CN117500933A - 能够实现精确的hdr介导的体内基因编辑的基于树枝状聚合物的全合一脂质纳米颗粒 - Google Patents

能够实现精确的hdr介导的体内基因编辑的基于树枝状聚合物的全合一脂质纳米颗粒 Download PDF

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Abstract

在某些方面，本公开内容提供了包含下述核酸中的每一种的一个或多个的组合物：(1)mRNA；(2)sgRNA；和(3)DNA；以及包含至少一种可电离脂质的脂质纳米颗粒；其中所述核酸中的每一种被包封在所述脂质纳米颗粒内，及其药物组合物。本公开内容也提供了采用所述组合物和/或药物组合物的方法，诸如修复基因的方法，对基因组执行同源性指导的修复的方法，以及治疗疾病或病症的方法。

Description

能够实现精确的HDR介导的体内基因编辑的基于树枝状聚合 物的全合一脂质纳米颗粒
交叉引用
本申请要求于2021年4月22日提交的美国临时申请号63/178,453的权益，其整个内容特此通过引用并入用于所有目的。
关于联邦资助研究或开发的声明
在美国国立卫生研究院(NIH)颁布的授权编号R01 EB025192-01A1下在政府支持下完成本发明。政府具有本发明的某些权利。
背景
1.领域
本发明总体上涉及核酸递送组合物的领域。例如，在某些方面，它涉及被配制用于递送以下核酸中的一种或多种的组合的组合物：mRNA、sgRNA和DNA；以及包含至少一种可电离脂质的脂质纳米颗粒；其中每种核酸被包封在所述脂质纳米颗粒内。又例如，更具体地，它涉及用于递送这样的组合以治疗疾病或障碍的脂质纳米颗粒组合物。
2.相关技术的描述
在自2013年发现它以来的短时间内(Jinek等人,2012；Cong等人,2013；Mali等人,2013；Doudna和Charpentier,2014；Sander和Joung,2014；Wang等人,2017)，CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR-相关的(Cas)蛋白)已经迅速应用于疾病诸如地中海贫血、镰刀形细胞病、家族性高胆固醇血症、杜兴肌营养不良、癌症和利伯先天性黑矇的治疗(Long等人,2016；Min等人,2019a；Min等人,2019b；Jo等人,2019；Wei等人,2020；Li等人,2018；Xu等人,2019；Wang等人,2019)。但是，迄今为止体内编辑的进展在很大程度上受限于通过被称为非同源末端连接(NHEJ)的易出错DNA修复机制进行的基因敲除。遗传性疾病和癌症突变的真正纠正将需要同源性指导的修复(HDR)，目前这种方案由于可以介导这种复杂DNA修复途径的载体的缺乏而受到阻碍。因此，存在对这样的载体的显著需求。
概述
在某些方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含与基因或转录物编辑组合物一起组装的脂质组合物(例如，纳米颗粒)，其中：
(A)所述基因或转录物编辑组合物包含下述核酸(1)-(3)中的一种或多种：
(1)包含编码多核苷酸引导核酸酶的序列的多核苷酸；
(2)引导多核苷酸(例如，被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物，或包含编码所述引导多核苷酸的序列的多核苷酸)；和
(3)供体多核苷酸(例如，被构造成修复经修饰的靶基因或转录物)，且
(B)所述脂质组合物包含至少一种可电离脂质。
在某些方面，本公开内容提供了组合物，其包含：
(A)下述核酸中的每一种的一个或多个：
(1)包含编码多核苷酸引导核酸酶的序列的多核苷酸诸如mRNA；
(2)引导多核苷酸，特别是已经被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物的多核苷酸或含有编码这样的引导多核苷酸的序列的多核苷酸诸如sgRNA；和
(3)供体多核苷酸，特别是被构造成修复经修饰的靶基因或转录物的多核苷酸诸如DNA；
(B)包含至少一种可电离脂质的脂质纳米颗粒；
其中所述核酸中的每一种被包封在所述脂质纳米颗粒内。
在某些实施方案中，所述mRNA编码基因编辑蛋白。在某些实施方案中，所述mRNA编码Cas蛋白。在某些实施方案中，mRNA编码Cas9蛋白。在某些实施方案中，所述DNA是单链DNA。在进一步的实施方案中，所述单链DNA是供体模板序列。在某些实施方案中，所述DNA校正细胞的基因组中的错误。在进一步的实施方案中，所述组合物能够校正所述细胞的基因组中的错误。在某些实施方案中，所述DNA与细胞的基因组的一部分互补。在某些实施方案中，所述细胞的基因组是患者的基因组。在某些实施方案中，所述DNA具有至少80％互补性。在进一步的实施方案中，所述DNA具有至少90％互补性。在更进一步的实施方案中，所述DNA具有至少95％互补性。在又进一步的实施方案中，所述DNA具有至少98％互补性。在进一步的实施方案中，所述DNA具有至少99％互补性。在某些实施方案中，所述DNA含有与细胞的基因组有关的修饰。在某些实施方案中，所述细胞的基因组不编码野生型基因。在某些实施方案中，所述DNA编码野生型基因。
在某些实施方案中，所述mRNA包含从约250个核苷酸至约15,000个核苷酸。在其它实施方案中，所述mRNA包含从约500个核苷酸至约5,000个核苷酸。在再其它实施方案中，所述mRNA包含从约800个核苷酸至约2,500个核苷酸。在某些实施方案中，所述sgRNA包含从约25个核苷酸至约500个核苷酸。在其它实施方案中，所述sgRNA包含从约50个核苷酸至约300个核苷酸。在再其它实施方案中，所述sgRNA包含从约80个核苷酸至约200个核苷酸。
在某些实施方案中，所述DNA包含从约25个核苷酸至约2,500个核苷酸。在某些实施方案中，所述DNA包含从约25个核苷酸至约200个核苷酸。在某些实施方案中，所述DNA包含从约50个核苷酸至约300个核苷酸。在某些实施方案中，所述DNA包含从约80个核苷酸至约200个核苷酸。
在某些实施方案中，所述组合物包含从约10:1至约1:5的mRNA:sgRNA的重量比。在其它实施方案中，所述mRNA:sgRNA的重量比是从约5:1至约1:3。在再其它实施方案中，所述mRNA:sgRNA的重量比是从约3:1至约1:2。在又其它实施方案中，所述mRNA:sgRNA的重量比是2:1、1:1或1:2。在某些实施方案中，所述组合物包含从约2:1至约1:20的mRNA:DNA的重量比。在其它实施方案中，所述mRNA:DNA的重量比是从约1:1至约1:10。在再其它实施方案中，所述mRNA:DNA的重量比是从约1:2至约1:8。在又其它实施方案中，所述mRNA:DNA的重量比是1:3或1:4。在某些实施方案中，所述组合物包含从约4:1至约1:10的sgRNA:DNA的重量比。在其它实施方案中，所述sgRNA:DNA的重量比是从约2:1至约1:8。在再其它实施方案中，所述sgRNA:DNA的重量比是从约1:1至约1:4。在又其它实施方案中，所述sgRNA:DNA的重量比是2:3或1:2。
在某些实施方案中，所述可电离脂质是阳离子脂质。在某些实施方案中，所述可电离脂质是树枝状大分子或树枝状聚合物。在某些实施方案中，所述可电离脂质是下式的化合物：
核心-重复单元-封端基团(D-I)
其中通过从所述核心除去一个或多个氢原子并用所述重复单元替换所述原子，将所述核心连接至所述重复单元，并且其中：
所述核心具有式：
其中：
X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
a是1、2、3、4、5或6；或
所述核心具有式：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢、烷基(C≤18)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3；或
所述核心具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或
所述核心是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基基团具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-、-S-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团包含连接至所述接头基团的氮和硫原子的独立的可降解的二酰基基团(如果n大于1)，其中所述重复单元中的第一基团是可降解的二酰基基团，其中对于每个接头基团，下一个重复单元包含连接至所述接头基团的氮原子的两个可降解的二酰基基团；且其中n是在所述重复单元中存在的接头基团的数目；且
所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷二基(C≤24)、烷二基(C≤24)或其取代形式；
R10是氢、氨基、羧基、羟基或芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最终的可降解的二酰基连接至封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢或烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3。
在某些实施方案中，所述核心进一步被定义为：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。
在某些实施方案中，所述核心进一步被定义为：
在某些实施方案中，所述核心进一步被定义为：
在某些实施方案中，所述核心进一步被定义为：
在某些实施方案中，A1和A2是O。在某些实施方案中，Y3是烷二基(C≤12)或被取代的烷二基(C≤12)。在某些实施方案中，Y1是烷二基(C≤12)或被取代的烷二基(C≤12)。
在某些实施方案中，所述封端基团进一步被定义为：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)或烯烃二基(C≤18)；且
R10是氢。
在某些实施方案中，所述封端基团进一步被定义为：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)；且
R10是氢。
在某些实施方案中，所述树枝状聚合物或树枝状大分子进一步被定义为：
其中：
R′是烷基(C≤18)、烯基(C≤18)或其取代形式。
在某些实施方案中，所述树枝状聚合物或树枝状大分子进一步被定义为：
其中：
R′是烷基(C≤18)、烯基(C≤18)或其取代形式。
在某些实施方案中，所述树枝状聚合物或树枝状大分子进一步被定义为：
其中：
R′是烷基(C6-18)。
在某些实施方案中，所述组合物包含从约15至约60的可电离脂质相对于任何其它脂质的摩尔比。在进一步的实施方案中，所述摩尔比是从约25至约50的可电离脂质。在更进一步的实施方案中，所述摩尔比是从约30至约45的可电离脂质。
在某些实施方案中，所述组合物还包含磷脂。在进一步的实施方案中，所述磷脂包含一个或两个长链烷基或烯基基团、甘油或鞘氨醇、一个或两个磷酸酯基团和小有机分子，其中所述小有机分子是氨基酸、糖或氨基取代的烷氧基基团。在更进一步的实施方案中，所述磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在某些实施方案中，所述磷脂是DOPE。在某些实施方案中，所述组合物包含从约5至约50的磷脂相对于任何其它脂质的摩尔比。在其它实施方案中，所述摩尔比是从约10至约45的磷脂。在更进一步的实施方案中，所述摩尔比是从约20至约40的磷脂。在某些实施方案中，所述组合物还包含类固醇，诸如胆固醇。在某些实施方案中，所述组合物包含从约10至约60的类固醇相对于任何其它脂质的摩尔比。在其它实施方案中，所述摩尔比是从约15至约50的类固醇。在更进一步的实施方案中，所述摩尔比是从约25至约50的类固醇。
在某些实施方案中，所述组合物还包含聚乙二醇化的脂质。在进一步的实施方案中，所述聚乙二醇化的脂质包含从约1000至约10,000道尔顿的PEG组分。在某些实施方案中，所述PEG脂质是聚乙二醇化的二酰基甘油。在某些实施方案中，所述PEG脂质进一步由下式定义：
其中：
R12和R13各自独立地是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这些基团中的任一个的取代形式；
Re是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；且
x是1-250。
在某些实施方案中，所述PEG脂质是二肉豆蔻酰基-sn-甘油或下式的化合物：
其中：
n1是5-250；且
n2和n3各自独立地是2-25。
在某些实施方案中，所述组合物包含从约0.25至约12.5的聚乙二醇化的脂质相对于任何其它脂质的摩尔比。在进一步的实施方案中，所述摩尔比是从约0.5至约10的聚乙二醇化的脂质。在更进一步的实施方案中，所述摩尔比是从约1至约6的聚乙二醇化的脂质。
在某些实施方案中，所述组合物包含从约1,000:1至约5,000:1的脂质组分:核酸组分的摩尔比。在进一步的实施方案中，所述组合物包含从约2,000:1至约4,000:1的脂质组分:核酸组分的摩尔比。在更进一步的实施方案中，所述组合物包含约2,500:1的脂质组分:核酸组分的摩尔比。在某些实施方案中，所述组合物包含4AC3-SC8、胆固醇、DOPE和DMG-PEG2000。在某些实施方案中，所述组合物包含从约38.5:30:30:1.5的4AC3-SC8:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000的摩尔比。
在某些实施方案中，所述组合物包含从约1:1至约20:1的N:P比率。在进一步的实施方案中，所述N:P比率是从约2:1至约10:1。在更进一步的实施方案中，所述N:P比率是从约4:1至约8:1。在某些实施方案中，所述组合物产生至少1％的同源性指导的修复率。在进一步的实施方案中，所述组合物产生至少5％的同源性指导的修复率。在更进一步的实施方案中，所述组合物产生至少15％的同源性指导的修复率。在又其它实施方案中，所述同源性指导的修复率是至少25％。在其它实施方案中，所述同源性指导的修复率是至少50％。在某些实施方案中，所述组合物具有小于5％的插入缺失率。在进一步的实施方案中，所述插入缺失率小于2％。在更进一步的实施方案中，所述插入缺失率小于1％。
在其它方面，本公开内容提供了用于用在同源性指导的修复中的组合物，其包含：
(A)下述核酸中的每一种的一个或多个：
(1)包含编码多核苷酸引导的核酸酶的序列的多核苷酸诸如mRNA；
(2)引导多核苷酸，特别是已经被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物的多核苷酸或含有编码这样的引导多核苷酸的序列的多核苷酸诸如sgRNA；和
(3)供体多核苷酸，特别是被构造成修复经修饰的靶基因或转录物的多核苷酸诸如DNA；
(B)包含至少一种可电离脂质的脂质纳米颗粒。
在其它方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含：
(A)本公开内容的组合物；和
(B)药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，将所述药物组合物配制用于以如下方式施用：口服地、脂肪内地、动脉内地、关节内地、颅内地、真皮内地、病灶内地、肌肉内地、鼻内地、眼内地、心包内地、腹膜内地、胸膜内地、前列腺内地、直肠内地、鞘内地、气管内地、肿瘤内地、脐带内地、阴道内地、静脉内地、囊内地(intravesicularlly)、玻璃体内地、以脂质体形式、局部地(locally)、粘膜地、胃肠外地、直肠地、结膜下的、皮下地、舌下地、经皮地(topically)、经颊地、透皮地、阴道地、以乳膏(crèmes)形式、以脂质组合物形式、经由导管，经由灌洗，经由连续输注，经由输注，经由吸入，经由注射，经由局部递送、或经由局部灌注。在其它实施方案中，将所述药物组合物配制用于注射。在某些实施方案中，将所述药物组合物配制为单位剂量。
在又其它方面，本公开内容提供了修复基因的方法，所述方法包含给有此需要的患者施用本公开内容的组合物。在某些实施方案中，所述DNA编码要修复的基因的野生型等位基因。
在其它方面，本公开内容提供了对细胞的基因组执行同源性指导的修复的方法，所述方法包含向细胞施用本公开内容的组合物。在某些实施方案中，所述细胞是多个细胞。在其它实施方案中，所述多个细胞是患者。
在再其它方面，本公开内容提供了治疗患者中的疾病或障碍的方法，所述方法包含给所述患者施用治疗有效量的本公开内容的组合物。在某些实施方案中，所述疾病或障碍是遗传性疾病或障碍。在某些实施方案中，所述疾病或障碍与一个或多个基因中的突变相关。在某些实施方案中，所述方法进一步包含给所述患者施用第二种疗法。在某些实施方案中，所述方法进一步包含给所述患者施用所述组合物一次。在某些实施方案中，所述方法进一步包含给所述患者施用所述组合物两次或更多次。
术语“包含”(以及包含的任何形式，诸如“包括”和“含有”)、“具有”(以及具有的任何形式，诸如“具”和“有”)、“含有”(以及含有的任何形式，诸如“含”和“包含”)和“包括”(以及包括的任何形式，诸如“包含”)都是开放式系动词。所以，“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或多个所列举的步骤或要素的方法、组合物、试剂盒或系统具有那些所列举的步骤或要素，但不限于仅具有那些步骤或要素；它可能具有(即涵盖)未列举的要素或步骤。同样，“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或多个所列举的特征的方法、组合物、试剂盒或系统的要素具有那些特征，但不限于仅具有那些特征；它可能具有未列举的特征。
本发明方法、组合物、试剂盒和系统中的任一种的任何实施方案可以由所描述的步骤和/或特征组成，或基本上由所描述的步骤和/或特征组成，而不是包含/包括/含有/具有所描述的步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语”由……组成”或”基本上由……组成”可以代替上面列举的任何开放式系动词，以使得给定权利要求的范围相比于它否则使用开放式系动词的范围发生改变。
在权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确表明仅仅表示替代物或替代物是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅表示替代物和“和/或”的定义。
从下述详细描述将会明白本公开内容的其它目的、特征和优点。但是，应当理解，详细描述和具体实施例尽管指明了本发明的具体实施方案，但是仅通过举例说明来给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。应当指出，仅仅因为特定化合物归于一个特定通式不意味着它不可以也属于另一个通式。
附图简述
专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的图。具有彩图的该专利或专利申请公开文本的副本将在请求并支付必要的费用后由专利局提供。
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1显示4A3-SC8 HDR dLNP在体外和在体内有效地协调HDR介导的基因编辑。含有三种核酸(Cas9 mRNA、sgRNA和ssDNA)的全合一dLNP能够逃离胞内体并将核酸货物释放到细胞质中。然后Cas9 mRNA被翻译成Cas9蛋白，所述蛋白与sgRNA结合以形成核糖核蛋白复合物(RNP)。RNP/ssDNA模板穿过核膜并定位在基因组DNA中产生双链断裂(DSB)的其靶位点，其中包含正确序列的ssDNA模板掺入基因组DNA中。
图2显示以系统方式改变4A3-SC8、胆固醇、DOPE和PEG-DMG的内部摩尔比以产生具有不同脂质性能的颗粒。筛选了各种制剂，其中每孔递送50ng的萤光素酶mRNA。测量萤光素酶活性和细胞毒性(N＝4±标准差)。制剂细节参见表1。
图3A-3F显示dLNP中的树枝状聚合物的化学特性影响跨细胞类型的萤光素酶mRNA递送效力。(图3A)通过连续迈克尔加成合成模块化可降解树枝状聚合物，其含有可电离的胺核心、酯键和烷基-硫醇末梢。(图3B)选择四种不同的胺核心和九种烷基末梢来形成由36种不同结构组成的树枝状聚合物文库用于效力评估。(图3C)用含有萤火虫萤光素酶mRNA的dLNP以12.5ng(6.672mM)的剂量转染HEK293T、HeLa和IGROV1细胞，并在归一化至背景和生存力以后分析生物发光的倍数增加(N＝4)。(图3D)在用每种dLNP制剂转染以后评估所有细胞的生存力，并且表现出最小的细胞毒性或没有细胞毒性(N＝4)。(图3E)大多数dLNP具有约100nm的直径并且是均匀的(PDI<0.2；N＝5)。(图3F)mRNA包封在dLNP制剂之间没有显著差异(N＝4)。
图4显示用含有萤光素酶mRNA的dLNP进行剂量应答实验。在HeLa细胞中的dLNP由4A3胺核心和9种不同的烷基末梢(SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12、SC14)构成。值得注意的是，随着萤光素酶mRNA的剂量增加，HeLa细胞表现出发光的显著增加(N＝4)。
图5显示用含有萤光素酶mRNA的dLNP进行剂量应答实验。在IGROV1细胞中的dLNP由4A3胺核心和9种不同的烷基末梢(SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12、SC14)构成(N＝4)。
图6显示用含有萤光素酶mRNA的dLNP进行剂量应答实验。在HEK293T细胞中的dLNP由4A3胺核心和9种不同的烷基末梢(SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12、SC14)构成(N＝4)。
图7显示在用含有萤光素酶mRNA的dLNP进行的剂量应答实验中，使用ONE-Glo+Tox测定来评估细胞生存力。dLNP由4A3胺核心和9种不同的烷基末梢(SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12、SC14)构成(N＝4)。
图8显示通过流式细胞计量术进行通过NHEJ和HDR的编辑的定量。在上述代表性图中，没有荧光的HEK293 B/GFP细胞显示为阴性对照，用于门控目的和通过NHEJ的编辑的定量，其中细胞由于插入缺失的引入而失去荧光。另外，显示了未编辑的细胞，其中观察到蓝色荧光。最后，显示通过HDR进行基因校正的细胞，如在为GFP轴上细胞群向上移动做指示，其指示亮绿色荧光。
图9A-9F显示4A3-SC8 dLNP通过Cas9 mRNA、sgRNA和经校正的ssDNA模板的一锅递送在含有具有Y66H突变的GFP测序的HEK293细胞中成功诱导HDR。(图9A)HEK293细胞在其GFP序列中含有单个氨基酸突变(Y66H)，该突变改变了它们的荧光。根据所采用的基因编辑技术，荧光可以被消除(NHEJ)或恢复为天然GFP(HDR)。(图9B)用含有1000ng仅Cas9mRNA和sgRNA(2:1比率)的dLNP或含有Cas9 mRNA、sgRNA和ssDNA模板(2:1:1比率)的dLNP转染HEK293(Y66H)细胞，并关于突变的GFP(蓝色)和GFP(绿色)信号使用共焦显微术成像。CellMask Orange用于对合并图像中的质膜进行染色。使用TIDER评估诱导的基因编辑的量和类型，以分析在用含有固定在(图9C)1:1、(图9D)1:2和(图9E)2:1的Cas9mRNA:sgRNA比率的HDR dLNP转染以后的DNA测序(N＝3)。(图9F)在Cas9mRNA:sgRNA的所有三种固定比率中，观察到HDR、NHEJ、总效力和未编辑的细胞的量的相似趋势，其中2:1Cas9 mRNA:sgRNA表现出所有编辑形式中的最高程度(N＝3)。
图10显示通过双颗粒系统实现依次递送，其中第一dLNP仅负载Cas9mRNA并以500ng的剂量施用给细胞。在用Cas9 mRNA dLNP转染后24小时，将第二轮含有仅sgRNA或sgRNA和ssDNA模板的颗粒施用给细胞，剂量为250ng(对于仅sgRNA颗粒)和500ng总核酸(对于含有sgRNA和ssDNA模板的颗粒)。
图11显示通过多个或单个颗粒系统实现同时递送。第一dLNP系统由三种不同的颗粒组成，每种颗粒仅负载一种核酸：Cas9 mRNA 500ng，sgRNA 250ng，或ssDNA模板250ng。将所有颗粒在同一时间点施用给细胞。第二系统使用两种颗粒，一种负载Cas9 mRNA(500ng)，并且另一种负载sgRNA和ssDNA模板(500ng总核酸)，将它们在同一时间点施用给细胞。最后，将含有1000ng总核酸(2:1:1比率的Cas9 mRNA:sgRNA:ssDNA模板)的颗粒施用给细胞。
图12显示使用相同的脂质组合物产生三种4A3-SC8 dLNP，并负载250ng仅sgRNA，250ng sgRNA和500ng Cas9 mRNA，或250ng sgRNA、500ng Cas9 mRNA和750ng ssDNA。Ribogreen测定用于评价在三种4A3-SC8dLNP中每一种中的核酸包封，从而揭示在每种制剂中包封的核酸的量增加。对于所有三种dLNP，包封效率均>75％。
图13显示使用动态光散射表征HDR dLNP的尺寸和多分散性。
图14显示产生的HDR dLNP含有不同比率的核酸组分，其中将Cas9mRNA:sgRNA的比率固定在按重量计的三种比率(1:1、1:2或2:1)之一(1＝250ng)，并以0.5、1、2、3、4、6、8或10的比率滴定ssDNA HDR模板的量。在用HDR dLNP处理后，使用流式细胞计量术分析细胞的GFP+(HDR)、BFP+(未编辑的)或非荧光(NHEJ)信号。在所有组中完成了HDR，但是HDR、NHEJ和未编辑的细胞的量相对于每种dLNP制剂中核酸组分的比率发生变化(N＝3)。
图15A-15E显示在体内实现了HDR基因校正。(图15A)在注射4A3-SC8HDR dLNP以后5天切除皮下异种移植物HEK293(Y66H)肿瘤，用于通过IVIS Lumina成像、流式细胞计量术、共焦显微术和DNA测序进行分析。(图15B)肿瘤和器官的IVIS Lumina成像揭示，在注射了1:1:8、1:1:3和2:1:3HDR dLNP的肿瘤中存在明亮的GFP信号，并且在注射PBS的肿瘤中没有可检测的GFP信号(N＝3)。(图15C)对每个HDR dLNP组中的肿瘤的平均辐射强度进行量化，从而揭示了所有三种HDR dLNP和PBS注射的肿瘤之间的显著差异(对于1:1:8p＝0.0060，对于1:1:3p＝0.0106，对于2:1:3p＝0.0008；使用单因素方差分析和Tukey氏多重比较检验进行统计分析；N＝3)。(图15D)将肿瘤在切除后冷冻，并以7mm的厚度切片用于共焦成像，其中GFP信号在注射了HDR dLNP的肿瘤中清晰可见。(图15E)从整个肿瘤中提取gDNA，并然后测序以得到HDR校正百分比。通过TIDER进行的分析揭示，1:1:8HDR dLNP的平均HDR介导的校正率为10.475％，1:1:3HDR dLNP的平均HDR介导的校正率为16.533％，2:1:3HDR dLNP的平均HDR介导的校正率为20.325％(使用单因素方差分析和Tukey氏多重比较检验进行统计分析，N＝4，1:1:3除外，其中N＝3)。
图16显示使用体外切割测定评价sgRNA序列的靶位点切割。使用IVT创建在本测定中使用的sgRNA。在上面的琼脂糖凝胶图像中，与sgRNA和Cas9蛋白一起温育的组中多个带的存在指示在靶位点处的切割。
图17显示经修饰的sgRNA与Cas9 mRNA一起按重量计以2:1的比率包封到dLNP中(500ng Cas9 mRNA,250ng经修饰的sgRNA)。类似地，将250ng经修饰的sgRNA包封到不含Cas9 mRNA的dLNP中。将dLNP施用给HEK293 B/GFP细胞，并将细胞在37℃温育48小时，然后收集并准备用于通过流式细胞计量术进行分析。在接受含有Cas9 mRNA和经修饰的sgRNA的dLNP的组中，存在通过NHEJ进行的显著基因编辑，如大量非荧光细胞所指示(白色条，58％)。通过控制已知由sgRNA在细胞中的存在诱导的反义活性，进一步证实了编辑。如上面指出的，当将经修饰的sgRNA单独递送给细胞时，存在的非荧光细胞的量与PBS对照相似。
图18显示以0.25mg/kg的剂量对携带HEK293 B/GFP肿瘤的裸鼠静脉内地(IV)或肿瘤内地(IT)注射含有萤光素酶mRNA的4A3-SC8 dLNP。在IT/IV注射后6小时，给小鼠施用d-荧光素并使用IVIS进行发光成像。在IT注射Luc mRNA4A3-SC8 dLNP的小鼠中，在6小时时的成像显示肿瘤块中的明亮发光，而在其它组织中没有发光。在IV注射Luc mRNA4A3-SC8dLNP的小鼠中，在肝脏中可以看到明亮的发光，但在肿瘤块中看不到发光。为了确保dLNP向体循环中的任何潜在渗漏的时间足够长，在首次IV/IT注射dLNP后24小时对小鼠进行成像。再次，发光仅存在于IT注射的小鼠的肿瘤块中。在IV注射的小鼠中，发光仅存在于肝脏中。此外，还从小鼠切除肿瘤块、心脏、肺、肝、肾和脾并进行发光成像。证实了先前的图像，仅在IT注射的小鼠的肿瘤块中可见明亮的发光，表明dLNP没有渗漏到体循环中。IV注射dLNP的小鼠显示在肝脏中的明亮发光，在脾脏中的轻微发光，但在肿瘤块中没有发光。
图19显示Cas-OFFinder被用于鉴定小鼠基因组中PTEN的5个顶级脱靶位点。以0.25mg/kg的剂量向荷有HEK293 B/GFP肿瘤的裸鼠肿瘤内地注射2:1比率的Cas9 mRNA:PTEN sgRNA，并通过Sanger DNA测序和T7E1测定来分析在靶和脱靶编辑。
图20显示Sanger DNA测序和T7E1测定揭示，在以0.25mg/kg的剂量IT注射含有2:1比率的Cas9 mRNA:PTEN sgRNA的4A3-SC8 dLNP以后，在肝脏中5个预测的脱靶位点中的任何一个处没有在靶或脱靶编辑。
图21显示Sanger DNA测序和T7E1测定揭示，在以0.25mg/kg的剂量IT注射含有2:1比率的Cas9 mRNA:PTEN sgRNA的4A3-SC8 dLNP以后，在肺中5个预测的脱靶位点中的任何一个处没有在靶或脱靶编辑。
图22显示Sanger DNA测序和T7E1测定揭示，在以0.25mg/kg的剂量IT注射含有2:1比率的Cas9 mRNA:PTEN sgRNA的4A3-SC8 dLNP以后，在脾中5个预测的脱靶位点中的任何一个处没有在靶或脱靶编辑。
图23显示Cas-OFFinder网络工具用于预测B/GFP sgRNA的可能脱靶编辑位点。用含有2:1比率的Cas9mRNA:sgRNA的4A3-SC8 dLNP转染HEK293B/GFP细胞以后，通过PCR扩增五个顶级潜在脱靶位点，并然后使用T7E1测定进行分析。在靶扩增子显示具有正确预测大小的清晰切割带，但在五个脱靶位点中的任何一个处没有编辑。
图24显示Cas-OFFinder网络工具用于预测B/GFP sgRNA的可能脱靶编辑位点。用含有2:1比率的Cas9mRNA:sgRNA的4A3-SC8 dLNP转染HEK293B/GFP细胞以后，通过PCR扩增五个顶级潜在脱靶位点，并然后使用T7E1测定和Sanger测序进行分析。测序数据揭示清晰的在靶编辑，在靶切割位点周围有小的、未定义的峰。在脱靶样品中，在潜在切割位点周围存在尖锐的、清晰的峰，表明没有插入缺失形成。
图25显示与均负载1:1:3比率的Cas9mRNA:sgRNA:ssDNA的商购可得的试剂Lipofectamine 2000和RNAiMAX相比，使用流式细胞计量术评估1:1:3 4A3-SC8 HDR dLNP的HDR效率，并施用给HEK293 B/GFP细胞。对GFP+细胞的分析揭示，与4A3-SC8 HDR dLNP(>35％)相比，Lipofectamine2000(<5％)和RNAiMAX(<2％)转染试剂几乎没有HDR诱导。此外，将HEK293 B/GFP细胞用4A3-SC8 dLNP转染，所述4A3-SC8 dLNP含有乱序sgRNA替代B/GFPsgRNA(SCsgRNA)、乱序DNA模板替代ssDNA B/GFP模板(SCssDNA)、Cas9 mRNA和ssDNA，但不含sgRNA和sgRNA和Cas9mRNA，但不含ssDNA。在除不含ssDNA模板的dLNP之外的所有情况下，HDR诱导<1％。
图26显示流式细胞计量术用于评估处理后的细胞毒性，所述处理使用含有1:1:3比率的Cas9 mRNA:sgRNA:ssDNA (1000ng总核酸)的4A3-SC8dLNP以及含有相同核酸剂量和比率的Lipofectamine 2000和RNAiMAX。将HEK293 B/GFP细胞以1.5x 105个细胞/孔的密度在500uL的DMEM(10％FBS,1％青霉素/链霉素)中铺在12孔平板中，并在转染前在37℃附着过夜。在转染后24小时，将另外的1mL的DMEM加入每个孔中。在初次转染后48小时，准备细胞用于流式细胞计量术分析。与PBS相比，在用1:1:34A3-SC8 HDR dLNP或RNAiMAX处理的细胞中没有观察到明显的毒性。但是，在用Lipofectamine 2000处理的细胞中存在约12％毒性(N＝3±标准差；使用单因素方差分析和Dunnett氏多重比较检验相对于PBS进行统计分析)。
示例性实施方案的描述
在某些方面，本公开内容提供了用于递送下述核酸中的每一种的一个或多个的脂质纳米颗粒组合物:(1)mRNA；(2)sgRNA；和(3)DNA；和包含至少一种可电离脂质的脂质纳米颗粒；其中所述核酸中的每一种被包封在所述脂质纳米颗粒内。这些组合物可以用于治疗mRNA、sgRNA和DNA对其有用的疾病和障碍，诸如与一个或多个基因中的突变相关的疾病或障碍。
A.CRISPR系统
基因编辑是一种允许修改活细胞内的靶基因的技术。近年来，利用CRISPR的细菌免疫系统进行按需基因编辑彻底改变了科学家进行基因组编辑的方式。CRISPR系统的Cas9蛋白(其为一种RNA引导的DNA内切核酸酶)可以通过改变其引导RNA序列被工程改造成相对轻松地靶向新位点。这一发现使得序列特异性的基因编辑在功能上变得有效。
一般而言，“CRISPR系统”统指参与CRISPR-相关的(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(在内源性CRISPR系统的上下文中，涵盖“正向重复”和tracrRNA-处理的部分正向重复)、引导序列(在内源性CRISPR系统的上下文中，也被称作“间隔区”)，和/或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括非编码RNA分子(引导)RNA，其序列特异性地结合DNA，以及具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。CRISPR系统的一个或多个元件可以源自I型、II型或III型CRISPR系统，例如，源自包含内源性CRISPR系统的特定生物体，诸如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
CRISPR系统可以在靶位点处诱导双链断裂(DSB)，随后进行如本文中讨论的破坏。在其它实施方案中，被视为“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点处对单链进行切口。可以使用配对的切口酶，例如，以提高特异性，每种切口酶由一对不同的gRNA靶向序列指导，使得在同时引入切口后，引入5'突出端。在其它实施方案中，使催化失活的Cas9融合至异源效应物结构域诸如转录阻遏物(例如，KRAB)或活化剂，以影响基因表达。可替换地，具有催化失活的Cas9的CRISPR系统进一步包含与核糖体结合蛋白融合的转录阻遏物或活化剂。
在某些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列特异性的crRNA和固定的tracrRNA的融合体)引入细胞中。一般而言，在gRNA的5'端处的靶位点使用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向靶位点，例如基因。所述靶位点可以基于其在前间区序列邻近基序(PAM)序列(诸如通常NGG或NAG)的5'紧邻的位置来选择。在这方面，通过修饰引导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸以对应于靶DNA序列，将gRNA靶向期望的序列。一般而言，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列位点处的CRISPR复合物形成的元件。通常，“靶序列”通常表示引导序列被设计为与其具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补，只要存在足够的互补性以造成杂交并促进CRISPR复合物的形成即可。
所述靶序列可以包含任何多核苷酸，诸如DNA或RNA多核苷酸。所述靶序列可以位于细胞的细胞核或细胞质中，诸如细胞的细胞器内。通常，可以用于重组进包含靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在某些方面，外源性模板多核苷酸可以被称作DNA模板。在某些方面，所述重组是同源重组。
通常，在内源性CRISPR系统的上下文中，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白形成复合物的引导序列)的形成导致一条或两条链在靶序列内或附近(例如在离靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的切割。tracr序列，其可以包含野生型tracr序列的全部或部分(例如，野生型tracr序列的约或超过约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)或由其组成，也可以形成CRISPR复合物的一部分，诸如通过沿着tracr序列的至少一部分与可操作地连接至引导序列的tracr配对序列的全部或一部分杂交。tracr序列与tracr配对序列具有足够的互补性以杂交并参与CRISPR复合物的形成，诸如当最佳比对时，沿着tracr配对序列的长度具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。
可以将CRISPR系统的元件引入细胞中，使得CRISPR系统的元件的表达指导CRISPR复合物在一个或多个靶位点处的形成。组分可以作为蛋白和/或RNA递送至细胞。例如，Cas酶可以作为编码Cas酶的mRNA来递送，引导RNA可以作为sgRNA来递送，并且用于HDR的DNA模板可以作为DNA来递送。
Cas蛋白的非限制性例子包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也被称作Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可以在登录号Q99ZW2下参见SwissProt数据库。
CRISPR酶可以是Cas9(例如，来自化脓链球菌或肺炎链球菌)。CRISPR酶可以在靶序列的位置处指导一条或两条链的切割，诸如在靶序列内和/或在靶序列的互补物内。所述载体可以编码相对于相应野生型酶发生突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸盐-至-丙氨酸置换(D10A)将Cas9从切割双链的核酸酶转化为切口酶(切割单链)。在某些实施方案中，Cas9切口酶可以与引导序列(例如两个引导序列，其分别靶向DNA靶标的有义链和反义链)组合使用。这种组合允许两条链都被切口并用于诱导HDR。
一般而言，引导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在某些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，引导序列与其对应的靶序列之间的互补程度为约或超过约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。
可以使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，其非限制性例子包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler转化(例如BurrowsWheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)、ELAND(Illumina,San Diego,Calif.),SOAP(可在soap.genomics.org.cn得到)和Maq(可在maq.sourceforge.net得到)的算法。
CRISPR酶可以是包含一个或多个异源蛋白结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何另外的蛋白序列，以及任选的在任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白结构域的例子包括、但不限于表位标签、报道基因序列和具有一种或多种以下活性的蛋白结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录活化活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性例子包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报道基因的例子包括、但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)β半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以融合至编码结合DNA分子或结合其它细胞分子的蛋白或蛋白片段的基因序列，包括、但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4A DNA结合结构域融合物和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域描述于US20110059502中，该文献通过引用并入本文。
B.可电离的脂质
在本公开内容的某些方面，提供了含有包含亲脂的和阳离子的组分的化合物的组合物，其中所述阳离子的组分是可电离的。在某些实施方案中，这些阳离子型可电离的脂质是树枝状聚合物，它们是展现规则树枝状分支的聚合物，其通过向核中或从核中依次或按代添加分支层而形成，并且以一个核、至少一个内部分支层和一个表面分支层为特征(参见Petar R.Dvornic和Donald A.Tomalia in Chem.in Britain,641-645,1994年8月)。在其它实施方案中，本文中使用的术语“树枝状聚合物”意图包括、但不限于具有内核、规律连接到该起始核的重复单元的内层(或“代”)以及连接到最外代的封端基团的外表面的分子体系结构。“树枝状大分子”是具有从焦点发出的分支的树枝状聚合物物质，所述焦点是核心，或可以直接地或通过连接部分连接到核心以形成更大的树枝状聚合物。在某些实施方案中，树枝状聚合物结构具有从中心核心辐射的重复基团，其对于每个分支用每个重复单元加倍。在某些实施方案中，本文所述的树枝状聚合物可以被描述为小分子、中等大小的分子、脂质或脂质样物质。这些术语可用于描述本文所述的具有树枝状大分子样外观的化合物(例如从单个焦点辐射的分子)。
虽然树枝状聚合物是聚合物，但由于它们具有可控的结构、单一分子量、众多且可控的表面官能团，并且在达到特定代数后在传统上采用球状构象，因此树枝状聚合物可能优于传统聚合物。树枝状聚合物可以通过每个重复单元的依次反应以产生单分散的、树状和/或代结构聚合物结构来制备。单个树枝状聚合物由一个中心核心分子组成，其中树枝状楔形物连接到该中心核心上的一个或多个功能位点。根据在制备过程中使用的组装单体，树枝状聚合物表面层可具有设置在其上的多种官能团，包括阴离子的、阳离子的、亲水的或亲脂的基团。在某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是由下式进一步定义的树枝状聚合物或树枝状大分子：
核心-重复单元-封端基团(D-I)
其中通过从所述核心除去一个或多个氢原子并用所述重复单元替换所述原子，将所述核心连接至所述重复单元，并且其中：
所述核心具有式：
其中：
X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
a是1、2、3、4、5或6；或
所述核心具有式：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢、烷基(C≤18)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3；或
所述核心具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或
所述核心是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基基团具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-、-S-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
其中当所述重复单元包含接头基团时，则所述接头基团包含连接至所述接头基团的氮和硫原子的独立的可降解的二酰基基团(如果n大于1)，其中所述重复单元中的第一基团是可降解的二酰基基团，其中对于每个接头基团，下一个重复单元包含连接至所述接头基团的氮原子的两个可降解的二酰基基团；且其中n是在所述重复单元中存在的接头基团的数目；且
所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)或烷二基(C≤18)，其中在烷二基(C≤18)上的氢原子中的一个或多个已经被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3替换；
R10是氢、羧基、羟基或芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最终的可降解的二酰基连接至封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述封端基团进一步由下式定义：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)；且
R10是氢。
在某些实施方案中，A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢或烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。
在式(I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述封端基团由下式代表：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)；且
R10是氢。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述核心进一步被定义为：
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述可降解的二酰基进一步被定义为：
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述接头进一步被定义为其中Y1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)。
在式(D-I)的树枝状聚合物或树枝状大分子的某些实施方案中，所述树枝状聚合物或树枝状大分子选自：
/>
/>
/>
及其药学上可接受的盐。
B.式(X)的树枝状聚合物或树枝状大分子
A.在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是式的树枝状聚合物或树枝状大分子。在某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是下式的树枝状聚合物或树枝状大分子：
。
B.在所述脂质组合物的某些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是具有以下结构式的代数(g)的树枝状聚合物或树枝状大分子：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
(a)所述核心包含结构式(X核心)：
其中：
Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b-；
R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f；
R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6，诸如C1-C3)烷基；
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢或任选地被取代的(例如，C1-C12)烷基；
L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、亚烷基、亚杂烷基、[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基]、[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基]、杂环烷基和亚芳基；或，
可替换地，L1的部分与R1c和R1d之一形成(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子)；且
x1是0、1、2、3、4、5或6；且
(b)所述多个(N个)分支中的每个分支独立地包含结构式(X分支)：
，
其中：
*指示所述分支与所述核心的连接点；
g是1、2、3或4；
Z＝2(g-1)；
当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，
(c)每个二酰基基团独立地包含结构式其中：
*指示所述二酰基基团在其近侧端部处的连接点；
**指示所述二酰基基团在其远侧端部处的连接点；
Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；
A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-，其中：
R4是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6)烷基；
m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3；且
R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C8)烷基；且
(d)每个接头基团独立地包含结构式
其中：
**指示所述接头与近侧二酰基基团的连接点；
***指示所述接头与远侧二酰基基团的连接点；且
Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；且
(e)每个封端基团独立地选自任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烷基硫醇和任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烯基硫醇。
在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是共价键。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-O-。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-S-。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-NR2和R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f。在X核心的某些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-CR3aR3b R3a和R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的烷基(例如，C1-C6，诸如C1-C3)。
在X核心的某些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢或任选地被取代的烷基。在X核心的某些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢。在X核心的某些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、任选地被取代的烷基(例如，C1-C12)。
在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、亚烷基、亚杂烷基、[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基]、[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基]、杂环烷基和亚芳基；或者，可替换地，L1的部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基(例如，C4-C6，并且含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是共价键。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是氢。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚烷基(例如，C1-C12，诸如C1-C6或C1-C3)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚杂烷基(例如，C1-C12，诸如C1-C8或C1-C6)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚杂烷基(例如，C2-C8亚烷基氧化物，诸如寡(亚乙基氧化物))。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基][(例如，C1-C6)亚烷基]-[(例如，C4-C6)杂环烷基]-[(例如，C1-C6)亚烷基]。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基][(例如，C1-C6)亚烷基]-(亚芳基)-[(例如，C1-C6)亚烷基]。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基](例如，[(例如，C1-C6)亚烷基]-亚苯基-[(例如，C1-C6)亚烷基])。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是杂环烷基(例如，C4-C6杂环烷基)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚芳基(例如，亚苯基)。在X核心的某些实施方案中，L1的部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基。在X核心的某些实施方案中，L1的部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基(例如，C4-C6杂环烷基)，并且所述杂环烷基可以含有1或2个氮原子和任选的选自氧和硫的另外杂原子。
在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，寡(亚乙基氧化物)，诸如-(CH2CH2O)1-4-(CH2CH2)-)、[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，)和[(C1-C4)亚烷基]-亚苯基-[(C1-C4)亚烷基](例如，/>)。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-和-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)。在某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基))。在X核心的某些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-)和[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-)。
在X核心的某些实施方案中，x1是0、1、2、3、4、5或6。在X核心的某些实施方案中，x1是0。在X核心的某些实施方案中，x1是1。在X核心的某些实施方案中，x1是2。在X核心的某些实施方案中，x1是0、3。在X核心的某些实施方案中，x1是4。在X核心的某些实施方案中，x1是5。在X核心的某些实施方案中，x1是6。
在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:(例如，)。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:/>在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:/>(例如， )。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:/>(例如，/>)。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:/>在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:/>(例如， 在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:(例如，/>诸如/>
在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:/>其中Q’是-NR2-或-CR3aR3b-；q1和q2各自独立地是1或2。在X核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式:/>或(例
如，)。在X5核心的某些实施方案中，所述核心包含结构式/>
(例如，/>
)，其中环A是任选地被取代的芳基或任选地被取代的(例如，C3-C12，诸如C3-C5)杂芳基。在X核心的某些实施方案中，所述核心具有结构式/>
在X核心的某些实施方案中，所述核心包含在表A中所示的结构式及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。在某些实施方案中，表A的实例核心不限于列出的立体异构体(即对映异构体、非对映异构体)。
表A.实例核心结构
/>
/>
/>
/>
/>
在X核心的某些实施方案中，所述核心包含选自以下的结构式：
/>
及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个5分支中的一个分支的连接点或H。在某些实施方案中，其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点。
在X核心的某些实施方案中，所述核心具有结构
其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。在某些实
施方案中，至少2个分支连接至所述核心。在某些实施方案中，至少3个分0支连接至所述核心。在某些实施方案中，至少4个分支连接至所述核心。
在X核心的某些实施方案中，所述核心具有结构
其中*指示所述核心与所述多个分支中的一个分支的连接点或H。在某些实施方案中，至少4个分支连接至所述核
心。在某些实施方案中，至少5个分支连接至所述核心。在某些实施方案中，5至少6个分支连接至所述核心。
在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少3个分支、至少4个分支、至少5个分支。在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少3个分支。在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少4个分支。在某些实施方案中，所述多个(N个)分支包含至少5个分支。
在X分支的某些实施方案中，g是1、2、3或4。在X分支的某些实施方案中，g是1。在X分支的某些实施方案中，g是2。在X分支的某些实施方案中，g是3。在X分支的某些实施方案中，g是4。
在X分支的某些实施方案中，Z＝2(g-1)，且当g＝1时，G＝0。在X分支的某些实施方案中，Z＝2(g-1)，且当g≠1时，
在X分支的某些实施方案中，g＝1，G＝0，Z＝1，且所述多个分支的每个分支包含结构式。
在X分支的某些实施方案中，g＝2，G＝1，Z＝2，且所述多个分支的每个分支包含结构式
。
在X分支的某些实施方案中，g＝3，G＝3，Z＝4，且所述多个分支的每个分支包含结构式
在X分支的某些实施方案中，g＝4，G＝7，Z＝8，且所述多个分支的每个分支包含结构式。
在某些实施方案中，具有代数(g)＝1的本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子具有结构:
在某些实施方案中，具有代数(g)＝1的本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子具有结构:。
代数为1至4的本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子的实例制剂显示在表B中。基于g可以计算二酰基基团、接头基团和封端基团的数目。
表B.基于代数(g)的树枝状聚合物或树枝状大分子基团的制剂
g＝1 g＝2 g＝3 g＝4
二酰基基团的数目 1 1+2＝3 1+2+22＝7 1+2+22+23＝15 1+2+…+2g-1
接头基团的数目 0 1 1+2 1+2+22 1+2+…+2g-2
封端基团的数目 1 2 22 23 2(g-1)
在某些实施方案中，所述二酰基基团独立地包含结构式*指示所述二酰基基团在其近侧端部处的连接点，且**指示所述二酰基基团在其远侧端部处的连接点。
在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的；亚烷基、任选地被取代的亚烯基或任选地被取代的亚芳烃基。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烷基(例如，C1-C12)。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烯基(例如，C1-C12)。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的亚芳烃基(例如，C1-C12)。
在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-S-。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-NR4-和R4是氢或任选地被取代的烷基(例如，C1-C6)。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是1。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是2。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是3。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的烷基。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢。在X分支的二酰基基团的某些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是任选地被取代的(例如，C1-C8)烷基。
在所述二酰基基团的某些实施方案中，A1是-O-或-NH-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，A1是-O-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，A2是-O-或-NH-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，A2是-O-。在所述二酰基基团的某些实施方案中，Y3是C1-C12(例如，C1-C6，诸如C1-C3)亚烷基。
在所述二酰基基团的某些实施方案中，所述二酰基基团在每次出现时独立地包含结构式(例如，/>诸如)，且任选地R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或C1-C3烷基。
在某些实施方案中，接头基团独立地包含结构式**指示所述接头与近侧二酰基基团的连接点，且***指示所述接头与远侧二酰基基团的连接点。
在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烷基、任选地被取代的亚烯基或任选地被取代的亚芳烃基。在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烷基(例如，C1-C12)。在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚烯基(例如，C1-C12)。在X分支的接头基团(如果存在的话)的某些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的亚芳烃基(例如，C1-C12)。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地选自任选地被取代的烷基硫醇和任选地被取代的烯基硫醇。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团是任选地被取代的烷基硫醇(例如，C1-C18，诸如C4-C18)。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团是任选地被取代的烯基硫醇(例如，C1-C18，诸如C4-C18)。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18烯基硫醇或C1-C18烷基硫醇，并且所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C6-C12芳基、C1-C12烷基氨基、C4-C6 N-杂环烷基、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6N-杂环烷基)、-C(O)-(C1-C12烷基氨基)和-C(O)-(C4-C6 N-杂环烷基)，并且前述取代基中的任一个的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如 )、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))(例如，/>)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，/>)、-C(O)-(C1-C12烷基氨基(例如，单-或二-烷基氨基))和-C(O)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，/>)，其中前述取代基中的任一个的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基取代，所述取代基选自C1-C12(例如，C1-C8)烷基氨基(例如，C1-C6单-烷基氨基(诸如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二-烷基氨基(诸如/> )和C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
在X分支的封端基团的某些实施方案中，每个封端基团独立地是在表C中所示的结构。在某些实施方案中，本文描述的树枝状聚合物或树枝状大分子可以包含选自表C的封端基团或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，表C的实例封端基团不限于列出的立体异构体(即对映异构体、非对映异构体)。
表C.实例封端基团/末梢结构
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在某些实施方案中，式(X)的树枝状聚合物或树枝状大分子选自在表D中所示的那些及其药学上可接受的盐。
表D.可电离的阳离子的脂-树枝状聚合物实例
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C.改变核心、重复单元和表面或封端基团的官能团和/或化学性质，可以调节它们的物理性质。可以改变的一些性质包括、但不限于溶解性、毒性、免疫原性和生物附着能力。树枝状聚合物经常通过其代数或分支中重复单元的数量来描述。仅由核心分子组成的树枝状聚合物被称为第0代，而沿着所有分支的每个连续重复单元是第1代、第2代诸如此类，直到封端或表面基团。在某些实施方案中，半代可能仅由与胺的第一缩合反应而不是与硫醇的第二缩合反应产生。
树枝状聚合物的制备需要通过系列逐步反应实现的合成控制水平，所述逐步反应包括通过每个连续基团构建树枝状聚合物。树枝状聚合物合成可以是收敛或发散型。在发散型树枝状聚合物合成期间，分子以逐步过程从核心到外周组装，所述逐步过程包括将一代连接到前一代，并然后改变下一反应阶段的官能团。官能团转化对于防止不受控制的聚合是必要的。这样的聚合将导致并非单分散的高支化分子，并且另外被称为超支化聚合物。由于空间效应，树枝状聚合物重复单元继续反应产生球形或球状分子，直到空间过度拥挤阻止了在特定代的完全反应并破坏了分子的单分散性。因此，在某些实施方案中，具体考虑了G1-G10代的树枝状聚合物。在某些实施方案中，树枝状聚合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复单元，或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，本文使用的树枝状聚合物是G0、G1、G2或G3。但是，通过减少分支聚合物中的间隔单元可以增加可能的代数(诸如11、12、13、14、15、20或25)。
此外，树枝状聚合物具有两种主要的化学环境：由封端代上的特定表面基团产生的环境，和由于更高级结构而可能被屏蔽本体介质和表面基团的树枝状结构的内部。由于这些不同的化学环境，树枝状聚合物已经发现了许多不同的潜在用途，包括在治疗用途中。
在某些方面，使用丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基团与胺和硫醇的差异反应性来组装可以用在本组合物中的树枝状聚合物。树枝状聚合物可以包括由丙烯酸酯基团与伯胺或仲胺、以及甲基丙烯酸酯与巯基基团的反应形成的仲或叔胺和硫醚。此外，树枝状聚合物的重复单元可以含有在生理条件下可降解的基团。在某些实施方案中，这些重复单元可以含有一个或多个生发的二醚、酯、酰胺或二硫化物基团。在某些实施方案中，核心分子是只在一个方向上允许树枝状聚合的单胺。在其它实施方案中，核心分子是具有多个不同树枝状分支的多胺，每个分支可以包含一个或多个重复单元。树枝状聚合物可以通过从该核心除去一个或多个氢原子而形成。在某些实施方案中，这些氢原子是在杂原子诸如氮原子上。在某些实施方案中，封端基团是亲脂基团诸如长链烷基或烯基。在其它实施方案中，封端基团是长链卤代烷基或卤代烯基。在其它实施方案中，封端基团是含有可电离基团诸如胺(-NH2)或羧酸(-CO2H)的脂族或芳族基团。在其它实施方案中，封端基团是含有一个或多个氢键供体诸如氢氧根基团、酰胺基团或酯的脂族或芳族基团。
在某些实施方案中，所述组合物可以进一步包含从约15至约60的可电离脂质与总脂质组合物的摩尔比。在某些实施方案中，所述摩尔比是从约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55至约60或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，所述摩尔比是从约30至约45。
本公开内容的阳离子型可电离脂质可以含有一个或多个不对称取代的碳或氮原子，并且可以以光学活性的或外消旋的形式分离。因而，除非特别指出具体的立体化学或异构形式，否则意指化学式的所有手性、非对映异构、外消旋形式、差向异构形式和所有几何异构形式。阳离子型可电离脂质可以作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和各非对映异构体存在。在某些实施方案中，获得单一非对映异构体。本公开内容的阳离子型可电离脂质的手性中心可以具有S或R构型。此外，预期阳离子型可电离脂质中的一种或多种可以作为结构异构体存在。在某些实施方案中，所述化合物具有相同的化学式，但与核心的氮原子的连接性不同。不希望受任何理论约束，据信这样的阳离子型可电离脂质存在，因为起始单体首先与伯胺反应，并然后在统计学上与存在的任何仲胺反应。因此，结构异构体可以呈现完全反应的伯胺，并然后呈现反应的仲胺的混合物。
用于表示本公开内容的阳离子型可电离脂质的化学式通常将仅显示可能的几种不同互变异构体中的一种。例如，已知许多类型的酮基与相应的烯醇基平衡存在。类似地，许多类型的亚胺基与烯胺基平衡存在。无论对于给定化学式描绘哪种互变异构体，并且不管哪种互变异构体是最普遍的，意指给定化学式的所有互变异构体。
本公开内容的阳离子型可电离脂质还可以具有以下优点：与现有技术中已知的化合物(无论是用于本文所述的适应症还是其它方面)相比，它们可以更有效，毒性更小，作用时间更长，更强效，产生更少的副作用，更容易被吸收，和/或具有更好的药代动力学特性(例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)，和/或具有其它有用的药理学、物理或化学性能。
另外，构成本公开内容的阳离子型可电离脂质的原子意图包括这样的原子的所有同位素形式。本文中使用的同位素包括具有相同原子序数但是具有不同质量数的那些原子。作为一般示例而非限制性地，氢的同位素包括氚和氘，且碳的同位素包括13C和14C。
应当认识到，形成本文所提供的阳离子型可电离脂质的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子不是至关重要的，只要该盐整体上是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其它例子和它们的制备方法与使用方法呈现于Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,and Use(2002)中，其通过引用并入本文。
C.在脂质纳米颗粒中的另外脂质
在本公开内容的某些方面，将含有一种或多种脂质的组合物与阳离子型可电离脂质混合以产生组合物。在某些实施方案中，将所述聚合物与1、2、3、4或5种不同类型的脂质混合。考虑到，可以将阳离子型可电离脂质与单一类型的多种不同脂质混合。在某些实施方案中，所述阳离子型可电离脂质组合物至少包含类固醇或类固醇衍生物、PEG脂质和磷脂。
1.类固醇和类固醇衍生物
在本公开内容的某些方面，将阳离子型可电离脂质与一种或多种类固醇或类固醇衍生物混合以产生组合物。在某些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物包含任何类固醇或类固醇衍生物。如本文中使用的，在某些实施方案中，术语“类固醇”是一类具有四环17碳环状结构的化合物，其可以进一步包含一个或多个取代，所述取代包括烷基、烷氧基、羟基、氧代基、酰基，或在两个或更多个碳原子之间的双键。在一个方面，类固醇的环结构包含三个稠合的环己基环和稠合的环戊基环，如下式所示：
在某些实施方案中，所述类固醇衍生物包含具有一个或多个非烷基取代的上述环结构。在某些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物是甾醇，其中该式进一步定义为：
在本公开内容的某些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物是胆甾烷或胆甾烷衍生物。在胆甾烷中，环结构进一步由下式定义：
如上所述，胆甾烷衍生物包括一个或多个上述环系统的非烷基取代。在某些实施方案中，所述胆甾烷或胆甾烷衍生物是胆甾烯或胆甾烯衍生物或者甾醇或甾醇衍生物。在其它实施方案中，所述胆甾烷或胆甾烷衍生物是胆甾烯(cholestere)和甾醇或其衍生物。
在某些实施方案中，所述组合物可以进一步包含从约10至约60的类固醇与总脂质组合物的摩尔比。在某些实施方案中，所述摩尔比是从约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55至约60或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，所述摩尔比是从约25至约50诸如30。
2.聚合物缀合的脂质
在本公开内容的某些方面，将所述聚合物与一种或多种聚合物缀合的脂质诸如聚乙二醇化的脂质(或PEG脂质)混合以产生树枝状聚合物组合物。在某些实施方案中，本公开内容包括使用已连接有PEG基团的任何脂质。在某些实施方案中，所述PEG脂质是甘油二酯，其也包含与甘油基团连接的PEG链。在其它实施方案中，所述PEG脂质是含有用PEG链与接头基团连接的一个或多个C6-C24长链烷基或烯基或C6-C24脂肪酸基团的化合物。PEG脂质的一些非限制性例子包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG缀合的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺、PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在某些实施方案中，PEG修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺或PEG修饰的二肉豆蔻酰基-sn-甘油。在某些实施方案中，通过脂质的PEG组分的分子量来测量PEG修饰。在某些实施方案中，所述PEG修饰具有约100至约15,000的分子量。在某些实施方案中，所述分子量是约200至约500、约400至约5,000、约500至约3,000、或约1,200至约3,000。PEG修饰的分子量是约100、200、400、500、600、800、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,500至约15,000。美国专利5,820,873、WO 2010/141069或美国专利8,450,298教导了可用于本发明中的脂质的一些非限制性例子，所述文献通过引用并入本文。
在另一个方面，所述PEG脂质具有下式：
其中:R12和R13各自独立地是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这些基团中的任一个的取代形式；Re是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；且x是1-250。在某些实施方案中，Re是烷基(C≤8)诸如甲基。R12和R13各自独立地是烷基(C≤4-20)。在某些实施方案中，x是5-250。在一个实施方案中，x是5-125或x是100-250。在某些实施方案中，所述PEG脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇。
在另一个方面，所述PEG脂质具有下式：
其中:n1是1-100之间的整数，且n2和n3各自独立地选自1-29之间的整数。在某些实施方案中，n1是5、10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，n1是约30至约50。在某些实施方案中，n2是5-23。在某些实施方案中，n2是11至约17。在某些实施方案中，n3是5-23。在某些实施方案中，n3是11至约17。
在某些实施方案中，所述组合物可以进一步包含从约0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12至约12.5或其中可导出的任何范围的PEG脂质与可电离的总脂质组合物的摩尔比。在某些实施方案中，所述摩尔比是从约1至约6。
3.磷脂
在本公开内容的某些方面，将所述聚合物与一种或多种磷脂混合以产生组合物。在某些实施方案中，也包含磷酸酯基团的任何脂质。在某些实施方案中，所述磷脂是含有一个或两个长链C6-C24烷基或烯基基团、甘油或鞘氨醇、一个或两个磷酸酯基团和任选的小有机分子的结构。在某些实施方案中，所述小有机分子是氨基酸、糖或氨基取代的烷氧基，诸如胆碱或乙醇胺。在某些实施方案中，所述磷脂是磷脂酰胆碱。在某些实施方案中，所述磷脂是二硬脂酰基磷脂酰胆碱或二油酰基磷脂酰乙醇胺。
在某些实施方案中，所述组合物可以进一步包含从约5至约50的磷脂与总脂质组合物的摩尔比。在某些实施方案中，所述摩尔比是从约5、10、15、20、25、30、35、40、45至约50或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，所述摩尔比是从约20至约40。
D.核酸和基于核酸的治疗剂
1.核酸
在本公开内容的某些方面，所述树枝状聚合物组合物包含一种或多种核酸。在某些实施方案中，所述树枝状聚合物组合物包含与可电离的脂质以从约5:1至约1:100的重量比存在的一种或多种核酸。在某些实施方案中，所述核酸与树枝状聚合物的重量比是约5:1、2.5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100或其中可导出的任何范围。另外，应该清楚，本公开内容不限于本文公开的具体核酸。本发明在范围上不限于核酸的任何特定来源、序列或类型，但是，本领域普通技术人员可容易地鉴定各种其它核酸来源中的相关同系物，所述其它核酸来源包括来自非人类物种(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猴、长臂猿、黑猩猩、猿、狒狒、牛、猪、马、绵羊、猫和其它物种)的核酸。考虑到，在本公开内容中使用的核酸可以包含基于天然存在序列的序列。考虑到遗传密码的简并性，与天然存在的序列的核苷酸序列具有至少约50％、通常至少约60％、更通常约70％、最通常约80％、优选至少约90％并且最优选约95％同一性的核苷酸的序列可以编码与天然存在的序列相同的蛋白。在另一个实施方案中，所述核酸是与天然存在的序列互补的序列，或以至少80％、90％、98％、98％和99％互补。本文考虑编码250、500、1000、1212、1500、2000、2500、3000或更长的较长多核苷酸。
本文使用的核酸可以源自基因组DNA，即，从特定生物体的基因组直接克隆。但是，在优选的实施方案中，所述核酸将包含互补DNA(cDNA)。还考虑cDNA加天然内含子或来自另一个基因的内含子；这样的经工程改造的分子有时被称为“小基因(mini-genes)”。最低限度上，本发明的这些和其它核酸可用作在例如凝胶电泳中的分子量标准。
术语“cDNA”意图表示使用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与基因组DNA或从基因组、非加工或部分加工的RNA模板聚合的DNA相比，使用cDNA的优点是，cDNA主要含有相应蛋白的编码序列。可能有时候全部或部分基因组序列是优选的，例如当非编码区是最佳表达所需时，或者当非编码区如内含子将在反义策略中被靶向时。
在某些实施方案中，所述核酸包含一个或多个靶向基因或基因产物中的期望HDR位点的反义区段。反义方法利用了核酸倾向于与“互补”序列配对的事实。互补意指多核苷酸是能够根据标准Watson-Crick互补性规则进行碱基配对的多核苷酸。也就是说，较大的嘌呤将与较小的嘧啶进行碱基配对，以在DNA情况下形成与胞嘧啶配对的鸟嘌呤(G:C)和与胸腺嘧啶配对的腺嘌呤(A:T)的组合，或者在RNA情况下形成与尿嘧啶配对的腺嘌呤(A:U)。在杂交序列中包含较少见的碱基诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等不会干扰配对。
在某些实施方案中，所述核酸包含一个或多个靶向基因或基因产物中的期望HDR位点的反义区段。反义方法利用了核酸倾向于与“互补”序列配对的事实。互补意指多核苷酸是能够根据标准Watson-Crick互补性规则进行碱基配对的多核苷酸。也就是说，较大的嘌呤将与较小的嘧啶进行碱基配对，以在DNA情况下形成与胞嘧啶配对的鸟嘌呤(G:C)和与胸腺嘧啶配对的腺嘌呤(A:T)的组合，或者在RNA情况下形成与尿嘧啶配对的腺嘌呤(A:U)。在杂交序列中包含较少见的碱基诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等不会干扰配对。
用多核苷酸靶向双链(ds)DNA会导致三螺旋形成；靶向RNA将导致双螺旋形成。反义多核苷酸在引入靶细胞中时会特异性地结合其靶多核苷酸并干扰转录、RNA加工、运输、翻译和/或稳定性。反义RNA构建体或编码这种反义RNA的DNA可用于在体外或在体内(诸如在包括人类受试者的宿主动物内)靶向宿主细胞内的基因编辑事件。
如上所述，“互补”或“反义”是指在其整个长度上基本上互补并且具有非常少的碱基错配的多核苷酸序列。例如，当长度为15个碱基的序列在13或14个位置上具有互补核苷酸时，它们可以被称为互补的。自然地，完全互补的序列将是在其整个长度上完全互补并且没有碱基错配的序列。也涵盖具有较低同源性的其它序列。例如，可以设计具有高度同源性的有限区域但也含有非同源区域(例如，核酶；参见下文)的反义构建体。这些分子虽然具有小于50％的同源性，但会在适当条件下结合靶序列。
在某些实施方案中，所述包含编码多核苷酸引导的核酸酶的序列的多核苷酸诸如mRNA包含从约250至约15,000个核苷酸、从约500至约5,000个核苷酸、从约800至约2,500个核苷酸、或从约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000至约15,000个核苷酸或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，所述引导多核苷酸、特别是已经被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物的多核苷酸或含有编码这样的引导多核苷酸的序列的多核苷酸诸如sgRNA包含从约25至约500个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约80至约200个核苷酸或从约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450至约500个核苷酸或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，所述供体多核苷酸、特别是被构造成修复经修饰的靶基因或转录物的多核苷酸诸如DNA包含从约25至约2,500个核苷酸、从约25至约500个核苷酸、从约50至约300个核苷酸、从约80至约200个核苷酸或从约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450至约500个核苷酸或其中可导出的任何范围。
在某些实施方案中，所述组合物包含从约10:1至约1:5、从约5:1至约1:3、从约3:1至约1:2或从约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4至约1:5或其中可导出的任何范围的包含编码多核苷酸引导的核酸酶的序列的多核苷酸诸如mRNA与引导多核苷酸、特别是已经被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物的多核苷酸或含有编码这样的引导多核苷酸的序列的多核苷酸诸如sgRNA的重量比。在某些实施方案中，所述组合物包含从约2:1至约1:20、从约1:1至约1:10、从约1:2至约1:8或从约2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19至约1:20或其中可导出的任何范围的包含编码多核苷酸引导的核酸酶的序列的多核苷酸诸如mRNA与供体多核苷酸、特别是被构造成修复经修饰的靶基因或转录物的多核苷酸诸如DNA的重量比。在某些实施方案中，所述组合物包含从约4:1至约1:10、从约2:1至约1:8、从约1:1至约1:4或从约4:1、3:1、2:1、2:3、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9至约1:10或其中可导出的任何范围的引导多核苷酸、特别是已经被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物的多核苷酸或含有编码这样的引导多核苷酸的序列的多核苷酸诸如sgRNA与供体多核苷酸、特别是被构造成修复经修饰的靶基因或转录物的多核苷酸诸如DNA的重量比。
在某些实施方案中，所述组合物包含从约1,000:1至约5,000:1、从约2,000:1至约4,000:1、或从约1,000:1、1,500:1、2,000:1、2,500:1、3,000:1、3,500:1、4,000:1、4,500:1至约1,500:1或其中可导出的任何范围的脂质组分:核酸组分的摩尔比。在某些实施方案中，所述组合物包含从约1:1至约20:1、从约2:1至约10:1、从约4:1至约8:1或从约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1至约20:1或其中可导出的任何范围的N:P比率。
2.经修饰的核碱基
在某些实施方案中，本公开内容的核酸包含一个或多个经修饰的核苷，所述核苷包含经修饰的糖部分。这样的包含一个或多个糖修饰的核苷的化合物可能具有合乎需要的性质，例如相对于仅包含含有天然存在的糖部分的核苷的寡核苷酸，增强的核酸酶稳定性或增加的与靶核酸的结合亲和力。在某些实施方案中，经修饰的糖部分是被取代的糖部分。在某些实施方案中，经修饰的糖部分是糖替代物。这样的糖替代物可以包含一个或多个与被取代的糖部分的取代对应的取代。
在某些实施方案中，经修饰的糖部分是包含一个或多个非桥连糖取代基的被取代的糖部分，包括、但不限于在2'和/或5'位置的取代基。适合于2'-位置的糖取代基的例子包括、但不限于：2'-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施方案中，在2'位置的糖取代基选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O--C1-C10烷基、O--C1-C10取代的烷基；OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)和O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H或被取代的或未被取代的C1-C10烷基。在5'-位置的糖取代基的例子包括、但不限于：5'-甲基(R或S)；5'-乙烯基和5'-甲氧基。在某些实施方案中，被取代的糖包含超过一个非桥连糖取代基，例如，T-F-5'-甲基糖部分(关于另外的5',2'-二取代的糖部分和核苷，参见例如PCT国际申请WO 2008/101157)。
包含2'-取代的糖部分的核苷被称作2'-取代的核苷。在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O、S或N(Rm)-烷基；O、S或N(Rm)-烯基；O、S或N(Rm)-炔基；O-烷基烯基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)或O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基或被取代的或未被取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基可以进一步被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、巯基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O--CH3、O(CH2)3NH2、CH2—CH＝CH2、O--CH2—CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N-取代的乙酰胺(O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基或被取代的或未被取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含含有选自F、OCF3、O--CH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(CH3)2、--O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O--CH2--C(＝O)--N(H)CH3的2'-取代基的糖部分。
在某些实施方案中，2'-取代的核苷包含含有选自F、O--CH3和OCH2CH2OCH3的2'-取代基的糖部分。
某些经修饰的糖部分包含桥连糖取代基，该基团形成第二个环从而产生二环糖部分。在某些这样的实施方案中，二环糖部分包含在4'和2'呋喃糖环原子之间的桥。这样的4'至2'糖取代基的例子包括、但不限于：--[C(Ra)(Rb)]n--、--[C(Ra)(Rb)]n--O--、--C(RaRb)--N(R)--O—或--C(RaRb)--O--N(R)--；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)--O-2'(LNA)；4'-(CH2)--S-2'；4'-(CH2)2--O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)--O-2'(cEt)和4'-CH(CH2OCH3)--O-2'及其类似物(参见，例如，美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)--O-2'及其类似物,(参见，例如，WO 2009/006478)；4'-CH2--N(OCH3)-2'及其类似物(参见，例如，WO2008/150729)；4'-CH2--O--N(CH3)-2'(参见，例如，US2004/0171570，公开于2004年9月2日)；4'-CH2--O--N(R)-2',和4'-CH2--N(R)--O-2'-，其中每个R独立地是H、保护基或C1-C12烷基；4'-CH2--N(R)--O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基(参见，美国专利7,427,672)；4'-CH2--C(H)(CH3)-2'(参见，例如，Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4'-CH2--C(＝CH2)-2'及其类似物(参见，PCT国际申请WO 2008/154401)。
在某些实施方案中，这样的4'至2'桥独立地包含1至4个独立地选自以下的连接基团：--[C(Ra)(Rb)]n--、--C(Ra)＝C(Rb)--、--C(Ra)＝N--、--C(＝NRa)--、--C(＝O)--、--C(＝S)--、--O--、--Si(Ra)2--、--S(＝O)x--和--N(Ra)--；其中：
x是0、1或2；
n是1、2、3或4；
每个Ra和Rb独立地是H、保护基、羟基、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、杂环残基、被取代的杂环残基、杂芳基、被取代的杂芳基、C5-C7脂环族残基、被取代的C5-C7脂环族残基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)--H)、被取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚砜基(S(＝O)-J1)；且
每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、被取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、被取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、被取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、被取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)--H)、被取代的酰基、杂环残基、被取代的杂环残基、C1-C12氨基烷基、被取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
包含二环糖部分的核苷被称为二环核苷或BNA。二环核苷包括、但不限于：(A)α-L-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')BNA(也被称作锁核酸或LNA)、(C)亚乙基氧基(4'-(CH2)2--O-2')BNA、(D)氨基氧基(4'-CH2--O--N(R)-2')BNA、(E)氧基氨基(4'-CH2--N(R)--O-2')BNA、(F)甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)--O-2')BNA(也被称作受限的乙基或cEt)、(G)亚甲基-硫(4'-CH2--S-2')BNA、(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA、(I)甲基碳环基(4'-CH2--CH(CH3)-2')BNA、(J)亚丙基碳环基(4'-(CH2)3-2')BNA和(K)甲氧基(亚乙基氧基)(4'-CH(CH2OMe)-O-2')BNA(也被称作受限的MOE或cMOE)。
其它二环糖部分是本领域中已知的，例如：Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,129(26)8362-8379(2007年7月4日)；Elayadi等人,Curr.OpinionInvens.Drugs,2001,2,5561；Braasch等人,Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利7,053,207,6,268,490,6,770,748,6,794,499,7,034,133,6,525,191,6,670,461，和7,399,845；WO 2004/106356,WO 1994/14226,WO 2005/021570，和WO 2007/134181；美国专利公开号US 2004/0171570,US 2007/0287831,和US 2008/0039618；美国系列号12/129,154,60/989,574,61/026,995,61/026,998,61/056,564,61/086,231,61/097,787,和61/099,844；和PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。
在某些实施方案中，二环糖部分和掺入这样的二环糖部分的核苷进一步由异构构型限定。例如，包含4'-2'亚甲基-氧基桥的核苷可以呈α-L构型或呈β-D构型。先前，α-L-亚甲基氧基(4'-CH2--O-2')二环核苷已被掺入显示出反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，被取代的糖部分包含一个或多个非桥连糖取代基和一个或多个桥连糖取代基(例如，5'-取代的和4'-2'桥连的糖；PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
在某些实施方案中，经修饰的糖部分是糖替代物。在某些这样的实施方案中，天然存在的糖的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在某些这样的实施方案中，这样的经修饰的糖部分还包含如上所述的桥连和/或非桥连取代基。例如，某些糖替代物包含4'-硫原子和在2'-位置(参见，例如，公开的美国专利申请US2005/0130923)和/或5'位置的取代。作为另外的例子，已经描述了具有4'-2'桥的碳环二环核苷(参见，例如，Freier等人,NucleicAcids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等人,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有并非5-原子的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃。这样的四氢吡喃可以进一步被修饰或取代。包含这样的经修饰的四氢吡喃的核苷包括、但不限于己糖醇核酸(HNA)、阿努醇(anitol)核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,C J.Bioorg.和Med.Chem.(2002)10:841-854)和氟代HNA(F-HNA)。
在某些实施方案中，提供式VII的经修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，提供式VII的THP核苷，其中R1和R2中的一个是F。在某些实施方案中，R1是氟且R2是H，R1是甲氧基且R2是H，以及R1是甲氧乙氧基且R2是H。
本领域还已知许多其它的二环和三环糖替代物环系统，其可用于修饰核苷以掺入反义化合物中(参见，例如，综述文章:Leumann,J.C,Bioorganic和Medicinal Chemistry,2002,10,841-854)。
也提供了修饰的组合，不限于例如2'-F-5'-甲基取代的核苷(关于其它公开的5',2'-二取代的核苷，参见PCT国际申请WO 2008/101157)和用S代替核糖基环氧原子和在2'-位置的进一步取代(参见美国专利公开US 2005/0130923)，或者可替换地二环核酸的5'-取代(参见PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2--O-2'二环核苷在5'位置被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。还已经描述了碳环二环核苷的合成和制备以及其寡聚化和生化研究(参见，例如，Srivastava等人,2007)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含经修饰的核苷的寡核苷酸。那些经修饰的核苷酸可以包括经修饰的糖、经修饰的核碱基和/或经修饰的键。选择特定修饰以使得得到的寡核苷酸具有合乎需要的特征。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个RNA样核苷。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个DNA样核苷酸。
在某些实施方案中，本发明的核苷包含一个或多个未修饰的核碱基。在某些实施方案中，本发明的核苷包含一个或多个经修饰的核碱基。
在某些实施方案中，经修饰的核碱基选自：如本文所定义的通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化的碱基。如本文所定义的5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫基烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化的碱基。其它经修饰的核碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G夹诸如被取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-13][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的核碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环代替的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它核碱基包括在美国专利3,687,808中公开的那些；在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,Kroschwitz,J.I.，编,John Wiley和Sons,1990,858-859中公开的那些；由Englisch等人,1991公开的那些；以及由Sanghvi,Y.S.,1993公开的那些。
教导某些上述经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的制备的代表性美国专利包括、但不限于美国专利3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本发明提供了包含连接的核苷的寡核苷酸。在这样的实施方案中，核苷可以使用任何核苷间键连接在一起。核苷间连接基团的两个主要类别由磷原子的存在或不存在限定。代表性的含磷核苷间键包括、但不限于磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括、但不限于：亚甲基甲基亚氨基(--CH2--N(CH3)--O--CH2--)、硫代二酯(--O--C(O)--S--)、硫羰氨基甲酸酯(--O--C(O)(NH)--S--)；硅氧烷(--O--Si(H)2--O--)；和N,N'-二甲基肼(--CH2--N(CH3)--N(CH3)--)。与天然磷酸二酯键相比，经修饰的键可以用于改变(通常增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施方案中，具有手性原子的核苷间键可以制备为外消旋混合物或单独的对映异构体。代表性的手性键包括、但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷的和不含磷的核苷间键的制备方法是本领域技术人员众所周知的。
本文所述的寡核苷酸含有一个或多个不对称中心，且因此产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构构型，其在绝对立体化学方面可以定义为(R)或(S)，α或β(例如对于糖端基异构体)，或者(D)或(L)(例如对于氨基酸等)。本文提供的反义化合物中包括所有这样的可能的异构体，以及其外消旋的和光学纯的形式。
中性核苷间键包括、但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2--N(CH3)--O-5')、酰胺-3(3'-CH2--C(＝O)--N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2--N(H)--C(＝O)-5')、甲缩醛(3'-O--CH2--O-5')和硫代甲缩醛(3'-S--CH2--O-5')。其它中性核苷间键包括非离子键，其包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(参见例如：Carbohydrate修饰s in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook,编,ACS Symposium Series580；第3和4章,40-65)。其它中性核苷间键包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键。
还可以在寡核苷酸上的其它位置进行另外的修饰，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。例如，本发明的配体缀合的寡核苷酸的一种另外的修饰涉及向寡核苷酸化学连接一个或多个另外的非配体部分或缀合物，其增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这样的部分包括、但不限于脂质部分诸如胆固醇部分(Letsinger等人,1989)，胆酸(Manoharan等人,1994)，硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,1992；Manoharan等人,1993)，硫代胆甾醇(Oberhauser等人,1992)，脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,1991；Kabanov等人,1990；Svinarchuk等人,1993)，磷脂例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,1995；Shea等人,1990)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,1995)，或金刚烷乙酸(Manoharan等人,1995)，棕榈基部分(Mishra等人,1995)，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆甾醇部分(Crooke等人,1996)。
教导这样的寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包括、但不限于美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，它们中的每一篇通过引用并入本文。
E.治疗方法
本文中公开的内容包括用于治疗患有或疑似患有疾病或障碍(诸如遗传性疾病或障碍或与一个或多个基因的突变相关的疾病或障碍)的受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用组合物，其包含下述核酸中的每一种的一个或多个：包含编码多核苷酸引导的核酸酶的序列的多核苷酸诸如mRNA；引导多核苷酸，特别是已经被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物的多核苷酸或含有编码这样的引导多核苷酸的序列的多核苷酸诸如sgRNA；和供体多核苷酸、特别是被构造成修复经修饰的靶基因或转录物的多核苷酸诸如DNA；和包含至少一种可电离脂质的脂质纳米颗粒；其中所述核酸中的每一种被包封在所述脂质纳米颗粒内。所述受试者可以是哺乳动物。所述受试者可以是非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猴、长臂猿、黑猩猩、猿、狒狒、牛、猪、马、绵羊、猫和其它物种)。所述受试者可以是人。可以确定所述受试者表现出基因突变。在某些实施方案中，所述施用包括全身(例如，静脉内)施用。在某些实施方案中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。在某些实施方案中，所述受试者是人。
F.修饰细胞的基因组的方法
本公开内容的某些方面涉及在体外或在受试者体内修饰细胞的基因组的方法，包括使所述细胞与编码序列靶向核酸酶、引导RNA(例如，单个引导RNA)和供体模板的核酸序列接触，其中所述修饰包含与供体模板的核苷酸序列对应的核苷酸序列的插入(例如，通过与供体序列的同源重组)。同源重组(HR)介导的修复(也被称作同源性指导的修复(HDR))使用同源供体DNA作为模板来修复双链DNA断裂。如果供体DNA的序列与基因组序列不同，此过程会导致基因组中引入序列变化。
本文使用的术语“基因组的修饰”涵盖通过同源重组添加调节序列或编码基因产物的核苷酸序列(即，插入与供体模板的核苷酸序列对应的核苷酸序列)。在某些实施方案中，所述修饰包含通过同源重组用非病理学基因组区域替换与疾病或病症相关的基因组区域(例如，基因突变)。例如，在某些实施方案中，所述修饰包含用野生型或非突变的基因组区域替换包含突变的基因组区域。在某些实施方案中，所述突变包含置换或缺失突变。在某些实施方案中，所述修饰包含通过同源重组在基因组中插入对应于缺失突变的缺失部分的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述基因组的修饰包含通过同源重组插入和/或替换基因组序列，其调节基因产物的表达、活性或稳定性。在某些实施方案中，所述基因组的修饰包含所述细胞的两个等位基因的修饰。在某些实施方案中，所述基因组的修饰包含所述细胞的一个等位基因的修饰。
在某些实施方案中，所述组合物产生至少1％、至少5％、至少15％、至少25％、至少50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或至少50％的同源性指导的修复率。在某些实施方案中，所述组合物具有小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的插入缺失率。
G.试剂盒
本公开内容还提供了试剂盒。本文公开的任何组分可以试剂盒的形式组合。在某些实施方案中，所述试剂盒包含如上文或权利要求书中所述的组合物。
所述试剂盒通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器，其中可以放置组分，并且优选适当地等分。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，所述试剂盒通常还会含有第二个、第三个或其它额外的容器，其中可以单独放置额外的组分。但是，各组分的组合可装在一个容器中。在某些实施方案中，所有脂质纳米颗粒组分都组合在单个容器中。在其它实施方案中，一些或所有的脂质纳米颗粒组分提供在分开的容器中。
本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳各种容器的包装，其紧密密封以用于商业销售。这样的包装可以包括在其中保持所需容器的卡纸板或者注塑或吹塑塑料包装。试剂盒也可以包括关于使用试剂盒组分的说明书。说明书可以包括可实现的变体。
H.化学定义
当在化学基团的上下文中使用时：“氢”是指-H；“羟基”是指-OH；“氧代”是指＝O；“羰基”是指-C(＝O)-；“羧基”是指-C(＝O)OH(也写作-COOH或-CO2H)；“卤代”独立地指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”是指-NH2；“羟氨基”是指-NHOH；“硝基”是指-NO2；亚氨基是指＝NH；“氰基”是指-CN；“异氰酸酯”是指-N＝C＝O；“叠氮基”是指-N3；在单价上下文中，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)2或其去质子化形式；在二价上下文中，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”是指-SH；且“硫代”是指＝S；“磺酰基”是指-S(O)2-；“羟基磺酰基”是指-S(O)2OH；“磺酰胺”是指-S(O)2NH2；且“亚磺酰基”是指-S(O)-。
在化学式的上下文中，符号“-”是指单键，“＝”是指双键，且“≡”是指三键。符号“----”代表任选的键，其如果存在的话是单键或双键。符号代表单键或双键。因而，例如，式/>包括/>和/>且应当理解，没有一个这样的环原子形成超过一个双键的一部分。此外，应当指出，当连接一个或两个立体原子时，共价键符号“-”未指示任何优选的立体化学。相反，它涵盖所有立体异构体及其混合物。当垂直穿过键绘制时(例如，对于甲基，/>)，符号/>指示该基团的连接点。应当指出，通常仅以这种方式为较大的基团标识连接点，以帮助读者明确标识连接点。符号/>是指单键，其中连接至楔的粗端的基团“从纸面出来”。符号/>是指单键，其中连接至楔的粗端的基团“进入纸面”。符号/>是指单键，在双键周围的几何形状(例如，E或Z)未确定。因此，两种选择以及它们的组合都是有可能的。在本申请中显示的结构的原子上的任何未定义化合价暗含地表示与该原子键合的氢原子。在碳原子上的粗体点指示，与该碳相连的氢朝向纸面之外。
当一个基团“R”被描述为在环系上的“浮动基团”时，例如，在下式中：
则R可以替代与环原子中的任一个相连的任何氢原子，包括所描绘的、暗示的或明确定义的氢，只要形成稳定的结构即可。当一个基团“R”被描述为在稠合环系上的“浮动基团”时，例如，在下式中：
，
则R可以替代与稠合环中的任一个的任何环原子相连的任何氢，除非另有说明。可替换的氢包括所描绘的氢(例如、在上式中与氮连接的氢)、隐含的氢(例如、未示出但理解为存在的上式中的氢)、明确定义的氢以及其存在取决于环原子的身份的任选氢(例如，当X等于-CH-时，与基团X相连的氢)，只要形成稳定的结构即可。在所示的例子中，R可以位于稠合环系的5元或6元环上。在上式中，在括号中的基团“R”后面紧跟着的下标字母“y”表示数字变量。除非另有说明，否则此变量可以是0、1、2或大于2的任何整数，仅受限于环或环系统的可替换氢原子的最大数目。
对于化学基团和化合物类别，该基团或类别中的碳原子的数目如下指示：“Cn”定义了该基团/类别中的碳原子的确切数目(n)。“C≤n”定义了可以在该基团/类别中的碳原子的最大数目(n)，而最小数目对于所讨论的基团/类别而言尽可能小，例如，应当理解，基团“烯基(C≤8)”或类别“烯烃(C≤8)”中的碳原子的最小数目是2。与“烷氧基(C≤10)”相比，它指示具有1-10个碳原子的烷氧基。“Cn-n′”定义了基团中碳原子的最小数目(n)和最大数目(n′)。因而，“烷基(C2-10)”表示具有2-10个碳原子的那些烷基。这些碳数指示符可以在其修饰的化学基团或类别之前或之后，并且它可以包封或不包封在括号中，而不表示含义的任何变化。因而，术语“C5烯烃”、“C5-烯烃”、“烯烃(C5)”和“烯烃C5”都是同义的。
当用于修饰化合物或化学基团时，术语“饱和的”是指该化合物或化学基团不具有碳-碳双键和碳-碳三键，除非如下所述。当该术语用于修饰原子时，它是指该原子不是任何双键或三键的部分。在饱和基团的被取代形式的情况下，可以存在一个或多个碳氧双键或碳氮双键。并且当这样的键存在时，则不排除可能作为酮-烯醇互变异构现象或亚胺/烯胺互变异构现象的一部分出现的碳-碳双键。当术语“饱和的”用于修饰物质的溶液时，它是指没有更多的该物质可以溶解在该溶液中。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“脂族的”表示如此修饰的化合物或化学基团是无环的或环状的、但非芳族的烃化合物或基团。在脂族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳族环(脂环族)连接在一起。脂族化合物/基团可以是饱和的，即通过单个碳-碳键连接(烷烃/烷基)，或不饱和的，具有一个或多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或多个碳-碳三键(炔烃/炔基)。
术语“芳族”当用于修饰化合物或化学基团原子时是指，所述化合物或化学基团含有通过形成环的键的相互作用而稳定化的原子的平面不饱和环。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷基”表示单价饱和脂族基团，其具有碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr或丙基)、-CH(CH3)2(i-Pr、iPr或异丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基、叔丁基、t-Bu或tBu)和-CH2C(CH3)3(新戊基)是烷基的非限制性例子。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷二基”表示二价饱和脂族基团，其具有1个或2个饱和碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-和-CH2CH2CH2-是烷二基的非限制性例子。“烷烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是烷基，该术语如上面所定义。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。下述基团是被取代的烷基的非限制性例子：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。术语“卤代烷基”是被取代的烷基的子集，其中氢原子替换限于卤代(即-F、-Cl、-Br或-I)，使得不存在除碳、氢和卤素外的其它原子。基团-CH2Cl是卤代烷基的一个非限制性例子。术语“氟代烷基”是被取代的烷基的子集，其中氢原子替换限于氟代，使得除碳、氢和氟外不存在其它原子。基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3是氟代烷基的非限制性例子。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷基”表示具有碳原子作为连接点的单价饱和脂族基团，所述碳原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。非限制性例子包括:-CH(CH2)2(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(Cy)。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷二基”表示具有2个碳原子作为连接点的二价饱和脂族基团，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团是环烷二基基团的一个非限制性例子。“环烷烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是环烷基，该术语如上面所定义。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烯基”表示具有碳原子作为连接点的单价不饱和脂族基团，其具有直链或支链无环结构，至少一个非芳族碳-碳双键，没有碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。非限制性例子包括:-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CHCH＝CH2。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烯烃二基”表示二价不饱和脂族基团，其具有2个碳原子作为连接点，具有直链或支链、直链或支链无环结构，至少一个非芳族碳-碳双键，没有碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和-CH2CH＝CHCH2-是烯烃二基基团的非限制性例子。应当指出，尽管烯烃二基基团是脂族的，但一旦在两端连接，就不排除该基团形成芳族结构的一部分。术语“烯烃”和“链烯烃”是同义的，并且表示具有式H-R的化合物类别，其中R是烯基，该术语如上面所定义。类似地，术语“末端烯烃”和“α-烯烃”是同义的且表示具有刚好一个碳-碳双键的烯烃，其中该键是在分子的末端处的乙烯基的部分。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是被取代的烯基的非限制性例子。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“炔基”表示具有碳原子作为连接点的单价不饱和脂族基团，其具有直链或支链无环结构，至少一个碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。本文中使用的术语炔基不排除一个或多个非芳族碳-碳双键的存在。基团-C≡CH、-C≡CCH3和-CH2C≡CCH3是炔基的非限制性例子。“炔烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是炔基。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“芳基”表示具有芳族碳原子作为连接点的单价不饱和芳族基团，所述碳原子形成一个或多个六元芳族环结构的一部分，其中所述环原子都是碳，且其中所述基团不由除碳和氢以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。本文中使用的该术语不排除连接至第一个芳族环或存在的任何额外芳族环的一个或多个烷基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。芳基基团的非限制性例子包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和从联苯衍生出的单价基团。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“芳烃二基”表示具有2个芳族碳原子作为连接点的二价芳族基团，所述碳原子形成一个或多个六元芳族环结构的一部分，其中所述环原子都是碳，且其中所述单价基团不由除碳和氢以外的原子组成。本文中使用的该术语不排除连接至第一个芳族环或存在的任何额外芳族环的一个或多个烷基、芳基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环可以通过以下一种或多种连接：共价键、烷二基或烯烃二基基团(碳数限制允许)。芳烃二基基团的非限制性例子包括：
“芳烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是芳基，该术语如上面所定义。苯和甲苯是芳烃的非限制性例子。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“芳烷基”表示单价基团-烷二基-芳基，其中术语烷二基和芳基各自以与上面提供的定义一致的方式使用。非限制性例子是：苯基甲基(苄基,Bn)和2-苯基-乙基。当术语芳烷基与“取代的”修饰词一起使用时，来自烷二基和/或芳基基团的一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。取代的芳烷基的非限制性例子是：(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂芳基”表示具有芳族碳原子或氮原子作为连接点的单价芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述杂芳基不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。杂芳基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧和硫的环原子。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。本文中使用的该术语不排除连接至芳族环或芳族环系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳基的非限制性例子包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、异噁唑基、甲基吡啶基、噁唑基、苯基吡啶基、吡啶基(吡啶基)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“N-杂芳基”表示具有氮原子作为连接点的杂芳基。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂芳烃二基”表示二价芳族基团，其具有2个芳族碳原子、2个芳族氮原子、或1个芳族碳原子和1个芳族氮原子作为2个连接点，所述原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述二价基团不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环可以通过以下一种或多种连接：共价键、烷二基或烯烃二基基团(碳数限制允许)。本文中使用的该术语不排除连接至芳族环或芳族环系的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许)的存在。杂芳烃二基的非限制性例子包括：
“杂芳烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性例子。当这些术语与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂环烷基”表示具有碳原子或氮原子作为连接点的单价非芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述杂环烷基不由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。杂环烷基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧或硫的环原子。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。本文中使用的该术语不排除连接至环或环系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。并且，该术语不排除一个或多个双键在环或环系中的存在，前提条件是，得到的基团仍然是非芳族的。杂环烷基的非限制性例子包括氮杂环丙基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡喃基、氧杂环丙基和氧杂环丁基。术语“N-杂环烷基”表示具有氮原子作为连接点的杂环烷基。N-吡咯烷基是这样的基团的一个例子。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“杂环烷二基”表示具有2个碳原子、2个氮原子、或1个碳原子和1个氮原子作为2个连接点的二价环状基团，所述原子形成一个或多个环结构的部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述二价基团不由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环可以通过以下一种或多种连接：共价键、烷二基或烯烃二基基团(碳数限制允许)。本文中使用的该术语不排除连接至环或环系的一个或多个烷基(碳数限制允许)的存在。并且，该术语不排除一个或多个双键在环或环系中的存在，前提条件是，得到的基团仍然是非芳族的。杂环烷二基的非限制性例子包括：
当这些术语与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“酰基”表示基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基或杂芳基，那些术语如上面所定义。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基、Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(咪唑基)是酰基基团的非限制性例子。“硫代酰基”以类似的方式定义，但是基团-C(O)R的氧原子已经用硫原子替换，-C(S)R。术语“醛”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经被-CHO基团替换。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子(包括直接连接至羰基或硫代羰基的碳原子的氢原子，如果有的话)已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨甲酰基)和-CON(CH3)2是被取代的酰基基团的非限制性例子。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷氧基”表示基团-OR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。非限制性例子包括:-OCH3(甲氧基)、-OCH2CH3(乙氧基)、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2(异丙氧基)、-OC(CH3)3(叔-丁氧基)、-OCH(CH2)2、-O-环戊基和-O-环己基。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷氧基”、“烯基氧基”、“炔基氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳氧基”、“杂环烷氧基”和“酰氧基”表示定义为-OR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基和酰基。术语“烷氧基二基”表示二价基团-O-烷二基-、-O-烷二基-O-或-烷二基-O-烷二基-。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷硫基”和“酰基硫基”表示基团-SR，其中R分别是烷基和酰基。术语“醇”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经用羟基基团替换。术语“醚”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经用烷氧基替换。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。
在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷基氨基”表示基团-NHR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。非限制性例子包括：-NHCH3和-NHCH2CH3。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“二烷基氨基”表示基团-NRR′，其中R和R′可以是相同的或不同的烷基，或R和R′可以一起代表烷二基。二烷基氨基基团的非限制性例子包括：-N(CH3)2和-N(CH3)(CH2CH3)。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷基氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷基氨基”、“杂芳基氨基”、“杂环烷基氨基”、“烷氧氨基”和“烷基磺酰基氨基”表示被定义为-NHR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基、烷氧基和烷基磺酰基。芳基氨基基团的一个非限制性例子是-NHC6H5。术语“烷基氨基二基”表示二价基团-NH-烷二基-、-NH-烷二基-NH-或-烷二基-NH-烷二基-。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“酰氨基”(酰基氨基)表示基团-NHR，其中R是酰基，该术语如上面所定义。酰氨基基团的一个非限制性例子是-NHC(O)CH3。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“烷基亚氨基”表示二价基团＝NR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰词一起使用时，连接至碳原子的一个或多个氢原子已经独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是被取代的酰氨基基团的非限制性例子。
当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以表示“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或一个/种以上”的含义一致。
贯穿本申请，术语“约”用于表示，值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变异、或研究受试者之间存在的变异。
如在本申请中使用的，术语“平均分子量”表示每种聚合物物质的摩尔数与该物质的摩尔质量之间的关系。具体地，每种聚合物分子可具有不同的聚合水平以及因此具有不同的摩尔质量。平均分子量可以用来表示多个聚合物分子的分子量。平均分子量通常与平均摩尔质量同义。具体地，有三种主要类型的平均分子量：数量平均摩尔质量、重量(质量)平均摩尔质量和Z-平均摩尔质量。在本申请的上下文中，除非另外指出，否则平均分子量代表该式的数量平均摩尔质量或重量平均摩尔质量。在某些实施方案中，数量平均摩尔质量。在某些实施方案中，平均分子量可用于描述存在于脂质中的PEG组分。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法并不限于仅具有那一个或多个步骤，并且还涵盖其它未列出的步骤。
当在本说明书和/或权利要求书中使用该术语时，术语“有效的”意指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的背景下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指所述化合物在对受试者或患者施用以治疗疾病时足以实现对所述疾病的这类治疗的量。
本文中使用的术语“IC50”表示获得最大应答的50％的抑制剂量。该定量量度指示将给定的生物过程、生物化学过程或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半所需的特定药物或其它物质(抑制剂)的量。
第一化合物的“异构体”是这样的单独化合物：其中每个分子含有与所述第一化合物相同的组分原子，但其中那些原子的三维构型不同。
本文中使用的术语“患者”或“受试者”表示活的哺乳动物生物体，诸如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，所述患者或受试者是灵长类动物。人类受试者的非限制性例子是成年人、青少年、婴儿和胎儿。
本文中普遍使用的“药学上可接受的”表示这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：其在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
“药学上可接受的盐”是指如上文所定义的药学上可接受的并且具有期望的药理学活性的本发明化合物的盐。这样的盐包括与以下酸形成的酸加成盐：无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸诸如1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂族单和二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡萄庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基-取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括在存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基还原葡糖胺等。应当认识到，形成本发明的任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子不是至关重要的，只要所述盐作为整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其它例子和它们的制备方法与使用方法呈现于Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,and Use(P.H.Stahl和C.G.Wermuth编,Verlag Helvetica ChimicaActa,2002)。
本文中使用的术语“药学上可接受的载体”是指参与运载或运输化学药剂的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。
“预防”包括：(1)抑制受试者或患者的疾病发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或征状；和/或(2)减慢受试者或患者的疾病的病状或征状发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或征状。
“重复单元”是特定材料的最简单的结构实体，例如，框架和/或聚合物，无论是有机的、无机的还是金属有机的。在聚合物链的情况下，重复单元沿着链依次连接在一起，就像项链的珠子一样。例如，在聚乙烯，-[-CH2CH2-]n-中，重复单元是-CH2CH2-。下标“n”表示聚合度，也就是说，连接在一起的重复单元的数量。当“n”的值未定义时或在“n”不存在的情况下，它只是指示括号内该式的重复以及材料的聚合性质。重复单元的概念同样适用于重复单元之间的连接性三维地延伸的场合，诸如在金属有机框架、改性聚合物、热固性聚合物等中。在树枝状聚合物的上下文中，重复单元也可以被描述为分支单元、内层或代。类似地，封端基团也可以被描述为表面基团。
“立体异构体”或“光学异构体”是这样的给定化合物的异构体：其中，相同的原子键合到相同的其它原子上，但其中那些原子的三维构型不同。“对映异构体”是给定化合物的立体异构体，其像左手和右手一样互为镜像。“非对映异构体”是给定化合物的的立体异构体但不是对映异构体。手性分子含有手性中心(也被称作立构中心或立体中心)，它是携带多个基团的分子中的任意点(尽管不一定是原子)，使得任意2个基团的互换会产生立体异构体。在有机化合物中，手性中心通常是碳、磷或硫原子，尽管其它原子也可能成为有机和无机化合物中的立构中心。分子可以具有多个立构中心，从而产生它的许多立体异构体。在其立体异构现象可归因于四面体立体中心(例如，四面体碳)的化合物中，假定可能的立体异构体的总数不会超过2n，其中n是四面体立构中心的数目。具有对称性的分子经常具有比立体异构体的最大可能数目更小的数目。对映异构体的50:50混合物被称作外消旋混合物。可替换地，可以对映异构地富集对映异构体的混合物，使得一种对映异构体以大于50％的量存在。通常，使用本领域已知的技术，可以拆分或分离对映异构体和/或非对映异构体。预期对于尚未定义其立体化学的任何立构中心或手性轴，该立构中心或手性轴可以以它的R形式、S形式或作为所述R形式和S形式的混合物(包括外消旋混合物和非外消旋混合物)存在。本文中使用的短语“基本上不含有其它立体异构体”是指所述组合物含有≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％、或最优选≤1％的另外一种或多种立体异构体。
“治疗”包括(1)抑制正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者的所述疾病(例如，阻止所述病状和/或征状的进一步发展)，(2)改善正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者的所述疾病(例如，逆转所述病状和/或征状)，和/或(3)使正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者的所述疾病出现任何可测量的减轻。
以上定义替代在通过引用并入本文的任何参考文献中的任何冲突的定义。但是，对某些术语加以定义的事实不应当被认为表示未被定义的任何术语是不确定的。相反，所使用的所有术语均被认为以使得本领域普通技术人员可以明白本发明的范围并实施本发明的方式描述本发明。
I.实施例
包括以下实施例来证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在以下的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因而可以视为构成其实践的优选模式。但是，本领域技术人员考虑到本公开内容以后应该理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变且仍然获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1:材料和方法
A.材料
用于生物学测定的核酸和其它试剂.Cas9信使RNA(CleanCap Cas9mRNA -(L-7607))和萤光素酶mRNA购自TriLink BioTechnologies。末端修饰的sgRNA购自Synthego(在前3个和最后3个碱基处为2'-O-甲基，且在前3个和最后2个碱基之间为3′硫代磷酸酯键)。DNA寡核苷酸(ssDNA HDR模板(Alt-R)、测序和参考引物、sgRNA引物)购自IntegratedDNA Technologies。Ribogreen试剂购自Life Technologies。One-Glo+Tox购自Promega。CellMask Orange Plasma膜染料购自Thermo Fisher Scientific。BFP dest克隆(质粒#71825)得自Addgene，且BFP/GFP HEK293细胞得自Jacob Corn教授(ETH苏黎士)的实验室。胶原酶I、DNA酶I和透明质酸酶购自Sigma-Aldrich。10X RBC裂解缓冲液和细胞染色缓冲液购自Biolegend。QIAquick凝胶提取试剂盒和QIAquick PCR纯化试剂盒购自Qiagen。PureLink Genomic DNA Mini Kit购自Thermo Fisher Scientific。PCR试剂DreamTaqGreen PCR Master Mix(2X)和Phusion High-Fidelity PCR Master Mix购自ThermoFisher Scientific。T7内切核酸酶I购自New England Biolabs。Lipofectamine 2000和RNAiMAX试剂购自Thermo Fisher Scientific。d-萤光素萤火虫钠盐一水合物购自Goldbio。Ghost Dye Red 780购自Tonbo Biosciences。
dLNP的脂质.胆固醇购自Sigma Aldrich,1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)购自Avanti Polar Lipids。DMG-PEG2000购自NOF America Corporation(Sunbright GM-020)。根据先前报道的方案合成所有树枝状聚合物脂质(Zhou等人,2016)。
细胞培养.Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)购自Thermo FisherScientific，含有高葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和酚红。RPMI-1640(ATCC modified)购自Thermo Fisher Scientific，并含有L-谷氨酰胺、HEPES、酚红、丙酮酸钠、高葡萄糖和低碳酸氢钠。青霉素-链霉素(10,000U/mL)购自Fisher Scientific。Dulbecco氏改良的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胰蛋白酶-EDTA(0.25％)和胎牛血清(FBS)购自Sigma-Aldrich。将突变的HEK293和WT HEK293细胞在含有10％ FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM中培养。将IGROV1细胞在含有10％ FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640中培养。
动物研究.所有实验均经德克萨斯大学西南医学中心(The University of TexasSouthwestern Medical Center)机构动物护理和使用委员会(Institutional AnimalCare&Use Committee，IACUC)批准，并符合当地、州和联邦适用法规(在适用时)。CorningMatrigel Membrane Matrix购自Fisher Scientific。无胸腺裸Foxn1nu小鼠购自Envigo。
B.方法
1.仪器仪表
流式细胞计量术.使用BD LSRFortessa机器进行流式细胞计量术以分析BFP/GFP信号，并在BD FACSAriaT Fusion机器(BD Biosciences)上进行HEK293细胞分选。使用FlowJo v10.6.1分析流式细胞计量术数据。
共焦激光扫描显微术.将Zeiss LSM-700共焦激光扫描显微镜用于对处理的细胞以及肿瘤组织切片进行成像。使用ImageJ(NIH)和Zen 2.6Blue Edition(Zeiss)处理图像。
纳米颗粒尺寸和多分散性.使用Malvern Zetasizer Nano ZS(He-Ne激光,λ＝632nm)进行动态光散射(DLS)以评估纳米颗粒尺寸和多分散性。
组织切片.使用Leica CM1900低温恒温器对肿瘤进行切片。
离体动物成像.使用Perkin Elmer IVIS Lumina系统进行所有离体成像，并使用Living Image分析软件(Perkin Elmer)处理图像。
体外发光和荧光测定.使用Tecan Infinite M200 Pro平板读数器进行发光测定和荧光测定。
Sanger DNA测序.所有DNA测序均通过Eugene McDermott人类生长与发育中心完成。
PCR.使用来自AppliedBiosystems(Thermo Fisher Scientific)的SimpliAmpThermocycler进行PCR(聚合酶链式反应)。
2.核酸序列
经修饰的sgRNA.5′-GCTGAAGCACTGCACGCCAT-3′(SEQ ID NO:1)
乱序sgRNA(SCsgRNA).5′-CAGCATCTTATCTGAGTGGA-3′(SEQ ID NO:2)
DNA sgRNA识别序列.5′-ATGGCGTGCAGTGCTTCAGC-3′(SEQ ID NO:3)
sgRNA引物.
5′-TAATACGACTCACTATAGGGGCTGAAGCACTGCACGCCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′(SEQ ID NO:4)
Cas9 mRNA.
5′-AUGGCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGGCAUCCACGGCGUGCCCGCCGCCGACAAGAAGUACAGCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACAGCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCAGCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCAGCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACAGCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGAGCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACAGCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACAGCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCAGCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGAGCGCCCGGCUGAGCAAGAGCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGAGCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGAGCGACGCCAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGAGCGCCAGCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCAGCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACAGCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACAGCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACAGCGUGGAGAUCAGCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCAGCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGAGCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGAGCGGCCAGGGCGACAGCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCAGCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGAGCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGUGCCCAGCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGAGCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACAGCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGAGCAAGCUGGUGAGCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGAGCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGAGCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGAGCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCAGCAAGGAGAGCAUCCUGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACAGCCCCACCGUGGCCUACAGCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGAGCAGCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACAGCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCAGCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCAGCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCAGCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCAGCGAGUUCAGCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGAGCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCAGCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGAGCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGAGCCAGCUGGGCGGCGACAGCGGCGGCAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCAGCUACCCCUACGACGUGCCCGACUACGCCUGA-3′(SEQ ID NO:5)
乱序ssDNA.
5′-CCAGGCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTCTTAGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGCGTTGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGGCATAGTG-3′(SEQ ID NO:6)
ssDNA HDR模板.
5′-GCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACGTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGA -3′(SEQ ID NO:7)测序引物.
B/GFP Fwd 1
5′-AGCTGGCTAGGTAAGCTTGG-3′(SEQ ID NO:8)
B/GFP Fwd 2
5′-TGGGTGGAGACTGAAGTTAGGC-3′(SEQ ID NO:9)
B/GFP Rev 1
5′-CTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′(SEQ ID NO:10)
B/GFP Rev 2
5′-GGGTGCTCAGGTAGTGGTT-3′(SEQ ID NO:11)
参考序列引物(TIDER)
B/GFP参考正向
5′-CCCTGACGTACGGCGTG-3′(SEQ ID NO:12)
B/GFP参考反向
5′-CACGCCGTACGTCAGGG-3′(SEQ ID NO:13)
3.实验细节
dLNP组分摩尔比筛选.使用具有五个不同变量的Box-Behnken实验设计通过乙醇稀释方法制备dLNP，以分析：树枝状聚合物:核酸的摩尔比(2000、4000、6000)；颗粒内树枝状聚合物(30、50、70)；胆固醇(20、40、60)；DOPE(20、40、60)；DMG-PEG2K(0.5、1.5、2.5)。将IGROV1细胞用dLNP转染，并按照下面列出的萤光素酶mRNA递送测定方案中的描述测定发光值。
体外dLNP制剂.通过乙醇稀释方法制备dLNP。将萤光素酶mRNA在酸性水性缓冲液(0.01M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，pH 3)中稀释。通过乙醇稀释产生特定摩尔浓度的每种脂质组分的储备溶液。然后将这些储备溶液以38.5:30:30:1.5(树枝状聚合物:胆固醇:DOPE:DMG-PEG)的摩尔比混合在一起。将该脂质混合物以1:3(脂质混合物:mRNA溶液)的体积比加入mRNA溶液中，并使用微量移液器快速混合。混合后，将dLNP在室温(RT)温育15-20分钟，并然后稀释(按体积，3倍)或在不含钙和镁的1×Dulbecco氏改良的PBS(Sigma-Aldrich)进行透析。如果透析，则通过在去离子的和高压灭菌的H2O中稀释10×PBS(Sigma-Aldrich)来产生1×PBS的2L溶液，并将dLNP加载到Pur-A-Lyzer Midi透析室(Sigma-Aldrich)中。然后将负载的dLNP在1×PBS中透析，对于每个室中的200μL样品持续时间为1小时。
核酸结合实验.使用Quant-iT Ribogreen测定(Fisher Scientific)来测定核酸结合。首先使用体外或体内dLNP制备方法制备dLNP。将这些dLNP以与治疗剂量相对应的体积加入96-孔黑色不透明聚苯乙烯微量培养板(Corning-Fisher Scientific)中。为了一致性，在与dLNP相同的介质中制备适当核酸的标准曲线。将Ribogreen试剂在1×PBS中稀释1000倍，并使用多通道微量移液器以50μL的体积加入每个孔中。使用定轨摇床，将dLNP和Ribogreen试剂混合物在室温摇动5分钟。然后测量每个孔的荧光(λEx 485nm、λEm 535nm)，并在拟合至标准曲线后评估游离mRNA的量。将游离mRNA用于通过以下公式确定包封的mRNA百分比：结合的核酸的分数＝[(加入的总核酸-游离核酸)/(加入的总核酸)](在所有情况下，N＝4±标准差)。
dLNP物理性质表征.使用Zetasizer Nano ZS(Malvern)和氦-氖激光(λ＝632nm)测定dLNP性质。使用动态光散射(DLS)通过173°反向散射测量dLNP的尺寸和多分散性，设置如下：5次测量，3次运行，每次运行10秒，并将衰减设置为自动。根据Malvern指南，适当调整每个样品的折射率，以考虑dLNP制剂之间任何可能的粘度差异。
萤光素酶mRNA递送测定.使用上述乙醇稀释方法用萤光素酶mRNA(Tri-LinkBiotechnologies)制备dLNP。将IGROV1细胞(为了摩尔比优化，如上所述使用其它细胞系进行树枝状聚合物文库筛选)以每孔4×103个细胞的密度在100μL的RPMI 1640培养基(含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素)中接种在白色不透明96孔微量培养板(Corning-FisherScientific)中，并允许在37℃粘附到孔上过夜。在过夜温育后，制备含有萤光素酶mRNA的dLNP，并使用多通道微量移液器以50ng mRNA/孔的剂量加入每个孔中。在添加dLNP后24小时，然后通过多通道微量移液器将100μL含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的额外RPMI1640加入每个孔中。然后将细胞在37℃再温育24小时，总转染时间为48小时。48-小时温育时段后，根据生产商方案使用ONE-Glo+Tox Assay(Promega)评估细胞生存力和萤光素酶表达，并归一化为生存力(N＝4±标准差)。
树枝状聚合物文库筛选.分析的树枝状聚合物文库由胺核心3A3、3A5、4A3和4A1以及烷基末梢基团SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12和SC14组成；总共36种不同的树枝状聚合物化合物。这些化合物中的每一种用于转染三种细胞系(IGROV1、HEK293T和HeLa)。将所有细胞以不同的密度在100μL的其各自培养基(IGROV1:4×103个细胞/孔-RPMI164010％ FBS1％青霉素/链霉素,HEK293T 1×104个细胞/孔-DMEM 10％ FBS1％青霉素/链霉素,HeLa:4×103个细胞/孔-DMEM 10％ FBS1％青霉素/链霉素)中接种在白色不透明96孔微量培养板中，并在37℃温育过夜，使得它们粘附在孔上。将每种树枝状聚合物脂质与乙醇混合以形成10mM工作储备溶液。然后将这些储备溶液与胆固醇、DOPE和DMG-PEG以38.5:30:30:1.5(树枝状聚合物:胆固醇:DOPE:DMG-PEG)的摩尔比混合，其中每种树枝状聚合物固定在10,000:1(树枝状聚合物:mRNA)的摩尔比。然后将每个dLNP混合物与在酸性水性缓冲液中的萤光素酶mRNA(如前所述)以1:3的体积比率(在乙醇中的脂质混合物:在酸性水性缓冲液中的mRNA)混合，并使用微量移液器快速混合。混合后，将dLNP在室温温育15分钟，并然后在1×PBS中按体积稀释三倍。过夜温育后，用以下含有12.5ng萤光素酶mRNA的dLNP转染所有细胞，并然后使用多通道微量移液器将100μL额外培养基加入每个孔中。将细胞在转染后在37℃温育48小时，并然后使用微量培养板读数器分析萤光素酶表达和毒性。根据生产商方案，使用ONE-Glo+Tox Assay(Promega)评价萤光素酶表达和毒性，并归一化至背景和生存力(N＝4±标准差)。
剂量应答.以剂量-应答方式检查具有4A3胺核心和烷基末梢SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12和SC14的选定树枝状聚合物化合物的效力和毒性。通过乙醇稀释方法(树枝状聚合物:胆固醇:DOPE:DMG-PEG的摩尔比为38.5:30:30:1.5)创建含有萤光素酶mRNA的dLNP，并以与树枝状聚合物文库筛选相同的方式但以4种不同的剂量(6.25ng、12.5ng、25ng、50ng)施用给三种不同的细胞系(IGROV1、HEK293T、HeLa)。通过ONE-Glo+ToxAssay(Promega)测定萤光素酶表达和毒性(N＝3±标准差)。
sgRNA序列验证.使用体外切割测定验证sgRNA序列。简而言之，将300ng线性化的pDNA (BFP dest克隆,addgene)与160ng Cas9蛋白和33ng IVT sgRNA RNP在1×NE缓冲液3.1中混合(终体积:20μL)。然后，将混合物在37℃温育2小时。通过琼脂糖电泳(2％琼脂糖凝胶)检测切割。
HDR组分的dLNP多包封.将HEK293 B/GFP细胞以每孔1.5×105个细胞的密度在500μL含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中铺在12孔组织培养皿(CytoOne)中，并在37℃附着过夜。过夜温育后，使用乙醇稀释方法制备4A3-SC8 dLNP(38.5:30:30:1.5；4A3-SC8:胆固醇:DOPE:DMG-PEG)，但将多种组分加入核酸混合物中进行包封。在第一轮评价中，实施了双颗粒依次递送系统，第一个dLNP仅含有Cas9 mRNA (500ng)，另一个dLNP含有三种不同货物之一：仅经修饰的sgRNA(250ng)，ssDNA HDR模板和经修饰的sgRNA(固定在1:1重量比，各250ng)，或ssDNA HDR模板和经修饰的sgRNA(固定在1:1摩尔比，500ng总核酸)。在过夜温育后，以每孔500ng的剂量向细胞施用含有Cas9 mRNA的dLNP。在用含有Cas9 mRNA的dLNP转染后24小时，将第二个dLNP施用给含有三种不同货物之一的细胞，并将细胞在37℃温育48小时。在第二轮dLNP转染后24小时，每孔加入1mL的DMEM。在48小时温育后，准备细胞用于流式细胞计量术分析。简而言之，吸出每个孔中的所有培养基，并然后用1mL的1×PBS冲洗每个孔。吸出1×PBS并向每孔添加500μL的胰蛋白酶-EDTA，并将细胞在37℃温育2分钟。温育后，向每个孔中添加1mL的DMEM，并将所有孔的内容物收集在1.5mL管(Eppendorf)中，并在300G旋转4分钟以产生细胞沉淀物。然后将细胞沉淀物重新悬浮于1mL的1×PBS中并置于冰上直至通过流式细胞计量术进行分析。在第二轮评价中，评价了由三个、两个或单个颗粒组成的同时递送系统。使用与上述相同的方法将HEK293B/GFP细胞接种到12孔板中。在三颗粒系统中，使用乙醇稀释方法创建4A3-SC8 dLNP，并且每个含有单个核酸货物(500ng Cas9 mRNA、250ng经修饰的sgRNA、250ng ssDNAHDR模板)。在双颗粒系统中，创建了一组含有500ng Cas9 mRNA的4A3-SC8 dLNP，且另一组4A3-SC8 dLNP含有1:1比率的ssDNAHDR模板和经修饰的sgRNA(500ng总核酸)。最后，在单颗粒系统中，创建了4A3-SC8 dLNP，其含有固定在2:1:1(Cas9 mRNA:经修饰的sgRNA:ssDNAHDR模板，1000ng总核酸)的重量比的所有三种核酸货物。将各颗粒混合物中的每一种同时加给细胞中，并遵循上面列出的相同方案进行培养基添加和温育时间(48小时)。温育后，如上所述准备细胞用于通过流式细胞计量术进行分析。
体外HDR滴度.将HEK293 B/GFP细胞以每孔1.5×105个细胞的密度在500μL含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中铺在12孔组织培养皿(CytoOne)中，并在37℃附着过夜。过夜温育后，使用乙醇稀释方法生成4A3-SC8 dLNP，并含有三种核酸(Cas9 mRNA、经修饰的sgRNA、ssDNA HDR模板)的混合物，并且组分的内部摩尔比固定在38.5:30:30:1.5的4A3-SC8:胆固醇:DOPE:DMG-PEG。4A3-SC8与核酸的摩尔比固定在2500:1。在所有制剂中，将Cas9 mRNA和经修饰的sgRNA固定在以下重量比之一：1:1、1:2或2:1，其中1表示250ng该特定核酸。一旦那两种组分之间的比率固定，按以下比率之一将一定量的ssDNA HDR模板加入每个单独RNA混合物中：0.5、1、2、3、4、6、8、10。然后使用微量移液器将dLNP施用给细胞。在转染后24小时，向每孔加入1mL的DMEM。在48小时温育后，如上所述准备细胞用于通过流式细胞计量术进行分析(N＝3±标准差)。
体外基因组DNA测序.对于所有细胞，在用HDR dLNP转染后48小时提取gDNA，如下所示。简而言之，将细胞在37℃用胰蛋白酶处理3分钟，其中然后添加500mL的DMEM以中和胰蛋白酶。然后将细胞收集在1.5mL DNA LoBinid管(Eppendorf)中并在300G下离心5分钟以形成细胞沉淀物。然后将该沉淀物重新悬浮于细胞消化介质中。所述消化介质由每个样品2μL蛋白水解酶K(Ambion，20mg/mL)、10μL的被动细胞裂解缓冲液(Promega)和40μL的DEPC处理过的H2O(Ambion)组成。然后将50μL的该细胞裂解缓冲液加入每个细胞沉淀物中，并使用微量移液器重新悬浮沉淀物。然后将混合物转移至0.5mL PCR管(Fisherbrand)并进行以下PCR循环：1×(65℃-20min；95℃-10min；4℃-保持)。然后使用以下方案通过PCR扩增提取的gDNA：制备引物B/GFP Fwd 1和B/GFP Rev 2的40μM工作溶液，并以等体积混合以产生两种引物的20μM混合物。每个反应的PCR混合物由2μL从裂解的细胞中提取的gDNA、25μLDreamTaq Green PCR Master Mix(2×)、1μL的20uM B/GFP Fwd+B/GFP Rev引物混合物和22μL DEPC处理过的H2O组成。在以下循环条件下运行每种混合物：(1×(95℃-5min)35×(95℃-30秒；61℃-30秒；72℃-1min)1×(72℃-7min)1×(4℃-保持)。此后，根据生产商方案(Qiagen)进行PCR纯化。然后将所有样品在2％琼脂糖凝胶中在130V运行30分钟-1小时，验证尺寸是否正确，并根据生产商的方案使用Qiagen凝胶纯化试剂盒进行提取。然后将纯化的样品提交用于通过Sanger DNA测序进行测序，其中使用6μL的PCR扩增的DNA(8.333ng/μL)和6μL的1μM引物B/GFP Rev 2储备物的混合物。
异种移植物HEK293 B/GFP肿瘤形成.将HEK293 B/GFP细胞悬浮液以1×106个细胞/50μL的浓度重新悬浮在1×PBS中，并以1:1体积比与Corning Matrigel MembraneMatrix组合。然后使用29G1/2胰岛素注射器(Excelint)将100μL混合物皮下注射到无胸腺裸Foxn1nu小鼠的右后腿中。允许肿瘤生长约2-3周，直至测得125mm3的大小。
体内dLNP递送.使用乙醇稀释方法创建4A3-SC8 dLNP用于体内实验并在1×PBS中透析2小时。将用于体内工作的所有dLNP在注射前在1×PBS中透析2小时。内部组分的摩尔比固定在38.5:30:30:1.5的4A3-SC8:胆固醇:DOPE:DMG-PEG，并且4A3-SC8与核酸的摩尔比固定在2500:1。所述核酸混合物由按重量比固定在1:1:8、1:1:3或2:1:3的Cas9 mRNA:经修饰的sgRNA:ssDNA HDR模板的内部组分组成。以0.5mg/kg的剂量在肿瘤内注射4A3-SC8dLNP。
用于IVIS成像的异种移植肿瘤和器官切除术.在注射HDR dLNP后5天，对小鼠实施安乐死，并通过剥皮切除肿瘤。此外，还切除了心脏、肺、脾和肾，以便使用IVIS Lumina进行成像。
用于共焦成像的异种移植肿瘤制备.将切除的肿瘤置于含有O.C.T.化合物(Tissue-Tek)的孔中，并然后转移至-80℃直至准备切片(至少过夜)。然后将在O.C.T.化合物中冷冻的肿瘤放入低温恒温器(Leica Biosystems)中，并以7μm至15μm的不同厚度进行切片，然后将它们安装到载玻片上。安装后，通过用4％低聚甲醛溶液在室温温育2小时来固定组织切片，用1×PBS洗涤3次，并覆盖。
10×消化介质.肿瘤的消化介质由以下混合物组成：在1×PBS中的胶原酶I(450单位/μL,Sigma Aldrich),DNA酶I(250单位/μL,Sigma Aldrich)和透明质酸酶(300单位/μL,Sigma Aldrich)。将混合物在-20℃储存。
体内肿瘤基因组DNA测序.对于所有肿瘤，使用PureLink Genomic DNA Mini Kit根据生产商方案从肿瘤中提取gDNA。然后通过PCR扩增肿瘤gDNA中的GFP序列。简而言之，制备F’1和R’2测序引物的40μM工作溶液，并将其加入由40ng gDNA、25μL DreamTaq GreenMaster Mix(2x)、1μL的F’1和R’2引物(20μM浓度)以及22μL的milliQ H2O组成的混合物中。按以下PCR循环运行该混合物：1×(95℃-5min)30×(95℃-30秒；62.5℃-30秒；72℃-1min)1X(72℃-7min)1×(4℃-保持)。然后将样品在2％琼脂糖凝胶中在130V运行30分钟至1小时，验证尺寸是否正确，并根据生产商的方案使用Qiagen凝胶纯化试剂盒进行提取。然后将纯化的样品提交用于通过Sanger DNA测序进行测序，其中使用6μL的PCR扩增的DNA(8.333ng/μL)和6μL的1μM引物B/GFP Rev 2储备物的混合物。
参考序列模板生成.使用以下方案生成参考序列：从PBS处理的肿瘤中提取gDNA，并使用上述PCR循环进行扩增。在扩增和纯化后，对于模板的第一半和第二半分别使用F’1引物+反向参考引物或正向参考引物+R’2引物的组合扩增序列的每一端。两种反应混合物中均由1μL的20μM引物混合物、25μL的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(2×)、1ngPBS PCR产物和H2O组成，至总反应体积50μL。用于生成模板序列的每一半的PCR循环如下：1×(95℃-5min)30×(95℃-30秒；62℃-30秒；72℃-1min)1×(72℃-7min)1×(4℃-保持)。该扩增后，使用以下PCR混合物和循环对两个序列进行退火：5μL的两个参考模板的每端、25μL的DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)和H2O至50μL。PCR循环为：1×(95℃-5min)10×(95℃-30秒；62℃-30秒；72℃-1min)1×(72℃-7min)1×(4℃-保持)。最后，将两端一起扩增并退火，将所得PCR产物稀释200倍，并然后使用1μL的200×稀释的PCR产物、1μL的20μMF’1+R’2引物集合、25μL的DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)和H2O(至50μL)进行扩增，条件如下：1×(95℃-5min)30×(95℃-30秒；66℃-30秒；72℃-1min)1×(72℃-7min)1×(4℃-保持)。将所得产物在2％琼脂糖凝胶中在130V运行1小时，使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化，并然后使用Sanger DNA测序进行测序。
通过DNA测序对HDR进行TIDER分析.将TIDER网络工具(tide.nki.nl/#about-tider)用于从Sanger DNA测序数据计算HDR。来自TIDER网站：“TIDER是TIDE的修改版本，其估计与使用供体模板的同源性指导的修复相组合的CRISPR引入的靶向小核苷酸变化的频率。此外，它确定非模板插入缺失的频谱和频率。与TIDE相比，TIDER需要一个额外的测序轨迹(即三个而不是两个)。该第三个“参考”DNA的制备可以通过简单的两步PCR方案来完成。该网络工具报告模板化突变和所有非模板化插入缺失的估计频率。”
流式细胞计量术.为了检测未编辑的细胞(BFP+)、NHEJ(无荧光)和HDR(GFP+)，使用BD LSRFortessa机器(BD Biosciences)分析细胞。使用FlowJo对GFP+、BFP+和非荧光细胞进行定量。
统计分析.在GraphPad Prism中使用Student氏t-检验或单因素方差分析与Tukey氏多重比较检验或Dunnett氏多重比较检验进行统计分析。
体内萤光素酶测定.使用HEK293 B/GFP细胞在无胸腺裸Foxn1nu小鼠的右后腿中形成肿瘤。一旦肿瘤达到约125mm3大小，就以0.25mg/kg的剂量向肿瘤注射含有萤光素酶mRNA的4A3-SC8 dLNP。在肿瘤内(IT)注射后6小时，给小鼠腹膜内(IP)注射d-荧光素，并使用IVIS进行发光成像。成像后，然后将小鼠送回其住处。在初次IT注射dLNP后24小时，再次对小鼠IP注射d-荧光素，并使用IVIS进行发光成像。紧接着，进行整只小鼠IVIS成像，从每只小鼠切除肿瘤块、肺、肝、心脏、肾和脾，使用IVIS进行发光成像(N＝3)。
体内PTEN脱靶测定.使用HEK293 B/GFP细胞在无胸腺裸Foxn1nu小鼠的右后腿中形成肿瘤。一旦肿瘤达到约125mm3大小，就以0.25mg/kg的剂量向肿瘤注射含有2:1重量比的Cas9 mRNA:PTEN sgRNA的4A3-SC8dLNP。在IT注射含有Cas9 mRNA和PTEN sgRNA的4A3-SC8dLNP后5天，从小鼠切除肝、肺和脾以进行下游脱靶分析(N＝3)。
用于PTEN脱靶编辑的体内T7E1和DNA测序.使用Cas-OFFinder网络工具预测PTENsgRNA的可能脱靶编辑位点。根据生产商方案，使用PureLink基因组DNA微型试剂盒从切除的肺、肝和脾中提取gDNA。然后通过PCR扩增在gDNA中的每个脱靶位点。然后将所有样品在2％琼脂糖凝胶中在130V运行30分钟至1小时，验证尺寸是否正确，并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒根据生产商的方案进行提取。然后根据生产商的方案将凝胶纯化的脱靶扩增子用于T7E1测定。此外，提交凝胶纯化的脱靶扩增子用于Sanger DNA测序(N＝3)。
用于脱靶HEK293 B/GFP编辑的体外T7E1和测序.使用Cas-OFFinder网络工具预测B/GFP sgRNA的可能脱靶编辑位点。对于所有细胞，如下在用HDR dLNP转染后48小时提取gDNA。简而言之，将细胞在37℃胰蛋白酶消化3分钟，然后添加500mL的DMEM以中和胰蛋白酶。然后将细胞收集在1.5mL DNA LoBinid管(Eppendorf)中并在300G离心5分钟以形成细胞沉淀物。然后将该沉淀物重新悬浮于细胞消化介质中。消化介质由每个样品2μL蛋白水解酶K(Ambion，20mg/mL)、10μL的被动细胞裂解缓冲液(Promega)和40μL的DEPC处理过的H2O(Ambion)组成。然后将50μL的该细胞裂解缓冲液加入每个细胞沉淀物中，并使用微量移液器重新悬浮沉淀物。然后将混合物转移至0.5mL PCR管(Fisherbrand)并进行以下PCR循环：1×(65℃-20min；95℃-10min；4℃-保持)。然后通过PCR在每个预测的脱靶位点对提取的gDNA进行扩增，并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒根据生产商的方案进行凝胶纯化。在扩增后，使用生产商的方案进行T7E1测定以检查脱靶编辑。此外，提交纯化的样品进行Sanger DNA测序(N＝3)。
混乱的和商购可得的试剂体外HDR评估.将HEK293 B/GFP细胞以每孔1.5×105个细胞的密度在500μL含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中铺在12孔组织培养皿(CytoOne)中，并在37℃附着过夜。过夜温育后，根据生产商的方案，使用1:1:3比率的sgRNA:Cas9 mRNA:ssDNA制备Lipofectamine 2000和RNAiMAX脂复合物。此外，还创建了包含以下物质的4A3-SC8 dLNP：1:1:3比率的Cas9 mRNA:sgRNA:ssDNA；1:1:3比率的Cas9mRNA:SCsgRNA:ssDNA；1:1:3比率的Cas9 mRNA:sgRNA:SCssDNA；1:3比率的Cas9 mRNA:ssDNA(无sgRNA)；和1:1比率的Cas9 mRNA:sgRNA(无ssDNA)。然后将所有制剂施用给细胞。在转染后24小时，向细胞添加另外的1mL的DMEM。温育48小时后，如前所述，准备细胞用于通过流式细胞计量术进行分析(N＝3±标准差)。
HDR细胞毒性分析.将HEK293 B/GFP细胞以每孔1.5×105个细胞的密度在500μL含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中铺在12孔组织培养皿(CytoOne)中，并在37℃附着过夜。过夜温育后，根据生产商的方案，使用1:1:3比率的sgRNA:Cas9 mRNA:ssDNA制备Lipofectamine 2000和RNAiMAX脂复合物。然后将所有制剂施用给细胞。在转染后24小时，向细胞中添加另外的1mL的DMEM。温育48小时后，如前所述准备细胞用于通过流式细胞计量术进行分析。在准备流式细胞计量术期间，根据生产商的方案用Ghost Dye Red 780对细胞进行染色，并然后用PBS洗涤3次。使用流式细胞计量术评估细胞毒性(N＝3±标准差；使用单因素方差分析和Dunnett氏多重比较检验针对PBS进行统计分析)。
C.讨论
迄今为止体内编辑的进展在很大程度上限于通过被称为非同源末端连接(NHEJ)的易出错DNA修复机制进行的基因敲除。遗传性疾病和癌症突变的真正纠正将需要同源定向修复(HDR)，目前这种方案由于可以介导这种复杂DNA修复途径的载体的缺乏而受到阻碍。本公开内容通过报告一种非病毒全合一方案克服了这一挑战，其中使用基于树枝状聚合物的脂质纳米颗粒(dLNP)通过体外和体内同源性指导的修复(HDR)进行精确基因校正。
CRISPR为基因编辑提供了几个非常合乎需要的特性，包括序列依赖性的靶标特异性和非分裂细胞中的编辑持久性(Doudna等人,2014；Sander和Joung,2014；Wei等人,2020)。在理论上，这些属性允许通过单次治疗治愈许多遗传性疾病。迄今为止，大多数体内编辑工作利用NHEJ，其中插入和/或删除(插入缺失)可以发生在Cas9和单个引导RNA(sgRNA)诱导的DNA中的双链断裂(DSB)的位点处。插入缺失向靶位点中的引入通常导致突变，其随后使蛋白失去功能或被截短(Cong等人,2013；Ran等人,2013；Platt等人,2014；Sanchez-Rivera等人,2014；Knott和Doudna,2018)。在其中靶标敲除是有益的疾病中，NHEJ机制是非常有用的。但是，在大多数遗传性疾病和癌症应用中，需要对序列的HDR校正才能获得治疗益处(Wei等人,2020；Lin等人,2014；Glass等人,2018；Pickar-Oliver等人,2019；Yeh等人,2019；Anzalone等人,2020；Li等人,2020；Mitchell等人,2021)。此外，在许多遗传性疾病(其中突变的基因组序列编码部分活性的蛋白，但仍保留某些生产活性)中，NHEJ可能非常有害，因为它可以消除先前存在的活性。
相比之下，通过利用HDR，细胞可以准确地将感兴趣的突变基因序列校正为精确固定的序列。不是通过NHEJ在切割位点处形成插入缺失，而是当紧密靠近含有正确氨基酸序列的DNA链(两侧是与内源DNA重叠同源的5′和3′区域)时可以修复DSB(Lin等人,2014；Pickar-Oliver等人,2019；Pinder等人,2015；Song等人,2016；Gutschner等人,2016；Jasin和Haber,2016；Gallagher和Haber,2018；Aird等人,2018；Nambiar等人,2019)。为了利用这一修复过程，三个必需组分必须彼此协同工作：Cas9蛋白、sgRNA和单链DNA (ssDNA)模板。因此，HDR校正的要求远高于NHEJ基因敲除的要求，这限制了基因校正工作的进展。
由于递送这些多种货物的困难挑战，发现和工程设计递送系统是一个重要目标，但没有明显的解决方案(Wei等人,2020；Lin等人,2014；Glass等人,2018；Pickar-Oliver等人,2019；Yeh等人,2019；Anzalone等人,2020；Li等人,2020；Mitchell等人,2021)。虽然病毒载体对于基因递送有效，但它们在诱导HDR方面存在几个缺点，包括限制性包装限制、随机有害整合到基因组中的风险以及潜在的免疫应答(Chandler等人,2015；Chandler等人,2017)。在用于部署Cas酶的非病毒选项中，Cas9 mRNA的递送可能比直接大量递送Cas9蛋白产生更多的蛋白，并且可能比递送pDNA(其编码可能整合到宿主基因组中的Cas9)更安全(Wang等人,2017；Wei等人,2020；Li等人,2018；Xu等人,2019；Lattanzi等人,2019；Mout等人,2017；Liu等人,2017)。据信，尚未报道使用完全核酸介导的方案在体内实现HDR的非病毒递送系统。在本文中，报告了一种全合一非病毒的基于树枝状聚合物的脂质纳米颗粒(dLNP)系统(Zhou等人,2016；Zhang等人,2018a；Zhang等人,2018b；Cheng等人,2018；Zhou等人,2020；Cheng等人,2020；Wei等人,2020)，其能够在体内诱导HDR。
为了通过HDR实现突变基因序列的校正，必须克服某些具有挑战性的障碍(图1)。本文提出了一种全核酸CRISPR/Cas系统的方案，该系统由包封在dLNP中的Cas9 mRNA、sgRNA和供体ssDNA组成，以实现细胞质递送(Zelphati和Szoka,Jr.,1996；Harvie等人,1998；Hafez等人,2001；Sahay等人,2013；Gilleron等人,2013；Wittrup等人,2015；Li和Szoka,2007)。在Cas9 mRNA翻译后，形成核糖核蛋白复合物(RNP)(Jinek等人,2012；Wei等人,2019；Deltcheva等人,2011；Gasiunas等人,2012)，其由Cas9核酸酶和sgRNA组成，其已经被证明可以在核定位信号(NLS)驱动的核定位之前进一步结合ssDNA(Nguyen等人,2020)。RNP定位在基因组DNA中的靶序列，其中sgRNA将以反向平行互补方式结合在前间区序列邻近基序(PAM)序列的上游(Wei等人,2019；Mojica等人,2009)。一旦结合，Cas9核酸酶将切割基因组DNA，导致双链断裂(Wei等人,2019；Garneau等人,2010)，其中ssDNA HDR供体模板可以被复制并整合到基因组DNA中(图1)(Lin等人,2014；Wei等人,2019；Pinder等人,2015；Song等人,2016；Gutschner等人,2016；Aird等人,2018；Nambiar等人,2019)。由于这些障碍，使用了工程优化方案来鉴定可以克服这些挑战的制剂，并将HDR效率作为首要目标。采用可降解的、可电离的基于树枝状聚合物的脂质的库(Zhou等人,2016)，其能够在低pH带正电荷以在自组装过程中结合RNA，在中性pH不带电荷以减少毒性，并在成熟胞内体pH下再次带正电荷以促进胞内体释放。探索可电离的树枝状聚合物脂质来递送短的siRNA/miRNA(18-22个碱基对)(Zhou等人,2016；Zhang等人,2018a；Zhang等人,2018b；Zhou等人,2020)或长的信使RNA(>1000个核苷酸)(Cheng等人,2018；Cheng等人,2020)的先前工作已经揭示，新脂质设计的创建(Miller等人,2017；Miller等人,2018)和制剂重新工程改造(Cheng等人,2018；Cheng等人,2020)是开发载体以迎接新机遇的必要方案，但解决挑战的解决方案并不明显。实际上，已经证实，短RNA的最佳载体并不总是对长RNA有效(Wei等人,2020；Miller等人,2017；Li等人,2015；Kauffman等人,2015；Miller和Siegwart,2018；Ball等人,2018；Hajj等人,2019；Patel等人,2017；Hao等人,2015)。LNP工程方面的这样的努力尚未针对HDR介导的基因组校正。
在这里，特别关注三种组分(Cas9 mRNA、sgRNA和供体DNA)的共包封，这呈现出不同长度和化学组成的核酸的空前混合物。据推测，相对于短RNA，组合的核酸货物的整体物理性能将表现出与长RNA更相似的疏水和静电特征(Zhou等人,2016)。重点是改变在dLNP内的四种核心脂质组分(可电离的氨基树枝状聚合物脂质、两亲的磷脂、胆固醇、PEG2000-DMG)的摩尔比，这可以极大地改变它们的有效地递送短的(siRNA)至长的(mRNA)货物的能力(Cheng等人,2018)。最初的重点是对核酸类型具有最大灵活性的树枝状聚合物和制剂参数(38.5:30:30:1.5；树枝状聚合物:胆固醇:DOPE:PEG-DMG)(图2)。选择用于分析的树枝状聚合物筛选文库由四种不同的胺核心(3A3、3A5、4A1、4A3)和九种具有不同烷基链长度的末梢(SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12、SC14)组成，总共36种单独的树枝状聚合物脂质(图3A和3B)(Zhou等人,2016)。然后将每种树枝状聚合物与胆固醇、DOPE和PEG-DMG在乙醇中以优化的内部摩尔比混合，并在酸性水性缓冲液中与萤光素酶(Luc)mRNA快速混合以形成dLNP(表2)。
表2.各个组分的内部摩尔比和颗粒分解百分比以及树枝状聚合物脂质组分与核酸的固定摩尔比。
由于非病毒纳米颗粒可以表现出一定程度的细胞类型特异性(Yan等人,2016)，因此筛选了选定的树枝状聚合物化合物的库以确保有效递送(通过萤光素酶表达进行量化)以及对三种不同细胞系(HEK293T、HeLa和IGROV-1)的低毒性，以鉴定对多种细胞类型最具活性的制剂(图3C和3D)。此外，为了排除可能由于无效的核酸结合或在颗粒形成过程中的扭曲而导致的任何递送差异，分别使用Ribogreen测定和动态光散射(DLS)评估了RNA包封效率以及颗粒尺寸和均匀度。正如预期的那样，在dLNP大小方面没有观察到重大差异，因为大多数平均直径为约100nm；所有纳米颗粒都是均匀的(PDI<0.2)(图2E)；并且大多数dLNP在试验比率下有效包封了>92％的mRNA(图2F)。与关于不同dLNP的这些方面观察到的差异缺乏相反，在树枝状聚合物化合物之间在递送效力方面存在显著且令人惊讶的差异。为了最大限度地提高跨细胞系的HDR的目标，注意到含有具有4A1和4A3胺核心的树枝状聚合物的制剂的最高递送。在IGROV1和HEK293T细胞中观察到增加的烷基链长度依赖性。考虑到整个数据，4A3因其在所有三种细胞系中的活性(包括在HeLa细胞中的显著效力)而成为长核酸递送的主流胺核心。
为了进一步确定烷基链长度在递送效率和毒性中的作用，使用顶级胺核心候选物(4A3)和所有先前检查的烷基末梢(SC5-SC14)在相同的三种细胞系中进行剂量-应答测定(图4-6)。增加烷基链长度和递送效力之间出现了轻微的趋势。但是，随着烷基链长度增加，也观察到细胞毒性的一些轻微增加(图7)。考虑到这两个因素，得出的结论是，4A3-SC8dLNP表现出显著的递送效力和最小毒性的最佳平衡(图3)。
完成非病毒HDR介导的基因编辑需要合成的载体来递送大小差异非常大的核酸：Cas9 mRNA(约4500个核苷酸)、经修饰的sgRNA (约120个核苷酸)和ssDNA HDR模板(127个核苷酸)(图1)。Cas9 mRNA必须首先翻译成Cas9蛋白然后它才可以完成引导基因编辑，这一事实进一步加剧了这一挑战。为了使用优化的4A3-SC8 dLNP解决这些因素，对在蛋白表达方面的货物递送的动力学以及4A3-SC8 dLNP将多个核酸包封在单个纳米颗粒内的能力进行了系统分析。采用表达具有单个Y66H氨基酸突变(CAT替代TAC)的GFP序列的HEK293细胞来量化NHEJ和HDR事件(Richardson等人,2016)。有了这个突变的序列(CAT)，细胞就会发出蓝色荧光，而不是绿色；但是，当突变被校正为TAC时，细胞恢复正常的绿色荧光(图8)。因此，正确氨基酸序列向该位置中的插入会恢复GFP功能。如果在序列中存在插入缺失(指示NHEJ)，则细胞失去其荧光(图9A和9B)(Richardson等人,2016)。
对分阶段和同时递送方案进行对比，以鉴定最方便的且最有效的HDR校正方案。因为Cas9是以mRNA形式递送，考虑使用两个或三个单独的dLNP的分阶段递送可以通过允许mRNA翻译成蛋白所需的时间来帮助HDR。另一方面，在一个纳米颗粒中同时共同递送所有三种核酸将是更方便的且可转化为体内编辑。
首先，为了试验分阶段的双颗粒方案，将含有Cas9 mRNA的4A3-SC8dLNP施用给HEK293 B/GFP细胞，在24小时后，施用在单个纳米颗粒中含有经修饰的sgRNA和ssDNA HDR模板(按重量计或按摩尔计，1:1的固定比率)的4A3-SC8 dLNP(图10)。其次，为了试验三颗粒方案，每组dLNP仅包含以下中的一种：Cas9 mRNA、经修饰的sgRNA或ssDNA HDR模板。第三，试验了全合一同时dLNP递送的方案，其中单个dLNP制剂含有用于HDR的所有三种核酸组分(图11)。为了确认HDR所需的所有三种核酸(Cas9mRNA、sgRNA、ssDNA)被共同包封到单个dLNP制剂中，对核酸负载进行定量并验证包封(图12)。令人鼓舞的是，使用流式细胞计量术通过GFP信号评价，所有三种方案以约18％的相似效率实现了HDR(图10和图11)。尽管所有三种方案都是可行的，但此后的重点涉及全合一同时dLNP递送，因为与分阶段方案相比，它是最简便的并且效力不会降低。当考虑在体内完成非病毒HDR时，同时的一锅递送尤其有价值，因为它确保所有三种组分都将内化到单个靶细胞中，而不是仅一种或两种必要的组分。
在全合一纳米颗粒方案的基础上，通过优化在dLNP内的核酸的比率来寻求HDR基因校正的改进。产生4A3-SC8 dLNP的组，其中将Cas9 mRNA和sgRNA分别固定在按重量计1:1(图9C)、1:2(图9D)和2:1(图9E)的比率。然后，假设有更多的ssDNA HDR模板可用，细胞可以通过HDR实现更高量的校正，将ssDNA HDR模板以0.5、1、2、3、4、6、8和10的递增比率滴定到核酸混合物中(表1)。在所有试验组中，1:1:3和2:1:3mRNA:经修饰的sgRNA:ssDNA HDR模板的比率是最有效的，通过DNA测序量化，两者产生56％的相似HDR校正率。DNA测序被确立为用于检测基因编辑事件的主要分析技术，因为它在DNA中以单碱基分辨率对核酸修饰进行明确的定量，从而避免可能与荧光报告技术相关的任何偏差。令人感兴趣的是，当在HDRdLNP中包含的ssDNAHDR模板的比率是在3到4之间时，在所有组中实现的HDR的量(1:1、1:2和2:1)似乎达到了约50％ HDR的校正最大值。在Cas9 mRNA和sgRNA被固定在1:1和1:2的比率并且在每组中ssDNA的量分别被固定在3和4的比率的组中，诱导的HDR校正的量急剧减少。但是，在Cas9 mRNA和sgRNA被固定在2:1的比率的组中，随着ssDNA HDR模板的比率增加到超过3，实现的HDR的量有所下降，但并不像1:1和1:2组中那样大幅或急剧下降(图9E)。当分析在三个Cas9 mRNA:sgRNA固定组中实现的编辑的量和类型时，出现了共同趋势：总编辑效率、HDR和NHEJ逐渐增加，直到ssDNA比率为约4，其中编辑效率开始下降并且未编辑的细胞的数目开始增加。值得注意的是，在1:2和2:1组中ssDNA比率为4之后，所有形式的编辑似乎也更逐渐下降(图9F)，这是令人惊讶的。与之前的腺病毒(AAV)递送数据一致，这些结果指示，Cas9可能不是诱导高水平的HDR介导的校正的限制因素(Min等人,2019b)。相反，靠近切割位点的ssDNA模板的可用性可能对增加HDR更重要，其中最佳比率导致平衡所有三种组分(Cas9 mRNA、sgRNA、ssDNA)的总量的最高HDR。对于所有比率，测量HDR dLNP大小和多分散性，以鉴定HDR效率与这些特征中的任一种之间是否存在任何相关性。在制剂之间不存在显著差异，所有HDR dLNP表现出均匀性且平均直径为约150nm(图13)。
表格1.在HDR dLNP的每种制剂内的核酸的比率.
为了确认DNA测序的结果，还使用流式细胞计量术测量了HDR校正。在Cas9 mRNA和sgRNA被固定在1:1和1:2的比率的组中实现的HDR的量似乎在某种程度上独立于在dLNP中包含的ssDNA HDR模板的量，其中条件对HDR的诱导率为30-35％，这可能与B/GFP DNA向HEK细胞模型中的随机病毒整合有关，尽管还需要更多的工作来进一步研究这一点。当Cas9mRNA和经修饰的sgRNA被固定在2:1的比率时，随着ssDNA HDR模板增加，实现的HDR的量几乎呈线性增加。值得注意的是，尽管在1:1和1:2Cas9mRNA:sgRNA组中实现的HDR的量没有大差异，但许多制剂似乎达到了类似的渐近线，这反映了关于诱导的HDR的量在2:1Cas9mRNA:sgRNA组中实现的约36％ HDR的最大值(图14)。为了进一步确认氨基酸序列的校正并可视化4A3-SC8 dLNP诱导HDR的能力，给纳米颗粒以2:1:1的比率负载Cas9 mRNA、经修饰的sgRNA和ssDNA HDR模板，并使用共焦显微术对细胞成像(图9B)。如预期的，校正的细胞是丰富的并表达明亮的GFP信号，而在PBS对照中明显不存在这种信号。
凭借在体外实现高水平HDR的既定系统，接下来评价分别含有1:1:8、1:1:3或2:1:3Cas9 mRNA:sgRNA:ssDNA的核酸比率的4A3-SC8 dLNP在原理验证实验中诱导体内HDR的能力，以帮助未来可转化的疾病纠正。利用HEK293 B/GFP细胞和Matrigel的1:1混合物产生异种移植肿瘤，然后将其皮下注射到无胸腺裸Foxn1nu小鼠的右后腿中。一旦肿瘤达到25mm3大小，配制含有Cas9 mRNA、经修饰的sgRNA和ssDNA HDR模板的三种比率(1:1:8、1:1:3、2:1:3)之一的4A3-SC8 dLNP，并以0.5mg/kg总核酸的剂量进行肿瘤内注射。5天后，切除肿瘤以及内脏器官并使用IVIS对GFP信号进行成像(图15A)。与在PBS对照中没有可检测的GFP信号相比，亮绿色GFP信号(指示通过HDR进行的基因校正)在用含有HDR机制的4A3-SC8 dLNP处理的肿瘤中是显而易见的(图15B和15C)。除了IVIS成像之外，还使用共焦显微术对肿瘤进行切片和成像。如预期的，肿瘤再次表现出明亮的GFP信号，表明已经实现了HDR(图15D)。
通过视觉确认HDR已经在体内完成，通过DNA测序进一步分析肿瘤，以在单个核苷酸水平准确量化整个肿瘤的HDR校正。据推测，从整个肿瘤组织中提取DNA能够以公正的方式准确地反映总体编辑。此外，由于HEK293(Y66H)细胞是通过慢病毒转导而产生，因此突变的GFP报告序列的拷贝数和插入位点在细胞之间可能有所不同。因此，DNA测序可以通过量化细胞中突变GFP序列的所有拷贝来消除这些变量。从肿瘤中提取的基因组DNA的DNA测序揭示，在使用TIDER(跟踪插入、缺失和重组事件)评估基因编辑后进行分析后，在使用2:1:3HDR dLNPS治疗的组中HDR编辑高达23％(图15E)。据信，体内HDR校正率迄今为止限于1-5％，在某些情况下需要病毒和非病毒递送或重复局部注射的组合(Jo等人,2019；Yin等人,2014；Yin等人,2016；Lee等人,2017)。此处显示，HDR dLNP以0.5mg/kg的剂量向肿瘤中的单次注射产生>20％ HDR介导的基因校正。此外，dLNP能够克服肿瘤的无血管性、大尺寸和硬度，从而在体内介导HDR。
表3.上面报告了每个重复中与体外HDR百分比相关的p值(通过DNA sanger测序的TIDER分析确定)(N＝3).
表4.上面报告了每个重复中与体内HDR百分比相关的p值(通过DNA sanger测序的TIDER分析确定)(在所有情况下，N＝4，但1:1:3除外，其中N＝3).
总之，已经开发出一种一锅式非病毒递送平台，其能够诱导HDR介导的体内单个氨基酸突变的校正。这些结果提高了对非病毒基因编辑在实现HDR所需组分方面的基本理解，并为以高周转率实现在细胞和组织中存在的众多遗传性疾病的基因编辑和校正奠定了基础。随着进一步的进展，非病毒全合一纳米颗粒可能为患有许多致残性遗传性疾病和癌症的人提供治疗选择。
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根据本公开内容，可以在不进行过多实验的情况下制备和执行本文公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管已经以某些实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员显而易见，可以将变化应用于组合物和方法以及本文所述的方法的步骤或步骤的顺序中，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见，可以用在化学上和生理学上均相关的某些药剂替代本文所述的药剂，并实现相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似的替代和修改均被认为落入由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
尽管在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将会明白，这样的实施方案仅作为示例提供。本发明无意受限于在说明书内提供的具体实施例。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但本文实施方案的描述和例证无意以限制性含义进行解释。现在本领域技术人员将做出众多变体、变化和置换而不脱离本发明。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体叙述、构型或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，本文描述的发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。因此，考虑本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等效物。以下权利要求意图限定本发明的范围，并且由此覆盖在这些权利要求和它们的等同方案的范围内的方法和结构。
序列表
<110> 德克萨斯大学系统董事会
<120> 能够实现精确的HDR介导的体内基因编辑的基于树枝状聚合物的全合一脂质纳米颗粒
<130> UTFD.P3907WO
<140> 未指定
<141> 2022-04-22
<150> US 63/178,453
<151> 2021-04-22
<160> 13
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 1
gctgaagcac tgcacgccat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 2
cagcatctta tctgagtgga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 3
atggcgtgca gtgcttcagc 20
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 4
taatacgact cactataggg gctgaagcac tgcacgccat gttttagagc tagaaatagc 60
<210> 5
<211> 4245
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<220>
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gagguggccu accacgagaa guaccccacc aucuaccacc ugcggaagaa gcugguggac 480
agcaccgaca aggccgaccu gcggcugauc uaccuggccc uggcccacau gaucaaguuc 540
cggggccacu uccugaucga gggcgaccug aaccccgaca acagcgacgu ggacaagcug 600
uucauccagc uggugcagac cuacaaccag cuguucgagg agaaccccau caacgccagc 660
ggcguggacg ccaaggccau ccugagcgcc cggcugagca agagccggcg gcuggagaac 720
cugaucgccc agcugcccgg cgagaagaag aacggccugu ucggcaaccu gaucgcccug 780
agccugggcc ugacccccaa cuucaagagc aacuucgacc uggccgagga cgccaagcug 840
cagcugagca aggacaccua cgacgacgac cuggacaacc ugcuggccca gaucggcgac 900
caguacgccg accuguuccu ggccgccaag aaccugagcg acgccauccu gcugagcgac 960
auccugcggg ugaacaccga gaucaccaag gccccccuga gcgccagcau gaucaagcgg 1020
uacgacgagc accaccagga ccugacccug cugaaggccc uggugcggca gcagcugccc 1080
gagaaguaca aggagaucuu cuucgaccag agcaagaacg gcuacgccgg cuacaucgac 1140
ggcggcgcca gccaggagga guucuacaag uucaucaagc ccauccugga gaagauggac 1200
ggcaccgagg agcugcuggu gaagcugaac cgggaggacc ugcugcggaa gcagcggacc 1260
uucgacaacg gcagcauccc ccaccagauc caccugggcg agcugcacgc cauccugcgg 1320
cggcaggagg acuucuaccc cuuccugaag gacaaccggg agaagaucga gaagauccug 1380
accuuccgga uccccuacua cgugggcccc cuggcccggg gcaacagccg guucgccugg 1440
augacccgga agagcgagga gaccaucacc cccuggaacu ucgaggaggu gguggacaag 1500
ggcgccagcg cccagagcuu caucgagcgg augaccaacu ucgacaagaa ccugcccaac 1560
gagaaggugc ugcccaagca cagccugcug uacgaguacu ucaccgugua caacgagcug 1620
accaagguga aguacgugac cgagggcaug cggaagcccg ccuuccugag cggcgagcag 1680
aagaaggcca ucguggaccu gcuguucaag accaaccgga aggugaccgu gaagcagcug 1740
aaggaggacu acuucaagaa gaucgagugc uucgacagcg uggagaucag cggcguggag 1800
gaccgguuca acgccagccu gggcaccuac cacgaccugc ugaagaucau caaggacaag 1860
gacuuccugg acaacgagga gaacgaggac auccuggagg acaucgugcu gacccugacc 1920
cuguucgagg accgggagau gaucgaggag cggcugaaga ccuacgccca ccuguucgac 1980
gacaagguga ugaagcagcu gaagcggcgg cgguacaccg gcuggggccg gcugagccgg 2040
aagcugauca acggcauccg ggacaagcag agcggcaaga ccauccugga cuuccugaag 2100
agcgacggcu ucgccaaccg gaacuucaug cagcugaucc acgacgacag ccugaccuuc 2160
aaggaggaca uccagaaggc ccaggugagc ggccagggcg acagccugca cgagcacauc 2220
gccaaccugg ccggcagccc cgccaucaag aagggcaucc ugcagaccgu gaagguggug 2280
gacgagcugg ugaaggugau gggccggcac aagcccgaga acaucgugau cgagauggcc 2340
cgggagaacc agaccaccca gaagggccag aagaacagcc gggagcggau gaagcggauc 2400
gaggagggca ucaaggagcu gggcagccag auccugaagg agcaccccgu ggagaacacc 2460
cagcugcaga acgagaagcu guaccuguac uaccugcaga acggccggga cauguacgug 2520
gaccaggagc uggacaucaa ccggcugagc gacuacgacg uggaccacau cgugccccag 2580
agcuuccuga aggacgacag caucgacaac aaggugcuga cccggagcga caagaaccgg 2640
ggcaagagcg acaacgugcc cagcgaggag guggugaaga agaugaagaa cuacuggcgg 2700
cagcugcuga acgccaagcu gaucacccag cggaaguucg acaaccugac caaggccgag 2760
cggggcggcc ugagcgagcu ggacaaggcc ggcuucauca agcggcagcu gguggagacc 2820
cggcagauca ccaagcacgu ggcccagauc cuggacagcc ggaugaacac caaguacgac 2880
gagaacgaca agcugauccg ggaggugaag gugaucaccc ugaagagcaa gcuggugagc 2940
gacuuccgga aggacuucca guucuacaag gugcgggaga ucaacaacua ccaccacgcc 3000
cacgacgccu accugaacgc cguggugggc accgcccuga ucaagaagua ccccaagcug 3060
gagagcgagu ucguguacgg cgacuacaag guguacgacg ugcggaagau gaucgccaag 3120
agcgagcagg agaucggcaa ggccaccgcc aaguacuucu ucuacagcaa caucaugaac 3180
uucuucaaga ccgagaucac ccuggccaac ggcgagaucc ggaagcggcc ccugaucgag 3240
accaacggcg agaccggcga gaucgugugg gacaagggcc gggacuucgc caccgugcgg 3300
aaggugcuga gcaugcccca ggugaacauc gugaagaaga ccgaggugca gaccggcggc 3360
uucagcaagg agagcauccu gcccaagcgg aacagcgaca agcugaucgc ccggaagaag 3420
gacugggacc ccaagaagua cggcggcuuc gacagcccca ccguggccua cagcgugcug 3480
gugguggcca agguggagaa gggcaagagc aagaagcuga agagcgugaa ggagcugcug 3540
ggcaucacca ucauggagcg gagcagcuuc gagaagaacc ccaucgacuu ccuggaggcc 3600
aagggcuaca aggaggugaa gaaggaccug aucaucaagc ugcccaagua cagccuguuc 3660
gagcuggaga acggccggaa gcggaugcug gccagcgccg gcgagcugca gaagggcaac 3720
gagcuggccc ugcccagcaa guacgugaac uuccuguacc uggccagcca cuacgagaag 3780
cugaagggca gccccgagga caacgagcag aagcagcugu ucguggagca gcacaagcac 3840
uaccuggacg agaucaucga gcagaucagc gaguucagca agcgggugau ccuggccgac 3900
gccaaccugg acaaggugcu gagcgccuac aacaagcacc gggacaagcc cauccgggag 3960
caggccgaga acaucaucca ccuguucacc cugaccaacc ugggcgcccc cgccgccuuc 4020
aaguacuucg acaccaccau cgaccggaag cgguacacca gcaccaagga ggugcuggac 4080
gccacccuga uccaccagag caucaccggc cuguacgaga cccggaucga ccugagccag 4140
cugggcggcg acagcggcgg caagcggccc gccgccacca agaaggccgg ccaggccaag 4200
aagaagaagg gcagcuaccc cuacgacgug cccgacuacg ccuga 4245
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 6
ccaggcctct gattcctcac tgattgctct taggtctggc ccctcctcag catcttatcc 60
gcgttgaagg aaatttgcgt gtggagtatt tggatgacag aaacactttt cggcatagtg 120
<210> 7
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的核酸
<400> 7
gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 60
tggcccaccc tcgtgaccac cctgacgtac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 120
cacatga 127
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 8
agctggctag gtaagcttgg 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 9
tgggtggaga ctgaagttag gc 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 10
cttgtacagc tcgtccatgc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 11
gggtgctcag gtagtggtt 19
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 12
ccctgacgta cggcgtg 17
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 13
cacgccgtac gtcaggg 17

Claims (139)

1.一种组合物，其包含与基因或转录物编辑组合物一起组装的脂质组合物(例如，纳米颗粒)，其中：
(A)所述基因或转录物编辑组合物包含下述核酸(1)-(3)中的一种或多种：
(1)包含编码多核苷酸引导的核酸酶的序列的多核苷酸；
(2)引导多核苷酸(例如，被构造成与靶基因或转录物的至少一部分形成复合物，或包含编码所述引导多核苷酸的序列的多核苷酸)；和
(3)供体多核苷酸(例如，被构造成修复经修饰的靶基因或转录物)，且
(B)所述脂质组合物包含至少一种可电离脂质。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述基因或转录物编辑组合物包含核酸(1)-(3)中的两种或更多种。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述基因或转录物编辑组合物至少包含核酸(1)和(2)。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述基因或转录物编辑组合物包含所有三种核酸(1)-(3)。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的组合物，其中，当与所述脂质组合物一起组装时，所述核酸(1)-(3)中的一种或多种各自被包封在所述脂质组合物内。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的组合物，其中所述组合物能够修饰细胞中的靶基因或转录物。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的组合物，其中所述组合物能够校正在细胞的基因组中的错误(在靶基因中)。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述细胞的基因组不编码野生型基因。
9.根据权利要求6-8中的任一项所述的组合物，其中所述细胞表现出或被确定表现出靶基因或转录物的异常表达或活性。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸引导的核酸酶是成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-相关的(Cas)核酸酶。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的组合物，其中(1)的所述多核苷酸包含从约250个核苷酸至约15,000个核苷酸。
12.根据权利要求1-10中的任一项所述的组合物，其中(1)的所述多核苷酸包含从约500个核苷酸至约5,000个核苷酸。
13.根据权利要求1-10中的任一项所述的组合物，其中(1)的所述多核苷酸包含从约800个核苷酸至约2,500个核苷酸。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的组合物，其中(1)的所述多核苷酸是信使核糖核酸(mRNA)。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述mRNA编码Cas(例如，Cas9)蛋白。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的组合物，其中(2)的所述引导多核苷酸是核糖核酸(RNA)(例如，单个引导RNA)。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的组合物，其中(2)的所述引导多核苷酸包含从约25个核苷酸至约500个核苷酸。
18.根据权利要求1-16中的任一项所述的组合物，其中(2)的所述引导多核苷酸包含从约50个核苷酸至约300个核苷酸。
19.根据权利要求1-16中的任一项所述的组合物，其中(2)的所述引导多核苷酸包含从约80个核苷酸至约200个核苷酸。
20.根据权利要求1-19中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)(例如，单链DNA)。
21.根据权利要求1-20中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸包含从约25个核苷酸至约2,500个核苷酸。
22.根据权利要求1-20中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸包含从约25个核苷酸至约500个核苷酸。
23.根据权利要求1-20中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸包含从约50个核苷酸至约300个核苷酸。
24.根据权利要求1-20中的任一项所述的组合物，其中(3)的供体多核苷酸包含从约80个核苷酸至约200个核苷酸。
25.根据权利要求1-24中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸包含与所述靶基因或转录物的至少一部分(例如，细胞的基因组的一部分)具有不超过5、4、3或2个错配的供体模板序列。
26.根据权利要求1-24中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸包含与所述靶基因或转录物的至少一部分(例如，细胞的基因组的一部分)具有不超过3或2个错配的供体模板序列。
27.根据权利要求1-26中的任一项所述的组合物，其中所述DNA含有相对于细胞的基因组的修饰。
28.根据权利要求1-27中的任一项所述的组合物，其中(3)的供体多核苷酸包含与所述靶基因或转录物的至少一部分(例如，细胞的基因组的一部分)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％互补性或同一性的供体模板序列。
29.根据权利要求1-28中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸包含与所述靶基因或转录物的至少一部分(例如，细胞的基因组的一部分)互补或相同的供体模板序列。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述供体多核苷酸编码野生型基因。
31.根据权利要求1-30中的任一项所述的组合物，其中(3)的所述供体多核苷酸被构造成校正细胞的基因组中的错误。
32.根据权利要求1-31中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含的所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述引导多核苷酸的重量比为从约10:1至约1:5。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述引导多核苷酸的重量比是从约5:1至约1:3。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述引导多核苷酸的重量比是从约3:1至约1:2。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述引导多核苷酸的重量比是2:1、1:1或1:2。
36.根据权利要求1-35中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含的所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述供体多核苷酸的重量比为约2:1至约1:20。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述供体多核苷酸的重量比是从约1:1至约1:10。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述供体多核苷酸的重量比是从约1:2至约1:8。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述编码核酸酶的多核苷酸(例如，mRNA)与所述供体多核苷酸的重量比是1:3或1:4。
40.根据权利要求1-39中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含的所述引导多核苷酸与所述供体多核苷酸的重量比为从约4:1至约1:10。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述引导多核苷酸与所述供体多核苷酸的重量比是从约2:1至约1:8。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述引导多核苷酸与所述供体多核苷酸的重量比是从约1:1至约1:4。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述引导多核苷酸与所述供体多核苷酸的重量比是2:3或1:2。
44.根据权利要求1-43中的任一项所述的组合物，其中所述可电离脂质是阳离子脂质。
45.根据权利要求1-44中的任一项所述的组合物，其中所述可电离脂质是树枝状大分子或树枝状聚合物。
46.根据权利要求1-45中的任一项所述的组合物，其中所述可电离脂质是下式的化合物：
核心-重复单元-封端基团(D-I)
其中通过从所述核心除去一个或多个氢原子并用所述重复单元替换所述原子，将所述核心连接至所述重复单元，并且其中：
所述核心具有式：
其中：
X1是氨基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、杂环烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
a是1、2、3、4、5或6；或
所述核心具有式：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢、烷基(C≤18)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3；或
所述核心具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或
所述核心是烷基胺(C≤18)、二烷基胺(C≤36)、杂环烷烃(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基基团具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-、-S-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
Y3是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
Y5是共价键、烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
R9是烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷二基(C≤12)、烯烃二基(C≤12)、芳烃二基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；且
其中当所述重复单元包含接头基团时，如果n大于1，则所述接头基团包含连接至所述接头基团的氮和硫原子二者的独立的可降解的二酰基基团，其中所述重复单元中的第一基团是可降解的二酰基基团，其中对于每个接头基团，下一个重复单元包含连接至所述接头基团的氮原子的两个可降解的二酰基基团；且其中n是在所述重复单元中存在的接头基团的数目；且
所述封端基团具有式：
其中：
Y4是烷二基(C≤24)、烷二基(C≤24)或其取代形式；
R10是氢、氨基、羧基、羟基或
芳基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、N-杂环烷基(C≤12)、-C(O)N(R11)-烷二基(C≤6)-杂环烷基(C≤12)、-C(O)-烷基氨基(C≤12)、-C(O)-二烷基氨基(C≤12)、-C(O)-N-杂环烷基(C≤12)，其中：
R11是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
其中所述链中的最终的可降解的二酰基连接至封端基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中，在式(D-I)中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢或烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤18)；且
y是0、1或2，前提条件是，y和z的总和是3；
R2是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；且
z是1、2、3；前提条件是，z和y的总和是3。
48.根据权利要求46或47所述的组合物，其中，在式(D-I)中，所述核心进一步被定义为：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)、-O-或烷基氨基二基(C≤8)、烷氧基二基(C≤8)、芳烃二基(C≤8)、杂芳烃二基(C≤8)、杂环烷二基(C≤8)或这些基团中的任一个的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基或烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)或这些基团中的任一个的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；前提条件是，e和f的总和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。
49.根据权利要求46-48中的任一项所述的组合物，其中，在式(D-I)中，所述核心进一步被定义为：
50.根据权利要求46-49中的任一项所述的组合物，其中，在式(D-I)中，所述核心进一步被定义为：
51.根据权利要求46-50中的任一项所述的组合物，其中，在式(D-I)中，所述核心进一步被定义为：
52.根据权利要求46-51中的任一项所述的组合物，其中A1和A2是O。
53.根据权利要求46-52中的任一项所述的组合物，其中Y3是烷二基(C≤12)或被取代的烷二基(C≤12)。
54.根据权利要求46-53中的任一项所述的组合物，其中Y1是烷二基(C≤12)或被取代的烷二基(C≤12)。
55.根据权利要求46-54中的任一项所述的组合物，其中所述封端基团进一步被定义为：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)或烯烃二基(C≤18)；且
R10是氢。
56.根据权利要求46-55中的任一项所述的组合物，其中所述封端基团进一步被定义为：
其中：
Y4是烷二基(C≤18)；且
R10是氢。
57.根据权利要求46-56中的任一项所述的组合物，其中所述树枝状聚合物或树枝状大分子进一步被定义为：
其中：
R′是烷基(C≤18)、烯基(C≤18)或其取代形式。
58.根据权利要求46-57中的任一项所述的组合物，其中所述树枝状聚合物或树枝状大分子进一步被定义为：
其中：
R′是烷基(C≤18)、烯基(C≤18)或其取代形式。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述树枝状聚合物或树枝状大分子进一步被定义为：
其中：
R′是烷基(C6-18)。
60.根据权利要求1-45中的任一项所述的组合物，其中所述可电离的阳离子脂质是具有以下结构式的代数(g)的树枝状聚合物或树枝状大分子：
，
或其药学上可接受的盐，其中：
(a)所述核心包含结构式(X核心)：
其中：
Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b-；
R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f；
R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6，诸如C1-C3)烷基；
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点、氢或任选地被取代的(例如，C1-C12)烷基；
L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、(例如，C1-C12，诸如C1-C6或C1-C3)亚烷基、(例如，C1-C12，诸如C1-C8或C1-C6)亚杂烷基(例如，C2-C8亚烷基氧化物，诸如寡(亚乙基氧化物))、[(例如，C1-C6)亚烷基]-[(例如，C4-C6)杂环烷基]-[(例如，C1-C6)亚烷基]、[(例如，C1-C6)亚烷基]-(亚芳基)-[(例如，C1-C6)亚烷基](例如，[(例如，C1-C6)亚烷基]-亚苯基-[(例如，C1-C6)亚烷基])、(例如，C4-C6)杂环烷基和亚芳基(例如，亚苯基)；或，
可替换地，L1的部分与R1c和R1d之一形成(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，含有1或2个氮原子，以及任选的，选自氧和硫的另外杂原子)；且
x1是0、1、2、3、4、5或6；且
(b)所述多个(N个)分支中的每个分支独立地包含结构式(X分支)：
其中：
*指示所述分支与所述核心的连接点；
g是1、2、3或4；
Z＝2(g-1)；
当g＝1时，G＝0；或当g≠1时，
(c)每个二酰基基团独立地包含结构式其中：
*指示所述二酰基基团在其近侧端部处的连接点；
**指示所述二酰基基团在其远侧端部处的连接点；
Y3在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；
A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-，其中：
R4是氢或任选地被取代的(例如，C1-C6)烷基；
m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3；且
R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选地被取代的(例如，C1-C8)烷基；且
(d)每个接头基团独立地包含结构式
其中：
**指示所述接头与近侧二酰基基团的连接点；
***指示所述接头与远侧二酰基基团的连接点；且
Y1在每次出现时独立地是任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选地被取代的(例如，C1-C12)亚烯基或任选地被取代的(例如，C1-C12)亚芳烃基；且
(e)每个封端基团独立地选自任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烷基硫醇和任选地被取代的(例如，C1-C18，诸如C4-C18)烯基硫醇。
61.权利要求60所述的组合物，其中x1是0、1、2或3。
62.权利要求60或61所述的组合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点(例如，如*所指示)、氢或C1-C12烷基(例如，C1-C8烷基，诸如C1-C6烷基或C1-C3烷基)，其中所述烷基部分任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自-OH、C4-C8(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，哌啶基(例如， )、N-(C1-C3烷基)-哌啶基(例如，/>)、哌嗪基(例如，/>)、N-(C1-C3烷基)-哌嗪二基(piperadizinyl)(例如，/>)、吗啉基(例如，/>)、N-吡咯烷基(例如，)、吡咯烷基(例如，/>)或N-(C1-C3烷基)-吡咯烷基(例如，/>))、(例如，C6-C10)芳基和C3-C5杂芳基(例如，咪唑基(例如，/>)或吡啶基(例如，/>))。
63.权利要求62所述的组合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在的话)在每次出现时各自独立地是与分支的连接点(例如，如*所指示)、氢或C1-C12烷基(例如，C1-C8烷基，诸如C1-C6烷基或C1-C3烷基)，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。
64.权利要求60-63中的任一项所述的组合物，其中R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢。
65.权利要求60-64中的任一项所述的组合物，其中所述多个(N个)分支包含至少3(例如，至少4或至少5)个分支。
66.权利要求60-65中的任一项所述的组合物，其中g＝1；G＝0；且Z＝1。
67.权利要求66所述的组合物，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式
68.权利要求60-65中的任一项所述的组合物，其中g＝2；G＝1；且Z＝2。
69.权利要求68所述的组合物，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式
70.权利要求60-69中的任一项所述的组合物，其中所述核心包含结构式:
71.权利要求70所述的组合物，其中所述核心包含结构式:(例如，/> )。
72.权利要求60-71中的任一项所述的组合物，其中所述核心包含选自由以下组成的组的结构式： 及其药学上可接受的盐，其中*指示所述核心与所述多个分支中的分支的连接点。
73.权利要求60-71中的任一项所述的组合物，其中所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的分支的连接点或H，其中至少2(例如，至少3或至少4)个分支连接至所述核心。
74.权利要求60-71中的任一项所述的组合物，其中所述核心具有结构其中*指示所述核心与所述多个分支中的分支的连接点或H，其中至少4(例如，至少5或至少6)个分支连接至所述核心。
75.权利要求60-74中的任一项所述的组合物，其中A1是-O-或-NH-。
76.权利要求60-75中的任一项所述的组合物，其中A2是-O-或-NH-。
77.权利要求60-76中的任一项所述的组合物，其中Y3是C1-C12(例如，C1-C6，诸如C1-C3)亚烷基。
78.权利要求60-77中的任一项所述的组合物，其中所述二酰基基团在每次出现时独立地包含结构式(例如，/>诸如)、任选地其中R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或C1-C3烷基。
79.权利要求60-78中的任一项所述的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
80.权利要求60-79中的任一项所述的组合物，其中每个封端基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
81.根据权利要求1-80中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含从约15至约60的所述可电离脂质相对于所述总脂质组合物的摩尔比。
82.根据权利要求81所述的组合物，其中所述摩尔比是从约25至约50的所述可电离脂质相对于所述总脂质组合物。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述摩尔比是从约30至约45的所述可电离脂质相对于所述总脂质组合物。
84.根据权利要求1-83中的任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含磷脂。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中所述磷脂包含一个或两个长链烷基或烯基基团、甘油或鞘氨醇、一个或两个磷酸酯基团和小有机分子，其中所述小有机分子是氨基酸、糖或氨基取代的烷氧基基团。
86.根据权利要求84或85所述的组合物，其中所述磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
87.根据权利要求84-86中的任一项所述的组合物，其中所述磷脂是DOPE。
88.根据权利要求1-87中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含从约5至约50的所述磷脂相对于所述总脂质组合物的摩尔比。
89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述摩尔比是从约10至约45的所述磷脂相对于所述总脂质组合物。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中所述摩尔比是从约20至约40的所述磷脂相对于所述总脂质组合物。
91.根据权利要求1-90中的任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含类固醇。
92.根据权利要求91所述的组合物，其中所述类固醇是胆固醇。
93.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述组合物包含从约10至约60的所述类固醇相对于所述总脂质组合物的摩尔比。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述摩尔比是从约15至约50的所述类固醇相对于所述总脂质组合物。
95.根据权利要求94所述的组合物，其中所述摩尔比是从约25至约50的所述类固醇相对于所述总脂质组合物。
96.根据权利要求1-95中的任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含聚合物缀合的(例如，聚乙二醇化的)脂质。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述聚合物缀合的脂质包含从约1000至约10,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)组分。
98.根据权利要求96或97所述的组合物，其中所述聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的二酰基甘油。
99.根据权利要求98所述的组合物，其中所述聚合物缀合的脂质进一步由下式定义：
其中：
R12和R13各自独立地是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这些基团中的任一个的取代形式；
Re是氢、烷基(C≤8)或被取代的烷基(C≤8)；且
x是1-250。
100.根据权利要求1-97中的任一项所述的组合物，其中所述聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的二肉豆蔻酰基-sn-甘油或下式的化合物：
其中：
n1是5-250；且
n2和n3各自独立地是2-25。
101.根据权利要求1-100中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含从约0.25至约12.5的所述聚合物缀合的脂质相对于所述总脂质组合物的摩尔比。
102.根据权利要求101所述的组合物，其中所述摩尔比是从约0.5至约10的所述聚合物缀合的脂质相对于所述总脂质组合物。
103.根据权利要求102所述的组合物，其中所述摩尔比是从约1至约6的所述聚合物缀合的脂质相对于所述总脂质组合物。
104.根据权利要求1-103中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含从约1,000:1至约5,000:1的脂质组分与核酸组分的摩尔比。
105.根据权利要求104所述的组合物，其中所述组合物包含从约2,000:1至约4,000:1的脂质组分与核酸组分的摩尔比。
106.根据权利要求105所述的组合物，其中所述组合物包含约2,500:1的脂质组分与核酸组分的摩尔比。
107.根据权利要求1-106中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含4AC3-SC8、胆固醇、DOPE和DMG-PEG2000。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中所述组合物包含从约38.5:30:30:1.5的4AC3-SC8:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000的摩尔比。
109.根据权利要求1-108中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含从约1:1至约20:1的N:P比率。
110.根据权利要求109所述的组合物，其中所述N:P比率是从约2:1至约10:1。
111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述N:P比率是从约4:1至约8:1。
112.一种药物组合物，其包含：
(A)根据权利要求1-111中的任一项所述的组合物；和
(B)药学上可接受的载体。
113.权利要求112所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为单位剂量。
114.权利要求112或113所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于全身施用。
115.权利要求112或113所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于局部(例如，注射)。
116.权利要求112或113所述的药物组合物，被配制用于如下施用：口服地、脂肪内地、动脉内地、关节内地、颅内地、真皮内地、病灶内地、肌肉内地、鼻内地、眼内地、心包内地、腹膜内地、胸膜内地、前列腺内地、直肠内地、鞘内地、气管内地、肿瘤内地、脐带内地、阴道内地、静脉内地、囊内地、玻璃体内地、以脂质体形式、局部地(locally)、粘膜地、胃肠外地、直肠地、结膜下的、皮下地、舌下地、经皮地(topically)、经颊地、透皮地、阴道地、以乳膏(crèmes)形式、以脂质组合物形式、经由导管，经由灌洗，经由连续输注，经由输注，经由吸入，经由注射，经由局部递送、或经由局部灌注。
117.根据权利要求1-116中的任一项所述的组合物，其用于在同源性指导的修复中的用途。
118.根据权利要求117所述的用途的组合物，其中所述用途包括使细胞与有效量的根据权利要求1-116中的任一项所述的组合物接触。
119.根据权利要求117所述的用途的组合物，其中所述用途包括使多个细胞与有效量的根据权利要求1-116中的任一项所述的组合物接触。
120.根据权利要求119所述的用途的组合物，其中所述接触在至少10％的所述多个细胞中提供修饰的基因或转录物谱。
121.根据权利要求118-120中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触是在体外。
122.根据权利要求118-120中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触是离体的。
123.根据权利要求118-120中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触是在体内。
124.根据权利要求118-120中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触包括向包含所述细胞或所述多个细胞的受试者施用有效量的所述组合物。
125.根据权利要求118-124中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触在所述细胞或所述多个细胞中提供至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％的同源性指导的修复(HDR)率。
126.根据权利要求118-124中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触在所述细胞或所述多个细胞中提供至少20％、25％、30％或35％的同源性指导的修复(HDR)率。
127.根据权利要求118-125中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触在所述细胞或所述多个细胞中提供不超过10％、5％、2％或1％的脱靶或/和缺失(插入缺失)率。
128.根据权利要求118-125中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触在所述细胞或所述多个细胞中提供至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的在靶修复率。
129.根据权利要求118-128中的任一项所述的用途的组合物，其中所述接触在所述细胞或所述多个细胞中提供至少30％、35％、40％、45％或50％的在靶修复率。
130.一种用于修复细胞中的靶基因或转录物的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求1-129中的任一项所述的组合物接触。
131.一种对细胞的基因组进行同源性指导的修复(HDR)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求1-129中的任一项所述的组合物接触。
132.权利要求130或131所述的方法，其中所述接触包括接触包含所述细胞的多个细胞。
133.权利要求130-132中的任一项所述的方法，其中所述接触包括向包含所述细胞的受试者施用所述组合物。
134.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-129中的任一项所述的组合物。
135.权利要求134所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病或病症。
136.权利要求134所述的方法，其中所述疾病或病症与所述受试者中靶基因或转录物的异常表达或活性相关。
137.根据权利要求134-136中的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含向所述受试者施用第二种疗法。
138.根据权利要求134-137中的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含向所述受试者施用所述组合物一次。
139.根据权利要求134-137中的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含向所述受试者施用所述组合物两次或更多次。
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