と標的ドメインの相補体との間にミスマッチを伴わないようにデザインする。Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子における標的ドメインの５’側のループドメインは、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）からなる。表１１に示された変異は、様々な遺伝子疾患と関連している（セクション６．３．４参照）。
Figure 2022520783000014
Figure 2022520783000015
Figure 2022520783000016
Figure 2022520783000017
Figure 2022520783000018
Figure 2022520783000019
単一Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質をコードするレンチウイルス粒子は、実施例１に記載された方法と類似した方法により産生される。表１１に列挙された遺伝子に対応する野生型および変異体ミニ遺伝子を発現する安定なミニ遺伝子細胞株は、実施例１に類似した様式で産生され、レンチウイルス粒子を形質導入される。形質導入からおよそ１０日後、細胞を収集し、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞から抽出する。実施例１と同様に、ＤＮＡをＣａｓ１２ａ誘導性ゲノム編集について分析し、ＲＮＡを、修正されたスプライシングについて分析する。
表１１に記載された変異を有する対象由来のオルガノイドに、実施例２に記載された手順と類似した手順を用いて、レンチウイルス粒子を形質導入する。形質導入から１４日後、オルガノイドを、疾患表現型の復帰変異について分析する。
６．８．１０．２． 結果
単一Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ１２ａタンパク質は、ミニ遺伝子モデルにおいて表１１に同定された変異により引き起こされるスプライシング欠陥を修正し、ＤＭＤのエクソン５０における有害な変異のミニ遺伝子モデルにおいてジストロフィン発現を回復させる。オルガノイドにおいて、単一Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ１２ａタンパク質は、疾患表現型を逆転させる。
[実施例１１]
６．８．１１． ＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ修正
６．８．１１．１． 材料および方法
６．８．１１．１．１． ｇＲＮＡデザイン
表１２に示されたＵＳＨ２Ａにおける標的ドメインに対応するターゲティング配列を有するＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子を、ターゲティング配列と標的ドメインの相補体との間にミスマッチを伴わないようにデザインした。この実施例におけるＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子を潜在性５’スプライス部位の近く（表１２に列挙された上位２つの標的ドメイン）または潜在性３’スプライス部位の近く（表１２に列挙された下位の標的ドメイン）において編集するようにデザインされた。Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子における標的ドメインの５’側のループドメインは、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）（ＡｓＣａｓ１２ａ）またはＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＡＧＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３１）（ＬｂＣａｓ１２ａ）からなる。選択された標的ドメインの位置の概略図は図２５に報告されている。
Figure 2022520783000020
標準ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅアセンブリを用いて、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、ｐＹ１０８（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８４７３９、ＡｓＣａｓ１２ａをコードする）またはｐＹ１０９（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８４７４０、ＬｂＣａｓ１２ａをコードする）レンチウイルスベクターへクローニングした。これらのベクターは、選択された標的ドメインの上流のＰＡＭ配列を認識するためのそれらのそれぞれのｇＲＮＡと共にＣａｓ１２ａタンパク質をコードするように操作された。スクランブル切り詰め型ｇＲＮＡと共にＡｓＣａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａタンパク質、それぞれをコードするｐＹ１０８およびｐＹ１０９プラスミドもまた、対照としての使用のために調製した。上記のベクターを作製するために用いられるオリゴヌクレオチドは、表１３に報告されている。
Figure 2022520783000021
６．８．１１．１．１． ミニ遺伝子作製
ミニ遺伝子モデルを、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子およびそれの変異型対応物のスプライシングパターンを模倣するように作製した。ＰＥ４０に対応するゲノム領域と共にＵＳＨ２Ａエクソン４０およびエクソン４１を、表１４に列挙されたプライマーを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから増幅した。エクソン４０に対応するアンプリコンは、イントロン４０の５’末端の追加の２０８ｂｐを含む；エクソン４１に対応するアンプリコンは、イントロン４０の３’末端の２４８ｂｐをさらに含む；ＰＥ４０に対応するアンプリコンは、その偽エクソン自体の上流７２２ｂｐまでおよび下流６２２ｂｐのイントロン４０の部分をさらに含む。その後、これらの断片を、ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅアセンブリを用いてアセンブリし、以前に発表されたｐｃＤＮＡ３ベクター（Cesaratto et al., 2015, J. Biotechnol. 212:159-166）のＫｐｎＩおよびＢｇｌＩＩ部位へクローニングして、ＣＭＶプロモーターの調節下での発現を可能にした。その構築物はまた、それの発現を助けるために、２つのタンパク質タグ、Ｖ５－タグおよびｒｏＴａｇ（Petris et al., 2014, PLoS One, 9(5):e96700）、それぞれをミニ遺伝子の５’末端および３’末端に含んだ。ＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を含有するミニ遺伝子を、表１４に報告されたプライマー（オリゴヌクレオチドＵＳＨ２Ａ＿ｍｕｔＡ２１４４Ｇ＿ＦおよびＵＳＨ２Ａ＿ｍｕｔＡ２１４４Ｇ＿Ｒ）を用いる部位特異的変異誘発の標準手順により、野生型ミニ遺伝子から得た。ミニ遺伝子構築物の概略図は図２３に報告されている。
Figure 2022520783000022
６．８．１１．１．１． 細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０Ｕ／ｍｌ抗生物質（ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。
ＵＳＨ２Ａ野生型および変異型ミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、直線化ミニ遺伝子プラスミドの安定的トランスフェクションにより作製した。細胞を、トランスフェクションから４８時間後から開始する、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて選択した。単一細胞クローンを単離し、ミニ遺伝子コピー数およびミニ遺伝子構築物の発現について特徴づけた。安定クローンを、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８をさらに追加して、上記で示されているように培養して維持した。
６．８．１１．１．１． ＨＥＫ２９３安定クローンにおけるミニ遺伝子コピー数の決定
ミニ遺伝子コピー数の決定を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出されたゲノムＤＮＡにおいてｑＰＣＲ分析により実施した。ゲノムＤＮＡを８６．２ｎｇ／μｌへ希釈し、ｑＰＣＲを、表１５に報告されたプライマーを用いて実施した。相対的コピー数を決定するために、ＧＡＰＤＨを対照として用いた。ミニ遺伝子とＧＡＰＤＨの両方についての標準曲線を、それぞれ、ミニ遺伝子プラスミドまたはｐｃＤＮＡ３－ＧＡＰＤＨ断片の段階希釈を用いて得た。ｐｃＤＮＡ３－ＧＡＰＤＨ断片構築物を、表１５に報告されたＧＡＰＤＨ＿ＣＮ＿ＦｏｒおよびＧＡＰＤＨ＿ＣＮ＿Ｒｅｖプライマーを用いて増幅されたＧＡＰＤＨ断片の平滑末端クローニングにより得て、そのプライマーは、ＧＡＰＤＨ ｑＰＣＲ増幅に用いられたのと同じプライマーであった。
Figure 2022520783000023
６．８．１１．１．１． トランスフェクションおよび形質導入
ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションを、２４ウェルプレート内に播種されたＨＥＫ２９３細胞（１００，０００細胞／ウェル）において実施した。播種から２４時間後、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて製造会社の使用説明書に従って、細胞に、１００ｎｇのミニ遺伝子プラスミド、ならびにＣａｓ１２ａタンパク質およびＵＳＨ２ＡをターゲットするＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするプラスミドの７００ｎｇをトランスフェクトした。コンフルエンス時点で細胞を分割し、トランスフェクションから６日後、収集した。その後、ペレットを、ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出のために２つに分け、同じ試料内の編集効率およびスプライシング修正を比較した。
ミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞の形質導入
レンチウイルス粒子は、１０ｃｍプレート中８０％コンフルエンシーでＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生された。簡単に述べれば、１０μｇのトランスファーベクタープラスミド（Ｃａｓ１２ａタンパク質およびＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするｐＹ１０８またはｐＹ１０９プラスミド）、３．５μｇのＶＳＶ－Ｇ発現プラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２５９）、および６．５μｇのレンチウイルスパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１）を、ポリエチレンイミン法（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした（Casini A et al., 2015, J. Virol. 89: 2966-2971参照）。一晩のインキュベーション後、培地を完全ＤＭＥＭと交換した。ウイルス上清を、４８時間後、収集し、０．４５μｍ ＰＥＳフィルターに通して濾過した。アリコートを、使用するまで－８０℃で保存した。ベクター力価を、ＳＧ－ＰＥＲＴ方法により逆転写酵素単位（ＲＴＵ）として測定した（Casini, A., et al., 2015, J. Virol. 89:2966-2971参照）。形質導入研究について、ミニ遺伝子構築物を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレート内に播種し（１００，０００細胞／ウェル）、播種の次の日、細胞上のベクター含有培地を１６００ｘｇ、２５℃で２時間、遠心分離することによる１ＲＴＵのレンチウイルスベクターを、細胞に形質導入した。およそ４８時間後、細胞を、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で選択し、形質導入から１０日後、収集した。
６，８．１１．１．１． ＲＴ－ＰＣＲおよび転写分析
ＮｕｃｌｅｏＺＯＬ試薬（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮアーゼを含まないｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ ＲＴ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造会社のプロトコールに従って、１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを得た。標的領域を、プライマーＶ５ｔａｇ＿ＦｏｒおよびＴＥＶｓｉｔｅ＿Ｒｅｖ（表１３に報告されている）を用いるＨＯＴ ＦＩＲＥＰｏｌ ＭｕｌｔｉＰｌｅｘ Ｍｉｘ（Ｓｏｌｉｓ Ｂｉｏｄｙｎｅ）でのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル上に流し、画像をＵＶＩｄｏｃ ＨＤ５システム（Ｕｖｉｔｅｃ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）を用いて取得した。バンド定量化を、Ｕｖｉｔｅｃ Ａｌｌｉａｎｃｅソフトウェア（Ｕｖｉｔｅｃ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）を用いて実施した。
６．８．１１．１．１． インデル形成の評価
ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って細胞ペレットから抽出した。組み込まれたＵＳＨ２Ａミニ遺伝子を特異的に検出する、プライマーＴＩＤＥ－ＵＳＨ２Ａ－ＰＥ４０－Ｆ（表１６に報告されている）およびＴＥＶｓｉｔｅ＿Ｒｅｖ（表１６に報告されている）を用いて、組み込まれたＵＳＨ２Ａミニ遺伝子を増幅するために，ＨＯＴ ＦＩＲＥＰｏｌ ＭｕｌｔｉＰｌｅｘ Ｍｉｘ（Ｓｏｌｉｓ Ｂｉｏｄｙｎｅ）を用いた。アンプリコンプールを、サンガーシーケンシングし（Ｍｉｘ２ｓｅｑキット、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、インデルレベルを、ＴＩＤＥウェブツール（ｔｉｄｅ．ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃｏｍ／）またはＳｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥウェブツール（ｉｃｅ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ／）を用いて評価した。
Figure 2022520783000024
６．８．１１．２．
６．８．１１．３． 結果
６．８．１１．３．１． ＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇスプライシングを再現するためのミニ遺伝子のデザイン
異常なＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇスプライシングを再現するためのミニ遺伝子を、ＵＳＨ２Ａエクソン４０およびエクソン４１、加えて偽エクソン４０（ＰＥ４０）に対応するＵＳＨ２Ａイントロン４０の一部分をコードするヒトゲノム領域を、ｐｃＤＮＡ３に基づいたＣＭＶ駆動型哺乳動物発現ベクターへクローニングすることにより作製した（Cesaratto et al., J. Biotechnol. 212, 159-166, 2015）。加えて、重要なスプライシング制御配列を保存するために、ミニ遺伝子はまた、エクソン４０および４１、それぞれの下流すぐおよび上流すぐのＵＳＨ２Ａイントロン４０の部分も含んだ。ミニ遺伝子デザインの概略図は図１Ａに報告されている。加えて、野生型ミニ遺伝子と、ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を含有するミニ遺伝子の両方を、野生型および変異型ＵＳＨ２Ａ配列のスプライシングへのデザインされたゲノム編集ストラテジーの効果を評価するために構築した。野生型ミニ遺伝子と変異型ミニ遺伝子の両方のスプライシングパターンを、まず、ＨＥＫ２９３細胞におけるその２つの構築物の一過性トランスフェクション後、ＲＴ－ＰＣＲにより評価した。予想通り、変異型ミニ遺伝子に由来したスプライシング産物は、発現したｍＲＮＡにおけるＰＥ４０の包含に対応する、長さが１５３ｂｐの増加を示した。ＰＥ４０の包含は、ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングによりさらに確認された。
６．８．１１．３．１． Ｃａｓ１２ａ媒介性ゲノム編集を用いるＵＳＨ２Ａ ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇスプライシングの修正
ＵＳＨ２Ａ転写産物におけるＰＥ４０の包含を促進する５’および３’潜在性スプライス部位をターゲットするＣａｓ１２ａガイドＲＮＡを、ＡｓＣａｓ１２ａとＬｂＣａｓ１２ａの両方についてデザインした。ガイド１およびガイド２は、３’潜在性スプライス部位およびｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異に渡り、一方、ガイド３は、ＰＥ４０に対応する配列の開始地点における５’潜在性スプライス部位のレベルに位置する（図２５）。
３つのデザインされたｇＲＮＡと組み合わせたＡｓＣａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａにより促進されるスプライシング修正のレベルを、まず、ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＵＳＨ２Ａミニ遺伝子と共に各ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡペアをＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトすることにより試験した。スクランブルの非ターゲティング性ｇＲＮＡ（ｓｃｒ）を、対照として本研究に含めた。細胞を、トランスフェクション後６日目に収集し、ＵＳＨ２Ａスプライシングパターンを、抽出された全ｍＲＮＡへのＲＴ－ＰＣＲにより分析した。図２６Ａおよび図２６Ｃに示されているように、ＡｓＣａｓ１２ａとＬｂＣａｓ１２ａの両方とも、成熟転写産物におけるＰＥ４０の包含を取り消すことができた。ガイド１は、最も効率的なｇＲＮＡであり（およそ７０～１００％スプライシング修正、図２６Ｂおよび図２６Ｄ参照）、続いて、ガイド３（およそ５０～８０％スプライシング修正、図２６Ｂおよび図２６Ｄ参照）であった。ガイド２は、より低いレベルのみのスプライシング修復を促進することができた（およそ１５～４０％の正しい産物、図２６Ｂおよび図２６Ｄ参照）。加えて、驚くべきことに、ＬｂＣａｓ１２ａは、ＡｓＣａｓ１２ａより、スプライシング修正を促進することにおいてずっと効率的であり、ＰＥ４０を含まない転写産物のパーセンテージにおいてほぼ２倍の改善があった（図２６Ａ～Ｂと図２６Ｃ～Ｄとを比較する）。野生型ＵＳＨ２Ａ転写産物へのゲノム編集ストラテジーの有害な効果の欠如を検証するために、同様の一過性トランスフェクション研究を、野生型ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子を用いて実施した。図２６Ａおよび図２６Ｃ（パネルの左側）に示されているように、全ての試験されたｇＲＮＡと組み合わせたＡｓＣａｓ１２ａおよびＬｂＣａｓ１２ａの両方は、野生型ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子転写産物のスプライシングを乱さなかった（レーンｓｃｒ、スクランブルをレーンｇ１～ｇ３と比較する）。
修正ストラテジーの効率をさらに確認するために、ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ ＵＳＨ２Ａ変異型ミニ遺伝子およびそれの野生型対応物を安定的に発現するＨＥＫ２９３クローンを作製し、ｑＰＣＲアッセイを用いてコピー数について特徴づけた。以下の３つのクローンを次の研究のために選択した：変異型ミニ遺伝子を発現する２つのクローン（クローン４、２コピーの変異型ミニ遺伝子を有する；クローン６、１コピーの変異型ミニ遺伝子を有する）、５コピーの野生型ミニ遺伝子により特徴づけられる単一のクローン（クローン１）。加えて、ガイド１およびガイド３と組み合わせたＬｂＣａｓ１２ａのみをさらに試験した。それらが、一過性トランスフェクション研究において最良のパフォーマンスの組合せであるという結果であったからである。ＬｂＣａｓ１２ａ、およびガイド１、ガイド３、またはスクランブルの非ターゲティング性ｇＲＮＡのいずれかをコードするレンチウイルスベクターを産生した。変異型ミニ遺伝子を有するＨＥＫ２９３クローンに、３つのレンチウイルスベクターのそれぞれを形質導入し、ピューロマイシン選択下で１０日間、維持して、形質導入された細胞を単離した。その後、ＵＳＨ２Ａスプライシング修正のレベルを、抽出された全ＲＮＡへのＲＴ－ＰＣＲにより評価し、一過性トランスフェクション研究において得られた前のデータと一致して、どちらのｇＲＮＡに関しても修正された転写産物の回復が明らかにされ（図２７Ａ～Ｂ）、ガイド１はガイド３より高い効率を示した（それぞれ、およそ８０％対４０～５０％、図２７Ｂ参照）。特に、スプライシング修正は、両方の試験されたクローンにおいて一貫性があり（図２７Ａ～Ｂ）、そのアプローチの有効性がさらに確認された。
異なるＬｂＣａｓ１２ａ－ｇＲＮＡ組合せにより生成された、野生型ミニ遺伝子と変異型ミニ遺伝子の両方におけるインデル形成のレベルをまた、それらのアレル特異性を評価するために評価した。転写産物評価に用いられたのと同じ試料から抽出されたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ増幅し、サンガーシーケンシングし、ＴＩＤＥウェブツールを用いて分析した（図２７Ｃ）。全ての試験されたｇＲＮＡについて、変異型ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子におけるかなりのインデル形成が測定され（およそ８０％、図２７Ｃ参照）、その２つの異なる試験されたクローン（クローン４およびクローン６）の中で良い一貫性を示した。その後、野生型ＵＳＨ２Ａミニ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３クローン１の形質導入後、インデル形成を評価した。予想通り、ガイド３は、いかなるアレル特異性も示さなかった。このｇＲＮＡの標的ドメインがｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異上に位置せず、したがって、それの標的が野生型ミニ遺伝子と変異型ミニ遺伝子の両方に存在するためである（図２７Ｃ）。他方、ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異をターゲットするガイド１は、実際、クローン４および６における変異型ミニ遺伝子上にインデルを生じることができ、一方、野生型ＵＳＨ２Ａ構築物を発現するクローン１においてバックグラウンドレベルの編集が検出された（図２７Ｃ）。さらに、ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ ＵＳＨ２Ａクローン４および６におけるガイド１およびガイド３により生成されたインデルプロファイルを、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥウェブツールを用いて分析し、－１ｎｔから－２２ｎｔまで及ぶ幅広い範囲の欠失が明らかにされた（図２８Ａ～２８Ｄ）。興味深いことに、ガイド１に反してガイド３はまた、低頻度ではあるが、挿入を生じている。加えて、検出されたインデルに関してその２つのクローンの中で、それらの相対的頻度がその２つの細胞株の中で常に保存されているわけではないが、良い一貫性があった。
７． 特定の実施形態
本開示は、以下の特定の実施形態により例示される。
１． （ａ）ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメイン、および
（ｂ）ループドメイン
を含む、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、
（ｉ）ターゲティング配列がゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応し、
（ｉｉ）標的ドメインがＣａｓ１２ａタンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接しており、および
（ｉｉｉ）ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、Ｃａｓ１２ａがゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断する、
Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２． 細胞が真核細胞である、実施形態１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３． 細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４． 細胞がヒト細胞である、実施形態３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
５． （ａ）ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメイン、および
（ｂ）ループドメイン
を含む、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、
（ｉ）ターゲティング配列がゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応し、
（ｉｉ）標的ドメインがＣａｓ１２ａタンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接しており、および
（ｉｉｉ）ＰＡＭがゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位から４０ヌクレオチド内にある、
Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
６． ＰＡＭがスプライス部位から４～３８ヌクレオチド内にある、実施形態５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
７． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、Ｃａｓ１２ａがゲノムＤＮＡを、スプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断する、実施形態５または実施形態６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８． 細胞が真核細胞である、実施形態７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９． 細胞が哺乳動物細胞である、実施形態８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０． 細胞がヒト細胞である、実施形態９に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１１． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、Ｃａｓ１２ａがゲノムＤＮＡを、スプライス部位から１０ヌクレオチドまでの地点で切断する、実施形態１～１０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
１２． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、Ｃａｓ１２ａがゲノムＤＮＡを、スプライス部位から１０～１５ヌクレオチドの地点で切断する、実施形態１～１０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
１３． スプライス部位が潜在性スプライス部位である、実施形態１～１２のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
１４． 潜在性スプライス部位がゲノムＤＮＡ配列における変異により生成されたものである、実施形態１３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
１５． 潜在性スプライス部位がゲノムＤＮＡ配列における変異により活性化されたものである、実施形態１３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
１６． 変異がＰＡＭ配列の３’側１～２３ヌクレオチド地点に位置する、実施形態１４または実施形態１５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１７． 変異が一塩基多型である、実施形態１４～１６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１８． 変異が欠失である、実施形態１４～１６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９． 欠失が１～１０６ヌクレオチドの欠失である、実施形態１８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０． 欠失が１～１０５ヌクレオチドの欠失である、実施形態１８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１． 欠失が１～１０４ヌクレオチドの欠失である、実施形態１８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２． 欠失が１～１０３ヌクレオチドの欠失である、実施形態１８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２３． 欠失が１～１００ヌクレオチドの欠失である、実施形態１８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２４． 欠失が１～１０ヌクレオチドの欠失である、実施形態１８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２５． 変異が挿入である、実施形態１４～１６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２６． 挿入が１～１０６ヌクレオチドの挿入である、実施形態２５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２７． 挿入が１～１０５ヌクレオチドの挿入である、実施形態２５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２８． 挿入が１～１０４ヌクレオチドの挿入である、実施形態２５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２９． 挿入が１～１０３ヌクレオチドの挿入である、実施形態２５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３０． 挿入が１～１００ヌクレオチドの挿入である、実施形態２５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３１． 挿入が１～１０ヌクレオチドの挿入である、実施形態２５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３２． インビトロでの、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞集団への導入により、Ｃａｓ１２ａタンパク質によるゲノムＤＮＡの切断が、生じたインデルの１０％～５０％において変異を欠失させる、実施形態１４～３１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３３． インビトロでの、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞集団への導入により、Ｃａｓ１２ａタンパク質によるゲノムＤＮＡの切断が、生じたインデルの１０％～４０％において変異を欠失させる、実施形態１４～３１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３４． インビトロでの、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞集団への導入により、Ｃａｓ１２ａタンパク質によるゲノムＤＮＡの切断が、生じたインデルの１０％～３０％において変異を欠失させる、実施形態１４～３１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３５． インビトロでの、ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞集団への導入により、Ｃａｓ１２ａタンパク質によるゲノムＤＮＡの切断が、生じたインデルの１０％～２０％において変異を欠失させる、実施形態１４～３１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３６． 潜在性スプライス部位におけるスプライシングが疾患表現型を生じる、実施形態１３～３５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３７． ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、潜在性スプライス部位により引き起こされる異常なスプライシングが修正される、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３８． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の少なくとも１０％において回復する、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
３９． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の１０％～２０％において回復する、実施形態３８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４０． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の少なくとも２０％において回復する、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４１． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の２０％～３０％において回復する、実施形態４０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４２． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の少なくとも３０％において回復する、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４３． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の３０％～４０％において回復する、実施形態４２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４４． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の少なくとも４０％において回復する、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４５． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の４０％～５０％において回復する、実施形態４４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４６． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の少なくとも５０％において回復する、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４７． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の５０％～６０％において回復する、実施形態４６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４８． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の少なくとも６０％において回復する、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
４９． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の６０％～７０％において回復する、実施形態４８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
５０． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の少なくとも７０％において回復する、実施形態１３～３６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
５１． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の７０％～８０％において回復する、実施形態５０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
５２． インビトロで、ゲノムＤＮＡ配列を有する細胞集団へＣａｓ１２ａタンパク質と共に導入された場合、正常なスプライシングが細胞の７０％～９０％において回復する、実施形態５０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
５３． 潜在性スプライス部位が潜在性３’スプライス部位である、実施形態１３～５２のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
５４． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、潜在性３’スプライス部位の活性が低下する、実施形態５３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
５５． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、潜在性３’スプライス部位の分岐部位が破壊される、実施形態５４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
５６． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、潜在性３’スプライス部位のポリピリミジントラクトが破壊される、実施形態５４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
５７． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、潜在性３’スプライス部位のイントロン／エクソン接合部が破壊される、実施形態５４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
５８． 潜在性３’スプライス部位が３’カノニカルスプライス部位の上流にある、実施形態５３～５７のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
５９． 潜在性３’スプライス部位が５’潜在性スプライス部位の上流にある、実施形態５３～５８のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
６０． 潜在性スプライス部位が潜在性５’スプライス部位である、実施形態１３～５２のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
６１． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、潜在性５’スプライス部位の活性が低下する、実施形態６０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
６２． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、潜在性５’スプライス部位のイントロン／エクソン接合部が破壊される、実施形態６１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
６３． 潜在性５’スプライス部位が潜在性３’スプライス部位の下流にある、実施形態６０～６２のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
６４． 潜在性５’スプライス部位が５’カノニカルスプライス部位の下流にある、実施形態６０～６２のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
６５． スプライス部位がカノニカルスプライス部位である、実施形態１～１２のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
６６． カノニカルスプライス部位がカノニカル３’スプライス部位である、実施形態６５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
６７． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、カノニカル３’スプライス部位の活性が破壊される、実施形態６６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
６８． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、カノニカル３’スプライス部位の分岐部位が破壊される、実施形態６７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
６９． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、カノニカル３’スプライス部位のポリピリミジントラクトが破壊される、実施形態６７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
７０． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、カノニカル３’スプライス部位のイントロン／エクソン接合部が破壊される、実施形態６７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
７１． カノニカルスプライス部位がカノニカル５’スプライス部位である、実施形態６５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
７２． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、カノニカル５’スプライス部位の活性が低下する、実施形態７１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
７３． ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質の、ゲノム配列を含有する細胞への導入により、カノニカル５’スプライス部位のイントロン／エクソン接合部が破壊される、実施形態７１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
７４． ４０～４４ヌクレオチド長である、実施形態１～７３のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
７５． ターゲティング配列が２０～２４ヌクレオチド長である、実施形態１～７４のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
７６． プロトスペーサードメインが１７～２６ヌクレオチド長である、実施形態１～７５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
７７． プロトスペーサードメインが２０～２４ヌクレオチド長である、実施形態１～７５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
７８． ターゲティング配列が２３ヌクレオチド長である、実施形態１～７７のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
７９． ターゲティング配列と標的ドメインの相補体の間にミスマッチがない、実施形態１～７８のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８０． プロトスペーサードメインが２３ヌクレオチド長である、実施形態１～７９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８１． ＰＡＭ配列がＴＴＴＶであり、ここで、ＶがＡ、Ｃ、またはＧである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８２． ＰＡＭ配列がＴＹＣＶであり、ここで、ＹがＣまたはＴであり、かつＶがＡ、Ｃ、またはＧである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８３． ＰＡＭ配列がＣＣＣＣである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８４． ＰＡＭ配列がＡＣＣＣである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８５． ＰＡＭ配列がＴＡＴＶであり、ここで、ＶがＡ、Ｃ、またはＧである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８６． ＰＡＭ配列がＲＡＴＲである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８７． ＰＡＭ配列がＮＴＴＮであり、ここで、Ｎが任意のヌクレオチドである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８８． ＰＡＭ配列がＴＣＴＮであり、ここで、Ｎが任意のヌクレオチドである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
８９． ＰＡＭ配列がＴＴＴＮであり、ここで、Ｎが任意のヌクレオチドである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９０． ＰＡＭ配列がＴＴＮであり、ここで、Ｎが任意のヌクレオチドである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９１． ＰＡＭ配列がＹＹＮであり、ここで、ＹがＣまたはＴであり、かつＮが任意のヌクレオチドである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９２． ＰＡＭ配列がＹＴＮであり、ここで、ＹがＣまたはＴであり、かつＮが任意のヌクレオチドである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９３． ＰＡＭ配列がＴＹＹＮであり、ここで、ＹがＣまたはＴであり、かつＮが任意のヌクレオチドである、実施形態１～８０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９４． ゲノム配列が真核生物ゲノム配列である、実施形態１～９３のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９５． 真核生物ゲノム配列が哺乳動物ゲノム配列である、実施形態９４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９６． 哺乳動物ゲノム配列がヒトゲノム配列である、実施形態９５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９７． 標的ドメインが、ＣＦＴＲ遺伝子、ＤＭＤ遺伝子、ＨＢＢ遺伝子、ＦＧＢ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、ＱＤＰＲ遺伝子、ＧＬＡ遺伝子、ＬＤＬＲ遺伝子、ＢＲＩＰ１遺伝子、Ｆ９遺伝子、ＣＥＰ２９０遺伝子、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＵＳＨ２Ａ遺伝子、またはＧＡＡ遺伝子であるヒトゲノム配列中にある、実施形態９６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９８． 標的ドメインが、ＣＦＴＲ遺伝子、ＤＭＤ遺伝子、ＦＧＢ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、ＱＤＰＲ遺伝子、ＧＬＡ遺伝子、ＬＤＬＲ遺伝子、ＢＲＩＰ１遺伝子、Ｆ９遺伝子、ＣＥＰ２９０遺伝子、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＵＳＨ２Ａ遺伝子、またはＧＡＡ遺伝子であるヒトゲノム配列中にある、実施形態９６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
９９． 標的ドメインがヒトＨＢＢ遺伝子中にない、実施形態１～９６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１００． 標的ドメインがＧＧＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＴＡ（配列番号２９３）以外のヌクレオチド配列を含みまたはそれからなる、実施形態１～９６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０１． 標的ドメインが、ＣＦＴＲ遺伝子、ＤＭＤ遺伝子、ＨＢＢ遺伝子、ＦＧＢ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、ＱＤＰＲ遺伝子、ＧＬＡ遺伝子、ＬＤＬＲ遺伝子、ＢＲＩＰ１遺伝子、Ｆ９遺伝子、ＣＥＰ２９０遺伝子、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＵＳＨ２Ａ遺伝子、またはＧＡＡ遺伝子であるヒトゲノム配列中にある、実施形態１～１０のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０２． 標的ドメインがＣＦＴＲ遺伝子中にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０３． ＣＦＴＲ遺伝子が、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異、３８４９＋１０ｋｂｃ＞Ｔ変異、ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異である変異を有する、実施形態１０２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０４． 変異が３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異である、実施形態１０３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０５． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＣＡ（配列番号３８）を有する、実施形態１０４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０６． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＣＡ（配列番号３８）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１０７． 変異が３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異である、実施形態１０３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＧＧＧＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＴＡ（配列番号３９）を有する、実施形態１０７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１０９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＧＧＧＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＴＡ（配列番号３９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１１０． 変異がＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異である、実施形態１０３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１１１． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＡＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＡ（配列番号４０）を有する、実施形態１１０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１１２． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＡＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＡ（配列番号４０）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１１３． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＣＡ（配列番号４１）を有する、実施形態１１０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１１４． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＣＡ（配列番号４１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１１５． 変異がＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異である、実施形態１０３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１１６． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡＡ（配列番号４２）を有する、実施形態１１５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１１７． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡＡ（配列番号４２）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１１８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡ（配列番号４３）を有する、実施形態１１５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１１９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡ（配列番号４３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１２０． 標的ドメインがＤＭＤ遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１２１． ＤＭＤ遺伝子が、ＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異、ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異、ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ１＋３６８４６Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ１＋３６８４６Ｇ＞Ａ変異、ＩＶＳ２＋５５９１Ｔ＞Ａ変異、またはＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異である変異を有する、実施形態１２０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１２２． 変異がＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異である、実施形態１２１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１２３． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴ（配列番号４４）を有する、実施形態１２２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１２４． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴ（配列番号４４）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１２５． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＣＡ（配列番号４５）を有する、実施形態１２２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１２６． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＣＡ（配列番号４５）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１２７． 変異がＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異である、実施形態１２１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１２８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＴＧＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴ（配列番号４６）を有する、実施形態１２７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１２９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＧＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴ（配列番号４６）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１３０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＡＴ（配列番号４７）を有する、実施形態１２７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１３１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＡＴ（配列番号４７）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１３２． ヌクレオチド配列ＡＧＴＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号４８）を有する、実施形態１２７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１３３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＧＴＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号４８）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１３４． ヌクレオチド配列ＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧ（配列番号４９）を有する、実施形態１２７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１３５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧ（配列番号４９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１３６． 変異がＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異である、実施形態１２１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１３７． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴ（配列番号５０）を有する、実施形態１３６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１３８． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴ（配列番号５０）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１３９． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴ（配列番号５１）を有する、実施形態１３６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１４０． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴ（配列番号５１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１４１． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣ（配列番号５２）を有する、実施形態１３６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１４２． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣ（配列番号５２）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１４３． 変異がＩＶＳ２＋５５９１Ｔ＞Ａ変異である、実施形態１２１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１４４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＡＴＡＧＧＴＴＧＡＡ（配列番号５３）を有する、実施形態１４３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１４５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＡＴＡＧＧＴＴＧＡＡ（配列番号５３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１４６． 変異がＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異である、実施形態１２１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１４７． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧ（配列番号５４）を有する、実施形態１４６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１４８． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧ（配列番号５４）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１４９． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号５５）を有する、実施形態１４６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１５０． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号５５）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１５１． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣ（配列番号５６）を有する、実施形態１４６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１５２． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣ（配列番号５６）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１５３． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣ（配列番号５７）を有する、実施形態１４６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１５４． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣ（配列番号５７）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１５５． 標的ドメインがＤＭＤのイントロン５０および／またはエクソン５１内にある、実施形態１２０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１５６． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＣＴ（配列番号５８）を有する、実施形態１５５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１５７． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＣＴ（配列番号５８）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１５８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴ（配列番号５９）を有する、実施形態１５５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１５９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴ（配列番号５９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１６０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴ（配列番号６０）を有する、実施形態１５５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１６１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴ（配列番号６０）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１６２． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧ（配列番号６１）を有する、実施形態１５５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１６３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧ（配列番号６１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１６４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴ（配列番号６２）を有する、実施形態１５５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１６５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴ（配列番号６２）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１６６． 標的ドメインがＨＢＢ遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１６７． ＨＢＢ遺伝子が、ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ、またはＩＶＳ２＋７４５Ｃ＞Ｇ変異である変異を有する、実施形態１６６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１６８． 変異がＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異である、実施形態１６７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１６９． 標的ドメインがＧＧＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＴＡ（配列番号２９３）以外のヌクレオチド配列を含みまたはそれからなる、実施形態１６６～１６８のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１７０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＣ（配列番号６３）を有する、実施形態１６８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１７１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＣ（配列番号６３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１７２． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＣ（配列番号６４）を有する、実施形態１６８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１７３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＣ（配列番号６４）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１７４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＡ（配列番号６５）を有する、実施形態１６８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１７５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＡ（配列番号６５）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１７６． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡ（配列番号６６）を有する、実施形態１６８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１７７． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡ（配列番号６６）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１７８． 変異がＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異である、実施形態１６７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１７９． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＧＴ（配列番号６７）を有する、実施形態１７８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１８０． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＧＴ（配列番号６７）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１８１． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧＧＴＴ（配列番号６８）を有する、実施形態１７８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１８２． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧＧＴＴ（配列番号６８）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１８３． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ（配列番号６９）を有する、実施形態１７８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１８４． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ（配列番号６９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１８５． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＧＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡ（配列番号７０）を有する、実施形態１７８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１８６． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＧＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡ（配列番号７０）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１８７． 変異がＩＶＳ２＋７４５Ｃ＞Ｇ変異である、実施形態１６７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１８８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＧＧＴ（配列番号７１）を有する、実施形態１８７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１８９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＧＧＴ（配列番号７１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１９０． 標的ドメインがＦＧＢ遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９１． ＦＧＢ遺伝子がＩＶＳ６＋１３Ｃ＞Ｔ変異を有する、実施形態１９０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９２． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＴＡＣＣＴ（配列番号７２）を有する、実施形態１９１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＴＡＣＣＴ（配列番号７２）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１９４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＡ（配列番号７３）を有する、実施形態１９１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＡ（配列番号７３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
１９６． 標的ドメインがＳＯＤ１遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９７． ＳＯＤ１遺伝子がＩＶＳ４＋７９２Ｃ＞Ｇ変異を有する、実施形態１９６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＣＴＡＡＣＣＴＴＡＧＴ（配列番号７４）を有する、実施形態１９７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
１９９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＣＴＡＡＣＣＴＴＡＧＴ（配列番号７４）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２００． 標的ドメインがＱＤＰＲ遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０１． 変異がＩＶＳ３＋２５５２Ａ＞Ｇ変異である、実施形態２００に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０２． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡ（配列番号７５）を有する、実施形態２０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡ（配列番号７５）を有する標的に対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２０４． 標的ドメインがＧＬＡ遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０５． ＧＬＡ遺伝子がＩＶＳ４＋９１９Ｇ＞Ａ変異を有する、実施形態２０４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０６． ヌクレオチド配列ＣＣＡＴＧＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＴＡ（配列番号７６）を有する、実施形態２０５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０７． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＣＡＴＧＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＴＡ（配列番号７６）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２０８． 標的ドメインがＬＤＬＲ遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２０９． ＬＤＬＲ遺伝子がＩＶＳ１２＋１１Ｃ＞Ｇ変異を有する、実施形態２０８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＧＧＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号７７）を有する、実施形態２０９に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＧＧＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号７７）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２１２． 標的ドメインがＢＲＩＰ１遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１３． ＢＲＩＰ１遺伝子がＩＶＳ１１＋２７６７Ａ＞Ｔ変異を有する、実施形態２１２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＡＣＣＴＴＴＧＡＡ（配列番号７８）を有する、実施形態２１３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＡＣＣＴＴＴＧＡＡ（配列番号７８）を有する標的に対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２１６． 標的ドメインがＦ９遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１７． Ｆ９遺伝子がＩＶＳ５＋１３Ａ＞Ｇ変異を有する、実施形態２１６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣ（配列番号７９）を有する、実施形態２１７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２１９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣ（配列番号７９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２２０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡ（配列番号８０）を有する、実施形態２１７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＡ（配列番号８０）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２２２． 標的ドメインがＣＥＰ２９０遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２３． ＣＥＰ２９０遺伝子がＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を有する、実施形態２２２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴ（配列番号８１）を有する、実施形態２２３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴ（配列番号８１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２２６． 標的ドメインがＣＯＬ２Ａ１遺伝子中にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２７． ＣＯＬ２Ａ１遺伝子がＩＶＳ２３＋１３５Ｇ＞Ａ変異を有する、実施形態２２６に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号８２）を有する、実施形態２２７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２２９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号８２）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２３０． 標的ドメインがＵＳＨ２Ａ遺伝子内にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２３１． ＵＳＨ２Ａ遺伝子がＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を有する、実施形態２３０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２３２． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＡ（配列番号８３）を有する、実施形態２３１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２３３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＡ（配列番号８３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２３４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣ（配列番号８４）を有する、実施形態２３１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２３５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣ（配列番号８４）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２３６． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号８５）を有する、実施形態２３１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２３７． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号８５）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２３８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡ（配列番号８６）を有する、実施形態２３１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２３９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡ（配列番号８６）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２４０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＣ（配列番号８７）を有する、実施形態２３１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２４１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＣ（配列番号８７）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２４２． ＵＳＨ２Ａ遺伝子がＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異を有する、実施形態２３０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２４３． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号８８）を有する、実施形態２４２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２４４． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号８８）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２４５． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号８９）を有する、実施形態２４２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２４６． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号８９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２４７． ＵＳＨ２Ａ遺伝子がｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有する、実施形態２３０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２４８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号９０）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２４９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号９０）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２５０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＣＡＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＡ（配列番号９１）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２５１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＣＡＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＡ（配列番号９１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２５２． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号９２）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２５３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号９２）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２５４． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡ（配列番号９３）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２５５． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡ（配列番号９３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２５６． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＧＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧ（配列番号９４）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２５７． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＧＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧ（配列番号９４）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２５８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴ（配列番号９５）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２５９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴ（配列番号９５）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２６０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号９６）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２６１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号９６）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２６２． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＣＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号９７）を有する、実施形態２４７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２６３． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＣＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号９７）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２６４． 標的ドメインがＧＡＡ遺伝子中にある、実施形態１０１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２６５． ＧＡＡ遺伝子がＩＶＳ１－１３Ｔ＞Ｇ変異を有する、実施形態２６４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２６６． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣ（配列番号９８）を有する、実施形態２６５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２６７． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣ（配列番号９８）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２６８． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＴＧＣ（配列番号９９）を有する、実施形態２６５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２６９． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＴＧＣ（配列番号９９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２７０． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣ（配列番号１００）を有する、実施形態２６５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２７１． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣ（配列番号１００）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２７２． ＧＡＡ遺伝子がＩＶＳ６－２２Ｔ＞Ｇ変異を有する、実施形態２６４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２７３． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧ（配列番号１０１）を有する、実施形態２７２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２７４． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧ（配列番号１０１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２７５． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡ（配列番号１０２）を有する、実施形態２７２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２７６． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡ（配列番号１０２）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２７７． 標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＴＴＧＧＣ（配列番号１０３）を有する、実施形態２７２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２７８． ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＴＴＧＧＣ（配列番号１０３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
２７９． ループドメインがプロトスペーサードメインの５’側にある、実施形態１～２７８のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２８０． ループドメインが、
Figure 2022520783000025
から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～２７９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２８１． ループドメインがヌクレオチド配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）を有する、実施形態１～２７９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２８２． ループドメインがヌクレオチド配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＡＧＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３１）を有する、実施形態１～２７９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２８３． ループドメインが２０ヌクレオチド長である、実施形態１～２８１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
２８４． 実施形態１～２８３のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードする核酸。
２８５． Ｃａｓ１２ａタンパク質をさらにコードする、実施形態２８４に記載の核酸。
２８６． プラスミドである、実施形態２８４または実施形態２８５に記載の核酸。
２８７． ウイルスである、実施形態２８４または実施形態２８５に記載の核酸。
２８８． 実施形態１～２８３のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡを含む粒子。
２８９． Ｃａｓ１２ａタンパク質をさらに含む、実施形態２８８に記載の粒子。
２９０． リポソーム、ベシクル、または金ナノ粒子である、実施形態２８８または実施形態２８９に記載の粒子。
２９１． リポソームである、実施形態２９０に記載の粒子。
２９２． ベシクルである、実施形態２９０に記載の粒子。
２９３． 金ナノ粒子である、実施形態２９０に記載の粒子。
２９４． （ａ）ＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａが野生型ＡｓＣａｓ１２ａまたは野生型ＬｂＣａｓ１２ａであり、
（ｂ）ＰＡＭ配列がＴＹＣＶ、ＣＣＣＣ、またはＡＣＣＣである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質がＡｓＣａｓ１２ ＲＲであり；および
（ｃ）ＰＡＭ配列がＴＡＴＶまたはＲＡＴＲである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質がＡｓＣａｓ１２ＲＶＲである、
実施形態２８８～２９３のいずれか一実施形態に記載の粒子。
２９５． 粒子がＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡの単一種のみを含有する、実施形態２８８～２９４のいずれか一実施形態に記載の粒子。
２９６．実施形態１～２８３のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａタンパク質およびｇＲＮＡ分子を含むシステム。
２９７． 単一ｇＲＮＡ分子を含む、実施形態２９６に記載のシステム。
２９８． （ａ）ＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａが野生型ＡｓＣａｓ１２ａまたは野生型ＬｂＣａｓ１２ａであり、
（ｂ）ＰＡＭ配列がＴＹＣＶ、ＣＣＣＣ、またはＡＣＣＣである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質がＡｓＣａｓ１２ ＲＲであり；および
（ｃ）ＰＡＭ配列がＴＡＴＶまたはＲＡＴＲである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質がＡｓＣａｓ１２ＲＶＲである、
実施形態２９６または実施形態２９７に記載のシステム。
２９９． ＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａが野生型ＡｓＣａｓ１２ａである、実施形態２９８に記載のシステム。
３００． ＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａが野生型ＬｂＣａｓ１２ａである、実施形態２９８に記載のシステム。
３０１． ゲノムＤＮＡをさらに含む、実施形態２９６～３００のいずれか一実施形態に記載のシステム。
３０２． 実施形態２８４～２８７のいずれか一実施形態に記載の核酸を含む細胞。
３０３． 実施形態２８８～２９５のいずれか一実施形態に記載の粒子を含む細胞。
３０４． 実施形態２９６～３０１のいずれか一実施形態に記載のシステムを含む細胞。
３０５． 実施形態３０２～３０４のいずれか一実施形態に記載の細胞の集団。
３０６． 細胞を変化させる方法であって、細胞を実施形態２８９～２９５のいずれか一実施形態に記載の粒子または実施形態２９６～３００のいずれか一実施形態に記載のシステムと接触させることを含む方法。
３０７． 細胞を実施形態２８９～２９５のいずれか一実施形態に記載の粒子と接触させることを含む、実施形態３０６に記載の方法。
３０８． 細胞を実施形態２９６～３００のいずれか一実施形態に記載のシステムと接触させることを含む、実施形態３０６に記載の方法。
３０９． 接触させることが、システムを細胞へ粒子またはベクターを介して送達することを含む、実施形態３０８に記載の方法。
３１０． 接触させることが、システムを細胞へ粒子を介して送達することを含む、実施形態３０８に記載の方法。
３１１． 粒子がリポソーム、ベシクル、または金ナノ粒子である、実施形態３１０に記載の方法。
３１２． 粒子がリポソームである、実施形態３１１に記載の方法。
３１３． 粒子がベシクルである、実施形態３１１に記載の方法。
３１４． 粒子が金ナノ粒子である、実施形態３１１に記載の方法。
３１５． 接触させることが、システムを細胞へベクターを介して送達することを含む、実施形態３０９に記載の方法。
３１６． ベクターがウイルスベクターである、実施形態３１５に記載の方法。
３１７． ウイルスベクターがレンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである、実施形態３１６に記載の方法。
３１８． ウイルスベクターがレンチウイルスである、実施形態３１７に記載の方法。
３１９． ウイルスベクターがアデノウイルスである、実施形態３１７に記載の方法。
３２０． ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスである、実施形態３１７に記載の方法。
３２１． 細胞が幹細胞である、実施形態３０６～３２０のいずれか一実施形態に記載の方法。
３２２． 細胞がｉＰＳ細胞である、実施形態３０６～３２１のいずれか一実施形態に記載の方法。
３２３． 接触させることが、疾患表現型を引き起こすスプライス部位の活性を低下させる、実施形態３０６～３２２のいずれか一実施形態に記載の方法。
３２４． 接触させることが細胞において正常なスプライシングを回復させる、実施形態３０６～３２３のいずれか一実施形態に記載の方法。
３２５． 細胞が、遺伝子疾患を有する対象由来であり、または遺伝子疾患を有する対象由来の細胞から導かれる、実施形態３０６～３２４のいずれか一実施形態に記載の方法。
３２６． 接触させることがエクスビボで実施される、実施形態３２５に記載の方法。
３２７． 接触した細胞を対象の身体に戻すことをさらに含む、実施形態３２６に記載の方法。
３２８． 接触させることがインビボで実施される、実施形態３２５に記載の方法。
３２９． ３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１０４～１０６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３０． ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１０７～１０９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３１． ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１１０～１１４のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３２． ＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１１５～１１９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３３． ＩＶＳ９＋４６８０６Ｃ＞Ｔ変異を含むＤＭＤ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１２２～１２６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３４． ＩＶＳ６２＋６２２９６Ａ＞Ｇ変異を含むＤＭＤ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１２７～１３５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３５． ＩＶＳ１＋３６９４７Ｇ＞Ａ変異を含むＤＭＤ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１３６～１４２のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３６． ＩＶＳ２＋５５９１Ｔ＞Ａ変異を含むＤＭＤ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１４３～１４５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３７． ＩＶＳ８－１５Ａ＞Ｇ変異を含むＤＭＤ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１４６～１５４のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３３８． エクソン５０における変異を含むＤＭＤ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１５５～１６５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質と接触させることを含む方法。
３３９． ＩＶＳ２＋６４５Ｃ＞Ｔ変異を含むＨＢＢ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１６８～１７７のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４０． ＩＶＳ２＋７０５Ｔ＞Ｇ変異を含むＨＢＢ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１７８～１８６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４１． ＩＶＳ２＋７４５Ｃ＞Ｇ変異を含むＨＢＢ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１８７～１８９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４２． ＩＶＳ６＋１３Ｃ＞Ｔ変異を含むＦＧＢ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１９１～１９５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４３． ＩＶＳ４＋７９２Ｃ＞Ｇ変異を含むＳＯＤ１遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態１９７～１９９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４４． ＩＶＳ３＋２５５２Ａ＞Ｇ変異を含むＱＤＰＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２０１～２０３のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４５． ＩＶＳ４＋９１９Ｇ＞Ａ変異を含むＧＬＡ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２０５～２０７のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４６． ＩＶＳ１２＋１１Ｃ＞Ｇ変異を含むＬＤＬＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２０９～２１１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４７． ＩＶＳ１１＋２７６７Ａ＞Ｔ変異を含むＢＲＩＰ１遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２１３～２１５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４８． ＩＶＳ５＋１３Ａ＞Ｇ変異を含むＦ９遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２１７～２２１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３４９． ＩＶＳ２６＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を含むＣＥＰ２９０遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２２３～２２５のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３５０． ＩＶＳ２３＋１３５Ｇ＞Ａ変異を含むＣＯＬ２Ａ１遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２２７～２２９のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３５１． ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２３１～２４１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３５２． ＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２４２～２４６のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３５３． ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２４７～２６３のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３５４． ＩＶＳ１－１３Ｔ＞Ｇ変異を含むＧＡＡ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２６５～２７１のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３５５． ＩＶＳ６－２２Ｔ＞Ｇ変異を含むＧＡＡ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、対象の細胞、または対象の細胞から導かれた細胞を、実施形態２７２～２７８のいずれか一実施形態に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
３５６． 対象の細胞をシステムと接触させることを含む、実施形態３２９～３５５のいずれか一実施形態に記載の方法。
３５７． 細胞が幹細胞である、実施形態３５６に記載の方法。
３５８． 接触させることがエクスビボで実施され、かつ方法が、細胞をシステムと接触させた後、細胞を対象の身体に戻すことをさらに含む、実施形態３５６または実施形態３５７に記載の方法。
３５９． 接触させることがインビボで実施される、実施形態３５６または実施形態３５７に記載の方法。
３６０． 対象の細胞から導かれた細胞をシステムとエクスビボで接触させることを含み、かつ細胞をシステムと接触させた後、細胞を対象の身体に戻すことをさらに含む、実施形態３２９～３５５のいずれか一実施形態に記載の方法。
３６１． システムと接触した細胞がｉＰＳ細胞である、実施形態３６０に記載の方法。
３６２． （ａ）ＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質が野生型ＡｓＣａｓ１２ａまたは野生型ＬｂＣａｓ１２ａであり、
（ｂ）ＰＡＭ配列がＴＹＣＶ、ＣＣＣＣ、またはＡＣＣＣである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質がＡｓＣａｓ１２ ＲＲであり；および
（ｃ）ＰＡＭ配列がＴＡＴＶまたはＲＡＴＲである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質がＡｓＣａｓ１２ＲＶＲである、
実施形態３２９～３６１のいずれか一実施形態に記載の方法。
３６３． ＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質が野生型ＡｓＣａｓ１２ａである、実施形態３６２に記載の方法。
３６４． ＰＡＭ配列がＴＴＴＶである場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質が野生型ＬｂＣａｓ１２ａである、実施形態３６２に記載の方法。
３６５． 細胞をシステムと接触させることが、システムを細胞へ粒子またはベクターを介して送達することを含む、請求項３２９～３６４のいずれか一実施形態に記載の方法。
３６６． 接触させることが、システムを細胞へ粒子を介して送達することを含む、実施形態３６５に記載の方法。
３６７． 粒子がリポソーム、ベシクル、または金ナノ粒子である、実施形態３６６に記載の方法。
３６８． 粒子がリポソームである、実施形態３６７に記載の方法。
３６９． 粒子がベシクルである、実施形態３６７に記載の方法。
３７０． 粒子が金ナノ粒子である、実施形態３６７に記載の方法。
３７１． 接触させることが、システムを細胞へベクターを介して送達することを含む、実施形態３６５に記載の方法。
３７２． ベクターがウイルスベクターである、実施形態３７１に記載の方法。
３７３． ウイルスベクターがレンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである、実施形態３７２に記載の方法。
３７４． ウイルスベクターがレンチウイルスである、実施形態３７３に記載の方法。
３７５． ウイルスベクターがアデノウイルスである、実施形態３７３に記載の方法。
３７６． ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスである、実施形態３７３に記載の方法。
様々な特定の実施形態が例示および記載されているが、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変化がなされ得ることは理解されるだろう。
８． 参照の引用
この出願に引用された全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が個々に示され、全ての目的のために参照により組み入れられているのと同じ程度で、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み入れられている。本明細書に組み入れられた参考文献の１つまたは複数の教示と本開示との間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図される。

Claims (59)

  1. （ａ）ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメイン、および
    （ｂ）ループドメイン
    を含む、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子またはヒトＣＦＴＲ遺伝子を編集するためのＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、
    （ｉ）前記ターゲティング配列がヒトＵＳＨ２ＡまたはヒトＣＦＴＲゲノムＤＮＡ配列における標的ドメインに対応し、
    （ｉｉ）前記標的ドメインがＣａｓ１２ａタンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接しており、および
    （ｉｉｉ）（ａ）前記ｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓ１２ａタンパク質の、前記ゲノム配列を含有するヒト細胞への導入により、前記Ｃａｓ１２ａが、前記ゲノムＤＮＡを、前記ゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位から１５ヌクレオチドまでの地点で切断する、および／または（ｂ）前記ＰＡＭが、前記ゲノムＤＮＡによりコードされるスプライス部位から４０ヌクレオチド内にある、
    Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  2. 前記スプライス部位が潜在性スプライス部位であり、任意で、前記潜在性スプライス部位が前記ゲノムＤＮＡ配列における変異によって生成され、または前記ゲノムＤＮＡ配列における変異によって活性化されたものである、請求項１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ分子。
  3. 前記潜在性スプライス部位が前記ゲノムＤＮＡ配列における変異によって生成され、または前記ゲノムＤＮＡ配列における変異によって活性化され、かつ前記変異が前記ＰＡＭ配列の３’側１～２３ヌクレオチド地点に位置する、請求項２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  4. 前記変異が一塩基多型である、請求項２または３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  5. 前記潜在性スプライス部位におけるスプライシングが疾患表現型を生じる、請求項２～４のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  6. 前記潜在性スプライス部位が潜在性３’スプライス部位である、請求項２～５のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  7. 前記潜在性スプライス部位が潜在性５’スプライス部位である、請求項２～５のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  8. ４０～４４ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  9. 前記ターゲティング配列が２０～２４ヌクレオチド長である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  10. 前記プロトスペーサードメインが１７～２６ヌクレオチド長である、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  11. 前記ターゲティング配列と前記標的ドメインの相補体との間にミスマッチがない、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  12. 前記標的ドメインがヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子内にある、請求項１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  13. 前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子がｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異、ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異を有する、請求項１２に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  14. 前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子がｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を有する、請求項１３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  15. 前記標的ドメインが、ヌクレオチド配列
    Figure 2022520783000026
     を有する、請求項１４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  16. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列
    Figure 2022520783000027
     を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  17. 前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子がＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を有する、請求項１３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  18. 前記標的ドメインが、ヌクレオチド配列
    Figure 2022520783000028
     を有する、請求項１７に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  19. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列
    Figure 2022520783000029
     を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  20. 前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子がＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異を有する、請求項１３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  21. 前記標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号８８）またはＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号８９）を有する、請求項２０に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  22. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号８８）またはＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号８９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  23. 前記標的ドメインがヒトＣＦＴＲ遺伝子内にある、請求項１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  24. 前記ＣＦＴＲ遺伝子が、３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異、３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異、ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異、またはＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異である変異を有する、請求項２３に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  25. 前記変異が３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異である、請求項２４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  26. 前記標的ドメインがヌクレオチド配列ＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＣＡ（配列番号３８）を有する、請求項２５に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  27. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＣＡ（配列番号３８）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  28. 前記変異が３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異である、請求項２４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  29. 前記標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＧＧＧＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＴＡ（配列番号３９）を有する、請求項２８に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  30. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＧＧＧＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＴＡ（配列番号３９）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  31. 前記変異がＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異である、請求項２４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  32. 前記標的ドメインがヌクレオチド配列ＴＡＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＡ（配列番号４０）またはＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＣＡ（配列番号４１）を有する、請求項３１に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  33. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＴＡＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＡ（配列番号４０）またはＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＣＡ（配列番号４１）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  34. 前記変異がＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異である、請求項２４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  35. 前記標的ドメインがヌクレオチド配列ＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡＡ（配列番号４２）またはＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡ（配列番号４３）を有する、請求項３４に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  36. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列ＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡＡ（配列番号４２）またはＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡ（配列番号４３）を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  37. ターゲティング配列を含有するプロトスペーサードメインおよびループドメインを含むＣａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であって、前記ターゲティング配列が、ヌクレオチド配列：
    Figure 2022520783000030
     を有する標的ドメインに対応する、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
  38. 前記ループドメインが前記プロトスペーサードメインの５’側にある、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  39. 前記ループドメインがヌクレオチド配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＡＧＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３１）またはＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号２５）を有する、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡ。
  40. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードする核酸。
  41. Ｃａｓ１２ａタンパク質をさらにコードする、請求項４０に記載の核酸。
  42. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含む粒子。
  43. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａタンパク質およびｇＲＮＡを含むシステム。
  44. 請求項４０もしくは請求項４１に記載の核酸、請求項４２に記載の粒子、または請求項４３に記載のシステムを含む細胞。
  45. 細胞を変化させる方法であって、前記細胞を請求項４２記載の粒子または請求項４３に記載のシステムと接触させることを含む方法。
  46. 前記接触させることが、前記細胞において、疾患表現型を引き起こすスプライス部位の活性を低下させ、および／または正常なスプライシングを回復させる、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記細胞が、遺伝子疾患を有する対象由来であり、または遺伝子疾患を有する対象由来の細胞から導かれる、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
  48. 前記接触させることがエクスビボで実施され、任意で、前記方法が、前記接触した細胞を前記対象の身体に戻すことをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記接触させることがインビボで実施される、請求項４７に記載の方法。
  50. ｃ．７５９５－２１４４Ａ＞Ｇ変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、前記対象の細胞、または前記対象の細胞から導かれた細胞を、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
  51. ＩＶＳ４０－８Ｃ＞Ｇ変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、前記対象の細胞、または前記対象の細胞から導かれた細胞を、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
  52. ＩＶＳ６６＋３９Ｃ＞Ｔ変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、前記対象の細胞、または前記対象の細胞から導かれた細胞を、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
  53. ３２７２－２６Ａ＞Ｇ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、前記対象の細胞、または前記対象の細胞から導かれた細胞を、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
  54. ３８４９＋１０ｋｂＣ＞Ｔ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、前記対象の細胞、または前記対象の細胞から導かれた細胞を、請求項２８～３０のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
  55. ＩＶＳ１１＋１９４Ａ＞Ｇ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、前記対象の細胞、または前記対象の細胞から導かれた細胞を、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
  56. ＩＶＳ１９＋１１５０５Ｃ＞Ｇ変異を含むＣＦＴＲ遺伝子を有する対象を処置する方法であって、前記対象の細胞、または前記対象の細胞から導かれた細胞を、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａタンパク質を含むシステムと接触させることを含む方法。
  57. 前記対象の細胞を前記システムとエクスビボで接触させることを含み、かつ前記細胞を前記システムと接触させた後、前記細胞を前記対象の身体に戻すことをさらに含む、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記対象の細胞を前記システムとインビボで接触させることを含む、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記対象の細胞から導かれた細胞を前記システムとエクスビボで接触させることを含み、かつ前記細胞を前記システムと接触させた後、前記細胞を前記対象の身体に戻すことをさらに含む、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。
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