CN117321214A - 用于治疗囊性纤维化和有关障碍的组合物、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于有效递送至受试者细胞的组合物、试剂盒和方法。所述细胞可以是特定细胞类型，诸如基底细胞、纤毛细胞或分泌细胞。在某些情况下，所述细胞可以是特定细胞类型的肺细胞。本文还描述了包含用脂质组合物组装的治疗剂或预防剂的药物组合物。所述脂质组合物可以包含可电离的阳离子脂质、磷脂和选择性器官靶向脂质。本文进一步描述了用脂质组合物配制的治疗剂或预防剂的高效剂型。

Description

用于治疗囊性纤维化和有关障碍的组合物、方法和用途
交叉引用
本申请要求2021年4月5日提交的美国临时申请号63/171,071的权益，其整体通过引用并入本文用于所有目的。
背景
囊性纤维化(CF)是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因中的缺陷造成的常染色体隐性的遗传性疾病。CFTR基因编码参与氯离子和碳酸氢盐运输的cAMP门控通道。它通过抑制由SCNN1A基因编码的上皮钠通道来调节钠运输。在气道、胃肠道、生殖道、汗腺和粘膜下腺中的上皮细胞的顶端表面上表达CFTR。
具有CF的受试者可以在出生时或在婴儿早期就出现胰腺功能不全。胰腺功能障碍会导致脂肪和脂溶性维生素的吸收不良，这会造成发育不全以及胆石和胆道疾病。该疾病的肺部表现可以更严重，但可能在婴儿期或幼童时期稍晚于胰腺表现而出现。由降低的CFTR活性导致的氯离子和钠运输异常会造成肺中降低的顶端表面流体水平，这导致“粘性的”粘液和下气道阻塞。患有CF或CF-样疾病的受试者由于不能清除粘液而频繁遭受感染。局部炎症介质试图清除感染，但遇到困难。炎症、感染和阻塞的三联征导致肺实质的进行性破坏。最终，许多患有CF或CF-样疾病的受试者在其30多岁时因呼吸衰竭而死亡。
为囊性纤维化(CF)患者开发有效且持久的疗法仍然是一个重要且有意义的目标。值得注意的是，大多数具有在CFTR中的功能丧失突变的患者仍然无法用现有方案治疗。
包括CRISPR/Cas在内的基因编辑技术代表了一种革命性的基因校正方案，其如果被成功开发以校正CFTR突变，将是一项为CF患者(包括具有功能丧失突变的那些)提供持久治疗的变革性进展。一个关键瓶颈是缺乏在特定细胞(尤其是肺部细胞)中进行靶向编辑所需的递送策略。迄今为止，成功的体内编辑已经主要由病毒载体介导，由于潜在的免疫原性、关于罕见但危险的整合事件的担忧以及不能重新施用，所述病毒载体给临床转化带来了挑战。非病毒脂质纳米颗粒(LNP)递送在那些方面具有优势，但进展迄今为止限于肝脏中的靶标。
概述
在一个方面，本公开内容提供了一种用于增强细胞中囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性的方法，所述方法包含：(a)使所述细胞接触用脂质组合物组装的核酸编辑系统，所述核酸编辑系统包含(i)指导核酸，(ii)包含内切核酸酶的异源多肽或编码所述异源多肽的异源多核苷酸，和(iii)供体模板核酸，以在所述细胞中产生所述异源内切核酸酶与所述指导核酸的复合物；(b)在切割位点处用所述复合物切割所述细胞中的CFTR基因或转录物以产生被切割的CFTR基因或转录物；和(c)使用所述供体模板核酸来修复所述被切割的CFTR基因或转录物以在所述细胞中产生编码功能性CFTR蛋白的经修复的CFTR基因或转录物，由此增强所述细胞中CFTR蛋白的表达或活性。在某些实施方案中，c)的特征在于不超过约50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％或40％的脱靶插入或/和缺失(插入缺失(indel))率。在某些实施方案中，所述脱靶插入缺失率包含(1)被检测到具有错误地改变的CFTR基因或转录物的试验细胞的总数相对于(2)总试验细胞的总数的比率。在某些实施方案中，c)的特征在于至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的在靶修复率。在某些实施方案中，所述在靶修复率包含(1)被检测到具有修复的CFTR基因或转录物的试验细胞的总数相对于(2)总试验细胞的总数的比率。在某些实施方案中，与相应对照相比，所述方法增加所述细胞中功能性CFTR基因、转录物或蛋白的量(例如，增加至少约1.1倍)，任选地，其中所述相应对照是没有所述接触的相应细胞。在某些实施方案中，所述方法在所述细胞中产生治疗有效量的功能性CFTR基因、转录物或蛋白(例如，在所有可检测的CFTR基因、转录物或蛋白中的至少约10％、15％、20％、25％或30％)。在某些实施方案中，与相应对照相比，所述方法增强所述细胞中的(例如，氯离子)离子运输(例如，增强至少约1.1倍)，任选地，其中所述相应对照是没有所述接触的相应细胞。在某些实施方案中，(b)包含切割包含功能丧失突变的CFTR基因或转录物。在某些实施方案中，所述方法进一步包含从所述细胞衍生出细胞组合物。
在某些实施方案中，所述细胞是肺细胞。在某些实施方案中，所述细胞是肺基底细胞。在某些实施方案中，所述细胞是气道上皮细胞(例如，支气管上皮细胞)。在某些实施方案中，所述细胞是未分化的。在某些实施方案中，所述细胞是分化的。
在某些实施方案中，所述功能丧失突变包含在外显子中的突变，所述外显子选自CFTR的外显子9-27(例如，外显子10、外显子12)。在某些实施方案中，所述功能丧失突变是F508del或G542X。在某些实施方案中，所述功能丧失突变与囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)相关。
在某些实施方案中，所述接触是离体的。在某些实施方案中，所述接触是体外的。在某些实施方案中，所述接触是体内的。在某些实施方案中，所述接触是重复的。在某些实施方案中，所述接触包含接触包含所述细胞的多个细胞。
在某些实施方案中，所述修复在所述多个细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％中产生功能性CFTR基因、转录物或蛋白，任选地其中所述多个细胞是多个(例如，肺)基底细胞。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含：可电离的阳离子脂质；和与所述可电离的阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含与所述SORT脂质分开的磷脂。
在另一个方面，本公开内容提供了一种经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自以下细胞，所述细胞具有通过本文别处描述的方法增强的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性。
在另一个方面，本公开内容提供了包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，其中所述核酸编辑系统包含：(i)指导核酸，其包含与囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因或转录物的靶序列互补的靶向序列；(ii)包含内切核酸酶的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，所述内切核酸酶被构造成(1)与所述指导核酸形成复合物和(2)在切割事件中切割细胞中的所述CFTR基因或转录物；和(iii)供体模板核酸，其被构造成在所述切割事件之后改变所述CFTR基因或转录物，以在所述细胞中提供功能性CFTR基因、转录物或蛋白。在某些实施方案中，(ii)是信使核糖核酸(mRNA)，其编码所述包含内切核酸酶的多肽。在某些实施方案中，(i)和(iii)存在于两种不同的分子上。在某些实施方案中，(ii)是所述包含内切核酸酶的多肽。在某些实施方案中，(i)、(ii)和(iii)存在于三种不同的分子上。在某些实施方案中，(i)、(ii)和(iii)中的至少两种存在于一种分子上。在某些实施方案中，所述(i)和(ii)以1:1至1:20的摩尔或重量比存在于所述组合物中。在某些实施方案中，(i)和(iii)以1:1至1:30的摩尔或重量比存在于所述组合物中。
在某些实施方案中，所述指导核酸包含核苷酸序列，其选自在表A中所示的(或在本文别处公开的)那些及其互补序列。在某些实施方案中，所述供体模板核酸包含核苷酸序列，其选自在表B中所示的(或在本文别处公开的)那些及其互补序列。在某些实施方案中，所述供体模板核酸包含5’同源臂。在某些实施方案中，所述供体模板核酸包含3’同源臂。
在某些实施方案中，所述内切核酸酶是CRISPR相关的(Cas)多肽或其修饰物。在某些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。
在某些实施方案中，将所述组合物配制用于药物(例如，全身性)施用。
在另一个方面，本公开内容提供了一种经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自一种细胞，所述细胞包含通过本文别处公开的组合物生产的异源囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因、转录物或蛋白。
在另一个方面，本公开内容提供了一种遗传校正肺基底细胞中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使所述肺基底细胞与组合物接触，所述组合物包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统，由此将所述核酸编辑系统递送给所述肺基底细胞。
在另一个方面，本公开内容提供了一种遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使包含多个肺基底细胞的细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述多个肺基底细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％。
在另一个方面，本公开内容提供了一种遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使所述细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，所述细胞组合物包含肺基底细胞和肺非基底细胞，由此将所述核酸编辑系统递送给所述肺基底细胞，其量大于递送给所述肺非基底细胞的量。在某些实施方案中，所述非基底细胞是离子细胞、纤毛细胞或分泌细胞。在某些实施方案中，确定所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞表现出在CFTR基因中的突变。在某些实施方案中，所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞表现出在CFTR基因中的突变。
在某些实施方案中，所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞是来自受试者。在某些实施方案中，确定所述受试者表现出在CFTR基因中的突变。在某些实施方案中，所述受试者表现出在CFTR基因中的突变。
在某些实施方案中，所述接触是离体的。在某些实施方案中，所述接触是体外的。在某些实施方案中，所述接触是体内的。
在另一个方面，本公开内容提供了一种用于治疗具有或疑似具有囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)相关病症的受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物。在某些实施方案中，所述CFTR相关病症是囊性纤维化、遗传性肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)或它们的组合。在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，确定所述受试者表现出在CFTR基因中的突变(例如，F508del或G542X)。在某些实施方案中，所述施用包含全身施用。
本领域技术人员将从下述详细描述容易明白本申请的另外方面和优点，其中仅示出和描述本申请的示例性实施方案。如将意识到的，本申请能够具有其它的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，都不脱离本公开内容。因此，附图和描述在性质上应被认为是示例性的，而不是限制性的。
通过引用并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与在本说明书中含有的公开内容矛盾的情况下，本说明书意图替代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的图。具有彩图的该专利或专利申请公开文本的副本将在请求并支付必要的费用后由专利局提供。通过参考阐述示例性实施方案(其中利用了本发明的原理)的下述详细描述和附图(在本文中也称作“附图”和“图”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A-1D显示了各种组合物的插入缺失和敲入百分比的图。
图2A-2B显示了用于编辑和校正G542X CFTR突变的各种组合物的插入缺失和敲入百分比的图[GACAACACAGTTCTCTGAGAAGG＝SEQ ID NO:3]。
图3A-3B显示了使用不同比例的组分的各种组合物的插入缺失和敲入百分比的图。
图4A-4B显示了通过本申请中描述的脂质组合物将mRNA递送给小鼠基底细胞。图4C-4D显示了插入缺失和敲入百分比的图。
图5A-5B显示了如本文描述的HBE细胞处理的TIDER分析，说明基因编辑技术的编辑效率(图5A)和敲入％(图5B)。
详细描述
在描述本公开内容的实施方案之前，应当理解，这样的实施方案仅作为例子提供，并且在实践本发明时可以采用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。现在本领域技术人员将做出众多变体、变化和置换而不脱离本发明。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料都可以用于本发明实践或试验，但是下面描述了适合的方法和材料。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。另外，所述的材料、方法和实施例仅仅是示例性的，无意成为限制性的。现在本领域技术人员将做出众多变体、变化和置换而不脱离本发明。
在本申请的上下文中，除非另有说明，否则以下术语具有其所赋予的含义：
如贯穿说明书和权利要求书使用的，术语“一个”、“一种”和“所述”通常以这样的含义使用：它们是指所提及的组分或步骤中的“至少一个/种”、“至少第一个/种”、“一个/种或多个/种”或“多个”，除了其中在此后具体说明上限的情况以外。例如，本文中使用的“切割序列”是指“至少第一个切割序列”，但是包括多个切割序列。与任何单一试剂的量一样，本领域普通技术人员考虑到本申请将知晓组合的可操作限制和参数。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地使用，通常表示任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物，例如，通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，诸如与标记组分缀合。
如本文在多肽结构的上下文中所使用的，“N-端”(或“氨基端”)和“C-端”(或“羧基端”)通常分别表示多肽的最末端氨基和羧基末端。
本文中关于感兴趣的多肽或多核苷酸序列使用的术语“N-端末端序列”通常是指，在N-端末端处，在感兴趣的多肽或多核苷酸序列中的N-端末端序列之前没有其它氨基酸或核苷酸残基。本文中关于感兴趣的多肽或多核苷酸序列使用的术语“C-端末端序列”通常是指，在C-端末端处，在感兴趣的多肽或多核苷酸序列中的C-端末端序列之后没有其它氨基酸或核苷酸残基。
术语“非天然存在的”和“非天然的”在本文中可互换地使用。本文中关于多肽或多核苷酸使用的术语“非天然存在的”或“非天然的”通常是指，所述试剂不是在哺乳动物(包括、但不限于人)中生物衍生的。术语“非天然存在的”或“非天然的”，当应用于序列和如本文所用时，意指不具有相应物、与在哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不互补或不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，当适当比对时，与天然序列相比，非天然存在的多肽或片段可以具有不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更少的氨基酸序列同一性。
“生理条件”表示模拟活受试者的那些条件的活宿主中的一组条件以及体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经建立了许多用于体外测定的生理相关条件。通常，生理缓冲液含有生理浓度的盐并被调节至约6.5至约7.8且优选约7.0至约7.5的范围内的中性pH。Sambrook等人(2001)列出了多种生理缓冲液。生理相关的温度范围为约25℃至约38℃且优选约35℃至约37℃。
本文中使用的术语“治疗”或“处理”或“减轻”或“改善”在本文中可互换地使用。这些术语通常表示用于获得有益的或期望的结果(包括、但不限于治疗益处和/或预防益处)的方案。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在障碍。并且，治疗益处如下实现：根除或改善一种或多种生理学症状或改善与潜在障碍相关的一种或多种临床参数，从而在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍受潜在障碍折磨。为了预防益处，可以将组合物施用给处于发生特定疾病的风险中的受试者，或施用给报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
本文中使用的“治疗效果”或“治疗益处”通常表示，除了生物活性蛋白所具有的诱导针对抗原表位的抗体的产生的能力之外，由施用本公开内容的多肽引起的生理效果，包括、但不限于疾病的缓解、改善或预防，或者与人类或其它动物中的基础障碍相关的一种或多种临床参数的改善，或以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康。为了预防益处，可以将组合物施用给处于发生特定疾病、先前疾病复发、疾病的状况或症状的风险中的受试者，或施用给报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
本文中使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”通常表示单独的或作为多肽组合物的一部分的药物或生物活性蛋白的量，当以一个或重复剂量施用给受试者时，其能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益效果。这样的效果不一定是绝对有益的。治疗有效量的确定完全是在本领域技术人员的能力之内，特别是根据本文中提供的详细公开内容。
术语“当量摩尔剂量”通常是指，基于在所述剂量中使用的材料的分子量，施用给受试者的材料的量具有相当的摩尔量。
本文中使用的术语“治疗上有效的和无毒的剂量”通常表示如本文中定义的组合物的耐受剂量，其足够高以造成肿瘤或癌细胞的耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定，而在受试者中没有或基本上没有重大毒性效应。这样的治疗上有效且无毒的剂量可以通过本领域中描述的剂量递增研究来确定，并且应该低于诱发严重不良副作用的剂量。
术语“癌”和“癌性的”表示或描述通常以失调的细胞生长/增殖为特征的哺乳动物中的生理状况。
当在化学基团的上下文中使用时：“氢”是指-H；“羟基”是指-OH；“氧代”是指＝O；“羰基”是指-C(＝O)-；“羧基”是指-C(＝O)OH(也写作-COOH或-CO2H)；“卤代”独立地指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”是指-NH2；“羟氨基”是指-NHOH；“硝基”是指-NO2；亚氨基是指＝NH；“氰基”是指-CN；“异氰酸酯”是指-N＝C＝O；“叠氮基”是指-N3；在单价上下文中，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)2或其去质子化形式；在二价上下文中，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”是指-SH；且“硫代”是指＝S；“磺酰基”是指-S(O)2-；“羟基磺酰基”是指-S(O)2OH；“磺酰胺”是指-S(O)2NH2；且“亚磺酰基”是指-S(O)-。
在化学式的上下文中，符号“-”是指单键，“＝”是指双键，且是指三键。符号“----”代表任选的键，其如果存在的话是单键或双键。符号/>代表单键或双键。因而，例如，式/>包括/>和/>且应当理解，没有一个这样的环原子形成超过一个双键的一部分。此外，应当指出，当连接一个或两个立体原子时，共价键符号“-”未指示任何优选的立体化学。相反，它涵盖所有立体异构体及其混合物。当垂直穿过键绘制时(例如，对于甲基，/>)，符号/>指示该基团的连接点。应当指出，通常仅以这种方式为较大的基团标识连接点，以帮助读者明确标识连接点。符号/>是指单键，其中连接至楔的粗端的基团“从纸面出来”。符号/>是指单键，其中连接至楔的粗端的基团“进入纸面”。符号/>“是指单键，在双键周围的几何形状(例如，E或Z)未确定。因此，两种选择以及它们的组合都是预期的。在本申请中显示的结构的原子上的任何未定义化合价暗含地表示与该原子键合的氢原子。在碳原子上的粗体点指示，与该碳相连的氢朝向纸面之外。
当一个基团“R”被描述为在环系上的“浮动基团”时，例如，在下式中：
则R可以替代与环原子中的任一个相连的任何氢原子，包括所描绘的、暗示的或明确定义的氢，只要形成稳定的结构即可。当一个基团“R”被描述为在稠合环系上的“浮动基团”时，例如，在下式中：
则R可以替代与稠合环中的任一个的任何环原子相连的任何氢，除非另有说明。可替换的氢包括所描绘的氢(例如、在上式中与氮连接的氢)、隐含的氢(例如、未示出但理解为存在的上式中的氢)、明确定义的氢以及其存在取决于环原子的身份的任选氢(例如，当X等于-CH-时，与基团X相连的氢)，只要形成稳定的结构即可。在所示的例子中，R可以位于稠合环系的5元或6元环上。在上式中，在括号中的基团“R”后面紧跟着的下标字母“y”表示数字变量。除非另有说明，否则此变量可以是0、1、2或大于2的任何整数，仅受限于环或环系统的可替换氢原子的最大数目。
对于化学基团和化合物类别，该基团或类别中的碳原子的数目如下指示：“Cn”定义了该基团/类别中的碳原子的确切数目(n)。“C≤n”定义了可以在该基团/类别中的碳原子的最大数目(n)，而最小数目对于所讨论的基团/类别而言尽可能小，例如，应当理解，基团“烯基(C≤8)”或类别“烯烃(C≤8)”中的碳原子的最小数目是2。与“烷氧基(C≤10)”相比，它指示具有1-10个碳原子的烷氧基。“Cn-n′”定义了基团中碳原子的最小数目(n)和最大数目(n′)。因而，“烷基(C2-10)”表示具有2-10个碳原子的那些烷基。这些碳数指示符可以在其修饰的化学基团或类别之前或之后，并且它可以包封或不包封在括号中，而不表示含义的任何变化。因而，术语“C5烯烃”、“C5-烯烃”、“烯烃(C5)”和“烯烃C5”都是同义的。
当用于修饰化合物或化学基团时，术语“饱和的”是指该化合物或化学基团不具有碳-碳双键和碳-碳三键，除非如下所述。当该术语用于修饰原子时，它是指该原子不是任何双键或三键的部分。在饱和基团的被取代形式的情况下，可以存在一个或多个碳氧双键或碳氮双键。并且当这样的键存在时，则不排除可能作为酮-烯醇互变异构现象或亚胺/烯胺互变异构现象的一部分出现的碳-碳双键。当术语“饱和的”用于修饰物质的溶液时，它是指没有更多的该物质可以溶解在该溶液中。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“脂族的”表示如此修饰的化合物或化学基团是无环的或环状的、但非芳族的烃化合物或基团。在脂族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳族环(脂环族)连接在一起。脂族化合物/基团可以是饱和的，即通过单个碳-碳键连接(烷烃/烷基)，或不饱和的，具有一个或多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或多个碳-碳三键(炔烃/炔基)。
术语“芳族”当用于修饰化合物或化学基团原子时是指，所述化合物或化学基团含有通过形成环的键的相互作用而稳定化的原子的平面不饱和环。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷基”表示单价饱和脂族基团，其具有碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr或丙基)、-CH(CH3)2(i-Pr、iPr或异丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基、叔丁基、t-Bu或tBu)和-CH2C(CH3)3(新戊基)是烷基的非限制性例子。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷二基”表示二价饱和脂族基团，其具有1个或2个饱和碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-和-CH2CH2CH2-是烷二基的非限制性例子。“烷烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是烷基，该术语如上面所定义。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。下述基团是被取代的烷基的非限制性例子：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。术语“卤代烷基”是被取代的烷基的子集，其中氢原子替换限于卤代(即-F、-Cl、-Br或-I)，使得不存在除碳、氢和卤素外的其它原子。基团-CH2Cl是卤代烷基的一个非限制性例子。术语“氟代烷基”是被取代的烷基的子集，其中氢原子替换限于氟代，使得不存在除碳、氢和氟外的其它原子。基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3是氟代烷基的非限制性例子。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷基”表示具有碳原子作为连接点的单价饱和脂族基团，所述碳原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。非限制性例子包括:-CH(CH2)2(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(Cy)。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷二基”表示具有2个碳原子作为连接点的二价饱和脂族基团，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团是环烷二基基团的一个非限制性例子。“环烷烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是环烷基，该术语如上面所定义。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烯基”表示具有碳原子作为连接点的单价不饱和脂族基团，其具有直链或支链无环结构，至少一个非芳族碳-碳双键，没有碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。非限制性例子包括:-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CHCH＝CH2。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烯烃二基”表示二价不饱和脂族基团，其具有2个碳原子作为连接点，具有直链或支链、直链或支链无环结构，至少一个非芳族碳-碳双键，没有碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和-CH2CH＝CHCH2-是烯烃二基基团的非限制性例子。应当指出，尽管烯烃二基基团是脂族的，但一旦在两端连接，就不排除该基团形成芳族结构的一部分。术语“烯烃”和“链烯烃”是同义的，并且表示具有式H-R的化合物类别，其中R是烯基，该术语如上面所定义。类似地，术语“末端烯烃”和“α-烯烃”是同义的且表示具有刚好一个碳-碳双键的烯烃，其中该键是在分子的末端处的乙烯基的部分。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是被取代的烯基的非限制性例子。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“炔基”表示具有碳原子作为连接点的单价不饱和脂族基团，其具有直链或支链无环结构，至少一个碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。本文中使用的术语炔基不排除一个或多个非芳族碳-碳双键的存在。基团-C≡CH、-C≡CCH3和-CH2C≡CCH3是炔基的非限制性例子。“炔烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是炔基。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“芳基”表示具有芳族碳原子作为连接点的单价不饱和芳族基团，所述碳原子形成一个或多个6元芳族环结构的一部分，其中所述环原子都是碳，且其中所述基团不由除碳和氢以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。本文中使用的该术语不排除连接至第一个芳族环或存在的任何额外芳族环的一个或多个烷基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。芳基基团的非限制性例子包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和从联苯衍生出的单价基团。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“芳烃二基”表示具有2个芳族碳原子作为连接点的二价芳族基团，所述碳原子形成一个或多个6元芳族环结构的一部分，其中所述环原子都是碳，且其中所述单价基团不由除碳和氢以外的原子组成。本文中使用的该术语不排除连接至第一个芳族环或存在的任何额外芳族环的一个或多个烷基、芳基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环可以通过以下一种或多种连接：共价键、烷二基或烯烃二基基团(碳数限制允许)。芳烃二基基团的非限制性例子包括：
“芳烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是芳基，该术语如上面所定义。苯和甲苯是芳烃的非限制性例子。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“芳烷基”表示单价基团-烷二基-芳基，其中术语烷二基和芳基各自以与上面提供的定义一致的方式使用。非限制性例子是：苯基甲基(苄基,Bn)和2-苯基-乙基。当术语芳烷基与“取代的”修饰词一起使用时，来自烷二基和/或芳基基团的一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。取代的芳烷基的非限制性例子是：(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂芳基”表示具有芳族碳原子或氮原子作为连接点的单价芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述杂芳基不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。杂芳基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧和硫的环原子。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。本文中使用的该术语不排除连接至芳族环或芳族环系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳基的非限制性例子包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、异噁唑基、甲基吡啶基、噁唑基、苯基吡啶基、吡啶基(吡啶基)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“N-杂芳基”表示具有氮原子作为连接点的杂芳基。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂芳烃二基”表示二价芳族基团，其具有2个芳族碳原子、2个芳族氮原子、或1个芳族碳原子和1个芳族氮原子作为2个连接点，所述原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述二价基团不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环可以通过以下一种或多种连接：共价键、烷二基或烯烃二基基团(碳数限制允许)。本文中使用的该术语不排除连接至芳族环或芳族环系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳烃二基的非限制性例子包括：
“杂芳烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性例子。当这些术语与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂环烷基”表示具有碳原子或氮原子作为连接点的单价非芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述杂环烷基不由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。杂环烷基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧或硫的环原子。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。本文中使用的该术语不排除连接至环或环系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。并且，该术语不排除一个或多个双键在环或环系中的存在，前提条件是，得到的基团仍然是非芳族的。杂环烷基的非限制性例子包括氮杂环丙基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡喃基、氧杂环丙基和氧杂环丁基。术语“N-杂环烷基”表示具有氮原子作为连接点的杂环烷基。N-吡咯烷基是这样的基团的一个例子。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂环烷二基”表示具有2个碳原子、2个氮原子、或1个碳原子和1个氮原子作为2个连接点的二价环状基团，所述原子形成一个或多个环结构的部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述二价基团不由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环可以通过以下一种或多种连接：共价键、烷二基或烯烃二基基团(碳数限制允许)。本文中使用的该术语不排除连接至环或环系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。并且，该术语不排除一个或多个双键在环或环系中的存在，前提条件是，得到的基团仍然是非芳族的。杂环烷二基的非限制性例子包括：
当这些术语与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“酰基”表示基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基或杂芳基，那些术语如上面所定义。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基、Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(咪唑基)是酰基基团的非限制性例子。“硫代酰基”以类似的方式定义，但是基团-C(O)R的氧原子已经用硫原子替换，-C(S)R。术语“醛”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经被-CHO基团替换。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子(包括直接连接至羰基或硫代羰基的碳原子的氢原子，如果有的话)已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨甲酰基)和-CON(CH3)2是被取代的酰基基团的非限制性例子。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷氧基”表示基团-OR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。非限制性例子包括:-OCH3(甲氧基)、-OCH2CH3(乙氧基)、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2(异丙氧基)、-OC(CH3)3(叔-丁氧基)、-OCH(CH2)2、-O-环戊基和-O-环己基。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷氧基”、“烯基氧基”、“炔基氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳氧基”、“杂环烷氧基”和“酰氧基”表示定义为-OR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基和酰基。术语“烷氧基二基”表示二价基团-O-烷二基-、-O-烷二基-O-或-烷二基-O-烷二基-。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷硫基”和“酰基硫基”表示基团-SR，其中R分别是烷基和酰基。术语“醇”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经用羟基基团替换。术语“醚”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经用烷氧基替换。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷基氨基”表示基团-NHR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。非限制性例子包括：-NHCH3和-NHCH2CH3。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“二烷基氨基”表示基团-NRR′，其中R和R′可以是相同的或不同的烷基，或R和R′可以一起代表烷二基。二烷基氨基基团的非限制性例子包括：-N(CH3)2和-N(CH3)(CH2CH3)。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷基氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷基氨基”、“杂芳基氨基”、“杂环烷基氨基”、“烷氧氨基”和“烷基磺酰基氨基”表示被定义为-NHR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基、烷氧基和烷基磺酰基。芳基氨基基团的一个非限制性例子是-NHC6H5。术语“烷基氨基二基”表示二价基团-NH-烷二基-、-NH-烷二基-NH-或-烷二基-NH-烷二基-。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“酰氨基”(酰基氨基)表示基团-NHR，其中R是酰基，该术语如上面所定义。酰氨基基团的一个非限制性例子是-NHC(O)CH3。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷基亚氨基”表示二价基团＝NR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，连接至碳原子的一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是被取代的酰氨基基团的非限制性例子。
贯穿本申请，术语“约”用于表示，值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变异、或研究受试者之间存在的变异。除非另外指出，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示成分、反应条件等的量的所有数字在所有情况下应理解为由术语“约”修饰。因此，除非相反说明，否则在本说明书和所附的权利要求书中阐述的数字参数是近似值，其可以根据本申请所寻求获得的期望性能而变化。一般而言，本文中使用的术语“约”在表示可测量的值诸如重量、时间、剂量等的量时意在涵盖从指定的量的以下变异：在一个实施例中±20％或±10％，在另一个实施例中±5％，在另一个实施例中±3％，在另一个实施例中±1％，和在又另一个实施例中±0.1％，因为这样的变异适合于执行公开的方法。
如在本申请中使用的，术语“平均分子量”表示每种聚合物物质的摩尔数与该物质的摩尔质量之间的关系。具体地，每种聚合物分子可具有不同的聚合水平以及因此具有不同的摩尔质量。平均分子量可以用来表示多个聚合物分子的分子量。平均分子量通常与平均摩尔质量同义。具体地，有三种主要类型的平均分子量：数量平均摩尔质量、重量(质量)平均摩尔质量和Z-平均摩尔质量。在本申请的上下文中，除非另外指出，否则平均分子量代表该式的数量平均摩尔质量或重量平均摩尔质量。在某些实施方案中，是数量平均摩尔质量。在某些实施方案中，平均分子量可用于描述存在于脂质中的PEG组分。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法并不限于仅具有那一个或多个步骤，并且还涵盖其它未列出的步骤。
当在本说明书和/或权利要求书中使用该术语时，术语“有效的”意指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的背景下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指在对受试者或患者施用所述化合物以治疗疾病时，该化合物的量足以实现对疾病的这种治疗。
本文中使用的术语“IC50”表示获得最大应答的50％的抑制剂量。该定量量度指示将给定的生物过程、生物化学过程或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半所需的特定药物或其它物质(抑制剂)的量。
第一化合物的“异构体”是这样的单独化合物：其中每个分子含有与所述第一化合物相同的组分原子，但其中那些原子的三维构型不同。
本文中使用的术语“患者”或“受试者”表示活的哺乳动物生物体，诸如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，所述患者或受试者是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)。在某些实施方案中，所述患者或受试者是人类。人类受试者的非限制性例子是成年人、青少年、婴儿和胎儿。
在将有效负载递送至靶细胞的上下文中，本文中使用的术语“组装”或“组装的”通常表示共价或非共价相互作用或结合，例如，使得治疗剂或预防剂与脂质组合物复合或被封装在脂质组合物中。
本文中使用的术语“脂质组合物”通常表示包含脂质化合物(包括、但不限于脂复合物、脂质体、脂质颗粒)的组合物。脂质组合物的例子包括悬浮液、乳剂和囊泡组合物。
本文中使用的术语“可检测的”表示通过观察或通过仪器可直接或间接检测的信号的出现或变化。通常，可检测的应答是信号的出现，其中荧光团在本质上是荧光的并且在与金属离子或生物化合物结合后不产生信号的变化。可替换地，可检测的应答是光学响应，其导致波长分布图案或吸光度或荧光强度的变化或者光散射、荧光寿命、荧光偏振或上述参数的组合的变化。其它可检测的应答包括例如化学发光、磷光、来自放射性同位素的辐射、磁引力和电子密度。
本文中与核酸编辑组合物的递送关联地使用的术语“有效的”或“效能”通常表示递送系统(例如，脂质组合物)在细胞(例如，靶向的细胞)中达到或实现核酸编辑系统的期望量、活性或效果(诸如蛋白或基因的翻译、转录、生产或活性的期望水平)至任何可测量的程度的更大能力，例如相对于参考递送系统。例如，具有较高效能的脂质组合物可以在更大数目的相关细胞中、在更短的应答时间内或持续更长的时间段实现期望的治疗效果。
本文中普遍使用的“药学上可接受的”表示这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：其在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
“药学上可接受的盐”是指如上文所定义的药学上可接受的并且具有期望的药理学活性的本申请的化合物的盐。这样的盐包括与以下酸形成的酸加成盐：无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸诸如1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂族单和二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡萄庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基-取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括在存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基还原葡糖胺等。应当认识到，形成本公开内容的任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子不是至关重要的，只要所述盐作为整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其它例子和它们的制备方法与使用方法呈现于Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,and Use(P.H.Stahl和C.G.Wermuth编,VerlagHelvetica Chimica Acta,2002)。
本文中使用的术语“药学上可接受的载体”是指参与运载或运输化学药剂的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。
“预防”或“防止”包括：(1)抑制受试者或患者的疾病发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或征状；和/或(2)减慢受试者或患者的疾病的病状或征状发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或征状。
“重复单元”是特定材料的最简单的结构实体，例如，框架和/或聚合物，无论是有机的、无机的还是金属有机的。在聚合物链的情况下，重复单元沿着链依次连接在一起，就像项链的珠子一样。例如，在聚乙烯-[-CH2CH2-]n-中，重复单元是-CH2CH2-。下标“n”表示聚合度，也就是说，连接在一起的重复单元的数量。当“n”的值未定义时或在“n”不存在的情况下，它只是指示括号内该式的重复以及材料的聚合性质。重复单元的概念同样适用于重复单元之间的连接性三维地延伸的场合，诸如在金属有机框架、改性聚合物、热固性聚合物等中。在树枝状聚合物或树枝状大分子的上下文中，重复单元也可以被描述为分支单元、内层或代。类似地，封端基团也可以被描述为表面基团。
“立体异构体”或“光学异构体”是这样的给定化合物的异构体：其中，相同的原子键合到相同的其它原子上，但其中那些原子的三维构型不同。“对映异构体”是给定化合物的立体异构体，其像左手和右手一样互为镜像。“非对映异构体”是给定化合物的并非对映异构体的立体异构体。手性分子含有手性中心(也被称作立构中心或立体中心)，它是携带多个基团的分子中的任意点(尽管不一定是原子)，使得任意2个基团的互换会产生立体异构体。在有机化合物中，手性中心通常是碳、磷或硫原子，尽管其它原子也可能成为有机和无机化合物中的立构中心。分子可以具有多个立构中心，从而产生它的许多立体异构体。在其立体异构现象可归因于四面体立体中心(例如，四面体碳)的化合物中，假定可能的立体异构体的总数不会超过2n，其中n是四面体立构中心的数目。具有对称性的分子经常具有比立体异构体的最大可能数目更小的数目。对映异构体的50:50混合物被称作外消旋混合物。可替换地，可以对映异构地富集对映异构体的混合物，使得一种对映异构体以大于50％的量存在。通常，使用本领域已知的技术，可以拆分或分离对映异构体和/或非对映异构体。预期对于尚未定义其立体化学的任何立构中心或手性轴，该立构中心或手性轴可以以它的R形式、S形式或作为所述R形式和S形式的混合物(包括外消旋混合物和非外消旋混合物)存在。本文中使用的短语“基本上不含有其它立体异构体”是指所述组合物含有≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％、或最优选≤1％的另外一种或多种立体异构体。
“治疗”包括(1)抑制正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者的所述疾病(例如，阻止所述病状和/或征状的进一步发展)，(2)改善正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者的所述疾病(例如，逆转所述病状和/或征状)，和/或(3)使正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者的所述疾病出现任何可测量的减轻。
作为本文所使用的术语，“脱靶插入缺失”通常表示在gRNA分子的靶向结构域的靶序列以外的位点处或附近的插入缺失。相对于gRNA的靶向结构域的序列，这样的位点可以包含例如1、2、3、4、5个或更多个错配核苷酸。
以上定义替代在通过引用并入本文的任何参考文献中的任何冲突的定义。但是，对某些术语加以定义的事实不应当被认为表示未被定义的任何术语是不确定的。相反，所使用的所有术语均被认为以使得普通技术人员可以明白范围并实施本申请的方式描述本公开内容。
核酸编辑系统
本文中公开的内容包括组合物，其包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统(例如，包封在其中)，其中所述核酸编辑系统包含：(i)指导核酸，其包含与(例如，内源)(例如，突变体)囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因或转录物的靶序列互补的靶向序列；(ii)(例如，异源)多肽(诸如本文描述的那种)，其包含编码所述多肽的(例如，异源)执行部分(诸如内切核酸酶)或(例如，异源)多核苷酸(诸如本文描述的那种)，所述执行部分被构造成(1)与所述指导核酸形成复合物和(2)在切割事件中切割细胞中的所述(例如，内源)(例如，突变体)CFTR基因或转录物；和(iii)供体模板核酸，其被构造成在所述切割事件之后改变所述(例如，内源)(例如，突变体)CFTR基因或转录物，以在所述细胞中提供功能性CFTR基因、转录物或蛋白。所述组合物可以用于增强表现出(例如，内源)突变体CFTR基因或转录物的细胞中囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性。
在某些实施方案中，所述指导核酸包含核苷酸序列，其选自在表A中所示的(或在本文别处公开的)那些及其互补序列。所述指导核酸的靶向序列可以包含核苷酸序列，其选自在表A中所示的(或在本文别处公开的)那些及其互补序列。所述靶序列可以位于CFTR基因或转录物的区域内。例如，所述靶序列可以对相对于相应野生型对应部分具有CFTR突变的区域具有特异性。所述靶序列可以位于编码ATP结合结构域、内部无序结构域、跨膜结构域、转运蛋白结构域、PDZ结构域或者CFTR蛋白、基因或转录物的其它区域、结构域或基序的区域内。外显子10是人CFTR中F508del突变的位置。外显子12是小鼠CFTR基因中G542X突变的位置。(例如，异源)执行部分(诸如内切核酸酶)可以被构造成在侧接CFTR突变的切割位点处切割(例如，内源)CFTR基因或转录物。
表A:指导物的非限制性示例序列
在某些实施方案中，所述供体模板核酸被构造成在切割事件中在切割位点处或附近将一个或多个核苷酸插入内源(例如，突变体)CFTR基因或转录物中。在某些实施方案中，所述供体模板核酸包含核苷酸序列，其选自在表B中所示的(或在本文别处公开的)那些及其互补序列。在某些实施方案中，所述供体模板核酸包含5’同源臂。在某些实施方案中，所述供体模板核酸包含3’同源臂。在某些实施方案中，所述供体模板核酸包含5’同源臂和3’同源臂。所述供体模板核酸可以包含野生型CFTR基因或转录物(或其片段)的序列。所述供体模板核酸可以是(例如，单链)寡核苷酸供体(ODN)。所述供体模板序列可以与靶序列区域具有同源性，使得可以利用基于同源性的修复机制。例如，所述供体模板核酸可以具有靶位置或切割位置的3'和5'同源性。所述同源臂可以与靶序列退火并允许基于同源性的修复发生并允许供体核酸的掺入。
在某些实施方案中，所述供体模板核酸被构造成在切割位点处或附近将一个或多个核苷酸插入所述突变体CFTR基因或转录物。所述一个或多个核苷酸可以对应于野生型CFTR的序列。所述一个或多个核苷酸的插入可能造成突变体CFTR基因或转录物被修复，使得所述基因或转录物对应于野生型CFTR(或非突变体序列)。所述供体模板核酸可以允许序列被插入到基因中，并且可以用于校正缺失。所述供体模板核酸可以被构造成在所述切割事件之后在同源定向修复(HDR)途径或事件中改变突变体CFTR基因或转录物。
表B:HDR模板的非限制性示例序列
在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(ii)是信使核糖核酸(mRNA)，其编码包含所述(例如，异源)执行部分(诸如内切核酸酶)的多肽。在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(ii)是包含所述(例如，异源)执行部分(诸如内切核酸酶)的多肽。所述(例如，异源)执行部分(诸如内切核酸酶)可以是CRISPR相关的(Cas)多肽或其修饰物。所述(例如，异源)执行部分(诸如内切核酸酶)可以是Cas9、Cas12、Cas13、Cpf1(或Cas12a)、C2C1、C2C2(或Cas13a)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、C2C3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Csnl、Csxl2、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4或Cul966；其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。所述(例如，异源)执行部分(诸如内切核酸酶)可以是Cas9。
表C.编码执行部分的多核苷酸的非限制性示例序列
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在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(i)和(iii)存在于两种不同的分子上。在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(i)、(ii)和(iii)存在于三种不同的分子上。在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(i)、(ii)和(iii)中的至少两种存在于一种分子上。
在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(i)和(ii)以不是1:1的摩尔比存在。在某些实施方案中，(i)和(ii)以小于1:1的摩尔或重量比存在(指示存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(i)的摩尔数小于存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(ii)的摩尔数)。在某些实施方案中，(i)和(ii)以至多约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(i)和(ii)以至少约1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(i)和(ii)以约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30或前述值中的任何两个之间的范围的摩尔或重量比存在。
在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(ii)和(i)以不是1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(ii)和(i)以小于1:1的摩尔或重量比存在(指示存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(ii)的摩尔数小于存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(i)的摩尔数)。在某些实施方案中，(ii)和(i)以至多约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(ii)和(i)以至少约1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(ii)和(i)以约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30或前述值中的任何两个之间的范围的摩尔或重量比存在。
在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(i)和(iii)以不是1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(i)和(iii)以小于1:1的摩尔或重量比存在(指示存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(i)的摩尔数小于存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(iii)的摩尔数)。在某些实施方案中，(i)和(iii)以至多约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(i)和(iii)以至少约1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(i)和(iii)以约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30或前述值中的任何两个之间的范围的摩尔或重量比存在。
在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(iii)和(i)以不是1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(iii)和(i)以小于1:1的摩尔或重量比存在(指示存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(iii)的摩尔数小于存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(i)的摩尔数)。在某些实施方案中，(iii)和(i)以至多约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(iii)和(i)以至少约1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(iii)和(i)以约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30或前述值中的任何两个之间的范围的摩尔或重量比存在。
在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(ii)和(iii)以不是1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(ii)和(iii)以小于1:1的摩尔或重量比存在(指示存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(ii)的摩尔数小于存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(iii)的摩尔数)。在某些实施方案中，(ii)和(iii)以至多约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(ii)和(iii)以至少约1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(ii)和(iii)以约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30或前述值中的任何两个之间的范围的摩尔或重量比存在。
在所述组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，(iii)和(ii)以不是1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(iii)和(ii)以小于1:1的摩尔或重量比存在(指示存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(iii)的摩尔数小于存在于所述组合物或核酸编辑系统中的(ii)的摩尔数)。在某些实施方案中，(iii)和(ii)以至多约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(iii)和(ii)以至少约1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1的摩尔或重量比存在。在某些实施方案中，(iii)和(ii)以约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29或1:30或前述值中的任何两个之间的范围的摩尔或重量比存在。
在某些实施方案中，在切割事件中，所述异源执行部分(诸如内切核酸酶)在侧接所述突变的切割位点处切割所述(例如，突变体)CFTR基因或转录物。所述切割事件可以切离包含突变的CFTR基因的一部分。例如，突变可以是插入，且所述切割可以除去所述插入。所述切割事件可以切割核酸酶的主链，而不切除核苷酸。突变体CFTR基因或转录物可以包含相对于相应野生型对应物的突变。所述CFTR突变可能与囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)相关。所述突变可以选自F508del、G542X或它们的组合。所述突变体CFTR基因或转录物可以包含在CFTR基因的外显子9-27(例如，外显子10、外显子12)中的一个或多个中的(例如，无义或移码)突变。
多核苷酸
在某些实施方案中，所述多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸，诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA)，用于与本文描述的指导RNA指导的核酸酶形成复合物。在某些实施方案中，所述多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸指导的异源核酸酶。所述核酸酶可以是执行部分(诸如内切核酸酶)。指导多核苷酸指导的异源内切核酸酶的非限制性例子可以选自CRISPR相关的(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关的(Cas)多肽、II型CRISPR相关的(Cas)多肽、III型CRISPR相关的(Cas)多肽、IV型CRISPR相关的(Cas)多肽、V型CRISPR相关的(Cas)多肽和VI型CRISPR相关的(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录活化剂样效应核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关的RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如，原核Argonaute(pAgo)、古细菌Argonaute(aAgo)、真核Argonaute(eAgo)和格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo))；作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；CIRT、PUF、归巢内切核酸酶或其任何功能片段、其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。
本文提供的组合物或核酸编辑系统的某些实施方案包含含有执行部分的异源多肽。所述执行部分可以被构造成与靶基因的对应靶多核苷酸形成复合物。在某些实施方案中，所述组合物或核酸编辑系统的施用导致改变的靶基因表达或活性。所述改变的靶基因表达或活性可以是可检测的，例如，在至少约1％(例如，至少约2％、5％、10％、15％或20％)的受试者细胞(例如，肺细胞，诸如肺基底细胞)中。所述组合物或核酸编辑系统可以包含编码执行部分的异源多核苷酸。所述执行部分可以被构造成与靶基因的对应靶多核苷酸形成复合物。所述异源多核苷酸可以编码指导多核苷酸，其被构造成将所述执行部分引导至所述靶多核苷酸。所述执行部分可以包含异源内切核酸酶或其片段(例如，被指导多核苷酸引导以特异性地结合所述靶多核苷酸)。所述异源内切核酸酶可以是(1)核糖核蛋白(RNP)的一部分和(2)与所述指导多核苷酸形成复合物。所述异源内切核酸酶可以是成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)蛋白复合物的一部分。所述异源内切核酸酶可以是成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的(Cas)内切核酸酶。所述异源内切核酸酶可以包含灭活的内切核酸酶。所述灭活的内切核酸酶可以融合至调节部分。所述调节部分可以包含转录活化剂、转录阻遏物、表观遗传修饰剂或其片段。
在某些实施方案中，所述多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸(诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA))指导的异源内切核酸酶。在某些实施方案中，所述多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸和至少一种异源内切核酸酶，其中所述指导多核苷酸可以与至少一种异源内切核酸酶形成复合物并指导至少一种异源内切核酸酶切割本文描述的基因中的任一个的遗传基因座。在某些实施方案中，所述多核苷酸编码至少一种指导多核苷酸指导的异源内切核酸酶诸如Cas9、Cas12、Cas13、Cpf1(或Cas12a)、C2C1、C2C2(或Cas13a)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、C2C3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Csnl、Csxl2、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4或Cul966；其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。在某些实施方案中，Cas13可以包括、但不限于Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas 13d(例如，CasRx)。
在某些实施方案中，所述异源内切核酸酶包含灭活的内切核酸酶，其任选地融合至调节部分(诸如表观遗传修饰剂)以改造介导所选感兴趣基因的表达的表观基因组。在某些情况下，所述表观遗传修饰剂可以包括甲基转移酶、脱甲基酶、歧化酶、烷化酶、脱嘌呤酶、氧化酶、光裂合酶、整合酶、转座酶、重组酶、聚合酶、连接酶、解螺旋酶、糖基化酶、乙酰基转移酶、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、泛素活化酶、泛素缀合酶、泛素连接酶、脱泛素化酶、腺苷酸形成酶、AMP基化剂、脱-AMP基化剂、SUMO基化酶、脱SUMO基化酶、核糖基化酶、脱核糖基化酶、N-肉豆蔻酰基转移酶、染色质改造酶、蛋白酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合酶、合成酶或去肉豆蔻酰化酶。在某些情况下，所述表观遗传修饰剂可以包含选自以下的一种或多种：p300、TET1、LSD1、HDAC1、HDAC8、HDAC4、HDAC11、HDT1、SIRT3、HST2、CobB、SIRT5、SIR2A、SIRT6、NUE、vSET、SUV39H1、DIM5、KYP、SUVR4、Set4、Set1、SETD8和TgSET8。
在某些实施方案中，所述多核苷酸编码与基因的基因组区域至少部分地互补的指导多核苷酸(诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA))，其中在所述指导多核苷酸与所述基因结合后，所述指导多核苷酸募集所述指导多核苷酸指导的核酸酶以切割和遗传修饰所述区域。例如，CFTR基因可以被所述指导多核苷酸指导的核酸酶修饰。
在某些实施方案中，本申请的多核苷酸包含一个或多个核苷酸的至少一种化学修饰。在某些实施方案中，所述化学修饰增加所述指导多核苷酸(诸如指导RNA(gRNA)或指导DNA(gDNA))与互补基因组基因座(例如，本文描述的基因中的任一个的基因组基因座)的结合的特异性。在某些实施方案中，当随后将多核苷酸施用给有此需要的受试者时，所述至少一种化学修饰增加对核酸酶消化的抗性。在某些实施方案中，当随后将多核苷酸施用给有此需要的受试者时，所述至少一种化学修饰降低免疫原性。这样的化学修饰可以具有合乎需要的性能，诸如与没有至少一种化学修饰的多核苷酸相比，增强的对核酸酶消化的抗性或增加的与靶基因组基因座的结合亲和力。
在某些实施方案中，所述至少一种化学修饰包含对糖部分的修饰。在某些实施方案中，经修饰的糖部分是包含一个或多个非桥连糖取代基的被取代的糖部分，包括、但不限于在2'和/或5'位置的取代基。适合于2'-位置的糖取代基的例子包括、但不限于：2'-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施方案中，在2'位置的糖取代基选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O--C1-C10烷基、O--C1-C10取代的烷基；OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)和O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H或被取代的或未被取代的C1-C10烷基。在5'-位置的糖取代基的例子包括、但不限于：5'-甲基(R或S)；5'-乙烯基和5'-甲氧基。在某些实施方案中，被取代的糖包含超过一个非桥连糖取代基，例如，T-F-5'-甲基糖部分。
包含2'-取代的糖部分的核苷被称作2'-取代的核苷。在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O、S或N(Rm)-烷基；O、S或N(Rm)-烯基；O、S或N(Rm)-炔基；O-烷基烯基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)或O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基或被取代的或未被取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基可以进一步被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、巯基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O--CH3、O(CH2)3NH2、CH2—CH＝CH2、O--CH2—CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N-取代的乙酰胺(O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基或被取代的或未被取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含含有选自F、OCF3、O--CH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(CH3)2、--O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O--CH2--C(＝O)--N(H)CH3的2'-取代基的糖部分。
在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含含有选自F、O--CH3和OCH2CH2OCH3的2'-取代基的糖部分。
某些经修饰的糖部分包含桥连糖取代基，该基团形成第二个环从而产生二环糖部分。在某些这样的实施方案中，二环糖部分包含在4'和2'呋喃糖环原子之间的桥。这样的4'至2'糖取代基的例子包括、但不限于：--[C(Ra)(Rb)]n--、--[C(Ra)(Rb)]n--O--、--C(RaRb)--N(R)--O--或--C(RaRb)--O--N(R)--；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)--O-2'(LNA)；4'-(CH2)--S-2'；4'-(CH2)2--O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)--O-2'(cEt)和4'-CH(CH2OCH3)--O-2'及其类似物；4'-C(CH3)(CH3)--O-2'及其类似物；4'-CH2--N(OCH3)-2'及其类似物；4'-CH2--O--N(CH3)-2'；4'-CH2--O--N(R)-2'和4'-CH2--N(R)--O-2'-，其中每个R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基；4'-CH2--N(R)--O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团；4'-CH2--C(H)(CH3)-2'；和4'-CH2--C(＝CH2)-2'及其类似物。
在某些实施方案中，这样的4'至2'桥独立地包含1至4个独立地选自以下的连接基团：--[C(Ra)(Rb)]n--、--C(Ra)＝C(Rb)--、--C(Ra)＝N--、--C(＝NRa)--、--C(＝O)--、--C(＝S)--、--O--、--Si(Ra)2--、--S(＝O)x--和--N(Ra)--；其中:x是0、1或2；n是1、2、3或4；每个Ra和Rb独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、杂环残基、被取代的杂环残基、杂芳基、被取代的杂芳基、C5-C7脂环族残基、被取代的C5-C7脂环族残基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)--H)、被取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚砜基(S(＝O)-J1)；且每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)--H)、被取代的酰基、杂环残基、被取代的杂环残基、C1-C12氨基烷基、被取代的C1-C12氨基烷基或保护基团。
包含二环糖部分的核苷被称为二环核苷或BNA。二环核苷包括、但不限于：(A)α-L-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')BNA(也被称作锁核酸或LNA)、(C)亚乙基氧基(4'-(CH2)2--O-2')BNA、(D)氨基氧基(4'-CH2--O--N(R)-2')BNA、(E)氧基氨基(4'-CH2--N(R)--O-2')BNA、(F)甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)--O-2')BNA(也被称作受限的乙基或cEt)、(G)亚甲基-硫(4'-CH2--S-2')BNA、(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA、(I)甲基碳环基(4'-CH2--CH(CH3)-2')BNA、(J)亚丙基碳环基(4'-(CH2)3-2')BNA和(K)甲氧基(亚乙基氧基)(4'-CH(CH2OMe)-O-2')BNA(也被称作受限的MOE或cMOE)。
在某些实施方案中，二环糖部分和掺入这样的二环糖部分的核苷进一步由异构构型限定。例如，包含4'-2'亚甲基-氧基桥的核苷可以呈α-L构型或呈β-D构型。先前，α-L-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')二环核苷已被掺入显示出反义活性的反义多核苷酸中。
在某些实施方案中，被取代的糖部分包含一个或多个非桥连糖取代基和一个或多个桥连糖取代基(例如，5'-取代的和4'-2'桥连的糖，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
在某些实施方案中，经修饰的糖部分是糖替代物。在某些这样的实施方案中，天然存在的糖的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在某些这样的实施方案中，这样的经修饰的糖部分还包含如上所述的桥连和/或非桥连取代基。例如，某些糖替代物包含4'-硫原子和在2'-位置和/或5'位置的取代。作为另外的例子，已经描述了具有4'-2'桥的碳环二环核苷。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有并非5-原子的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含6元四氢吡喃。这样的四氢吡喃可以进一步被修饰或取代。包含这样的经修饰的四氢吡喃的核苷包括、但不限于己糖醇核酸(HNA)、阿努醇(anitol)核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)和氟代HNA(F-HNA)。
在某些实施方案中，提供式VII的经修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，提供式VII的THP核苷，其中R1和R2中的一个是F。在某些实施方案中，R1是氟且R2是H，R1是甲氧基且R2是H，以及R1是甲氧基乙氧基且R2是H。
本领域还已知许多其它的二环和三环糖替代物环系统，其可用于修饰核苷以掺入反义化合物中。
也提供了修饰的组合，不限于例如2'-F-5'-甲基取代的核苷和用S代替核糖基环氧原子和在2'-位置的进一步取代，或者可替换地二环核酸的5'-取代。在某些实施方案中，4'-CH2--O-2'二环核苷在5'位置被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代。还已经描述了碳环二环核苷的合成和制备以及其寡聚化和生化研究。
在某些实施方案中，本申请提供了包含经修饰的核苷的多核苷酸。那些经修饰的核苷酸可以包括经修饰的糖，经修饰的核碱基和/或经修饰的键。选择特定修饰以使得得到的多核苷酸具有合乎需要的特征。在某些实施方案中，多核苷酸包含一个或多个RNA样核苷。在某些实施方案中，多核苷酸包含一个或多个DNA样核苷酸。
在某些实施方案中，本申请的核苷包含一个或多个未修饰的核碱基。在某些实施方案中，本申请的核苷包含一个或多个经修饰的核碱基。
在某些实施方案中，经修饰的核碱基选自：如本文所定义的通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化的碱基。如本文所定义的5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫基烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化的碱基。其它经修饰的核碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G夹诸如被取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-13][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的核碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环代替的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含连接的核苷的多核苷酸。在这样的实施方案中，核苷可以使用任何核苷间键连接在一起。核苷间连接基团的两个主要类别由磷原子的存在或不存在限定。代表性的含磷核苷间键包括、但不限于磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括、但不限于：亚甲基甲基亚氨基(--CH2--N(CH3)--O--CH2--)、硫代二酯(--O--C(O)--S--)、硫羰氨基甲酸酯(--O--C(O)(NH)--S--)；硅氧烷(--O--Si(H)2--O--)；和N,N'-二甲基肼(--CH2--N(CH3)--N(CH3)--)。与天然磷酸二酯键相比，经修饰的键可以用于改变(通常增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施方案中，具有手性原子的核苷间键可以制备为外消旋混合物或单独的对映异构体。代表性的手性键包括、但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷的和不含磷的核苷间键的制备方法是本领域技术人员众所周知的。
本文所述的多核苷酸含有一个或多个不对称中心，且因此产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构构型，其在绝对立体化学方面可以定义为(R)或(S)，α或β(例如对于糖端基异构体)，或者(D)或(L)(例如对于氨基酸等)。本文提供的反义化合物中包括所有这样的可能的异构体，以及其外消旋的和光学纯的形式。
中性核苷间键包括、但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2--N(CH3)--O-5')、酰胺-3(3'-CH2--C(＝O)--N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2--N(H)--C(＝O)-5')、甲缩醛(3'-O--CH2--O-5')和硫代甲缩醛(3'-S--CH2--O-5')。其它中性核苷间键包括非离子键，其包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(参见例如：CarbohydrateModifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook,编,ACS SymposiumSeries 580；第3和4章，40-65)。其它中性核苷间键包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键。
还可以在寡核苷酸上的其它位置进行另外的修饰，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。例如，本申请的配体缀合的多核苷酸的一种另外的修饰涉及向寡核苷酸化学连接一个或多个另外的非配体部分或缀合物，其增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这样的部分包括、但不限于脂质部分诸如胆固醇部分，胆酸，硫醚，例如，己基-5-三苯甲基硫醇，硫代胆甾醇，脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂，例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯，多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸，棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆甾醇部分。
多肽
在本申请的组合物或核酸编辑系统的某些实施方案中，用脂质组合物组装的组合物或核酸编辑系统包含一种或多种多肽。某些多肽可以包括内切核酸酶诸如本文描述的核酸酶中的任何一种。例如，所述核酸酶可以包括CRISPR相关的(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关的(Cas)多肽、II型CRISPR相关的(Cas)多肽、III型CRISPR相关的(Cas)多肽、IV型CRISPR相关的(Cas)多肽、V型CRISPR相关的(Cas)多肽和VI型CRISPR相关的(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录活化剂样效应核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关的RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如，原核Argonaute(pAgo)、古细菌Argonaute(aAgo)、真核Argonaute(eAgo)和格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo))；作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；CIRT、PUF、归巢内切核酸酶或其任何功能片段、其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。在某些实施方案中，所述核酸酶可以包括Cas蛋白诸如Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也被称作Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物或其修饰形式。在某些实施方案中，所述Cas蛋白可以与本文描述的指导多核苷酸复合以形成CRISPR核糖核蛋白(RNP)。
本文描述的组合物中的核酸酶可以是Cas9(例如，来自化脓链球菌或肺炎链球菌)。CRISPR酶可以指导在靶序列的位置处一条链或两条链的切割，诸如在本文描述的基因中的任一个的靶序列内和/或所述靶序列的互补序列内。例如，CRISPR酶可以定向并切割CFTR的基因组基因座。
所述CRISPR酶可以相对于相应野生型酶发生突变，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸盐-至-丙氨酸置换(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化为切口酶(切割单条链)。在某些实施方案中，Cas9切口酶可以与指导序列(例如，两个指导序列)组合使用，其分别靶向DNA靶标的有义链和反义链。这种组合允许两条链都被切口并用于诱导非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。
在某些实施方案中，本申请提供了含有一种或多种治疗性蛋白的多肽。可以被包含在组合物中的治疗性蛋白包括多种分子，诸如细胞因子、趋化因子、白介素、干扰素、生长因子、凝固因子、抗凝剂、血液因子、骨形态形成蛋白、免疫球蛋白和酶。特定治疗性蛋白的一些非限制性例子包括促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、促甲状腺素α、N-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)、阿法链道酶、组织型纤溶酶原激活物(TPA)活化酶、葡糖脑苷脂酶、干扰素(IF)β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ、干扰素α、TNF-α、IL-1至IL-36、人生长激素(rHGH)、人胰岛素(BHI)、人绒毛膜促性腺激素α、达依泊汀α(Darbepoetinα)、促卵泡激素(FSH)和因子VIII。
在某些实施方案中，所述多肽包含与包含肽序列的组合物或核酸编辑系统中的任一种至少部分相同的肽序列。例如，所述多肽可以包含与用于治疗肺病诸如肺癌的抗体(例如，单克隆抗体)至少部分相同的肽序列。在某些实施方案中，所述多肽包含恢复用本文描述的药物组合物治疗的受试者中的缺陷蛋白的功能的肽或蛋白。例如，所述多核苷酸包含恢复囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的功能的肽或蛋白，其可以用于拯救患有导致突变CFTR蛋白的表达的先天性缺陷的受试者。
药物组合物
在某些实施方案中，将所述组合物配制用于药物(例如，全身性)施用。所述药物(例如，全身性)施用可以是静脉内施用。在某些实施方案中，通过任何合适的途径，包括，例如，口服、直肠、阴道、透粘膜、肺(包括气管内或吸入)或肠施用，胃肠外递送，包括肌肉内、皮下、骨髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，可以施用本申请的药物组合物。
在某些实施方案中，可以以局部而非全身方式施用本申请的药物组合物，例如，通过将所述药物组合物直接注射到靶组织中，优选在持续释放制剂中。局部递送可能受多种因素影响，取决于要靶向的组织。
在某些实施方案中，含有本申请的组合物的气雾剂可以被吸入(用于鼻、气管或支气管递送)。在某些实施方案中，可以将本申请的组合物注射到例如损伤、疾病表现或疼痛的部位。在某些实施方案中，可以以用于口服、气管或食管施用的锭剂形式提供本申请的组合物。在某些实施方案中，可以将本申请的组合物以液体、片剂或胶囊剂形式提供以施用至胃或肠。在某些实施方案中，可以以用于直肠或阴道施用的栓剂形式提供本申请的组合物。在某些实施方案中，甚至可以通过使用乳膏剂、滴剂或甚至注射剂将本申请的组合物递送至眼。
可以配制所述药物组合物，使得可以以靶向感兴趣的器官或与其接触的方式进行施用。在某些实施方案中，将所述组合物配制用于喷雾。在某些实施方案中，将所述组合物配制用于静脉内施用。在某些实施方案中，将所述组合物配制用于顶端递送。
在某些实施方案中，本申请的药物组合物包含用脂质组合物组装(例如，包封在其中)的多个有效负载。用脂质组合物组装的多个有效负载可以被构造用于基因编辑或基因表达修饰。用脂质组合物组装的多个有效负载可以包含编码执行部分(例如，包含异源内切核酸酶诸如Cas)的多核苷酸或编码所述执行部分的多核苷酸。用脂质组合物组装的多个有效负载可以进一步包含一种或多种(例如，一种或两种)指导多核苷酸。用脂质组合物组装的多个有效负载可以进一步包含一种或多种供体或模板多核苷酸。用脂质组合物组装的多个有效负载可以包含核糖核蛋白(RNP)。
在本申请的(例如，药物)组合物的某些实施方案中，(1)所述包含内切核酸酶的多肽或编码所述多肽的多核苷酸与(2)所述脂质组合物的总脂质的摩尔或重量比不超过(约)1:1、不超过(约)1:5、不超过(约)1:10、不超过(约)1:15、不超过(约)1:20、不超过(约)1:25、不超过(约)1:30、不超过(约)1:35、不超过(约)1:40、不超过(约)1:45、不超过(约)1:50、不超过(约)1:60、不超过(约)1:70、不超过(约)1:80、不超过(约)1:90或不超过(约)1:100。在本申请的(例如，药物)组合物的某些实施方案中，(1)所述包含内切核酸酶的多肽或编码所述多肽的多核苷酸与(2)所述脂质组合物的总脂质的摩尔或重量比不小于(约)1:1、不小于(约)1:5、不小于(约)1:10、不小于(约)1:15、不小于(约)1:20、不小于(约)1:25、不小于(约)1:30、不小于(约)1:35、不小于(约)1:40、不小于(约)1:45、不小于(约)1:50、不小于(约)1:60、不小于(约)1:70、不小于(约)1:80、不小于(约)1:90或不小于(约)1:100。在本申请的(例如，药物)组合物的某些实施方案中，(1)所述包含内切核酸酶的多肽或编码所述多肽的多核苷酸与(2)所述脂质组合物的总脂质的摩尔或重量比是(约)1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100或前述值中的任何两个之间的范围。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，(1)总有效负载分子(包括多肽和多核苷酸)与(2)所述脂质组合物的总脂质的摩尔或重量比不小于(约)1:1、不小于(约)1:5、不小于(约)1:10、不小于(约)1:15、不小于(约)1:20、不小于(约)1:25、不小于(约)1:30、不小于(约)1:35、不小于(约)1:40、不小于(约)1:45、不小于(约)1:50、不小于(约)1:60、不小于(约)1:70、不小于(约)1:80、不小于(约)1:90或不小于(约)1:100。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，(1)总有效负载分子(包括多肽和多核苷酸)与(2)所述脂质组合物的总脂质的摩尔或重量比不小于(约)1:1、不小于(约)1:5、不小于(约)1:10、不小于(约)1:15、不小于(约)1:20、不小于(约)1:25、不小于(约)1:30、不小于(约)1:35、不小于(约)1:40、不小于(约)1:45、不小于(约)1:50、不小于(约)1:60、不小于(约)1:70、不小于(约)1:80、不小于(约)1:90或不小于(约)1:100。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，(1)总有效负载分子(包括多肽和多核苷酸)与(2)所述脂质组合物的总脂质的摩尔或重量比是(约)1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100或前述值中的任何两个之间的范围。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，至少(约)85％、至少(约)86％、至少(约)87％、至少(约)88％、至少(约)89％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或(约)100％的核酸编辑系统被包封在所述脂质组合物的颗粒中。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个通过下述一种或多种特征表征的颗粒：(1)100纳米(nm)或更小的(例如，平均)尺寸；(2)不超过约0.2的多分散性指数(PDI)；和(3)-10毫伏(mV)至10mV的ζ电位。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约50纳米(nm)至约100纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约70纳米(nm)至约100纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约50纳米(nm)至约80纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约60纳米(nm)至约80纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有至多约100纳米(nm)、至多约90纳米(nm)、至多约85纳米(nm)、至多约80纳米(nm)、至多约75纳米(nm)、至多约70纳米(nm)、至多约65纳米(nm)、至多约60纳米(nm)、至多约55纳米(nm)或至多约50纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有至少约100纳米(nm)、至少约90纳米(nm)、至少约85纳米(nm)、至少约80纳米(nm)、至少约75纳米(nm)、至少约70纳米(nm)、至少约65纳米(nm)、至少约60纳米(nm)、至少约55纳米(nm)或至少约50纳米(nm)的(例如，平均)尺寸的颗粒。通过尺寸排阻色谱法(SEC)可以确定(例如，平均)尺寸。通过光谱方法或基于图像的方法，例如，动态光散射、静态光散射、多角度光散射、激光散射或动态图像分析，可以确定(例如，平均)尺寸。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约0.05至约0.5的多分散性指数(PDI)的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约0.1至约0.5的多分散性指数(PDI)的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约0.1至约0.3的多分散性指数(PDI)的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有约0.2至约0.5的多分散性指数(PDI)的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有不超过约0.5、不超过约0.4、不超过约0.3、不超过约0.2、不超过约0.1或不超过约0.05的多分散性指数(PDI)的颗粒。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-5毫伏(mV)或更小的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-10毫伏(mV)或更小的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-15毫伏(mV)或更小的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-20毫伏(mV)或更小的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-30毫伏(mV)或更小的负ζ电位的颗粒。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有0毫伏(mV)或更小的ζ电位的颗粒。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有5毫伏(mV)或更小的ζ电位的颗粒。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有10毫伏(mV)或更小的ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有15毫伏(mV)或更小的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有20毫伏(mV)或更小的负ζ电位的颗粒。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-5毫伏(mV)或更大的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-10毫伏(mV)或更大的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-15毫伏(mV)或更大的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-20毫伏(mV)或更大的负ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有-30毫伏(mV)或更大的负ζ电位的颗粒。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有0毫伏(mV)或更大的ζ电位的颗粒。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有5毫伏(mV)或更大的ζ电位的颗粒。在某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有10毫伏(mV)或更大的ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有15毫伏(mV)或更大的ζ电位的颗粒。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含多个具有20毫伏(mV)或更大的ζ电位的颗粒。
在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有在6至7的范围外的表观电离常数(pKa)。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有约8或更高、约9或更高、约10或更高、约11或更高、约12或更高或约13或更高的表观pKa。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有约8至约13的表观pKa。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有约8至约10的表观pKa。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有约9至约11的表观pKa。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有约10至约13的表观pKa。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有约8至约12的表观pKa。在本申请的药物组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物具有约10至约12的表观pKa。
脂质组合物
在一个方面，本文提供了一种脂质组合物，其包含：(i)可电离的阳离子脂质(诸如本文描述的)；和(iii)与所述可电离的阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质(诸如本文描述的)。所述脂质组合物可以进一步包含与所述SORT脂质分开的磷脂。
可电离的阳离子脂质
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含可电离的阳离子脂质。在某些实施方案中，所述阳离子型可电离脂质含有一个或多个在生理pH质子化但可以去质子化并且在高于8、9、10、11或12的pH不带电荷的基团。可电离的阳离子基团可以含有一种或多种能在生理pH形成阳离子基团的可质子化胺。阳离子型可电离脂质化合物还可以进一步包含一种或多种脂质组分，诸如两种或更多种具有C6-C24烷基或烯基碳基团的脂肪酸。这些脂质基团可以通过酯键连接，或可以通过迈克尔加成进一步添加至硫原子。在某些实施方案中，这些化合物可以是树枝状聚合物、树枝状大分子、聚合物或它们的组合。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质表示具有可以获得电荷(pKa)的氮原子的脂质和脂质样分子。这些脂质在文献中可称为阳离子脂质。这些具有氨基的分子通常具有2-6个疏水链，通常为烷基或烯基诸如C6-C24烷基或烯基，但是可以具有至少1个或多于6个尾巴。在某些实施方案中，这些阳离子型可电离脂质是树枝状聚合物，它们是展现规则树枝状分支的聚合物，其通过向核中或从核中依次或按代添加分支层而形成，并且以一个核、至少一个内部分支层和一个表面分支层为特征(参见PetarR.Dvornic和Donald A.Tomalia in Chem.in Britain,641-645,1994年8月)。在其它实施方案中，本文中使用的术语“树枝状聚合物”意图包括、但不限于具有内核、规律连接到该起始核的重复单元的内层(或“代”)以及连接到最外代的封端基团的外表面的分子体系结构。“树枝状大分子”是具有从焦点发出的分支的树枝状聚合物物质，所述焦点是核心，或可以直接地或通过连接部分连接到核心以形成更大的树枝状聚合物。在某些实施方案中，树枝状聚合物结构具有从中心核心辐射的重复基团，其对于每个分支用每个重复单元加倍。在某些实施方案中，本文所述的树枝状聚合物可以被描述为小分子、中等尺寸的分子、脂质或脂质样物质。这些术语可用于描述本文所述的具有树枝状大分子样外观的化合物(例如从单个焦点辐射的分子)。
虽然树枝状聚合物是聚合物，但由于它们具有可控的结构、单一分子量、众多且可控的表面官能团，并且在达到特定代数后在传统上采用球状构象，因此树枝状聚合物可能优于传统聚合物。树枝状聚合物可以通过每个重复单元的依次反应以产生单分散的、树状和/或代结构聚合物结构来制备。单个树枝状聚合物由一个中心核心分子组成，其中树枝状楔形物连接到该中心核心上的一个或多个功能位点。根据在制备过程中使用的组装单体，树枝状聚合物表面层可具有设置在其上的多种官能团，包括阴离子的、阳离子的、亲水的或亲脂的基团。
改变核心、重复单元和表面或封端基团的官能团和/或化学性质，可以调节它们的物理性质。可以改变的一些性质包括、但不限于溶解性、毒性、免疫原性和生物附着能力。树枝状聚合物经常通过其代数或分支中重复单元的数量来描述。仅由核心分子组成的树枝状聚合物被称为第0代，而沿着所有分支的每个连续重复单元是第1代、第2代诸如此类，直到封端或表面基团。在某些实施方案中，半代可能仅由与胺的第一缩合反应而不是与硫醇的第二缩合反应产生。
树枝状聚合物的制备需要通过系列逐步反应实现的合成控制水平，所述逐步反应包括通过每个连续基团构建树枝状聚合物。树枝状聚合物合成可以是收敛或发散型。在发散型树枝状聚合物合成期间，分子以逐步过程从核心到外周组装，所述逐步过程包括将一代连接到前一代，并然后改变下一反应阶段的官能团。官能团转化对于防止不受控制的聚合是必要的。这样的聚合将导致并非单分散的高支化分子，并且另外被称为超支化聚合物。由于空间效应，树枝状聚合物重复单元继续反应产生球形或球状分子，直到空间过度拥挤阻止了在特定代的完全反应并破坏了分子的单分散性。因此，在某些实施方案中，具体考虑了G1-G10代的树枝状聚合物。在某些实施方案中，树枝状聚合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复单元，或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，本文使用的树枝状聚合物是G0、G1、G2或G3。但是，通过减少分支聚合物中的间隔单元可以增加可能的代数(诸如11、12、13、14、15、20或25)。
此外，树枝状聚合物具有两种主要的化学环境：由封端代上的特定表面基团产生的环境，和由于更高级结构而可能被屏蔽本体介质和表面基团的树枝状结构的内部。由于这些不同的化学环境，树枝状聚合物已经发现了许多不同的潜在用途，包括在治疗用途中。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，使用丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基团与胺和硫醇的差异反应性来组装所述树枝状聚合物或树枝状大分子。所述树枝状聚合物或树枝状大分子可以包括由丙烯酸酯基团与伯胺或仲胺、以及甲基丙烯酸酯与巯基基团的反应形成的仲或叔胺和硫醚。此外，所述树枝状聚合物或树枝状大分子的重复单元可以含有在生理条件下可降解的基团。在某些实施方案中，这些重复单元可以含有一个或多个生发的二醚、酯、酰胺或二硫化物基团。在某些实施方案中，核心分子是只在一个方向上允许树枝状聚合的单胺。在其它实施方案中，核心分子是具有多个不同树枝状分支的多胺，每个分支可以包含一个或多个重复单元。所述树枝状聚合物或树枝状大分子可以通过从该核心除去一个或多个氢原子而形成。在某些实施方案中，这些氢原子是在杂原子诸如氮原子上。在某些实施方案中，封端基团是亲脂基团诸如长链烷基或烯基。在其它实施方案中，封端基团是长链卤代烷基或卤代烯基。在其它实施方案中，封端基团是含有可电离基团诸如胺(-NH2)或羧酸(-CO2H)的脂族或芳族基团。在其它实施方案中，封端基团是含有一个或多个氢键供体诸如氢氧根基团、酰胺基团或酯的脂族或芳族基团。
本申请的阳离子型可电离脂质可以含有一个或多个不对称取代的碳或氮原子，并且可以以光学活性的或外消旋的形式分离。因而，除非特别指出具体的立体化学或异构形式，否则意指化学式的所有手性、非对映异构、外消旋形式、差向异构形式和所有几何异构形式。阳离子型可电离脂质可以作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和各非对映异构体存在。在某些实施方案中，获得单一非对映异构体。本申请的阳离子型可电离脂质的手性中心可以具有S或R构型。此外，预期阳离子型可电离脂质中的一种或多种可以作为结构异构体存在。在某些实施方案中，所述化合物具有相同的化学式，但与核心的氮原子的连接性不同。不希望受任何理论约束，据信这样的阳离子型可电离脂质存在，因为起始单体首先与伯胺反应，并然后在统计学上与存在的任何仲胺反应。因此，结构异构体可以呈现完全反应的伯胺，并然后呈现反应的仲胺的混合物。
用于表示本申请的阳离子型可电离脂质的化学式通常将仅显示可能的几种不同互变异构体中的一种。例如，已知许多类型的酮基与相应的烯醇基平衡存在。类似地，许多类型的亚胺基与烯胺基平衡存在。无论对于给定化学式描绘哪种互变异构体，并且不管哪种互变异构体是最普遍的，意指给定化学式的所有互变异构体。
本申请的阳离子型可电离脂质还可以具有以下优点：与现有技术中已知的化合物(无论是用于本文所述的适应症还是其它方面)相比，它们可以更有效，毒性更小，作用时间更长，更强效，产生更少的副作用，更容易被吸收，和/或具有更好的药代动力学特性(例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)，和/或具有其它有用的药理学、物理或化学性能。
另外，构成本申请的阳离子型可电离脂质的原子意图包括这样的原子的所有同位素形式。本文中使用的同位素包括具有相同原子序数但是具有不同质量数的那些原子。作为一般示例而非限制性地，氢的同位素包括氚和氘，且碳的同位素包括13C和14C。
应当认识到，形成本文所提供的阳离子型可电离脂质的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子不是至关重要的，只要该盐整体上是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其它例子和它们的制备方法与使用方法呈现于Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,and Use(2002)中，其通过引用并入本文。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是树枝状聚合物或树枝状大分子。在某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质包含在生理pH带正电荷的铵基团并且含有至少两个疏水基团。在某些实施方案中，所述铵基团在约6至约8的pH带正电荷。在某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是树枝状聚合物或树枝状大分子。在某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质包含至少两个C6-C24烷基或烯基基团。
式(I)的树枝状聚合物或树枝状大分子
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质包含至少两个C8-C24烷基基团。在某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是由下式进一步定义的树枝状聚合物或树枝状大分子：
核心-重复单元-封端基团(D-I)
其中通过从所述核心除去一个或多个氢原子并用重复单元替换所述原子，将所述核心连接至所述重复单元，并且其中：
所述核心具有式：
其中：
X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
a是1、2、3、4、5或6；或
所述核心具有式：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢、烷基(C≤18)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3；或
所述核心具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或
所述核心是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基基团具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-、-S-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团包含连接至所述接头基团的氮和硫原子的独立的可降解的二酰基基团(如果n大于1)，其中所述重复单元中的第一基团是可降解的二酰基基团，其中对于每个接头基团，下一个重复单元包含连接至所述接头基团的氮原子的两个可降解的二酰基基团；且其中n是在所述重复单元中存在的接头基团的数目；且
所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)或这样的烷二基(C≤18)：其中在烷二基(C≤18)上的一个或多个氢原子已经被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3替换；
R10是氢、羧基、羟基或
芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最终的可降解的二酰基连接至封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述封端基团进一步由下式定义：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)；且
R10是氢。在某些实施方案中，A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢或烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。
在式(I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述封端基团由下式代表：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)；且
R10是氢。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述核心进一步被定义为：
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述可降解的二酰基进一步被定义为：
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述接头进一步被定义为(D-VI)，
其中Y1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述树枝状聚合物或树枝状大分子选自：
/>
/>
/>
及其药学上可接受的盐。
式(X)的树枝状聚合物或树枝状大分子
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是式的树枝状聚合物或树枝状大分子。在某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是下式的树枝状聚合物或树枝状大分子：
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是具有以下结构式的代数(g)的树枝状聚合物或树枝状大分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(a)所述核心包含结构式(X核心)：
其中：
Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b-；
R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f；
R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6，诸如C1-C3)烷基；
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢或任选地被取代的(例如，C1-C12)烷基；
L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、亚烷基、亚杂烷基、[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基]、[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基]、杂环烷基和亚芳基；或，
可替换地，L1的部分与R1c和R1d之一形成(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子)；且
x1是0、1、2、3、4、5或6；且
(b)所述多个(N个)分支中的每个分支独立地包含结构式(X分支)：
其中：
*指示所述分支与所述核心的连接点；
g是1、2、3或4；
Z＝2(g-1)；
当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，
(c)每个二酰基基团独立地包含结构式其中：
*指示所述二酰基基团在其近侧端部处的连接点；
**指示所述二酰基基团在其远侧端部处的连接点；
Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；
A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-，其中：
R4是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6)烷基；
m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3；且
R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C8)烷基；且
(d)每个接头基团独立地包含结构式
其中：
**指示所述接头与近侧二酰基基团的连接点；
***指示所述接头与远侧二酰基基团的连接点；且
Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；且
(e)每个封端基团独立地选自任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烷基硫醇和任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烯基硫醇。
在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是共价键。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-O-。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-S-。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-NR2且R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-CR3aR3b R3a，且R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的烷基(例如，C1-C6，诸如C1-C3)。
在X核心的某些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢或任选地被取代的烷基。在X核心的某些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢。在X核心的某些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、任选地被取代的烷基(例如，C1-C12)。
在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、亚烷基、亚杂烷基、[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基]、[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基]、杂环烷基和亚芳基；或者，可替换地，L1的部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基(例如，C4-C6，并且含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是共价键。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是氢。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚烷基(例如，C1-C12，诸如C1-C6或C1-C3)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚杂烷基(例如，C1-C12，诸如C1-C8或C1-C6)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚杂烷基(例如，C2-C8亚烷基氧化物，诸如寡(亚乙基氧化物))。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基][(例如，C1-C6)亚烷基]-[(例如，C4-C6)杂环烷基]-[(例如，C1-C6)亚烷基]。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基][(例如，C1-C6)亚烷基]-(亚芳基)-[(例如，C1-C6)亚烷基]。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基](例如，[(例如，C1-C6)亚烷基]-亚苯基-[(例如，C1-C6)亚烷基])。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是杂环烷基(例如，C4-C6杂环烷基)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚芳基(例如，亚苯基)。在X核心的某些实施方案中，L1的部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基。在X核心的某些实施方案中，L1的部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基(例如，C4-C6杂环烷基)，并且所述杂环烷基可以含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子。
在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，寡(亚乙基氧化物)，诸如-(CH2CH2O)1-4-(CH2CH2)-)、[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，)和[(C1-C4)亚烷基]-亚苯基-[(C1-C4)亚烷基](例如，/>)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-和-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)。在某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基))。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-)和[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-)。
在X核心的某些实施方案中，x1是0、1、2、3、4、5或6。在X核心的某些实施方案中，x1是0。在X核心的某些实施方案中，x1是1。在X核心的某些实施方案中，x1是2。在X核心的某些实施方案中，x1是0、3。在X核心的某些实施方案中，x1是4。在X核心的某些实施方案中，x1是5。在X核心的某些实施方案中，x1是6。
在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：(例如，/>)。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：/>在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：/>(例如， )。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：/>(例如，/>)。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：/>在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：/>(例如，
)。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：(例如，/>诸如/>/>)。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：/>其中Q’是-NR2-或-CR3aR3b-；q1和q2各自独立地是1或2。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式：/>或(例如，)。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式/> (例如， )，其中环A是任选地被取代的芳基或任选地被取代的(例如，C3-C12，诸如C3-C5)杂芳基。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式
在X核心的某些实施方案中，所述核心包含在表1中所示的结构式及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。在某些实施方案中，表1的实例核心不限于列出的立体异构体(即对映异构体、非对映异构体)。
表1.实例核心结构
/>
/>
/>
/>
在X核心的某些实施方案中，所述核心包含选自以下的结构式：
/>
及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。在某些实施方案中，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。
在X核心的某些实施方案中，所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。在某些实施方案中，至少2个分支连接至所述核心。在某些实施方案中，至少3个分支连接至所述核心。在某些实施方案中，至少4个分支连接至所述核心。
在X核心的某些实施方案中，所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。在某些实施方案中，至少4个分支连接至所述核心。在某些实施方案中，至少5个分支连接至所述核心。在某些实施方案中，至少6个分支连接至所述核心。
在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少3个分支、至少4个分支、至少5个分支。在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少3个分支。在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少4个分支。在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少5个分支。
在X分支的某些实施方案中，g是1、2、3或4。在X分支的某些实施方案中，g是1。在X分支的某些实施方案中，g是2。在X分支的某些实施方案中，g是3。在X分支的某些实施方案中，g是4。
在X分支的某些实施方案中，Z＝2(g-1)，且当g＝1时，G＝0。在X分支的某些实施方案中，Z＝2(g-1)，且当g≠1时，
在X分支的某些实施方案中，g＝1，G＝0，Z＝1，且所述多个分支的每个分支包含结构式/>
在X分支的某些实施方案中，g＝2，G＝1，Z＝2，且所述多个分支的每个分支包含结构式
在X分支的某些实施方案中，g＝3，G＝3，Z＝4，且所述多个分支的每个分支包含结构式
在X分支的某些实施方案中，g＝4，G＝7，Z＝8，且所述多个分支的每个分支包含结构式
在某些实施方案中，具有代数(g)＝1的本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子具有结构:
在某些实施方案中，具有代数(g)＝1的本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子具有结构:
代数为1至4的本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子的实例制剂显示在表2中。基于g可以计算二酰基基团、接头基团和封端基团的数目。
表2.基于代数(g)的树枝状聚合物或树枝状大分子基团的制剂
g＝1 g＝2 g＝3 g＝4
二酰基基团的数目 1 1+2＝3 1+2+22＝7 1+2+22+23＝15 1+2+…+2g-1
接头基团的数目 0 1 1+2 1+2+22 1+2+…+2g-2
封端基团的数目 1 2 22 23 2(g-1)
在某些实施方案中，所述二酰基基团独立地包含结构式*指示所述二酰基基团在其近侧端部处的连接点，且**指示所述二酰基基团在其远侧端部处的连接点。
在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烷基、任选地被取代的亚烯基或任选地被取代的亚芳烃基。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烷基(例如，C1-C12)。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烯基(例如，C1-C12)。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的亚芳烃基(例如，C1-C12)。
在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-S-。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-NR4-和R4是氢或任选地被取代的烷基(例如，C1-C6)。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是1。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是2。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是3。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的烷基。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是任选地被取代的(例如，C1-C8)烷基。
在所述二酰基基团的某些实施方案中，A1是-O-或-NH-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，A1是-O-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，A2是-O-或-NH-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，A2是-O-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，Y3是C1-C12(例如，C1-C6，诸如C1-C3)亚烷基。
在所述二酰基基团的某些实施方案中，所述二酰基基团在每次出现时独立地包含结构式(例如，/>诸如)，并且任选地R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或C1-C3烷基。
在某些实施方案中，接头基团独立地包含结构式**指示所述接头与近侧二酰基基团的连接点，且***指示所述接头与远侧二酰基基团的连接点。
在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烷基、任选地被取代的亚烯基或任选地被取代的亚芳烃基。在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烷基(例如，C1-C12)。在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烯基(例如，C1-C12)。在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚芳烃基(例如，C1-C12)。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地选自任选地被取代的烷基硫醇和任选地被取代的烯基硫醇。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团是任选地被取代的烷基硫醇(例如，C1-C18，诸如C4-C18)。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团是任选地被取代的烯基硫醇(例如，C1-C18，诸如C4-C18)。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18烯基硫醇或C1-C18烷基硫醇，并且所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C6-C12芳基、C1-C12烷基氨基、C4-C6 N-杂环烷基、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6N-杂环烷基)、-C(O)-(C1-C12烷基氨基)和-C(O)-(C4-C6 N-杂环烷基)，并且前述取代基中的任一个的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如 ))、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))(例如，/>)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，/>)、-C(O)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))和-C(O)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，/>)，其中前述取代基中的任一个的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基取代，所述取代基选自C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如/> ))和C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基)。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是在表3中所示的结构。在某些实施方案中，本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子可以包含选自表3的封端基团或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，表3的实例封端基团不限于列出的立体异构体(即对映异构体、非对映异构体)。
表3.实例封端基团/末梢结构
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在某些实施方案中，式(X)的树枝状聚合物或树枝状大分子选自在表4中所示的那些及其药学上可接受的盐。
表4.实例可电离的阳离子的脂-树枝状聚合物
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其它可电离的阳离子脂质
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述阳离子脂质包含结构式(D-I’)：
其中：
a是1且b是2、3或4；或者，可替换地，b是1且a是2、3或4；
m是1且n是1；或者，可替换地，m是2和n是0；或者，可替换地，m是2和n是1；且
R1,R2,R3,R4,R5,和R6各自独立地选自H、-CH2CH(OH)R7、-CH(R7)CH2OH、-CH2CH2C(＝O)OR7、-CH2CH2C(＝O)NHR7和-CH2R7，其中R7独立地选自C3-C18烷基、具有一个C＝C双键的C3-C18烯基、氨基基团的保护基团、-C(＝NH)NH2、聚(乙二醇)链和受体配体；
前提条件是，R1至R6中的至少两个部分独立地选自-CH2CH(OH)R7、-CH(R7)CH2OH、-CH2CH2C(＝O)OR7、-CH2CH2C(＝O)NHR7或-CH2R7，其中R7独立地选自C3-C18烷基或具有一个C＝C双键的C3-C18烯基；且
其中在式(D-I’)中指出的一个或多个氮原子可以被质子化以提供阳离子脂质。
在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，a是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，b是2。在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，m是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，n是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地是H或-CH2CH(OH)R7。在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地是H或在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地是H或/>在式(D-I’)的阳离子脂质的某些实施方案中，R7是C3-C18烷基(例如，C6-C12烷基)。
在某些实施方案中，式(D-I’)的阳离子脂质是13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇:
在某些实施方案中，式(D-I’)的阳离子脂质是(11R,25R)-13,16,20-三((R)-2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇:
可以用在本申请的组合物和方法中的另外的阳离子脂质包括在以下文献中描述的那些阳离子脂质：J.McClellan,M.C.King,细胞2010,141,210-217、以及国际专利公开WO2010/144740、WO 2013/149140、WO 2016/118725、WO 2016/118724、WO 2013/063468、WO2016/205691、WO 2015/184256、WO 2016/004202、WO 2015/199952、WO 2017/004143、WO2017/075531、WO 2017/117528、WO 2017/049245、WO 2017/173054和WO 2015/095340，它们通过引用并入本文用于所有目的。那些可电离的阳离子脂质的实例包括、但不限于如在表5中所示的那些。
表5:实例可电离的阳离子脂质
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在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质以从约20至约23的量存在。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是从约20、20.5、21、21.5、22、22.5、至约23或其中可导出的任何范围。在其它实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约7.5至约20。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、至约20或其中可导出的任何范围。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约5％至约30％的摩尔或重量百分比的可电离的阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约10％至约25％的摩尔或重量百分比的可电离的阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约15％至约20％的摩尔或重量百分比的可电离的阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约10％至约20％的摩尔或重量百分比的可电离的阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约20％至约30％的摩尔或重量百分比的可电离的阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至少(约)5％、至少(约)10％、至少(约)15％、至少(约)20％、至少(约)25％或至少(约)30％的摩尔或重量百分比的可电离的阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至多(约)5％、至多(约)10％、至多(约)15％、至多(约)20％、至多(约)25％或至多(约)30％的摩尔或重量百分比的可电离的阳离子脂质。
选择性器官靶向(SORT)脂质
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质(例如，纳米颗粒)组合物优先递送至靶器官。在某些实施方案中，所述靶器官是肺、肺组织或肺细胞。本文中使用的术语“优先递送”用于表示这样的组合物：在递送后，其以施用量的至少25％(例如，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％)递送至靶器官(例如，肺)、组织或细胞。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含一种或多种选择性的器官靶向(SORT)脂质，其导致所述组合物向特定器官的选择性递送。在某些实施方案中，所述SORT脂质可以具有两个或更多个C6-C24烷基或烯基链。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质包含永久带正电荷的部分。所述永久带正电荷的部分在生理pH可以带正电荷，使得所述SORT脂质在将多核苷酸递送至细胞后包含正电荷。在某些实施方案中，所述带正电荷的部分是季胺或季铵离子。在某些实施方案中，所述SORT脂质包含抗衡离子或以其它方式与抗衡离子络合或相互作用。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质是永久阳离子脂质(即，包含一种或多种疏水组分和永久阳离子基团)。所述永久阳离子脂质可以含有带正电荷的基团，而与pH无关。可以用在永久阳离子脂质中的一种永久阳离子基团是季铵基团。所述永久阳离子脂质可以包含结构式：
其中：
Y1、Y2或Y3各自独立地是X1C(O)R1或X2N+R3R4R5；
前提条件是，Y1、Y2和Y3中的至少一个是X2N+R3R4R5；
R1是C1-C24烷基、C1-C24取代的烷基、C1-C24烯基、C1-C24取代的烯基；
X1是O或NRa，其中Ra是氢、C1-C4烷基或C1-C4取代的烷基；
X2是C1-C6烷二基或C1-C6取代的烷二基；
R3、R4和R5各自独立地是C1-C24烷基、C1-C24取代的烷基、C1-C24烯基、C1-C24取代的烯基；且
A1是阴离子，其电荷等于在所述化合物中的X2N+R3R4R5基团的数目。
在所述SORT脂质的某些实施方案中，所述永久阳离子的SORT脂质具有结构式:其中：
R6-R9各自独立地是C1-C24烷基、C1-C24取代的烷基、C1-C24烯基、C1-C24取代的烯基；前提条件是，R6-R9中的至少一个是C8-C24的基团；且
A2是单价阴离子。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质是可电离的阳离子脂质(即，包含一个或多个疏水组分和可电离的阳离子基团)。所述可电离的带正电荷部分在生理pH可以带正电荷。可以用在可电离的阳离子脂质中的一种可电离的阳离子基团是叔胺基团。在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；且
R3和R3′各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质包含特定结构的首基。在某些实施方案中，所述SORT脂质包含具有以下结构式的首基：其中L是接头；Z+是带正电荷的部分且X-是抗衡离子。在某些实施方案中，所述接头是可生物降解的接头。所述可生物降解的接头可以是在生理pH和温度下可降解的。所述可生物降解的接头可以被来自受试者的蛋白或酶降解。在某些实施方案中，所述带正电荷的部分是季铵离子或季胺。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：其中R1和R2各自独立地是任选地被取代的C6-C24烷基或任选地被取代的C6-C24烯基。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质包含接头(L)。在某些实施方案中，L是其中：
p和q各自独立地是1、2或3；且
R4是任选地被取代的C1-C6烷基
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
R4是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；且
X-是单价阴离子。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质是磷脂酰胆碱(例如，14:0EPC)。在某些实施方案中，所述磷脂酰胆碱化合物进一步被定义为:
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；且
X-是单价阴离子。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质。在某些实施方案中，所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。所述乙基磷酸胆碱可以是，作为例子，不受限于，1,2-二肉豆蔻酰油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
作为例子，且不限于此，刚刚前一段的结构式的SORT脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)(例如，盐酸盐)。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R4和R4′各自独立地是烷基(C6-C24)、烯基(C6-C24)或任一个基团的被取代形式；
R4″是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或任一个基团的被取代形式；
R4″′是烷基(C1-C8)、烯基(C2-C8)或任一个基团的被取代形式；且
X2是单价阴离子。
作为例子，且不限于此，刚刚前一段的结构式的SORT脂质是二甲基双十八烷基铵(DDAB)(例如，氢溴酸盐)。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；且
X-是单价阴离子。
作为例子，且不限于此，刚刚前一段的结构式的SORT脂质是N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质是阴离子脂质。在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)或-Y1-R4，其中：
Y1是烷二基(C≤6)或被取代的烷二基(C≤6)；且
R4是酰氧基(C≤8-24)或被取代的酰氧基(C≤8-24)。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述SORT脂质包含选自表6中列出的脂质的一种或多种。
表6.实例SORT脂质
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X-是抗衡离子(例如，Cl-、Br-等)
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约5％至约65％、约10％至约65％、约15％至约65％或约20％至约65％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约5％至约60％、约10％至约60％、约15％至约60％、约20％至约60％或约25％至约60％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约5％至约55％、约10％至约55％、约15％至约55％、约20％至约55％、约25％至约55％或约30％至约55％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约5％至约50％、约10％至约50％、约15％至约50％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％或约40％至约50％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约30％至约60％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约25％至约60％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约5％至约20％、约5％至约25％、约5％至约30％、约5％至约35％或约5％至约40％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至少(约)5％、至少(约)10％、至少(约)15％、至少(约)20％、至少(约)25％、至少(约)30％、至少(约)35％、至少(约)40％、至少(约)45％、至少(约)50％、至少(约)55％、至少(约)60％或至少(约)65％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至多(约)5％、至多(约)10％、至多(约)15％、至多(约)20％、至多(约)25％、至多(约)30％、至多(约)35％、至多(约)40％、至少(约)45％、至多(约)50％、至多(约)55％、至多(约)60％或至多(约)65％的摩尔或重量百分比的SORT脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含(约)5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％或前述值中的任何两个之间(包括端值)的范围的摩尔或重量百分比的SORT脂质。
在所述方法的某些实施方案中，所述SORT脂质实现所述核酸编辑系统向受试者的细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比具有更大的治疗效果。在某些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在某些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含一定量的SORT脂质。在某些实施方案中，所述参考脂质包含13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。
在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约20倍治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约10倍治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约5倍治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约5倍至约10倍治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约10倍至约20倍治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍或至少约20倍治疗效果。
在所述方法的某些实施方案中，在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约20倍治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约10倍的治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约1.1倍至约5倍的治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现约10倍至约20倍的治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，在选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合的细胞中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质实现至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍或至少约20倍治疗效果。
在所述方法的某些实施方案中，所述SORT脂质实现所述核酸编辑系统向受试者的细胞的递送，其特征在于与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比在更多细胞中的治疗效果。在某些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含SORT脂质。在某些实施方案中，所述参考脂质组合物不包含一定量的SORT脂质。在某些实施方案中，所述参考脂质包含13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇(“LF92”)、磷脂、胆固醇和PEG-脂质。
在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约20倍细胞中实现治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍细胞中实现治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约5倍细胞中实现治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍细胞中实现治疗效果。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍或至少约100倍细胞中实现治疗效果。
在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约20倍细胞中实现治疗效果，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约1.1倍至约10倍细胞中实现治疗效果，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约5倍至约10倍细胞中实现治疗效果，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在约10倍至约20倍细胞中实现治疗效果，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。在所述方法的某些实施方案中，与用参考脂质组合物实现的治疗效果相比，所述SORT脂质在至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍或至少约20倍细胞中实现治疗效果，其中所述细胞选自基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。
另外的脂质
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含另外的脂质，包括、但不限于类固醇或类固醇衍生物、PEG脂质和磷脂。
磷脂或其它两性离子脂质
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含磷脂。在某些实施方案中，所述磷脂可以含有一个或两个长链(例如，C6-C24)烷基或烯基基团、甘油或鞘氨醇、一个或两个磷酸酯基团和任选的小有机分子。所述小有机分子可以是氨基酸、糖或氨基取代的烷氧基基团，诸如胆碱或乙醇胺。在某些实施方案中，所述磷脂是磷脂酰胆碱。在某些实施方案中，所述磷脂是二硬脂酰基磷脂酰胆碱或二油酰基磷脂酰乙醇胺。在某些实施方案中，使用其它两性离子脂质，其中两性离子脂质定义具有正电荷和负电荷的脂质和脂质样分子。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述磷脂不是乙基磷酸胆碱。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述组合物可以进一步包含约20至约23的磷脂与总脂质组合物的摩尔或重量百分比。在某些实施方案中，所述摩尔百分比是约20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、24、25、26、27、28、29、至约30或其中可导出的任何范围。在其它实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约7.5至约60。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、至约20或其中可导出的任何范围。在其它实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约7.5至约60。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、24、25、26、27、28、29、至约30或其中可导出的任何范围。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约8％至约23％的摩尔或重量百分比的磷脂。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约10％至约20％的摩尔或重量百分比的磷脂。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约15％至约20％的摩尔或重量百分比的磷脂。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约8％至约15％的摩尔或重量百分比的磷脂。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约10％至约15％的摩尔或重量百分比的磷脂。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约12％至约18％的摩尔或重量百分比的磷脂。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至少(约)8％、至少(约)10％、至少(约)12％、至少(约)15％、至少(约)18％、至少(约)20％或至少(约)23％的摩尔或重量百分比的磷脂。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至多(约)8％、至多(约)10％、至多(约)12％、至多(约)15％、至多(约)18％、至多(约)20％或至多(约)23％的摩尔或重量百分比的磷脂。
类固醇或类固醇衍生物
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含类固醇或类固醇衍生物。在某些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物包含任何类固醇或类固醇衍生物。如本文中使用的，在某些实施方案中，术语“类固醇”是一类具有四环17碳环状结构的化合物，其可以进一步包含一个或多个取代，所述取代包括烷基基团、烷氧基基团、羟基基团、氧代基团、酰基基团、或在两个或更多个碳原子之间的双键。在一个方面，类固醇的环结构包含三个稠合的环己基环和一个稠合的环戊基环，如下式所示：
在某些实施方案中，所述类固醇衍生物包含具有一个或多个非烷基取代的上述环结构。在某些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物是甾醇，其中该式进一步定义为：在本申请的某些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物是胆甾烷或胆甾烷衍生物。在胆甾烷中，环结构进一步由下式定义：/>如上所述，胆甾烷衍生物包括一个或多个上述环系统的非烷基取代。在某些实施方案中，所述胆甾烷或胆甾烷衍生物是胆甾烯或胆甾烯衍生物或者甾醇或甾醇衍生物。在其它实施方案中，所述胆甾烷或胆甾烷衍生物是胆甾烯(cholestere)和甾醇或其衍生物。
在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述组合物可以进一步包含约40至约46的类固醇与总脂质组合物的摩尔或重量百分比。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约40、41、42、43、44、45、至约46或其中可导出的任何范围。在其它实施方案中，类固醇相对于总脂质组合物的摩尔或重量百分比是约15至约40或约15至约45。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、至约50或其中可导出的任何范围。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约15％至约46％的摩尔或重量百分比的类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约20％至约40％的摩尔或重量百分比的类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约25％至约35％的摩尔或重量百分比的类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约30％至约40％的摩尔或重量百分比的类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约20％至约30％的摩尔或重量百分比的类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至少(约)15％、至少(约)20％、至少(约)25％、至少(约)30％、至少(约)35％、至少(约)40％、至少(约)45％或至少(约)46％的摩尔或重量百分比的类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至多(约)15％、至多(约)20％、至多(约)25％、至多(约)30％、至多(约)35％、至多(约)40％、至多(约)45％或至多(约)46％的摩尔或重量百分比的类固醇或类固醇衍生物。
聚合物缀合的脂质
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物进一步包含聚合物缀合的脂质。在某些实施方案中，所述聚合物缀合的脂质是PEG脂质。在某些实施方案中，所述PEG脂质是甘油二酯，其也包含与甘油基团连接的PEG链。在其它实施方案中，所述PEG脂质是含有用PEG链与接头基团连接的一个或多个C6-C24长链烷基或烯基基团或C6-C24脂肪酸基团的化合物。PEG脂质的一些非限制性例子包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG缀合的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺、PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在某些实施方案中，PEG修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺或PEG修饰的二肉豆蔻酰基-sn-甘油。在某些实施方案中，通过脂质的PEG组分的分子量来测量PEG修饰。在某些实施方案中，所述PEG修饰具有约100至约15,000的分子量。在某些实施方案中，所述分子量是约200至约500、约400至约5,000、约500至约3,000、或约1,200至约3,000。PEG修饰的分子量是约100、200、400、500、600、800、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,500至约15,000。美国专利5,820,873、WO 2010/141069或美国专利8,450,298教导了可用于本申请中的脂质的一些非限制性例子，所述文献通过引用并入本文。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述PEG脂质具有结构式：其中：R12和R13各自独立地是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这些基团中的任一个的取代形式；Re是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；且x是1-250。在某些实施方案中，Re是烷基(C≤8)诸如甲基。R12和R13各自独立地是烷基(C≤4-20)。在某些实施方案中，x是5-250。在一个实施方案中，x是5-125或x是100-250。在某些实施方案中，所述PEG脂质是1、2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述PEG脂质具有结构式:其中：n1是1至100之间的整数且n2和n3各自独立地选自1至29之间的整数。在某些实施方案中，n1是5、10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，n1是从约30至约50。在某些实施方案中，n2是从5至23。在某些实施方案中，n2是11至约17。在某些实施方案中，n3是从5至23。在某些实施方案中，n3是11至约17。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述组合物可以进一步包含约4.0至约4.6的PEG脂质与总脂质组合物的摩尔或重量百分比。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、至约4.6或其中可导出的任何范围。在其它实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约1.5至约4.0。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约1、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、至约4.0或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，所述摩尔或重量百分比是约1、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、至约10或其中可导出的任何范围。
在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约0.5％至约10％的摩尔或重量百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约1％至约8％的摩尔或重量百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约1％至约10％的摩尔百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约2％至约10％的摩尔百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约2％至约7％的摩尔或重量百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约3％至约5％的摩尔或重量百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含约5％至约10％的摩尔或重量百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至少(约)0.5％、至少(约)1％、至少(约)1.5％、至少(约)2％、至少(约)2.5％、至少(约)3％、至少(约)3.5％、至少(约)4％、至少(约)4.5％、至少(约)5％、至少(约)5.5％、至少(约)6％、至少(约)6.5％、至少(约)7％、至少(约)7.5％、至少(约)8％、至少(约)8.5％、至少(约)9％、至少(约)9.5％或至少(约)10％的摩尔或重量百分比的聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的某些实施方案中，所述脂质组合物包含至多(约)0.5％、至多(约)1％、至多(约)1.5％、至多(约)2％、至多(约)2.5％、至多(约)3％、至多(约)3.5％、至多(约)4％、至多(约)4.5％、至多(约)5％、至多(约)5.5％、至多(约)6％、至多(约)6.5％、至多(约)7％、至多(约)7.5％、至多(约)8％、至多(约)8.5％、至多(约)9％、至多(约)9.5％或至多(约)10％的摩尔或重量百分比的聚合物缀合的脂质。
用于增强CFTR表达或活性的方法
本文中公开的内容包括一种用于增强细胞中囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性的方法。所述方法可以包含：(a)使所述细胞接触用脂质组合物组装的核酸编辑系统，所述核酸编辑系统包含(i)指导核酸，(ii)包含内切核酸酶的异源多肽或编码所述异源多肽的异源多核苷酸，和(iii)供体模板核酸，以在所述细胞中产生所述异源内切核酸酶与所述指导核酸的复合物；(b)在切割位点处用所述复合物切割所述细胞中的CFTR基因或转录物以产生被切割的CFTR基因或转录物；和(c)使用所述供体模板核酸来修复所述被切割的CFTR基因或转录物以在所述细胞中产生编码功能性CFTR蛋白的经修复的CFTR基因或转录物，由此增强所述细胞中CFTR蛋白的表达或活性。在(b)或切割事件中切割的CFTR基因或转录物可以是内源CFTR基因或转录物。在(b)或切割事件中切割的CFTR基因或转录物可以是突变体CFTR基因或转录物。在(b)或切割事件中切割的CFTR基因或转录物可以是内源突变体CFTR基因或转录物。通过同源定向修复(HDR)途径或事件可以产生修复的CFTR基因或转录物。由修复的CFTR基因或转录物编码的功能性CFTR蛋白可以是野生型CFTR蛋白。所述核酸编辑系统可以是本文描述的一种，例如，在“核酸编辑系统”部分中。所述方法可以包含使用所述供体模板核酸通过同源定向修复(HDR)途径或事件来修复所述被切割的CFTR基因或转录物。
在用于增强CFTR蛋白的表达或活性的方法的某些实施方案中，所述脂质组合物包含：可电离的阳离子脂质；和与所述可电离的阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含与所述SORT脂质分开的磷脂。所述脂质组合物可以是本文描述的一种，例如，在“脂质组合物”部分中。
在用于增强CFTR蛋白的表达或活性的方法的某些实施方案中，所述接触或(a)是离体的。在某些实施方案中，所述接触或(a)是体外的。在某些实施方案中，所述接触或(a)是体内的。在某些实施方案中，所述接触或(a)是重复的。在某些实施方案中，所述细胞是本文描述的细胞，例如，在“细胞”部分中。在某些实施方案中，所述细胞是肺细胞，例如，肺基底细胞。在某些实施方案中，所述肺基底细胞表现出或被确定表现出p63。在某些实施方案中，所述细胞是气道上皮细胞，例如，支气管上皮细胞。在某些实施方案中，所述细胞是未分化的。在某些实施方案中，所述细胞是分化的。在某些实施方案中，所述接触或(a)包含接触多个包含所述细胞(例如，肺细胞，诸如肺基底细胞)的细胞(例如，肺细胞，诸如肺基底细胞)。所述修复或(c)可以产生功能性的(例如，野生型)CFTR基因、转录物或蛋白，例如，在所述多个细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％中。
在用于增强CFTR蛋白的表达或活性的方法的某些实施方案中，切割事件或(b)包含切割(例如，内源)(例如，突变体)CFTR基因或转录物，其与相应野生型相应物相比包含突变。所述突变可以是功能丧失突变，诸如无义或移码突变。所述突变可以存在于选自CFTR的外显子9-27(例如，外显子10、外显子12)的外显子中。所述突变可以是F508del或G542X。所述突变可以是F508del。所述突变可以是G542X。所述(例如，功能丧失)突变可以与囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)相关。所述方法可以将细胞中的突变体CFTR基因或转录物改变为功能性CFTR基因或转录物，例如，通过在切割位点处或附近插入一个或多个核苷酸。
在用于增强CFTR蛋白的表达或活性的方法的某些实施方案中，修复事件或(c)的特征在于例如不超过约50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％或40％的脱靶插入或/和缺失(插入缺失)率。所述脱靶插入缺失率可以与在修复事件或(c)中的不同源末端连接(NHEJ)途径或事件相关或以其为特征。所述脱靶插入缺失率可以包含(1)被检测到具有错误地改变的CFTR基因或转录物的试验细胞的总数相对于(2)总试验细胞的总数的比率。所述错误地改变的CFTR基因或转录物可以编码无功能的CFTR蛋白。所述错误地改变的CFTR基因或转录物可以在核酸编辑系统的切割位点处或附近包含相对于细胞中的内源(例如，突变体)CFTR基因或转录物的插入或/和缺失(插入缺失)。在某些实施方案中，修复事件或(c)的特征在于例如至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的在靶修复率。所述在靶修复率可以与在修复事件或(c)中的同源定向修复(HDR)途径或事件相关或以其为特征。所述在靶修复率可以包含(1)被检测到具有(例如，校正地)修复的CFTR基因或转录物的试验细胞的总和相对于(2)总试验细胞的总数的比率。(例如，校正地)修复的CFTR基因或转录物可以编码功能性的(例如，野生型)CFTR蛋白。对靶序列的准确特异性以及脱靶插入和/或缺失的数目的防止或减少可以通过使用计算机环境预测算法设计寡物或寡物的其它设计方法来进行，诸如分析给定序列中的潜在靶标和脱靶。
在用于增强CFTR蛋白的表达或活性的方法的某些实施方案中，与相应对照相比，所述方法增加所述细胞中功能性CFTR基因、转录物或蛋白的量(例如，增加至少约1.1倍)。在某些实施方案中，所述方法在所述细胞中产生治疗有效量的功能性CFTR基因、转录物或蛋白。在某些实施方案中，按摩尔或重量计，在所有检测的或可检测的CFTR基因、转录物或蛋白中，所述方法产生至少约10％、15％、20％、25％或30％。所述功能性CFTR基因、转录物或蛋白可以是野生型CFTR基因、转录物或蛋白。对应的对照可以是没有所述接触或(a)的相应细胞。对应的对照可以是没有所述接触或(a)的相应细胞。
在用于增强CFTR蛋白的表达或活性的方法的某些实施方案中，与相应对照相比，所述方法增强细胞中的(例如，氯离子)离子运输(例如，增强至少约1.1倍)。所述方法可以减少氯离子(诸如氯阴离子或以盐酸盐或其它含氯化合物的形式)从或向细胞的缺陷输出或输入。所述方法可以增强或刺激细胞中的离子(例如，氯离子)运输。增强的或刺激的离子(例如，氯离子)运输可以导致(例如，氯离子)离子的分泌或吸收。对应的对照可以是没有所述接触的相应细胞。通过采用标准Ussing室(参见Ussing和Zehrahn,Acta.Physiol.Scand.23:110-127,1951)或鼻电位差测量(参见Knowles等人,Hum.GeneTherapy 6:445-455,1995)评价CFTR介导的跨细胞电流，可以确定增强的(例如，氯离子)离子运输。通过使用Vu等人,J.Med.Chem.2017,60,458-473(其特此通过引用整体并入)所描述的TECC-24系统的Ieq(等效电流)测定，可以确定增强的氯离子运输。
通过国际专利申请号PCT/US2017/032967(公开为WO2017201091，其特此通过引用整体并入)中描述的CFTR依赖性的全细胞电流测量，可以确定增强的(例如，氯离子)离子运输。
在某些实施方案中，所述方法进一步包含从所述细胞衍生出(例如，通过细胞培养)细胞组合物(例如，肺细胞组合物)。
肺细胞编辑的方法
本文中公开的内容包括一种用于遗传校正肺(例如，基底)细胞中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使肺(例如，基底)细胞接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述肺(例如，基底)细胞。
本文中公开的内容包括一种用于遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使包含多个肺(例如，基底)细胞的细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给例如所述多个肺(例如，基底)细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％。
本文中公开的内容包括一种用于遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：所述细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，所述细胞组合物包含肺(例如，基底)细胞和肺非基底细胞，由此将所述核酸编辑系统递送给所述肺(例如，基底)细胞，其量大于递送给所述肺非基底细胞的量。所述非基底细胞可以是离子细胞(例如，表现出或被确定表现出FOXI1)、纤毛细胞或分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)。
在这部分的用于遗传校正CFTR的方法中的任一种的某些实施方案中，所述肺(例如，基底)细胞或所述多个肺(例如，基底)细胞被确定表现出在CFTR基因中的突变。在这部分的用于遗传校正CFTR的方法中的任一种的某些实施方案中，所述肺(例如，基底)细胞或所述多个肺(例如，基底)细胞表现出在CFTR基因中的突变。
在这部分的用于遗传校正CFTR的方法中的任一种的某些实施方案中，所述肺(例如，基底)细胞或所述多个肺(例如，基底)细胞是来自受试者。所述受试者可以被确定表现出在CFTR基因中的突变。所述受试者可以表现出在CFTR基因中的突变。
在这部分的用于遗传校正CFTR的方法中的任一种的某些实施方案中，所述接触是离体的。在这部分的用于遗传校正CFTR的方法中的任一种的某些实施方案中，所述接触是体外的。在这部分的用于遗传校正CFTR的方法中的任一种的某些实施方案中，所述接触是体内的。
在所述方法的某些实施方案中，从所述受试者分离细胞或多个细胞。可以使本文别处描述的组合物与在所述受试者体外的细胞接触。在施用所述组合物或治疗剂后，可以将所述细胞重新注射或以其它方式重新引入所述受试者中。在所述方法的某些实施方案中，所述细胞是细胞系。在所述方法的某些实施方案中，所述细胞是肺细胞。在某些实施方案中，所述肺细胞是肺气道细胞。通过本申请的递送可以靶向的肺气道细胞的例子包括、但不限于基底细胞、分泌细胞(诸如杯形细胞和棒状细胞)、纤毛细胞及其任何组合。
治疗方法
本文中公开的内容包括一种用于治疗患有或疑似患有囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)相关病症的受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用一种组合物，其包含用脂质组合物(诸如本文在“脂质组合物”部分中描述的那种)组装的核酸编辑系统(诸如本文在“核酸编辑系统”部分中描述的那种)。所述CFTR相关病症可以是囊性纤维化、遗传性肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)或它们的组合。所述受试者可以是哺乳动物。所述受试者可以是非人类物种(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猴、长臂猿、黑猩猩、猿、狒狒、牛、猪、马、绵羊、猫和其它物种)。所述受试者可以是人。所述受试者可以被确定表现出在CFTR基因中的突变(例如，F508del或G542X)。在某些实施方案中，所述施用包含全身性(例如，静脉内的)施用。在某些实施方案中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。在某些实施方案中，所述受试者是人。
经工程改造的细胞
本文中公开的内容包括经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自细胞，所述细胞包含由本文(例如，在“核酸编辑系统”部分中)描述的组合物产生的异源囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因、转录物或蛋白。
本文中公开的内容包括经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自特定细胞，所述特定细胞具有通过本文(例如，在“用于增强CFTR表达或活性的方法”部分中)描述的方法增强的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性。
本文中公开的内容包括经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自与本文(例如，在“肺细胞编辑方法”部分中)描述的包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物发生接触的一个肺(例如，基底)细胞或多个肺(例如，基底)细胞。
在某些实施方案中，在体外衍生出所述经工程改造的细胞组合物。在某些实施方案中，离体衍生出所述经工程改造的细胞组合物。
细胞
基底细胞
基底细胞源自发育中的气道内的未分化柱状上皮。它们的特征在于在柱状上皮中的基底位置、半桥粒(其特征在于α6β4整联蛋白)、细胞角蛋白5和14、NGFR和核蛋白p63的存在。基底细胞的分布因气道水平和动物物种而异。直径较大的气道具有比直径较小的气道更多的基底细胞。随着气道直径减小，基底细胞的数目也减少，并且在终末细支气管中不存在基底细胞。
在另一个方面，本文提供了一种用于核酸编辑系统的(例如，肺)基底细胞递送的方法，所述方法包含：使所述(例如，肺)基底细胞接触包含用脂质组合物组装的所述核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述(例如，肺)基底细胞。在某些实施方案中，所述接触是离体的。例如，可以从患者分离细胞并与所述组合物接触。然后可以将所述细胞重新引入所述受试者中。在某些实施方案中，所述接触是体外的。在某些实施方案中，所述接触是体内的。所述细胞可以源自所述受试者。所述细胞可以是在所述受试者中。所述受试者可以是本文别处描述的受试者。例如，所述受试者可以被确定表现出在CFTR基因中的突变。
在另一个方面，本文提供了一种用于核酸编辑系统的(例如，肺)基底细胞递送的方法，所述方法包含：使包含多个(例如，肺)基底细胞的(例如，肺)细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的所述核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述多个(例如，肺)基底细胞中的至少15％。所述肺细胞组合物还可以包含如本文别处所述的其它肺细胞，例如，离子细胞、纤毛细胞、分泌细胞或它们的组合。所述(例如肺)细胞组合物可以包含第一CFTR基因型的第一细胞和第二CFTR基因型的第二细胞。所述(例如肺)细胞可以包含多种基因型或多种CFTR等位基因。
在另一个方面，本文提供了一种用于核酸编辑系统的(例如，肺)基底细胞靶向递送的方法，所述方法包含：使多个细胞类型的多个(例如，肺)细胞接触包含用脂质组合物组装的所述核酸编辑系统的组合物，所述多个细胞包含(例如，肺)基底细胞和(例如，肺)非基底细胞，由此将所述核酸编辑系统递送给所述基底细胞，其量大于递送给所述非基底细胞的量。所述肺细胞组合物还可以包含如本文别处所述的其它肺细胞，例如，离子细胞、纤毛细胞、分泌细胞或它们的组合。所述(例如肺)细胞组合物可以包含第一CFTR基因型的第一细胞和第二CFTR基因型的第二细胞。所述(例如肺)细胞可以包含多种基因型或多种CFTR等位基因。
在另一个方面，本文提供了一种用于向受试者的基底细胞递送的方法，所述方法包含向所述受试者施用在本申请中描述的药物组合物。在所述方法的某些实施方案中，所述药物组合物包含在本申请中描述的用脂质组合物组装的核酸编辑系统，其中所述脂质组合物包含(i)可电离的阳离子脂质；和(ii)与所述可电离的阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。所述脂质组合物可以进一步包含磷脂。在某些实施方案中，所述基底细胞是肺基底细胞。
在所述方法的某些实施方案中，通过任何合适的递送将所述药物组合物施用给所述受试者。在某些实施方案中，通过吸入将所述药物组合物施用给所述受试者。在某些实施方案中，通过全身施用诸如静脉内施用将所述药物组合物施用给所述受试者。
纤毛细胞
纤毛细胞是在细胞表面上具有纤毛结构的那些细胞。纤毛细胞的例子包括、但不限于呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸网纤毛细胞、输出小管纤毛细胞和/或纤毛室管膜细胞。人呼吸道纤毛细胞在其表面上有200至300根纤毛。纤毛是直径约0.25mm的来自顶端细胞膜的细长活动圆柱形突出物，其含有与细胞连续的微管和细胞质。人气管纤毛具有5至8mm长度，在越远端气道中变得越短。
纤毛的结构是复杂的，并且由轴丝组成，所述轴丝通过基体和小根锚定至细胞，并且其在其尖端具有一些较小的爪状结构。所述基体所指向的方向定义了纤毛的方向和有效搏动的方向。所述轴丝含有围绕一对中央微管的九对微管，以及径向辐条和外围连接蛋白链接，这在很大程度上维持了纤毛的轮状排列。内臂和外臂附着至微管。双联体的主要结构蛋白是微管蛋白。臂(内臂和外臂)含有动力蛋白，这是一种被归类为ATP酶的蛋白。动力蛋白产生导致微管滑动的力，这引起纤毛运动。普遍认为，外部动力蛋白臂主要负责搏动频率，而内部动力蛋白臂与径向辐条和连接蛋白链接一起在搏动波形中发挥作用。轴丝的结构完整性的变化可以导致异常运动，其范围从静止到异常的多动模式。
分泌细胞
“分泌细胞”表示专门进行分泌的细胞。这些细胞通常起源于上皮细胞，并具有特征性的、发育良好的粗面内质网，或者在分泌脂质或脂质衍生产物的细胞的情况下，具有发育良好的光滑内质网。分泌细胞的例子包括：唾液腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、耵聍腺细胞、外泌汗腺细胞、顶泌汗腺细胞、皮脂腺细胞、鲍曼氏腺细胞、布伦纳腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、巴多林腺细胞、利特雷氏腺细胞、子宫内膜细胞、呼吸道和消化道的杯形细胞、胃粘液细胞、胃腺的酶原细胞、胃腺的泌酸细胞、胰腺的腺泡细胞、小肠的潘氏细胞、肺的II型肺细胞、肺的棒状细胞、垂体前叶细胞、垂体中叶细胞、垂体后叶细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、肾脏的近肾小球旁器细胞、分泌细胞外基质的细胞(例如，上皮细胞、非上皮细胞(诸如成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞/骨细胞、骨祖细胞)和免疫系统的分泌细胞(例如，产生Ig的B细胞、产生细胞因子的T细胞等)。
以下是本公开内容的组合物的实施例和组合物的评价。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其它的实施方案。
实施方案的列表
本发明的以下实施方案列表将被认为公开了本发明的各种特征，所述特征可以被认为是在其下讨论它们的特定实施方案所特有的，或者可以与在其它实施方案中列出的各种其它特征组合。因而，仅仅因为在一个特定实施方案下讨论一个特征并不一定将该特征的使用限制于该实施方案。
实施方案1.一种用于增强细胞中囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性的方法，所述方法包含：(a)使所述细胞接触用脂质组合物组装的核酸编辑系统，所述核酸编辑系统包含(i)指导核酸，(ii)包含内切核酸酶的异源多肽或编码所述异源多肽的异源多核苷酸，和(iii)供体模板核酸，以在所述细胞中产生所述异源内切核酸酶与所述指导核酸的复合物；(b)在切割位点处用所述复合物切割所述细胞中的CFTR基因或转录物以产生被切割的CFTR基因或转录物；和(c)使用所述供体模板核酸修复所述被切割的CFTR基因或转录物以在所述细胞中产生编码功能性CFTR蛋白的经修复的CFTR基因或转录物，由此增强所述细胞中所述CFTR蛋白的表达或活性。
实施方案2.实施方案1的方法，其中(c)的特征在于不超过约50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％或40％的脱靶插入或/和缺失(插入缺失)率。
实施方案3.实施方案2的方法，其中所述脱靶插入缺失率包含(1)被检测到具有错误地改变的CFTR基因或转录物的试验细胞的总数相对于(2)总试验细胞的总数的比率。
实施方案4.实施方案1-3中的任一个的方法，其中(c)的特征在于至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的在靶修复率。
实施方案5.实施方案4的方法，其中所述在靶修复率包含(1)被检测到具有所述修复的CFTR基因或转录物的试验细胞的总数相对于(2)总试验细胞的总数的比率。
实施方案6.实施方案1-5中的任一个的方法，其中与相应对照相比，所述方法增加所述细胞中功能性CFTR基因、转录物或蛋白的量(例如，增加至少约1.1倍)，任选地，其中所述相应对照是没有所述接触的相应细胞。
实施方案7.实施方案1-6中的任一个的方法，其中所述方法在所述细胞中产生治疗有效量的功能性CFTR基因、转录物或蛋白(例如，在所有可检测的CFTR基因、转录物或蛋白中的至少约10％、15％、20％、25％或30％)。
实施方案8.实施方案1-7中的任一个的方法，其中与相应对照相比，所述方法增强所述细胞中的(例如，氯离子)离子运输(例如，增强至少约1.1倍)，任选地，其中所述相应对照是没有所述接触的相应细胞。
实施方案9.实施方案1-8中的任一个的方法，其中所述细胞是肺细胞。
实施方案10.实施方案9的方法，其中所述细胞是肺基底细胞。
实施方案11.实施方案1-10中的任一个的方法，其中所述细胞是气道上皮细胞(例如，支气管上皮细胞)。
实施方案12.实施方案1-11中的任一个的方法，其中所述细胞是未分化的。
实施方案13.实施方案1-11中的任一个的方法，其中所述细胞是分化的。
实施方案14.实施方案1-13中的任一个的方法，其中(b)包含切割包含功能丧失突变的CFTR基因或转录物。
实施方案15.实施方案14的方法，其中所述功能丧失突变包含在外显子中的突变，所述外显子选自CFTR的外显子9-27。
实施方案16.实施方案14或15的方法，其中所述功能丧失突变是F508del或G542X。
实施方案17.实施方案14-16中的任一个的方法，其中所述功能丧失突变与囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)相关。
实施方案18.实施方案1-17中的任一个的方法，其中所述接触是离体的。
实施方案19.实施方案1-17中的任一个的方法，其中所述接触是体外的。
实施方案20.实施方案1-17中的任一个的方法，其中所述接触是体内的。
实施方案21.实施方案1-20中的任一个的方法，其中所述接触是重复的。
实施方案22.实施方案1-21中的任一个的方法，其中所述接触包含接触多个包含所述细胞的细胞。
实施方案23.实施方案22的方法，其中所述修复在所述多个细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％中产生功能性CFTR基因、转录物或蛋白，任选地其中所述多个细胞是多个(例如，肺)基底细胞。
实施方案24.实施方案1-23中的任一个的方法，其中所述脂质组合物包含：可电离的阳离子脂质；和与所述可电离的阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。
实施方案25.实施方案24的方法，其中所述脂质组合物包含与所述SORT脂质分开的磷脂。
实施方案26.实施方案1-25中的任一个的方法，其中所述治疗效果的特征在于在所述受试者的所述器官或组织内的所述至少约10％(例如，至少约15％)基底细胞中可检测的所述试剂的量或活性。
实施方案27.实施方案1-26中的任一个的方法，其中所述脂质组合物包含约20％至约65％的摩尔百分比的所述SORT脂质。
实施方案28.实施方案1-27中的任一个的方法，其中所述脂质组合物包含约5％至约30％的摩尔百分比的所述可电离的阳离子脂质。
实施方案29.实施方案1-28中的任一个的方法，其中所述脂质组合物包含约8％至约23％的摩尔百分比的所述磷脂。
实施方案30.实施方案1-29中的任一个的方法，其中所述磷脂不是乙基磷酸胆碱。
实施方案31.实施方案1-30中的任一个的方法，其中所述脂质组合物进一步包含类固醇或类固醇衍生物。
实施方案32.实施方案31的方法，其中所述脂质组合物包含约15％至约46％的摩尔百分比的所述类固醇或类固醇衍生物。
实施方案33.实施方案1-32中的任一个的方法，其中所述脂质组合物进一步包含聚合物缀合的脂质(例如，聚(乙二醇)(PEG)缀合的脂质)。
实施方案34.实施方案33的方法，其中所述脂质组合物包含约0.5％至约10％、约1％至约10％或约2％至约10％的摩尔百分比的所述聚合物缀合的脂质。
实施方案35.实施方案1-34中的任一个的方法，其中所述治疗剂是多核苷酸；且其中所述脂质组合物中的氮与所述多核苷酸中的磷酸酯的摩尔比(N/P比率)不超过约20:1。
实施方案36.实施方案35的方法，其中所述N/P比率是约5:1至约20:1。
实施方案37.实施方案1-36中的任一个的方法，其中所述治疗剂与所述脂质组合物的总脂质的摩尔比不超过约1:1、1:10、1:50或1:100。
实施方案38.实施方案1-37中的任一个的方法，其中至少约85％的所述治疗剂被包封在所述脂质组合物的颗粒中。
实施方案39.实施方案1-38中的任一个的方法，其中所述脂质组合物包含多个通过下述一种或多种特征表征的颗粒：
(1)100纳米(nm)或更小的(例如，平均)尺寸；
(2)不超过约0.2的多分散性指数(PDI)；和
(3)-10毫伏(mV)至10mV的负ζ电位。
实施方案40.实施方案1-39中的任一个的方法，其中所述脂质组合物具有在6至7的范围外的表观电离常数(pKa)。
实施方案41.实施方案40的方法，其中所述脂质组合物的所述表观pKa是约7或更高。
实施方案42.实施方案40的方法，其中所述脂质组合物的所述表观pKa是约8或更高。
实施方案43.实施方案42的方法，其中所述脂质组合物的所述表观pKa是约8至约13。
实施方案44.实施方案1-43中的任一个的方法，其中所述SORT脂质包含永久带正电荷的部分(例如，季铵离子)。
实施方案45.实施方案44的方法，其中所述SORT脂质包含抗衡离子。
实施方案46.实施方案1-45中的任一个的方法，其中所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质(例如，饱和的或不饱和的)。
实施方案47.实施方案46中的任一个的方法，其中所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。
实施方案48.实施方案1-47中的任一个的方法，其中所述SORT脂质包含具有以下结构式的首基：其中L是(例如，可生物降解的)接头；Z+是带正电荷部分(例如，季铵离子)；且X-是抗衡离子。
实施方案49.实施方案48的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中R1和R2各自独立地是任选地被取代的C6-C24烷基或任选地被取代的C6-C24烯基。
实施方案50.实施方案48的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：
实施方案51.实施方案48-50中的任一个的方法，其中L是其中:p和q各自独立地是1、2或3；且R4是任选取代的C1-C6烷基。
实施方案52.实施方案48的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
R4是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；且
X-是单价阴离子。
实施方案53.实施方案1-47中的任一个的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
实施方案54.实施方案1-47中的任一个的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
实施方案55.实施方案1-47中的任一个的方法，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R4和R4′各自独立地是烷基(C6-C24)、烯基(C6-C24)或任一个基团的被取代形式；
R4″是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或任一个基团的被取代形式；
R4″′是烷基(C1-C8)、烯基(C2-C8)或任一个基团的被取代形式；且
X2是单价阴离子。
实施方案56.实施方案1-47中的任一个的方法，其中所述SORT脂质选自表6中所示的那些、或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案57.实施方案1-56中的任一个的方法，其中所述可电离的阳离子脂质是具有以下结构式的代数(g)的树枝状聚合物或树枝状大分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(a)所述核心包含结构式(X核心)：
其中：
Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b-；
R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f；
R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6，诸如C1-C3)烷基；
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢或任选地被取代的(例如，C1-C12)烷基；
L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、(例如，C1-C12，诸如C1-C6或C1-C3)亚烷基、(例如，C1-C12，诸如C1-C8或C1-C6)亚杂烷基(例如，C2-C8亚烷基氧化物，诸如寡(亚乙基氧化物))、[(例如，C1-C6)亚烷基]-[(例如，C4-C6)杂环烷基]-[(例如，C1-C6)亚烷基]、[(例如，C1-C6)亚烷基]-(亚芳基)-[(例如，C1-C6)亚烷基](例如，[(例如，C1-C6)亚烷基]-亚苯基-[(例如，C1-C6)亚烷基])、(例如，C4-C6)杂环烷基和亚芳基(例如，亚苯基)；或，
可替换地，L1的部分与R1c和R1d之一形成(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子)；且
x1是0、1、2、3、4、5或6；且
(b)所述多个(N个)分支中的每个分支独立地包含结构式(X分支)：
其中：
*指示所述分支与所述核心的连接点；
g是1、2、3或4；
Z＝2(g-1)；
当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，
(c)每个二酰基基团独立地包含结构式其中：
*指示所述二酰基基团在其近侧端部处的连接点；
**指示所述二酰基基团在其远侧端部处的连接点；
Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；
A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-，其中：
R4是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6)烷基；
m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3；且
R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C8)烷基；且
(d)每个接头基团独立地包含结构式
其中：
**指示所述接头与近侧二酰基基团的连接点；
***指示所述接头与远侧二酰基基团的连接点；且
Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；且
(e)每个封端基团独立地选自任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烷基硫醇和任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烯基硫醇。
实施方案58.实施方案57的方法，其中x1是0、1、2或3。
实施方案59.实施方案57或58的方法，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点(例如，如*所指示)、氢或C1-C12烷基(例如，C1-C8烷基，诸如C1-C6烷基或C1-C3烷基)，其中所述烷基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自-OH、C4-C8(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，哌啶基(例如，或/>)、N-(C1-C3烷基)-哌啶基(例如，/>)、哌嗪基(例如，/>)、N-(C1-C3烷基)-哌嗪基(piperadizinyl)(例如，/>)、吗啉基(例如，/>)、N-吡咯烷基(例如，)、吡咯烷基(例如，/>)或N-(C1-C3烷基)-吡咯烷基(例如，/>))、(例如，C6-C10)芳基和C3-C5杂芳基(例如，咪唑基(例如，/>)或吡啶基(例如，/>))。
实施方案60.实施方案59的方法，其中R1a,R1b,R1c,R1d,R1e,R1f,和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点(例如，如*所指示)、氢或C1-C12烷基(例如，C1-C8烷基，诸如C1-C6烷基或C1-C3烷基)，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。
实施方案61.实施方案57-60中的任一个的方法，其中R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢。
实施方案62.实施方案57-61中的任一个的方法，其中所述多个(N个)分支包含至少3个(例如，至少4个或至少5个)分支。
实施方案63.实施方案57-62中的任一个的方法，其中g＝1；G＝0；且Z＝1。
实施方案64.实施方案63的方法，其中所述多个分支的每个分支包含结构式
实施方案65.实施方案57-62中的任一个的方法，其中g＝2；G＝1；且Z＝2。
实施方案66.实施方案65的方法，其中所述多个分支的每个分支包含结构式
实施方案67.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心包含结构式：(例如，/>)。
实施方案68.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心包含结构式：
实施方案69.实施方案68的方法，其中所述核心包含结构式：(例如，/> )。
实施方案70.实施方案68的方法，其中所述核心包含结构式：(例如，/>诸如/> )。
实施方案71.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心包含结构式：其中Q’是-NR2-或-CR3aR3b-；q1和q2各自独立地是1或2。
实施方案72.实施方案71的方法，其中所述核心包含结构式：(例如，/> )。
实施方案73.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心包含结构式(例如，/> )，其中环A是任选地被取代的芳基或任选地被取代的(例如，C3-C12，诸如C3-C5)杂芳基。
实施方案74.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心包含结构式
实施方案75.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心选自在表1中所示的那些或其子集。
实施方案76.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心包含选自以下的结构式：/> />及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。
实施方案77.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心包含选自以下的结构式：
及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。
实施方案78.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。
实施方案79.实施方案78的方法，其中至少2个分支连接至所述核心。
实施方案80.实施方案78的方法，其中至少3个分支连接至所述核心。
实施方案81.实施方案78的方法，其中至少4个分支连接至所述核心。
实施方案82.实施方案57-66中的任一个的方法，其中所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。
实施方案83.实施方案82的方法，其中至少4个分支连接至所述核心。
实施方案84.实施方案82的方法，其中至少5个分支连接至所述核心。
实施方案85.实施方案82的方法，其中至少6个分支连接至所述核心。
实施方案86.实施方案57-85中的任一个的方法，其中A1是-O-或-NH-。
实施方案87.实施方案86的方法，其中A1是-O-。
实施方案88.实施方案57-87中的任一个的方法，其中A2是-O-或-NH-。
实施方案89.任何实施方案88的方法，其中A2是-O-。
实施方案90.实施方案57-89中的任一个的方法，其中Y3是C1-C12(例如，C1-C6，诸如C1-C3)亚烷基。
实施方案91.实施方案57-90中的任一个的方法，其中所述二酰基基团在每次出现时独立地包含结构式(例如，/>诸如)，任选地其中R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或C1-C3烷基。
实施方案92.实施方案57-91中的任一个的方法，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，寡(亚乙基氧化物)，诸如-(CH2CH2O)1-4-(CH2CH2)-)、[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，)和[(C1-C4)亚烷基]-亚苯基-[(C1-C4)亚烷基](例如，/>)。
实施方案93.实施方案92的方法，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-和-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-。
实施方案94.实施方案92的方法，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)。
实施方案95.实施方案92的方法，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基))。
实施方案96.实施方案92的方法，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-)和[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-)。
实施方案97.实施方案57-96中的任一个的方法，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如))、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))(例如，)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，)、-C(O)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))和-C(O)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，/>)，其中前述取代基中的任一个的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
实施方案98.实施方案97的方法，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个或多个(例如，一个)取代基取代，所述取代基各自独立地选自C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如))、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))(例如，/>)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，/>)和-C(O)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，/>)，其中前述取代基中的任一个的C4-C6N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
实施方案99.实施方案98的方法，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。
实施方案100.实施方案98的方法，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基取代，所述取代基选自C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如 ))和C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)。
实施方案101.实施方案97的方法，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
实施方案102.实施方案101的方法，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
实施方案103.实施方案102的方法，其中每个封端基团独立地选自：
实施方案104.实施方案57-96中的任一个的方法，其中每个封端基团独立地选自在表3中所示的那些或其子集。
实施方案105.实施方案1-56中的任一个的方法，其中所述可电离的阳离子脂质选自在表4中所示的那些、或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案106.实施方案1-56中的任一个的方法，其中所述可电离的阳离子脂质选自在表4或表5中所示的那些、或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案107.实施方案1-106中的任一个的方法，所述方法进一步包含从所述细胞衍生出细胞组合物。
实施方案108.一种经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自特定细胞，所述特定细胞具有通过实施方案1-106中的任一个的方法增强的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性。
实施方案109.包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，其中所述核酸编辑系统包含：
(i)指导核酸，其包含与囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因或转录物的靶序列互补的靶向序列；
(ii)包含内切核酸酶的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，所述内切核酸酶被构造成(1)与所述指导核酸形成复合物和(2)在切割事件中切割细胞中的所述CFTR基因或转录物；和
(iii)供体模板核酸，其被构造成在所述切割事件之后改变所述CFTR基因或转录物，以在所述细胞中提供功能性CFTR基因、转录物或蛋白。
实施方案110.实施方案109的组合物，其中所述指导核酸包含核苷酸序列，其选自在表A中所示的那些及其互补序列。
实施方案111.实施方案109或110的组合物，其中所述供体模板核酸包含核苷酸序列，其选自在表B中所示的那些及其互补序列。
实施方案112.实施方案109-111中的任一个的组合物，其中所述供体模板核酸包含5’同源臂。
实施方案113.实施方案109-112中的任一个的组合物，其中所述供体模板核酸包含3’同源臂。
实施方案114.实施方案109-113中的任一个的组合物，其中(ii)是信使核糖核酸(mRNA)，其编码包含所述内切核酸酶的所述多肽。
实施方案115.实施方案109-113中的任一个的组合物，其中(ii)是包含所述内切核酸酶的所述多肽。
实施方案116.实施方案109-115中的任一个的组合物，其中所述内切核酸酶是CRISPR相关的(Cas)多肽或其修饰物。
实施方案117.实施方案116的组合物，其中所述内切核酸酶是Cas9。
实施方案118.实施方案109-117中的任一个的组合物，其中(i)和(iii)存在于两种不同的分子上。
实施方案119.实施方案109-118中的任一个的组合物，其中(i)、(ii)和(iii)存在于三种不同的分子上。
实施方案120.实施方案109-118中的任一个的组合物，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两种存在于一种分子上。
实施方案121.实施方案109-120中的任一个的组合物，其中(i)和(ii)以1:1至1:20的摩尔或重量比存在于所述组合物中。
实施方案122.实施方案109-121中的任一个的组合物，其中(i)和(iii)以1:1至1:30的摩尔或重量比存在于所述组合物中。
实施方案123.实施方案109-122中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物包含：可电离的阳离子脂质；和与所述可电离的阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。
实施方案124.实施方案123的组合物，其中所述治疗效果的特征在于在所述受试者的所述器官或组织内的所述至少约10％(例如，至少约15％)基底细胞中可检测的所述试剂的量或活性。
实施方案125.实施方案109-124中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物进一步包含(iii)磷脂。
实施方案126.实施方案109-125中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物包含约20％至约65％的摩尔百分比的所述SORT脂质。
实施方案127.实施方案109-126中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物包含约5％至约30％的摩尔百分比的所述可电离的阳离子脂质。
实施方案128.实施方案109-127中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物包含约8％至约23％的摩尔百分比的所述磷脂。
实施方案129.实施方案109-128中的任一个的组合物，其中所述磷脂不是乙基磷酸胆碱。
实施方案130.实施方案109-129中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物进一步包含类固醇或类固醇衍生物。
实施方案131.实施方案130的组合物，其中所述脂质组合物包含约15％至约46％的摩尔百分比的所述类固醇或类固醇衍生物。
实施方案132.实施方案109-131中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物进一步包含聚合物缀合的脂质(例如，聚(乙二醇)(PEG)缀合的脂质)。
实施方案133.实施方案132的组合物，其中所述脂质组合物包含约0.5％至约10％的摩尔百分比的所述聚合物缀合的脂质。
实施方案134.实施方案132的组合物，其中所述脂质组合物包含约1％至约10％的摩尔百分比的所述聚合物缀合的脂质。
实施方案135.实施方案132的组合物，其中所述脂质组合物包含约2％至约10％的摩尔百分比的所述聚合物缀合的脂质。
实施方案136.实施方案109-135中的任一个的组合物，其中所述治疗剂是多核苷酸；且其中所述脂质组合物中的氮与所述多核苷酸中的磷酸酯的摩尔比(N/P比率)不超过约20:1。
实施方案137.实施方案136的组合物，其中所述N/P比率是约5:1至约20:1。
实施方案138.实施方案109-137中的任一个的组合物，其中所述治疗剂与所述脂质组合物的总脂质的摩尔比不超过约1:1、1:10、1:50或1:100。
实施方案139.实施方案109-138中的任一个的组合物，其中至少约85％的所述治疗剂被包封在所述脂质组合物的颗粒中。
实施方案140.实施方案109-139中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物包含多个通过下述一种或多种特征表征的颗粒：
(1)100纳米(nm)或更小的(例如，平均)尺寸；
(2)不超过约0.2的多分散性指数(PDI)；和
(3)-10毫伏(mV)至10mV的负ζ电位。
实施方案141.实施方案109-140中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物具有在6至7的范围外的表观电离常数(pKa)。
实施方案142.实施方案141的组合物，其中所述脂质组合物的所述表观pKa是约7或更高。
实施方案143.实施方案141的组合物，其中所述脂质组合物的所述表观pKa是约8或更高。
实施方案144.实施方案143的组合物，其中所述脂质组合物的所述表观pKa是约8至约13。
实施方案145.实施方案109-144中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质包含永久带正电荷的部分(例如，季铵离子)。
实施方案146.实施方案145的组合物，其中所述SORT脂质包含抗衡离子。
实施方案147.实施方案109-146中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质(例如，饱和的或不饱和的)。
实施方案148.实施方案147中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。
实施方案149.实施方案109-148中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质包含具有以下结构式的首基：其中L是(例如，可生物降解的)接头；Z+是带正电荷部分(例如，季铵离子)；且X-是抗衡离子。
实施方案150.实施方案149的组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：其中R1和R2各自独立地是任选地被取代的C6-C24烷基或任选地被取代的C6-C24烯基。
实施方案151.实施方案149的组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：/>
实施方案152.实施方案149-151中的任一个的组合物，其中L是其中:p和q各自独立地是1、2或3；且R4是任选取代的C1-C6烷基。
实施方案153.实施方案149的组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
R4是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；且
X-是单价阴离子。
实施方案154.实施方案109-146中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
实施方案155.实施方案109-146中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或任一个基团的被取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
实施方案156.实施方案109-146中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R4和R4′各自独立地是烷基(C6-C24)、烯基(C6-C24)或任一个基团的被取代形式；
R4″是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或任一个基团的被取代形式；
R4″′是烷基(C1-C8)、烯基(C2-C8)或任一个基团的被取代形式；且
X2是单价阴离子。
实施方案157.实施方案109-144中的任一个的组合物，其中所述SORT脂质选自表6中所示的那些、或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案158.实施方案109-157中的任一个的组合物，其中所述可电离的阳离子脂质是具有以下结构式的代数(g)的树枝状聚合物或树枝状大分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(a)所述核心包含结构式(X核心)：
其中：
Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b-；
R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f；
R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6，诸如C1-C3)烷基；
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢或任选地被取代的(例如，C1-C12)烷基；
L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、(例如，C1-C12，诸如C1-C6或C1-C3)亚烷基、(例如，C1-C12，诸如C1-C8或C1-C6)亚杂烷基(例如，C2-C8亚烷基氧化物，诸如寡(亚乙基氧化物))、[(例如，C1-C6)亚烷基]-[(例如，C4-C6)杂环烷基]-[(例如，C1-C6)亚烷基]、[(例如，C1-C6)亚烷基]-(亚芳基)-[(例如，C1-C6)亚烷基](例如，[(例如，C1-C6)亚烷基]-亚苯基-[(例如，C1-C6)亚烷基])、(例如，C4-C6)杂环烷基和亚芳基(例如，亚苯基)；或，
可替换地，L1的部分与R1c和R1d之一形成(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子)；且
x1是0、1、2、3、4、5或6；且
(b)所述多个(N个)分支中的每个分支独立地包含结构式(X分支)：
其中：
*指示所述分支与所述核心的连接点；
g是1、2、3或4；
Z＝2(g-1)；
当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，
(c)每个二酰基基团独立地包含结构式其中：
*指示所述二酰基基团在其近侧端部处的连接点；
**指示所述二酰基基团在其远侧端部处的连接点；
Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；
A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-，其中：
R4是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6)烷基；
m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3；且
R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C8)烷基；且
(d)每个接头基团独立地包含结构式
其中：
**指示所述接头与近侧二酰基基团的连接点；
***指示所述接头与远侧二酰基基团的连接点；且
Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；且
(e)每个封端基团独立地选自任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烷基硫醇和任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烯基硫醇。
实施方案159.实施方案158的组合物，其中x1是0、1、2或3。
实施方案160.实施方案158或159的组合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点(例如，如*所指示)、氢或C1-C12烷基(例如，C1-C8烷基，诸如C1-C6烷基或C1-C3烷基)，其中所述烷基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自-OH、C4-C8(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，哌啶基(例如， )、N-(C1-C3烷基)-哌啶基(例如，/>)、哌嗪基(例如，/>)、N-(C1-C3烷基)-哌嗪基(piperadizinyl)(例如，/>)、吗啉基(例如，/>)、N-吡咯烷基(例如，/>)、吡咯烷基(例如，/>)或N-(C1-C3烷基)-吡咯烷基(例如，/>))、(例如，C6-C10)芳基和C3-C5杂芳基(例如，咪唑基(例如，/>)或吡啶基(例如，/>))。
实施方案161.实施方案160的组合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点(例如，如*所指示)、氢或C1-C12烷基(例如，C1-C8烷基，诸如C1-C6烷基或C1-C3烷基)，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。
实施方案162.实施方案158-161中的任一个的组合物，其中R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢。
实施方案163.实施方案158-162中的任一个的组合物，其中所述多个(N个)分支包含至少3个(例如，至少4个或至少5个)分支。
实施方案164.实施方案158-163中的任一个的组合物，其中g＝1；G＝0；且Z＝1。
实施方案165.实施方案164的组合物，其中所述多个分支的每个分支包含结构式
实施方案166.实施方案158-163中的任一个的组合物，其中g＝2；G＝1；且Z＝2。
实施方案167.实施方案166的组合物，其中所述多个分支的每个分支包含结构式
实施方案168.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如，/>)。
实施方案169.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心包含结构式：
实施方案170.实施方案169的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如，/> )。
实施方案171.实施方案169的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如，/>诸如/> )。
实施方案172.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心包含结构式：其中Q’是-NR2-或-CR3aR3b-；q1和q2各自独立地是1或2。
实施方案173.实施方案172的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如，/> )。
实施方案174.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心包含结构式(例如，/> )，其中环A是任选地被取代的芳基或任选地被取代的(例如，C3-C12，诸如C3-C5)杂芳基。
实施方案175.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心包含结构式
实施方案176.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心选自在表1中所示的那些或其子集。
实施方案177.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心包含选自以下的结构式： /> 及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。
实施方案178.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心包含选自以下的结构式：/>
其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。
实施方案179.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。
实施方案180.实施方案179的组合物，其中至少2个分支连接至所述核心。
实施方案181.实施方案179的组合物，其中至少3个分支连接至所述核心。
实施方案182.实施方案179的组合物，其中至少4个分支连接至所述核心。
实施方案183.实施方案158-167中的任一个的组合物，其中所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。
实施方案184.实施方案183的组合物，其中至少4个分支连接至所述核心。
实施方案185.实施方案183的组合物，其中至少5个分支连接至所述核心。
实施方案186.实施方案183的组合物，其中至少6个分支连接至所述核心。
实施方案187.实施方案158-186中的任一个的组合物，其中A1是-O-或-NH-。
实施方案188.实施方案187的组合物，其中A1是-O-。
实施方案189.实施方案158-188中的任一个的组合物，其中A2是-O-或-NH-。
实施方案190.任何实施方案189的组合物，其中A2是-O-。
实施方案191.实施方案158-190中的任一个的组合物，其中Y3是C1-C12(例如，C1-C6，诸如C1-C3)亚烷基。
实施方案192.实施方案158-191中的任一个的组合物，其中所述二酰基基团在每次出现时独立地包含结构式(例如，/>诸如/>)，任选地其中R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或C1-C3烷基。
实施方案193.实施方案158-192中的任一个的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，寡(亚乙基氧化物)，诸如-(CH2CH2O)1-4-(CH2CH2)-)、[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，)和[(C1-C4)亚烷基]-亚苯基-[(C1-C4)亚烷基](例如，/>)。
实施方案194.实施方案193的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-和-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-。
实施方案195.实施方案193的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)。
实施方案196.实施方案193的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基))。
实施方案197.实施方案193的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-)和[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-)。
实施方案198.实施方案158-197中的任一个的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如))、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))(例如，)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，)、-C(O)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))和-C(O)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，/>)，其中前述取代基中的任一个的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
实施方案199.实施方案198的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个或多个(例如，一个)取代基取代，所述取代基各自独立地选自C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如 ))、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))(例如，/>)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，/>)和-C(O)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，)，其中前述取代基中的任一个的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
实施方案200.实施方案199的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。
实施方案201.实施方案199的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基取代，所述取代基选自C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如 ))和C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基、N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)。
实施方案202.实施方案198的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
实施方案203.实施方案202的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
实施方案204.实施方案203的组合物，其中每个封端基团独立地选自：
实施方案205.实施方案158-197中的任一个的组合物，其中每个封端基团独立地选自在表3中所示的那些或其子集。
实施方案206.实施方案109-157中的任一个的组合物，其中所述可电离的阳离子脂质选自在表4中所示的那些、或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案207.实施方案109-157中的任一个的组合物，其中所述可电离的阳离子脂质选自在表4或表5中所示的那些、或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案208.实施方案109-207中的任一个的组合物，其中所述组合物被配制用于药物(例如，全身性)施用。
实施方案209.一种经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自一种细胞，所述细胞包含通过实施方案109-208中的任一个的组合物生产的异源囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因、转录物或蛋白。
实施方案210.一种用于遗传校正肺基底细胞中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使所述肺基底细胞接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述肺基底细胞。
实施方案211.一种用于遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使所述包含多个肺基底细胞的细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述多个肺基底细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％。
实施方案212.一种用于遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包含：使所述细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，所述细胞组合物包含肺基底细胞和肺非基底细胞，由此将所述核酸编辑系统递送给所述肺基底细胞，其量大于递送给所述肺非基底细胞的量。
实施方案213.实施方案212的方法，其中所述非基底细胞是离子细胞、纤毛细胞或分泌细胞。
实施方案214.实施方案210-213中的任一个的方法，其中所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞被确定表现出在CFTR基因中的突变。
实施方案215.实施方案210-213中的任一个的方法，其中所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞表现出在CFTR基因中的突变。
实施方案216.实施方案210-215中的任一个的方法，其中所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞是来自受试者。
实施方案217.实施方案216的方法，其中所述受试者被确定表现出在CFTR基因中的突变。
实施方案218.实施方案216的方法，其中所述受试者表现出在CFTR基因中的突变。
实施方案219.实施方案210-218中的任一个的方法，其中所述接触是离体的。
实施方案220.实施方案210-218中的任一个的方法，其中所述接触是体外的。
实施方案221.实施方案210-218中的任一个的方法，其中所述接触是体内的。
实施方案222.一种用于治疗患有或疑似患有囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)相关病症的受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物。
实施方案223.实施方案222的方法，其中所述CFTR相关病症是囊性纤维化、遗传性肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)或它们的组合。
实施方案224.实施方案222或223的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
实施方案225.实施方案224的方法，其中所述受试者是人。
实施方案226.实施方案222-225中的任一个的方法，其中所述受试者被确定表现出在CFTR基因中的突变(例如，F508del或G542X)。
实施方案227.实施方案222-226中的任一个的方法，其中所述施用包含全身施用。
实施方案228.实施方案208-227中的任一个的方法，其中所述脂质组合物是根据实施方案24-106或123-207中的任一个。
实施例
实施例1：CFTR的编辑
将人支气管上皮细胞解冻并铺板。在处理前将5×105个未分化的HBE细胞接种到6孔板的每个孔中过夜。在第1天，向含有2mL新鲜培养基的每孔中加入100uL的LNP样品溶液(每孔1ug总核酸)。将平板的3个孔用包含Cas9 mRNA、对CFTR特异性的gRNA和对F508del突变等位基因特异性的供体核酸的脂质纳米颗粒处理，并且将1个孔用对照制剂处理。4-5天后，将细胞传代至T-75烧瓶中并允许生长7-10天。取出并裂解500,000个细胞的样品。对裂解的细胞进行测序并分析CFTR基因以确定校正。将校正过的细胞再次传代并铺在HTStranswell滤板上以使其分化。然后对所述细胞进行分析以确定蛋白表达的存在和功能正常的细胞。
成熟CFTR的定量方法
将细胞直接在2×样品缓冲液((Tris-HCL 250mM,pH 6.8,20％甘油,2.5％SDS,0.1％溴酚蓝)中裂解。通过使用Tris-甘氨酸缓冲系统在7％/10％梯度(重量/体积)聚丙烯酰胺凝胶上电泳来分离细胞裂解物蛋白，并转移至聚偏氟乙烯Immobilon膜(EMDMillipore)。使用一级CFTR抗体(596)(北卡罗来纳大学医学院,Chapel Hill,NC)、肌动蛋白抗体(EMD Millipore)和二级抗体IRdye-680RD(Li-Cor)进行蛋白质印迹分析，并使用Li-Cor Odyssey CLx(Li-Cor)成像/定量。使用Prism 6(Graphpad)绘制数据。
CFTR依赖性的全细胞电流检测
将膜片箝技术的全细胞构造用于测量Cl-电流。移液器溶液含有145mM NMDG+-Cl-、1mM MgCl2、2mM EGTA、5mM ATP和10mM HEPES(用Tris调至pH 7.3)。浴溶液为145mM NMDG+-Cl-、1mM MgCl2、1mM CaCl2、10mM HEPES和10mM葡萄糖(用Tris调至pH 7.4)。使用Axopatch200B膜片箝放大器记录电流并在2kHz进行数字化。通过将膜电位从0mV的保持电位步进至膜电位-40和+40mV步骤保持200ms来探测膜电导。测量响应于10μM福司柯林+100μM IBMX和10μM CFTRInh-172(Inh-172)的全细胞电流应答。当移液器充满移液器溶液时具有3至5MΩ之间的电阻，并且密封电阻超过8GU。使用pClamp 9.2软件进行电流记录和分析，并使用Origin 8软件进行分析。
实施例2：CFTR编辑的检测
将未分化的人支气管上皮细胞(unHBE)解冻并铺板。在处理前将465,000个未分化的HBE细胞接种到6孔板的每个孔中过夜。在3天后裂解细胞。对裂解的细胞进行测序并分析CFTR基因以确定校正。图1A显示了不同LNP组合物的插入缺失％的图。该图表明插入缺失向CFTR基因中的成功引入。例如，将“sgF508Del-1”(SEQ ID NO.1)和“SgF508-1-NTS-60”(SEQID NO:6)用于HBE处理。
在另一个平板中，向每孔添加1ug总RNA(包括Cas9 mRNA、对CFTR特异性的gRNA和对F508del突变体等位基因特异性的供体核酸)。图1B显示了使用不同LNP组合物编辑hBE的图组，相应的数字显示在图1B中。
在另一组示例性实验中，在处理前将5×105个未分化的HBE细胞接种到6孔板的每个孔中过夜。在第1天，将100μL的LNP样品溶液加入含有2mL新鲜培养基的每个孔中(每孔1ug总核酸)，在第3天更换为新鲜培养基，并在第4天收集细胞用于PCR和测序。图1D显示了使用不同LNP组合物编辑hBE的另外图。为不同的供体核酸分析插入缺失百分比以及敲除和敲入评分。当在没有供体核酸的情况下递送时，所述组合物能够对细胞敲入校正、以及敲除基因序列。图1D示出了用含有不同HDR模板的DOTAP 10LNP处理HBE细胞后的插入缺失％和敲入％。HDR组涉及Cas9 mRNA、sgF508del和相应HDR模板在DOTAP 10LNP中的共同递送。单独DOTAP 10LNP(“单独LNP”)以及包封Cas9 mRNA和sgF508del的DOTAP 10LNP(“单独插入缺失”)用作对照。对这些数据通过基于Sanger DNA测序数据的TIDER分析进行了分析。插入缺失(％)表示通过非同源末端连接(NHEJ)进行的插入和缺失(导致基因敲除)。敲入(％)表示通过同源定向修复(HDR)进行基因校正。
实施例试验的脂质组合物通常包括40-50％ DOTAP 5A2-SC8 SORT LNP制剂(用于体内肺编辑)和10％ DOTAP 5A2-SC8 SORT LNP制剂(用于体外基因编辑)。例如，在F508delHBE治疗实验中，使用了肺SORT制剂“DOTAP 10”(其包含10mol％DOTAP)以及稍微调整摩尔比的功能变体。用于辅助体外转染和F508del HBE编辑的一个示例制剂为5A2-SC8:DOPE:胆固醇:PEG2000-DMG:DOTAP＝32.4:18:36:3.6:10(mol/mol)，其中总脂质:总核酸＝40:1(重量/重量)。用脂质递送组合物组装Cas9 mRNA、sgRNA和ssDNA模板(重量比在Cas9 mRNA:sgRNA:HDR＝0.5:1:6之间)。
还探索了“DOTAP 40”LNP在肺中的有效体内基因编辑。例如，使用5A2-SC8:DOPE:胆固醇:DMG-PEG:DOTAP＝21.6:12:24:2.4:40(摩尔比)。总脂质:总核酸＝20:1(质量比)；Cas9 mRNA:sgRNA:HDR的重量比＝0.5:1:6。
实施例3：CFTR-G542X的基因校正
将Hela-G542X细胞解冻并铺板。(向每孔添加)1ug总RNA(包括Cas9mRNA、对CFTR特异性的gRNA和对G542X突变体等位基因特异性的供体核酸)。在3天后裂解细胞。对裂解的细胞进行测序并分析CFTR基因以确定校正。图2A显示了Hela-G542X细胞的编辑的图组，对应的数字如图2B所示。为不同的供体核酸分析插入缺失百分比以及敲除和敲入评分。所述组合物能够以约20％的比率对细胞敲入校正。
将1.5×105个Hela-G542X细胞接种在12孔板中过夜。然后将细胞用100ul具有三种组分的不同重量比的“DOTAP 10”(10mol％DOTAP)LNP(连同500uL新鲜培养基)处理，在处理2天后给细胞加入1mL新鲜培养基，在处理3天后收集细胞用于PCR和DNA测序。基于SangerDNA测序数据使用TIDER分析。此外，分析了在LNP中各个组分的重量比。图3A和3B显示了不同比例的Cas9 mRNA、sgRNA和供体核酸(HDR)的插入缺失％和敲入％的图。
实施例4:递送至小鼠基底肺细胞
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠(也被称作Ai9或Ai9(RCL-tdT)小鼠)从The Jackson Laboratory(007909)获得，并进行培育以维持Cre报告等位基因的纯合表达，所述Cre报告等位基因具有loxP侧接的STOP盒，它阻止CAG启动子驱动的红色荧光tdTomato蛋白的转录。基因编辑会删除终止子并开启红色荧光tdTomato蛋白表达。使用静脉内递送向小鼠递送包含50％ DOTAP(“DOTAP 50”)LNP(例如，5A2-SC8:DOPE:胆固醇:PEG2000-DMG:DOTAP＝18:10:20:2:50(摩尔比))和Cre mRNA的脂质纳米颗粒。分离并消化小鼠的肺。将细胞用Ghost Red 780标记以区分活细胞和死细胞，并用抗-p75 NGF受体抗体标记以定义基底细胞，并然后使用FACS进行分析。图4B显示了小鼠肺中整个基底细胞群的tdTOM+细胞的定量结果(n＝4)(DOTAP 50LNP，0.5mg/kg Cre mRNA，2天)。用于分析肺基底细胞中的tdTOM+表达的FACS门控包括Ghost Red 780，用于区分活细胞和死细胞，并使用抗-p75 NGF受体抗体来定义基底细胞。PBS组用作阴性对照。在静脉内注射后2天进行分析。总脂质:Cre mRNA＝40:1(质量比)；剂量：0.5mg/kg的Cre mRNA；注射途径：静脉内(IV)。基因编辑删除了终止子并开启红色荧光tdTomato蛋白表达，如图4A所示。在相关实验中，将包含Cas9mRNA和gRNA的LNP施用给未分化的HBE细胞。将DNA分离并测序。图4B表明，本文描述的递送技术影响了(effectuated)试验受试者(小鼠)中所有基底细胞的至少(约)15％。
图4C显示了在气-液界面处聚集的人上皮细胞中Cas9和gRNA的插入缺失的产生。将包含Cas9 mRNA、gRNA和供体核酸的LNP施用给未分化的HBE细胞以实现同源定向修复。从细胞分离出DNA并测序。图4C示出了通过本文描述的技术实现的对至少(约)70％的试验的未分化CF hBE有效的基因编辑。
图4D显示了细胞中基因修复的百分比。具体地，本文描述的技术在未分化的CFhBE中实现了F508del的至少(约)8％基因校正。
实施例5：具有CFTR突变的受试者的治疗.
通过施用LNP、Cas9 mRNA、gRNA和供体核酸的组合物来对患有或疑似患有CFTR相关病症的受试者进行治疗。定期监测受试者肺中CFTR的表达。从受试者采集肺组织样品，其包含肺细胞。收获细胞并准备用于DNA测序。对细胞测序并分析CFTR等位基因的任何突变。
可替代地或另外，具有或疑似具有CFTR相关病症的受试者可以被提取一些肺细胞。通过施用LNP、Cas9 mRNA、gRNA和供体核酸的组合物来对支气管上皮细胞进行处理。然后将细胞移植回受试者肺部并允许其增殖。定期监测受试者肺中CFTR的表达。从受试者采集肺组织样品，其包含肺细胞。收获细胞并准备用于DNA测序。对细胞测序并分析CFTR等位基因的任何突变。
实施例6:TIDER分析。
将HBE细胞(例如，第一代(P1))接种到6孔板(150k/孔)中并培养4天。然后在2mL新鲜培养基中用100μL的Cas9 mRNA:sgRNA:HDR(0.5:1:6wt/wt/wt)(其用本文描述的脂质组合物(例如，5A2-SC8 10％ DOTAP)组装)处理细胞。使用在表B中所示的HDR模板(“NTS60”)。在处理后第2天更换新鲜培养基；并且随后在第3天收集处理过的细胞进行测序。处理的一部分包括添加HDR增强剂(每孔2μL)，其预期与NHEJ相比，增加HDR的使用以修复双链断裂(DSB)。出乎意料的是，数据表明增强剂的使用没有显著增强。
尽管在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将会明白，这样的实施方案仅作为示例提供。本发明无意受限于在说明书内提供的具体实施例。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但本文实施方案的描述和例证无意以限制性含义进行解释。现在本领域技术人员将做出众多变体、变化和置换而不脱离本发明。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体叙述、构型或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，本文描述的发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。因此，考虑本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等效物。以下权利要求意图限定本发明的范围，并且由此覆盖在这些权利要求和它们的等同方案的范围内的方法和结构。
序列表
<110> 德克萨斯大学系统董事会
<120> 用于治疗囊性纤维化和有关障碍的组合物、方法和用途
<130> UTFD.P3895WO
<140> PCT/US22/23333
<141> 2022-04-04
<150> US 63/171.071
<151> 2021-04-05
<160> 14
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 1
accattaaag aaaatatcat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 2
tctgtatcta tattcatcat 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 3
gacaacacag ttctctgaga agg 23
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 4
agttttcctg gattatgcct ggcaccatta aagaaaatat catctttggt gtttcctatg 60
atgaatatag atacagaagc 80
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 5
gcttctgtat ctatattcat cataggaaac accaaagatg atattttctt taatggtgcc 60
aggcataatc caggaaaact 80
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 6
aagaatttca ttctgttctc agttttcctg gattatgcct ggcaccatta aagaaaatat 60
catctttggt gtttcctatg atgaatatag atacagaagc gtcatcaaag catgccaact 120
<210> 7
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 7
ataggaaaca ccaaagatga tattttcttt aatggtgcca ggcataatcc aggaaaactg 60
agaacagaat gaaattcttc cactgtg 87
<210> 8
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 8
tttcaatttt ggattgtgca tgctaaattt tatttctggt gttatgcttt ggataatagg 60
acatcaccaa gtttgcagaa caagacaaca cagttctagg agaaggtgga gtcacactga 120
gtggaggtca gcgtgcaagg atttctttag caaggtaaat atttaactgt tggtcttgtg 180
agcacttgct gtaaatacta 200
<210> 9
<211> 160
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的核酸
<400> 9
tgctaaattt tatttctggt gttatgcttt ggataatagg acatcaccaa gtttgcagaa 60
caagacaaca cagttctagg agaaggtgga gtcacactga gtggaggtca gcgtgcaagg 120
atttctttag caaggtaaat atttaactgt tggtcttgtg 160
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 10
gttatgcttt ggataatagg acatcaccaa gtttgcagaa caagacaaca cagttctagg 60
agaaggtgga gtcacactga gtggaggtca gcgtgcaagg atttctttag caaggtaaat 120
<210> 11
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 11
acatcaccaa gtttgcagaa caagacaaca cagttctagg agaaggtgga gtcacactga 60
gtggaggtca gcgtgcaagg 80
<210> 12
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 12
ccttgcacgc tgacctccac tcagtgtgac tccaccttct cctagaactg tgttgtcttg 60
ttctgcaaac ttggtgatgt 80
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 13
gtttgcagaa caagacaaca cagttctagg agaaggtgga gtcacactga gtggaggtca 60
<210> 14
<211> 4203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 14
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaag 60
tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 120
tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag 180
aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 240
aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 300
atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360
ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 420
gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480
agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 540
cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 600
ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 660
ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca agagcagacg gctggaaaat 720
ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggaaacct gattgccctg 780
agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 840
cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 900
cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 960
atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga 1020
tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1080
gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 1140
ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 1200
ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 1260
ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 1320
cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 1380
accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 1440
atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 1500
ggcgcttccg cccagagctt catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 1560
gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 1620
accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 1680
aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt gaagcagctg 1740
aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 1800
gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 1860
gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 1920
ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 1980
gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 2040
aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 2100
tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 2160
aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 2220
gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 2280
gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 2340
agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 2400
gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 2460
cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 2520
gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggaccatat cgtgcctcag 2580
agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg 2640
ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 2700
cagctgctga acgccaagct gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 2760
agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 2820
cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 2880
gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 2940
gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc 3000
cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060
gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 3120
agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 3180
tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 3240
acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 3300
aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360
ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 3420
gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 3480
gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540
gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 3600
aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660
gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720
gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 3780
ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcacaagcac 3840
tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900
gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc catcagagag 3960
caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4020
aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080
gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag 4140
ctgggaggcg acaaaaggcc ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa aaagaaaaag 4200
taa 4203

Claims (61)

1.一种用于增强细胞中囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞接触用脂质组合物组装的核酸编辑系统，所述核酸编辑系统包含(i)指导核酸，(ii)包含内切核酸酶的异源多肽或编码所述异源多肽的异源多核苷酸，和(iii)供体模板核酸，以在所述细胞中产生所述异源内切核酸酶与所述指导核酸的复合物；
(b)在切割位点处用所述复合物切割所述细胞中的CFTR基因或转录物以产生被切割的CFTR基因或转录物；和
(c)使用所述供体模板核酸修复所述被切割的CFTR基因或转录物以在所述细胞中产生编码功能性CFTR蛋白的经修复的CFTR基因或转录物，由此增强所述细胞中所述CFTR蛋白的表达或活性。
2.权利要求1所述的方法，其中(c)的特征在于不超过约50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％或40％的脱靶插入或/和缺失(插入缺失)率。
3.权利要求2所述的方法，其中所述脱靶插入缺失率包含(1)被检测到具有错误地改变的CFTR基因或转录物的试验细胞的总数相对于(2)总试验细胞的总数的比率。
4.权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中(c)的特征在于至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的在靶修复率。
5.权利要求4所述的方法，其中所述在靶修复率包含(1)被检测到具有所述修复的CFTR基因或转录物的试验细胞的总数相对于(2)总试验细胞的总数的比率。
6.权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中与相应对照相比，所述方法增加所述细胞中功能性CFTR基因、转录物或蛋白的量(例如，增加至少约1.1倍)，任选地，其中所述相应对照是没有所述接触的相应细胞。
7.权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中所述方法在所述细胞中产生治疗有效量的功能性CFTR基因、转录物或蛋白(例如，在所有可检测的CFTR基因、转录物或蛋白中的至少约10％、15％、20％、25％或30％)。
8.权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中与相应对照相比，所述方法增强所述细胞中的(例如，氯离子)离子运输(例如，增强至少约1.1倍)，任选地，其中所述相应对照是没有所述接触的相应细胞。
9.权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述细胞是肺细胞。
10.权利要求9所述的方法，其中所述细胞是肺基底细胞。
11.权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述细胞是气道上皮细胞(例如，支气管上皮细胞)。
12.权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中所述细胞是未分化的。
13.权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中所述细胞是分化的。
14.权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中(b)包含切割包含功能丧失突变的CFTR基因或转录物。
15.权利要求14所述的方法，其中所述功能丧失突变包含在外显子中的突变，所述外显子选自CFTR的外显子9-27。
16.权利要求14或15所述的方法，其中所述功能丧失突变是F508del或G542X。
17.权利要求14-16中的任一项所述的方法，其中所述功能丧失突变与囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)相关。
18.权利要求1-17中的任一项所述的方法，其中所述接触是离体的。
19.权利要求1-17中的任一项所述的方法，其中所述接触是体外的。
20.权利要求1-17中的任一项所述的方法，其中所述接触是体内的。
21.权利要求1-20中的任一项所述的方法，其中所述接触是重复的。
22.权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中所述接触包含接触多个包含所述细胞的细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述修复在所述多个细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％中产生功能性CFTR基因、转录物或蛋白，任选地其中所述多个细胞是多个(例如，肺)基底细胞。
24.权利要求1-23中的任一项所述的方法，其中所述脂质组合物包含：
可电离的阳离子脂质；和
与所述可电离的阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。
25.权利要求24所述的方法，其中所述脂质组合物包含与所述SORT脂质分开的磷脂。
26.权利要求1-25中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括从所述细胞衍生出细胞组合物。
27.一种经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自以下细胞，所述细胞具有通过权利要求1-25中的任一项所述的方法增强的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达或活性。
28.一种组合物，其包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统，其中所述核酸编辑系统包含：
(i)指导核酸，其包含与囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因或转录物的靶序列互补的靶向序列；
(ii)包含内切核酸酶的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，所述内切核酸酶被构造成(1)与所述指导核酸形成复合物，以及(2)在切割事件中切割细胞中的所述CFTR基因或转录物；和
(iii)供体模板核酸，其被构造成在所述切割事件之后改变所述CFTR基因或转录物，以在所述细胞中提供功能性CFTR基因、转录物或蛋白。
29.权利要求28所述的组合物，其中所述指导核酸包含选自表A所列的核苷酸序列及其互补序列。
30.权利要求28或29所述的组合物，其中所述供体模板核酸包含选自表B所列的核苷酸序列及其互补序列。
31.权利要求28-30中的任一项所述的组合物，其中所述供体模板核酸包含5’同源臂。
32.权利要求28-31中的任一项所述的组合物，其中所述供体模板核酸包含3’同源臂。
33.权利要求28-32中的任一项所述的组合物，其中(ii)是信使核糖核酸(mRNA)，其编码包含所述内切核酸酶的所述多肽。
34.权利要求28-32中的任一项所述的组合物，其中(ii)是包含所述内切核酸酶的所述多肽。
35.权利要求28-34中的任一项所述的组合物，其中所述内切核酸酶是CRISPR相关的(Cas)多肽或其修饰物。
36.权利要求35所述的组合物，其中所述内切核酸酶是Cas9。
37.权利要求28-36中的任一项所述的组合物，其中(i)和(iii)存在于两种不同的分子上。
38.权利要求28-37中的任一项所述的组合物，其中(i)、(ii)和(iii)存在于三种不同的分子上。
39.权利要求28-37中的任一项所述的组合物，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个存在于一种分子上。
40.权利要求28-39中的任一项所述的组合物，其中(i)和(ii)以1:1至1:20的摩尔或重量比存在于所述组合物中。
41.权利要求28-40中的任一项所述的组合物，其中(i)和(iii)以1:1至1:30的摩尔或重量比存在于所述组合物中。
42.权利要求28-41中的任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于药物(例如，全身性)施用。
43.一种经工程改造的细胞组合物，其包含或衍生自以下细胞，所述细胞包含由权利要求28-42中的任一项所述的组合物生产的异源囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因、转录物或蛋白。
44.一种用于遗传校正肺基底细胞中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包括：
使所述肺基底细胞接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述肺基底细胞。
45.一种用于遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包括：
使包含多个肺基底细胞的所述细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，由此将所述核酸编辑系统递送给所述多个肺基底细胞中的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％。
46.一种用于遗传校正细胞组合物中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的方法，所述方法包括：
使所述细胞组合物接触包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物，所述细胞组合物包含肺基底细胞和肺非基底细胞，由此将所述核酸编辑系统以大于递送给所述肺非基底细胞的量递送给所述肺基底细胞。
47.权利要求46所述的方法，其中所述非基底细胞是离子细胞、纤毛细胞或分泌细胞。
48.权利要求44-47中的任一项所述的方法，其中所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞被确定表现出在CFTR基因中的突变。
49.权利要求44-47中的任一项所述的方法，其中所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞表现出在CFTR基因中的突变。
50.权利要求44-49中的任一项所述的方法，其中所述肺基底细胞或所述多个肺基底细胞是来自受试者。
51.权利要求50所述的方法，其中所述受试者被确定表现出在CFTR基因中的突变。
52.权利要求50所述的方法，其中所述受试者表现出在CFTR基因中的突变。
53.权利要求44-52中的任一项所述的方法，其中所述接触是离体的。
54.权利要求44-52中的任一项所述的方法，其中所述接触是体外的。
55.权利要求44-52中的任一项所述的方法，其中所述接触是体内的。
56.一种用于治疗患有或疑似患有囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)相关病症的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含用脂质组合物组装的核酸编辑系统的组合物。
57.权利要求56所述的方法，其中所述CFTR相关病症是囊性纤维化、遗传性肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)或它们的组合。
58.权利要求56或57所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
59.权利要求58所述的方法，其中所述受试者是人。
60.权利要求56-59中的任一项所述的方法，其中所述受试者被确定表现出在CFTR基因中的突变(例如，F508del或G542X)。
61.权利要求56-60中的任一项所述的方法，其中所述施用包含全身施用。
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