CN117321203A - 多核苷酸组合物、相关配制品及其使用方法 - Google Patents

多核苷酸组合物、相关配制品及其使用方法 Download PDF

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CN117321203A CN202280035684.1A CN202280035684A CN117321203A CN 117321203 A CN117321203 A CN 117321203A CN 202280035684 A CN202280035684 A CN 202280035684A CN 117321203 A CN117321203 A CN 117321203A
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M·亨尼格
D·石丸
D·J·洛克哈特
M·托里斯
J·伊比
D·博迪克
B·乌斯特曼
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Abstract

本发明公开了一种或多种多核苷酸的组合物、其药物组合物及其使用方法。多核苷酸可以编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)或其功能片段。所述多核苷酸可以与脂质组合物组装，以用于靶向递送至受试者的细胞或器官，如肺细胞或肺。本发明提供了用于增强CFTR蛋白在细胞中的表达或活性的方法。本发明还提供了用于治疗患有或怀疑患有CFTR相关病症的受试者的方法。

Description

多核苷酸组合物、相关配制品及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月23日提交的美国临时申请号63/164,573、2021年6月9日提交的美国临时申请63/208,966和2021年11月2日提交的美国临时申请号63/274,912的权益，将其各自出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
背景技术
核酸(如一种或多种信使核糖核酸(mRNA))可以被细胞用来表达蛋白质和多肽。一些细胞可能缺乏某种蛋白质或核酸而导致疾病状态。细胞也可以摄取和翻译一种或多种外源性核糖核酸(RNA)，但许多因素影响其摄取和翻译的效率。例如，免疫系统将许多外源性RNA识别为外来物，并引发旨在使RNA失活的应答。
发明内容
这里提供了用于递送核酸的组合物和方法。核酸可以用作治疗剂。特别地，mRNA可以被递送至受试者细胞中。在将核酸递送至细胞中之后，核酸可用于合成多肽。在患有疾病或障碍的细胞或受试者的情况下，核酸可以通过增加多肽的表达而有效地发挥治疗剂的作用。在障碍或疾病由多肽的异常表达或活性引起或与之相关的情况下，多肽表达的增加可能是有益的。然而，细胞可能有限地摄取外源核酸，并且核酸的递送可能受益于允许核酸的摄取增加的组合物。
此外，治疗剂可能受益于器官特异性递送。许多不同类型的化合物(如化学治疗剂)都表现出显著的细胞毒性。如果这些化合物能更好地定向递送至所需器官，那么脱靶效应将会减少。
在一个方面，本公开文本提供了编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含一种或多种核苷类似物。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含1-甲基假尿苷。
在一个方面，本公开文本提供了编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少100、300、500、700、900或1,000个碱基具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述核酸序列包含少于约115、110、105、100、95或90个UU或TT二核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸序列包含至少两个编码精氨酸的同义密码子。在一些实施方案中，所述核酸序列包含至少三个编码精氨酸的同义密码子。在一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％、65％、60％、55％或50％是AGA密码子。在一些实施方案中，所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含在至少100、300、500、700、900或1,000个连续氨基酸残基上与SEQ IDNO:5具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸是信使核糖核酸(mRNA)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸还包含3’或5’非编码区。在一些实施方案中，所述3’或5’非编码区增强由所述合成多核苷酸编码的所述CFTR蛋白在细胞内的表达或活性。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸还包含5’帽结构。在一些实施方案中，所述3’非编码区包含聚腺苷尾。在一些实施方案中，所述聚腺苷尾包含至多200个腺苷。在一些实施方案中，所述聚腺苷尾改善所述合成多核苷酸在细胞中的药代动力学特性。在一些实施方案中，所述聚腺苷尾改善所述合成多核苷酸在细胞中的延长的半衰期。
在一个方面，本公开文本提供了药物组合物，其包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含可电离阳离子脂质以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。
在一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比不超过约50:1、40:1、30:1、20:1、15:1或10:1。在一些实施方案中，所述SORT脂质是永久阳离子脂质。在一些实施方案中，所述SORT脂质是第二可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约65％的所述SORT脂质。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述SORT脂质。在一些实施方案中，所述脂质组合物还包含两性离子脂质(例如，磷脂)。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约25％的所述两性离子脂质。在一些实施方案中，所述两性离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比不超过约50:1、40:1、30:1或20:1。在一些实施方案中，所述脂质组合物还包含类固醇或类固醇衍生物。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约46％的所述类固醇或类固醇衍生物。在一些实施方案中，所述脂质组合物还包含聚合物缀合的脂质(例如，聚(乙二醇)(PEG)缀合的脂质)。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约0.5％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)不超过约50:1、40:1、30:1或20:1。在一些实施方案中，所述N/P比为约5:1至约30:1。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸与所述脂质组合物的总脂质的(例如，质量或重量)比不超过约1:20、1:50或1:100。在一些实施方案中，所述SORT脂质包含永久带正电的部分(例如，季铵离子)。在一些实施方案中，所述SORT脂质包含反离子。在一些实施方案中，所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质(例如，饱和的或不饱和的)。在一些实施方案中，所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。在一些实施方案中，所述SORT脂质包含具有结构式的头基，其中L是(例如，可生物降解的)接头；Z+是带正电的部分(例如，季铵离子)；并且X-是反离子。在一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：/>其中R1和R2各自独立地是任选经取代的C6-C24烷基或任选经取代的C6-C24烯基。在一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：/>在一些实施方案中，L是其中：
p和q各自独立地是1、2或3；并且
R4是任选经取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
R4是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
在一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
在一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R4和R4′各自独立地是烷基(C6-C24)、烯基(C6-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″′是烷基(C1-C8)、烯基(C2-C8)或这两种基团中任一种的取代形式；并且
X2是单价阴离子。
在一些实施方案中，所述药物组合物是气雾剂组合物。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物具有0.5微米(μm)至10μm的微滴大小。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的中值微滴大小。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的平均微滴大小。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于气雾剂施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于顶端递送。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于雾化。
在另一个方面，本公开文本提供了用于增强囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)在细胞中的表达或活性的方法，所述方法包括：使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸编码CFTR蛋白；并且其中所述脂质组合物包含可电离阳离子脂质以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而在接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体；任选地其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性是通过测量包含所述细胞的多个细胞与没有所述接触的多个参考细胞相比的跨上皮离子转运特性的变化来确定的。在一些实施方案中，重复所述接触。在一些实施方案中，每周至少一次进行所述接触。在一些实施方案中，每周至少两次进行所述接触。在一些实施方案中，所述方法在每次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。在一些实施方案中，所述接触是第一次接触，并且其中所述方法包括第二次接触，其任选地在所述第一次接触之后至少1、2或3天进行。在一些实施方案中，所述方法还包括第三次接触，任选地其中所述第三次接触在所述第二次接触之后至少1、2或3天进行。在一些实施方案中，所述方法在所述第二次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。在一些实施方案中，所述方法在所述第三次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。在一些实施方案中，所述接触包括向受试者施用所述组合物，所述组合物包含与所述脂质组合物组装的所述合成多核苷酸。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述施用包括通过雾化而吸入。在一些实施方案中，每次接触中的组合物是相同的。在一些实施方案中，所述细胞是肺气道细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肺分泌细胞或肺基底细胞。所述肺基底细胞可以是肺基底干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是支气管上皮细胞。在一些实施方案中，所述细胞是未分化的。在一些实施方案中，所述细胞是分化的。在一些实施方案中，所述细胞来源于所述受试者。在一些实施方案中，所述接触在体内进行。在一些实施方案中，所述接触在体外进行。在一些实施方案中，所述接触离体进行。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体是野生型CFTR蛋白。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体是全长CFTR蛋白。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性对应于至少约5微安(μA)的跨上皮电流，例如，如在体外测定中所确定的。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性对应于约5微安(μA)至约30μA的跨上皮电流。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性对应于至少约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)的跨上皮电流，例如，如在体外测定中所确定的。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性对应于从约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)至约20μA·cm-2·min-1的跨上皮电流。在一些实施方案中，相对于相应对照(例如，不进行所述接触的相应细胞)，所述方法增加所述CFTR蛋白的功能变体在所述细胞中的量或活性(例如，增加至少约1.1倍)。在一些实施方案中，相对于相应对照(例如，不进行所述接触的相应细胞)，所述方法增强离子(例如，氯离子)在所述细胞中的转运(例如，增强至少约1.1倍)。在一些实施方案中，所述受试者展现或被确定展现囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因中的突变。在一些实施方案中，所述突变是功能丧失性突变。在一些实施方案中，所述突变是无义突变或移码突变。在一些实施方案中，所述突变在CFTR基因的外显子11-27中的一个或多个中。在一些实施方案中，所述突变是R553X、G542X或F508del或其组合。在一些实施方案中，所述突变是R1162X。在一些实施方案中，所述突变是R553X、G542X、F508del或R1162X或其组合。
在另一个方面，本公开文本提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含可电离阳离子脂质以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而在所述受试者的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生治疗有效量或活性的所述合成多核苷酸，任选地其中所述合成多核苷酸的所述治疗有效活性是通过测量包含所述肺分泌细胞或肺基底细胞的肺与不进行所述接触的参考肺相比的跨上皮离子转运特性的变化来确定的。所述肺基底细胞可以是肺基底干细胞。
在另一个方面，本公开文本提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含可电离阳离子脂质以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而在所述受试者的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生与所述受试者的肺非分泌细胞或肺非基底细胞相比更大的治疗量或活性的所述合成多核苷酸。在用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法的一些实施方案中，在肺分泌细胞、肺基底细胞或其组合中检测或观察到所述合成多核苷酸的至少约50％、55％或60％(例如，肺)表达，例如，如通过测量所述合成多核苷酸编码的相应多肽的量或活性所确定的。在用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法的一些实施方案中，在肺非分泌细胞、肺非基底细胞或其组合中检测或观察到所述合成多核苷酸的不超过约50％、45％或40％(例如，肺)表达，例如，如通过测量所述合成多核苷酸编码的相应多肽的量或活性所确定的。在用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法的一些实施方案中，在肺纤毛细胞中检测或观察到所述合成多核苷酸的不超过约50％、45％或40％(例如，肺)表达，例如，如通过测量所述合成多核苷酸编码的相应多肽的量或活性所确定的。在一些实施方案中，所述用于肺分泌细胞或肺基底细胞递送的方法在一个或多个肺分泌细胞或肺基底细胞中产生比在一个或多个参考细胞中大至少1.1、1.5或2倍的所述合成多核苷酸的量或活性，所述一个或多个参考细胞既不是肺分泌细胞也不是肺基底细胞。所述一个或多个参考细胞可以是一个或多个肺纤毛细胞。在一些实施方案中，所述肺非分泌细胞或肺非基底细胞是肺纤毛细胞。在一些实施方案中，所述肺非分泌细胞是肺基底细胞。所述(例如，肺)基底细胞可以是(例如，肺)基底干细胞。
在另一个方面，本公开文本提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含可电离阳离子脂质以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而在所述受试者的至少5％肺分泌细胞或肺基底细胞中产生治疗量或活性的所述合成多核苷酸。在一些实施方案中，所述施用包括向所述受试者的肺施用所述组合物，所述组合物包含与所述脂质组合物组装的所述合成多核苷酸。在一些实施方案中，所述肺分泌细胞是俱乐部细胞(club cell)或杯状细胞。所述(例如，肺)基底细胞可以是(例如，肺)基底干细胞。
在另一个方面，本公开文本提供了用于治疗患有或怀疑患有囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)相关病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文其他地方公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述CFTR相关病症是囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)。在一些实施方案中，所述施用包括局部施用。在一些实施方案中，所述施用包括雾化。
根据以下详细描述，本公开文本的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得清楚，其中仅示出和描述了本公开文本的说明性实施方案。如将认识到的，本公开文本能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开文本。因此，附图和描述本质上应被视为说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地指出以通过引用并入一样。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包括的公开内容相矛盾而言，说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细描述，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了使用本发明原理的说明性实施方案和附图(本文中也称为“图”)，并且附图中：
图1显示示例脂质的化学结构。
图2显示示例树状聚合物脂质的化学结构。
图3显示使用不同LNP组合物递送的mRNA的细胞类型和表达水平的图表。
图4示出在使用多种LNP组合物进行报告物Luc mRNA/LNP的吸入气雾剂递送之后，使用小鼠的生物发光的体内成像得到的图像。
图5显示关于各种LNP组合物在人支气管上皮(hBE)细胞中的细胞毒性的图表。
图6示出各种LNP组合物的稳定性和一般特性。
图7显示小鼠中LNP组合物(例如，5A2-SC8 DOTAP)的组织特异性辐射随时间变化的图表。
图8显示小鼠中LNP组合物(例如，5A2-SC8 DOTAP)的组织特异性辐射随时间变化的图像。
图9A示出本申请中所述的CFTR mRNA的结构设计；并且图9B示出本申请中所述的CFTR mRNA的产生。
图10A-图10B示出CFTR蛋白在FRT细胞中的剂量依赖性表达。
图11A示出CFTR在FRT细胞中的活性。
图11B-图11C显示用本文所述的CFTR mRNA在FRT细胞中观察到剂量依赖性CFTR功能。图11B显示使用Lipofectamine 2000，将在可渗透支持物上生长的5日龄汇合的FRT细胞用ReCode优化的mRNA转染。在用一个剂量的本文所述的CFTR mRNA转染后1天进行跨上皮电导的MTECC24测定。图11C显示mRNA剂量依赖性跨上皮电导(Gt)响应：条是在毛喉素添加和抑制剂172添加时间点之间的Gt曲线下面积(AUC)/min。
图12示出报告mRNA向完全分化的hBE细胞的递送。
图13A-图13C显示hBE细胞对参考化合物和本申请的CFTR mRNA配制品w/tdTomatomRNA的抗性和响应。
图14A-图14B示出通过本申请的CFTR mRNA配制品，CFTR功能在完全分化的F508del/F508del hBE中的恢复。
图15A-图15B示出通过本申请的CFTR mRNA配制品，CFTR功能在R553X/F508delhBE中的恢复。
图16A-图16B示出用本文所述的CFTR mRNA LNP进行的单剂量气雾剂处理挽救了原代CF hBE细胞中的CFTR功能。图16A显示使用本申请的CFTR mRNA配制品在单次给药后，毛喉素诱导的G542X/F508 hBE细胞的代表性轨迹。
图17A-图17B显示基于每周两次给药方案的CFTR mRNA LNP配制品的重复施用。在使用类似方案来确定CFTR功能的情况下，重复施用在每次给药后均显示CFTR功能。图17A和图17B显示与阴性对照相比，每次给药都能够产生改进的CFTR功能。
图18显示用报告mRNA转染hBE细胞揭示了配制品特异性细胞的向性特征。靠上的图显示，使用Vitrocell雾化，用RTX0001配制的Td Tomato mRNA(4mg)处理分化良好的人hBE细胞一次。通过用所示标记物共定位来确定阳性细胞％。如本文所用，“RTX001”是指本文测试的示例脂质组合物。RTX0001是包含约19.05％4A3-SC7(可电离阳离子脂质)、约20％DODAP(SORT脂质)、约19.05％ DOPE、约38.9％胆固醇和约3.81％ DMG-PEG(PEG缀合脂质)的5组分脂质组合物，其中以总脂质组合物的mol％确定每种脂质组分。
图19显示人受试者中用本文公开的组合物治疗囊性纤维化的临床试验的概述。
具体实施方式
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域的技术人员来说，显然这些实施方案仅作为举例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用在本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”通常是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，其包含嘌呤和嘧啶碱基、嘌呤和嘧啶类似物、化学或生化修饰的天然或非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或核糖核酸的DNA拷贝(cDNA)的序列，所有这些序列都可以重组产生、人工合成或从天然来源分离并纯化。多核苷酸和核酸可以以单链或双链存在。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基团(如通常可以在RNA或DNA中发现的)或类似物或者经取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。
如本文所用的术语“多核糖核苷酸”通常是指包含核糖核酸的多核苷酸聚合物。该术语还指包含化学修饰的核糖核苷酸的多核苷酸聚合物。多核糖核苷酸可以由可在自然界中发现的d-核糖形成。
如本文所用的术语“多肽”通常是指包含氨基酸残基单体的聚合物链，所述氨基酸残基单体通过酰胺键(肽键)连接在一起。多肽可以是至少三个氨基酸的链、蛋白质、重组蛋白、抗原、表位、酶、受体或结构类似物或其组合。如本文所用，形成多肽的l-对映异构体氨基酸的缩写如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。X或Xaa可以表示任何氨基酸。
如本文所用的术语“工程化的”通常是指已被遗传设计和操纵的多核苷酸、载体和核酸构建体，以在细胞内提供多核苷酸。工程化的多核苷酸可以在体外部分地或完全地合成。工程化的多核苷酸也可以被克隆。工程化的多核糖核苷酸可以含有一种或多种碱基或糖类似物，如非天然存在于信使RNA中的核糖核苷酸。工程化的多核糖核苷酸可以含有存在于以下各项中的核苷酸类似物：转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、指导RNA(gRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、SmY RNA、剪接前导RNA(SL RNA)、CRISPR RNA、长非翻译RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)或其他合适的RNA。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物有机体，如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)。在某些实施方案中，患者或受试者是人。人类受试者的非限制性例子是成年人、青少年、婴儿和胎儿。
如本文所用的术语“组装”或“组装的”在将有效载荷递送至一个或多个靶细胞的上下文中通常是指共价或非共价相互作用或缔合，例如，这样使得治疗剂或预防剂与脂质组合物复合或包封在脂质组合物中。
如本文所用，术语“脂质组合物”通常是指包含一种或多种脂质化合物(包括但不限于阳离子脂质复合物(lipoplex)、脂质体、脂质颗粒)的组合物。脂质组合物的例子包括悬浮液、乳液和囊泡组合物。
如本文所用，术语“可检测的”是指可通过观察或通过使用仪器直接或间接检测的信号的发生或变化。通常，可检测的响应是信号的发生，其中荧光团是固有地发荧光的并且在与金属离子或生物化合物结合后不会产生信号的变化。可替代地，可检测的响应是导致波长分布模式或吸光度或荧光的强度的变化或者光散射、荧光寿命、荧光偏振或上述参数的组合的变化的光学响应。其他可检测的响应包括例如化学发光、磷光、来自放射性同位素的辐射、磁吸引和电子密度。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中所用的表示量、范围、条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据本申请试图获得的所需特性而变化。通常，如本文所用，当涉及如重量、时间、剂量等量的可测量值时，术语“约”意味着在一个例子中涵盖指定量±20％或±10％的变化，在另一个例子中涵盖指定量±5％的变化，在另一个例子中涵盖指定量±1％的变化，并且在又另一个例子中涵盖指定量±0.1％的变化，这些变化适合于执行所公开的方法。
如本文所用，术语“比率”通常是指一种或多种分子与另一种或多种分子的相对量。所述比率的非限制性例子包括摩尔比率、重量比率或质量比率。
当在化学基团的背景下使用时：“氢”表示-H；“羟基”表示-OH；“氧代”表示＝O；“羰基”表示-C(＝O)-；“羧基”表示-C(＝O)OH(也写为-COOH或-CO2H)；“卤代”独立地表示-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”表示-NH2；“羟基氨基”表示-NHOH；“硝基”表示-NO2；亚氨基表示＝NH；“氰基”表示-CN；“异氰酸根”表示-N＝C＝O；“叠氮基”表示-N3；在单价背景下，“磷酸根”表示-OP(O)(OH)2或其去质子化形式；在二价背景下，“磷酸根”表示-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”表示-SH；并且“硫代”表示＝S；“磺酰基”表示-S(O)2-；“羟基磺酰基”表示-S(O)2OH；“磺酰胺”表示-S(O)2NH2；并且“亚磺酰基”表示-S(O)-。
在化学式的背景下，符号“-”表示单键，“＝”表示双键，并且“≡”表示三键。符号“----”表示任选的键，其如果存在，则是单键或双键。符号表示单键或双键。因此，例如，式/>包括/>并且应理解，没有一个这样的环原子形成多于一个双键的一部分。此外，应注意，当连接一个或两个立体生成原子时，共价键符号“-”不表示任何优选的立体化学。相反，它涵盖了所有立体异构体及其混合物。当跨过键垂直绘制(例如，针对甲基的/>)时，符号/>表示基团的附接点。应注意，通常仅针对较大基团以这种方式识别附接点，以帮助读者清楚地识别附接点。符号/>表示单键，其中附接到该楔形基团的粗端的基团是“朝向纸面外”。符号/>表示单键，其中附接到该楔形基团的粗端的基团是“朝向纸面内”。符号/>表示单键，其中双键(例如，E或Z)周围的几何形状是未确定的。因此，这两种选择及其组合都是刻意的。本申请中所示结构的原子上的任何未确定的价态都隐含地表示与该原子键合的氢原子。碳原子上的粗体点表示附接在该碳上的氢朝向纸张平面外。
当基团“R”被描绘为环系统上的“浮动基团”时，例如在以下式中：
则只要形成稳定的结构，R可以替换附接到任何环原子上的任何氢原子，包括所示的、隐含的或明显确定的氢。当基团“R”被描绘为稠合环系统上的“浮动基团”时，例如在以下式中：
则R可以替换附接到任一稠环的任何环原子上的任何氢，除非另有说明。可替换氢包括所示的氢(例如，附接到上式中的氮上的氢)、隐含的氢(例如，在上式中未显示但被理解为存在的氢)、明显确定的氢、以及任选的氢(其存在取决于环原子的身份(例如，当X等于-CH-时，附接到基团X上的氢))，只要形成稳定的结构。在所描绘的例子中，R可以位于稠环系统的5元环或6元环上。在上式中，紧接在括号中的基团“R”之后的下标字母“y”表示数字变量。除非另有说明，否则该变量可以是0、1、2或大于2的任何整数，仅受环或环系统的可替换氢原子的最大数限制。
对于化学基团和化合物类别，基团或类别中的碳原子数目如下所示：“Cn”定义基团/类别中碳原子的确切数目(n)。“C≤n”定义可在基团/类别中的碳原子的最大数目(n)，其中对于所讨论的基团/类别，最小数目尽可能小，例如应理解，基团“烯基(C≤8)”或类别“烯烃(C≤8)”中的最小碳原子数目为2。与“烷氧基(C≤10)”相比较，其表示具有1至10个碳原子的烷氧基。“Cn-n′”定义了基团中碳原子的最小数目(n)和最大数目(n′)。因此，“烷基(C2-10)”表示具有2至10个碳原子的烷基。这些碳数目指标可以在其修饰的化学基团或类别之前或之后并且可以或可以不括在括号中，而不代表含义的任何变化。因此，术语“C5烯烃”、“C5-烯烃”、“烯烃(C5)”和“烯烃C5”都是同义的。
当用于修饰化合物或化学基团时，术语“饱和的”意指化合物或化学基团不具有碳碳双键和碳碳三键，除非下文另有注明。当该术语用于修饰原子时，表示该原子不是任何双键或三键的一部分。在饱和基团的取代形式的情况下，可以存在一个或多个碳氧双键或碳氮双键。并且当存在这样的键时，则不排除可能作为酮-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互变异构的一部分出现的碳碳双键。当术语“饱和的”用于修饰一种物质的溶液时，这意味着不再有该物质可以溶解于该溶液中。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“脂肪族”表示如此修饰的化合物或化学基团是非环状或环状但非芳族烃化合物或基团。在脂肪族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳环(脂环)的形式连接在一起。脂肪族化合物/基团可以是饱和的，即通过单个碳碳键连接(烷烃/烷基)；或是不饱和的，即具有一个或多个碳碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或多个碳碳三键(炔烃/炔基)。
当用于修饰化合物或化学基团原子使用时，术语“芳族”意指化合物或化学基团含有通过形成环的键的相互作用而稳定的平面不饱和原子环。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烷基”是指具有碳原子作为附接点、具有直链或支链无环结构、并且没有除了碳和氢以外的原子的单价饱和脂肪族基团。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr或丙基)、-CH(CH3)2(i-Pr、iPr或异丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基、t-丁基、t-Bu或tBu)和-CH2C(CH3)3(新戊基)是烷基的非限制性例子。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烷二基”是指具有一个或两个饱和碳原子作为附接点、具有直链或支链无环结构、没有碳碳双键或三键、并且没有除了碳和氢以外的原子的二价饱和脂肪族基团。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-和-CH2CH2CH2-是烷二基的非限制性例子。“烷烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是烷基，该术语如上文所定义。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。以下基团是经取代的烷基的非限制性例子：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。术语“卤代烷基”是经取代的烷基的子集，其中氢原子替代限于卤代(即，-F、-Cl、-Br或-I)，使得除了碳、氢和卤素以外没有其他原子存在。基团-CH2Cl是卤代烷基的非限制性例子。术语“氟烷基”是经取代的烷基的子集，其中氢原子替代限于氟，使得除了碳、氢和氟以外没有其他原子存在。基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3是氟烷基的非限制性例子。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“环烷基”是指具有碳原子作为附接点、没有碳碳双键或三键、并且没有除了碳和氢以外的原子的单价饱和脂肪族基团，所述碳原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分。非限制性例子包括：-CH(CH2)2(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(Cy)。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“环烷二基”是指具有两个碳原子作为附接点、没有碳碳双键或三键、并且没有除了碳和氢以外的原子的二价饱和脂肪族基团。基团是环烷二基的非限制性例子。“环烷烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是环烷基，该术语如上文所定义。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烯基”是指具有碳原子作为附接点、具有直链或支链无环结构、具有至少一个非芳族碳碳双键、没有碳碳三键、并且没有除了碳和氢以外的原子的单价不饱和脂肪族基团。非限制性例子包括：-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CHCH＝CH2。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烯二基”是指具有两个碳原子作为附接点、具有直链或支链、具有直链或支链无环结构、具有至少一个非芳族碳碳双键、没有碳碳三键、并且没有除了碳和氢以外的原子的二价不饱和脂肪族基团。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和-CH2CH＝CHCH2-是烯二基的非限制性例子。请注意，尽管烯二基是脂肪族的，但一旦其两端连接，该基团就不排除会形成芳族结构的一部分。术语“烯烃(alkene)”和“烯烃(olefin)”是同义的，并且是指具有式H-R的化合物类别，其中R是烯基，该术语如上文所定义。类似地，术语“末端烯烃(terminal alkene)”和“α-烯烃(α-olefin)”是同义的，并且是指仅具有一个碳碳双键的烯烃，其中该键是分子末端的乙烯基的一部分。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是经取代的烯基的非限制性例子。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“炔基”是指具有碳原子作为附接点、具有直链或支链无环结构、具有至少一个碳碳三键、并且没有除了碳和氢以外的原子的单价不饱和脂肪族基团。如本文所用，术语炔基不排除存在一个或多个非芳族碳碳双键。基团-C≡CH、-C≡CCH3和-CH2C≡CCH3是炔基的非限制性例子。“炔烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是炔基。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“芳基”是指具有芳族碳原子作为附接点的单价不饱和芳族基团，所述碳原子形成一个或多个六元芳族环结构的一部分，其中环原子都是碳，并且其中该基团不包含除了碳和氢以外的原子。如果存在多于一个环，则这些环可以是融合或非融合的。如本文所用，该术语不排除存在与存在的第一芳环或任何另外的芳环附接的一个或多个烷基或芳烷基(碳数限制允许的情况下)。芳基的非限制性例子包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和源自联苯的单价基团。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“芳二基”是指具有两个芳族碳原子作为附接点的二价芳族基团，所述碳原子形成一个或多个六元芳族环结构的一部分，其中环原子都是碳，并且其中该单价基团不包含除了碳和氢以外的原子。如本文所用，该术语不排除存在与存在的第一芳环或任何另外的芳环附接的一个或多个烷基、芳基或芳烷基(碳数限制允许的情况下)。如果存在多于一个环，则这些环可以是融合或非融合的。非融合环可以经由以下中的一种或多种连接：共价键、烷二基或烯二基(碳数限制允许的情况下)。芳二基的非限制性例子包括：
“芳烃”是指具有式H-R的化合物类别，其中R是芳基，该术语如上所定义。苯和甲苯是芳烃的非限制性例子。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“芳烷基”是指-烷二基-芳基单价基团，其中术语烷二基和芳基各自以与上文提供的定义一致的方式使用。非限制性例子是：苯基甲基(苄基，Bn)和2-苯基-乙基。当术语芳烷基与修饰语“取代的”一起使用时，来自烷二基和/或芳基的一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。经取代的芳烷基的非限制性例子是：(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“杂芳基”是指具有芳族碳原子或氮原子作为附接点的单价芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中杂芳基基团不包含除了碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子。杂芳基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧和硫的环原子。如果存在多于一个环，则这些环可以是融合或非融合的。如本文所用，该术语不排除存在与芳环或芳环系统附接的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许的情况下)。杂芳基的非限制性例子包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、异噁唑基、甲基吡啶基、噁唑基、苯基吡啶基、吡啶基(pyridinyl或pyridyl)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“N-杂芳基”是指具有氮原子作为附接点的杂芳基。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“杂芳二基”是指具有两个芳族碳原子、两个芳族氮原子或者一个芳族碳原子和一个芳族氮原子作为两个附接点的二价芳族基团，所述原子形成一个或多个芳环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中该二价基团不包含除了碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子。如果存在多于一个环，则这些环可以是融合或非融合的。非融合环可以经由以下中的一种或多种连接：共价键、烷二基或烯二基(碳数限制允许的情况下)。如本文所用，该术语不排除存在与芳环或芳环系统附接的一个或多个烷基、芳基和/或芳烷基(碳数限制允许的情况下)。杂芳二基的非限制性例子包括：
“杂芳烃”是指具有式H-R的化合物，其中R是杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性例子。当这些术语与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“杂环烷基”是指具有碳原子或氮原子作为附接点的单价非芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中该杂环烷基不包含除了碳、氢、氮、氧和硫以外的原子。杂环烷基环可以含有1、2、3或4个选自氮、氧或硫的环原子。如果存在多于一个环，则这些环可以是融合或非融合的。如本文所用，该术语不排除存在与该环或环系统附接的一个或多个烷基(碳数限制允许的情况下)。此外，该术语不排除在该环或环系统中存在一个或多个双键，条件是所得基团保持非芳族。杂环烷基的非限制性例子包括氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基、吡喃基、环氧乙烷基和氧杂环丁烷基。术语“N-杂环烷基”是指具有氮原子作为附接点的杂环烷基。N-吡咯烷基是这种基团的一个例子。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“杂环烷二基”是指具有两个碳原子、两个氮原子或者一个碳原子和一个氮原子作为两个附接点的二价环状基团，所述原子形成一个或多个环结构的一部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，并且其中该二价基团不包含除了碳、氢、氮、氧和硫以外的原子。如果存在多于一个环，则这些环可以是融合或非融合的。非融合环可以经由以下中的一种或多种连接：共价键、烷二基或烯二基(碳数限制允许的情况下)。如本文所用，该术语不排除存在与该环或环系统附接的一个或多个烷基(碳数限制允许的情况下)。此外，该术语不排除在该环或环系统中存在一个或多个双键，条件是所得基团保持非芳族。杂环烷二基的非限制性例子包括：
当这些术语与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“酰基”是指基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基或杂芳基，这些术语如上文所定义。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基，Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(咪唑基)是酰基的非限制性例子。“硫酰基”以类似的方式定义，不同之处在于基团-C(O)R的氧原子已被硫原子替代，即-C(S)R。术语“醛”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已被-CHO基团替代。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子(包括直接与羰基或硫代羰基的碳原子附接的氢原子，如果有的话)已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨基甲酰基)和-CON(CH3)2是经取代的酰基的非限制性例子。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烷氧基”是指基团-OR，其中R是烷基，该术语如上文所定义。非限制性例子包括：-OCH3(甲氧基)、-OCH2CH3(乙氧基)、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2(异丙氧基)、-OC(CH3)3(叔丁氧基)、-OCH(CH2)2、-O-环戊基和-O-环己基。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“环烷氧基”、“烯氧基”、“炔氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳氧基”、“杂环烷氧基”和“酰氧基”是指定义为-OR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基和酰基。术语“烷氧基二基”是指二价基团-O-烷二基-、-O-烷二基-O-或-烷二基-O-烷二基-。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烷硫基”和“酰硫基”是指基团-SR，其中R分别是烷基和酰基。术语“醇”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已被羟基替代。术语“醚”对应于如上文所定义的烷烃，其中至少一个氢原子已被烷氧基替代。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。
当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烷氨基”是指基团-NHR，其中R是烷基，该术语如上文所定义。非限制性例子包括：-NHCH3和-NHCH2CH3。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“二烷氨基”是指基团-NRR′，其中R和R′可以是相同或不同的烷基，或者R和R′可以一起表示烷二基。二烷氨基的非限制性例子包括：-N(CH3)2和-N(CH3)(CH2CH3)。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“环烷氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷氨基”、“杂芳基氨基”、“杂环烷氨基”、“烷氧基氨基”和“烷基磺酰基氨基”是指定义为-NHR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基、烷氧基和烷基磺酰基。芳基氨基的非限制性例子是-NHC6H5。术语“烷氨基二基”是指二价基团-NH-烷二基-、-NH-烷二基-NH-或-烷二基-NH-烷二基-。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“酰胺基(amido)”(酰氨基(acylamino))是指基团-NHR，其中R是酰基，该术语如上文所定义。酰胺基的非限制性例子是-NHC(O)CH3。当在没有修饰语“取代的”情况下使用时，术语“烷亚氨基”是指二价基团＝NR，其中R是烷基，该术语如上文所定义。当这些术语中的任何一个与修饰语“取代的”一起使用时，与碳原子附接的一个或多个氢原子已独立地被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替代。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是经取代的酰胺基的非限制性例子。
在权利要求和/或说明书中，当与术语“包含(comprising)”连用时，词语“一个/一种(a或an)”的使用可以指“一个/一种(one)”，但也与“一个/一种或多个/多种(one ormore)”、“至少一个/一种(at least one)”和“一个/一种或超过一个/一种(one or morethan one)”的意思一致。
如本申请所用，术语“平均分子量”是指每种聚合物种类的摩尔数与该种类的摩尔质量之间的关系。特别地，每个聚合物分子可以具有不同的聚合水平，因此具有不同的摩尔质量。平均分子量可以用于表示多个聚合物分子的分子量。平均分子量通常与平均摩尔质量同义。特别地，平均分子量有三种主要类型：数均摩尔质量、重(质)均摩尔质量和Z-平均摩尔质量。在本申请的上下文中，除非另有说明，否则平均分子量表示式的数均摩尔质量或重均摩尔质量。在一些实施方案中，平均分子量是数均摩尔质量。在一些实施方案中，平均分子量可以用于描述存在于脂质中的PEG组分。
术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态(如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”)也是开放式的。例如，“包含(comprises)”、“具有(has)”或“包括(includes)”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有这一个或多个步骤并且还覆盖其他未列出的步骤。
在说明书和/或权利要求中使用的术语“有效的”意指足以实现希望的、期望的或预期的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指当向受试者或患者施用以治疗疾病时，该量的化合物足以实现对该疾病的这种治疗。
如本文所用，术语“IC50”是指获得50％的最大响应的抑制剂量。这种定量量度表明需要多少特定的药物或其他物质(抑制剂)才能将给定的生物过程、生化过程或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。
第一化合物的“异构体”是单独的化合物，其中每个分子含有与第一化合物相同的组成原子，但是这些原子的构型在三维上不同。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物有机体，如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者是灵长类动物。人类受试者的非限制性例子是成年人、青少年、婴儿和胎儿。
如本文通常所用的“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
“药学上可接受的盐”意指本公开文本的化合物的盐，其是如上所定义的药学上可接受的并且其具有所希望的药理学活性。此类盐包括与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸如1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯丙酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂肪族单羧酸和二羧酸、脂肪族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括碱加成盐，当存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时，可以形成碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应认识到，形成本公开文本的任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子不是关键的，只要盐作为一个整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其他例子及其制备和使用方法呈现于Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(P.H.Stahl和C.G.Wermuth编辑,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)中。
“预防(prevention或preventing)”包括：(1)抑制受试者或患者的疾病发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病理或症状，和/或(2)减缓受试者或患者的疾病的病理或症状的发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病理或症状。
“重复单元”是某些材料(例如，构架和/或聚合物，无论是有机的、无机的还是金属有机的)的最简单的结构实体。在聚合物链的情况下，重复单元沿着链依次连接在一起，就像项链的珠子一样。例如，在聚乙烯即-[-CH2CH2-]n-中，重复单元是-CH2CH2-。下标“n”表示聚合度，即连接在一起的重复单元的数目。当“n”的值未定义或不存在“n”时，它仅表示括号内的式的重复以及材料的聚合性质。重复单元的概念同样适用于重复单元之间的连通性在三维上延伸的情况下，如在金属有机框架、改性聚合物、热固性聚合物等中。在树状聚合物的情况下，重复单元还可以被描述为分支单元、内层或代。类似地，终止基团还可以被描述为表面基团。
“立体异构体”或“光学异构体”是给定化合物的异构体，其中相同的原子与相同的其他原子键合，但是这些原子的构型在三维上不同。“对映异构体”是给定化合物的立体异构体，它们是彼此的镜像，像左手和右手一样。“非对映异构体”是给定化合物的不是对映异构体的立体异构体。手性分子含有手性中心，也称为立体中心或立体生成中心，其是带有基团的分子中的任何如下点(尽管不一定是原子)，所述点使得任何两个基团的互换导致立体异构体。在有机化合物中，手性中心通常是碳、磷或硫原子，尽管其他原子也可能是有机和无机化合物中的立体中心。一个分子可以具有多个立体中心，从而给出许多立体异构体。在其立体异构是由于四面体立体生成中心(例如，四面体碳)引起的化合物中，假设可能的立体异构体的总数将不超过2n，其中n是四面体立体中心的数目。具有对称性的分子通常具有小于最大可能数目的立体异构体。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物。可替代地，对映异构体的混合物可以对映异构地富集，使得一种对映异构体以大于50％的量存在。通常，可以使用本领域已知的技术拆分或分离对映异构体和/或非对映异构体。预期对于尚未确定立体化学的任何立体中心或手性轴来说，该立体中心或手性轴可以以其R形式、S形式或R和S形式的混合物(包括外消旋和非外消旋混合物)存在。如本文所用，短语“基本上不含其他立体异构体”意指组合物含有≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％或最优选≤1％的另外一种或多种立体异构体。
“治疗(treatment或treating)”包括：(1)抑制正在经历或表现疾病的病理或症状的受试者或患者的疾病(例如，阻止病理和/或症状的进一步发展)，(2)改善正在经历或表现疾病的病理或症状(例如，逆转病理和/或症状)的受试者或患者的疾病，和/或(3)影响正在经历或表现疾病的病理或症状的受试者或患者的疾病的任何可测量的减少。
本文中与一种或多种脂质组合物联合使用的术语“摩尔百分比”或“％摩尔”通常是指脂质组分与配制于或存在于脂质组合物中的所有脂质相比的摩尔比例。
上述定义代替了通过引用并入本文的任何参考文献中的任何冲突的定义。然而，定义某些术语这一事实不应被视为指示任何未定义的术语都是不确定的。相反，所使用的所有术语都被认为是以如下术语描述本公开文本，所述术语使得普通技术人员能够理解本公开文本的范围并实践本公开文本。
在一些实施方案中，本公开文本提供了用于用编码蛋白质或一个或多个蛋白质片段的核酸治疗与纤毛维持和功能相关的病症的组合物和方法。许多真核细胞带有通常被称为纤毛或鞭毛的附属物，其内核包含称为轴丝的细胞骨架结构。轴丝可以用作细胞骨架结构的骨架，支持所述结构，又在一些实施方案中导致其弯曲。通常，轴丝的内部结构是纤毛和鞭毛共有的。纤毛通常发现于气道、生殖系统以及其他器官和组织的内层中。鞭毛是类似于纤毛的尾状结构，可以推动细胞(如精子细胞)前进。
在气道内没有正常运作的纤毛的情况下，细菌可能会留在呼吸道中并引起感染。在呼吸道中，纤毛以协调的方式来回移动，以使黏液向喉咙移动。黏液的这种运动有助于从肺部清除液体、细菌和颗粒。许多患有纤毛和鞭毛功能障碍的婴儿在出生时会出现呼吸问题，这表明纤毛在从肺部清除胎儿液方面起着重要作用。从儿童早期开始，患有纤毛功能障碍的受试者会经常发生呼吸道感染。
囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)
囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)是脊椎动物中由CFTR基因编码的膜蛋白和氯离子通道。CFTR基因位于7号染色体的长臂上的q31.2位置处。影响氯离子通道功能的CFTR基因突变导致肺、胰腺和其他器官中上皮液体运输的失调，从而导致囊性纤维化(CF)。
在美国，大约每2,500名婴儿中就有一名患有囊性纤维化(CF)。在美国普通人群中，多达1000万人携带该缺陷基因的单个拷贝，而没有明显的不良影响。相比之下，具有CF相关基因的两个拷贝的个体遭受CF导致的虚弱和致命影响(包括慢性肺病)。囊性纤维化的并发症包括肺部黏液增厚并伴有频繁的呼吸道感染，以及胰腺功能不全(导致营养不良和糖尿病)。这些病症导致慢性残疾和预期寿命缩短。在男性患者中，发育中的输精管(精索)和附睾的进行性阻塞和破坏似乎是由腔内分泌物异常引起的，从而导致先天性输精管缺失和男性不育。
到目前为止，已经描述了近1000个引起囊性纤维化的突变。许多突变是不常见的。突变的分布和频率在不同人群中有所不同。突变由CFTR基因中的替代、重复、缺失或缩短组成。这可能产生功能失调的蛋白，其活性较低、降解速度更快或存在数量不足。最常见的突变DeltaF508(ΔF508)由三个核苷酸的缺失(Δ)引起，这导致所述蛋白质上第508位处的氨基酸苯丙氨酸(F)丢失。因此，所述蛋白质不能正常折叠并且降解得更快。
组合物
在一些实施方案中，本公开文本提供了(例如，药物的)组合物，其包含如本文所述的编码CFTR蛋白的(例如，合成的)多核苷酸。在所述组合物的一些实施方案中，所述多核苷酸与脂质组合物(如本文所述)组装。
多核苷酸
在一些实施方案中，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码CFTR蛋白的核糖核酸(RNA)，例如信使核糖核酸(mRNA)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码CFTR蛋白的脱氧核糖核酸(DNA)。
在各个方面的一些实施方案中，所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含在至少100、300、500、700、900或1,000个连续氨基酸残基上与SEQ ID NO:5具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在各个方面的一些实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:5基本上相同的多肽。在一些实施方案中，所述核酸序列编码在至少1,000个连续氨基酸残基上与SEQ ID NO:5基本上相同的多肽。在一些实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:5基本上相同的多肽。在一些实施方案中，所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含在至少100、300、500、700、900或1,000个连续氨基酸残基上与SEQ IDNO:5具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:5基本上相同的多肽。
水解热点
旨在减少密码子内以及经修饰的mRNA的密码子中更具反应性的5'-U(U/A)-3'二核苷酸的数量的改变的核苷酸使用方案部分缓解了RNA的固有化学不稳定性所强加的限制。同时，降低RNA转录物中的U含量使它们的免疫原性降低。本公开文本涉及包含改变的开放阅读框(ORF)的RNA转录物。例如，密码子优化或改变的核苷酸使用可以包括蛋白质编码区内5'-U(U/A)-3'二核苷酸的大量减少，从而产生稳定的治疗性mRNA。密码子优化的多核苷酸可以包含编码特定氨基酸的、要被同义密码子取代或替代的密码子。密码子优化的多核苷酸可以编码与相应野生型多核苷酸相同的多肽，其中所述多核苷酸包含与相应野生型不同的多核苷酸序列。多个密码子可以编码相同的氨基酸，然而即使在编码相同氨基酸的密码子之间给定密码子的特性也不同。因为多个不同的密码子可以编码相同的氨基酸，所以特定的多核苷酸可以编码相同的多肽并且与编码相同多肽的另一个多核苷酸相比具有有利的特征。例如，密码子优化的多核苷酸可以被更快翻译，可以具有更高的稳定性(体内或体外)，可以导致表达产量增加或产生全长或功能性多肽，或者可以导致可溶性多肽增加和多肽聚集体减少。不受特定机制的限制，密码子优化的多核苷酸的有利特征可以是例如基于与所述多核苷酸进行的核糖体相互作用，表达的产物的改进的蛋白质折叠；或者可以是溶液中活性键的水解减少。例如，密码子优化可以改变或改善与核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)或核糖体暂停或翻译暂停有关的特征。有利的特征可能是减少使用“稀有密码子”的结果，所述“稀有密码子”可以具有较低的同源tRNA浓度，从而允许改善的翻译反应。有利的特征可能是减少使用“稀有密码子”的结果，所述“稀有密码子”可以具有较低的同源tRNA浓度，从而允许改善的翻译反应。有利的特征可能是经由酶促反应减少降解的结果。例如，寡核苷酸的水解表明，连接单链(ss)RNA中两个核糖核苷酸的磷酸二酯键的反应性取决于这些核苷酸的性质。在pH 8.5下，当嵌入ssRNA十二聚体中时，二核苷酸切割敏感性可能会变化一个数量级。在近生理条件下，RNA的水解通常涉及2'-氧亲核试剂在5'-氧阴离子离去基团对侧的相邻磷靶中心上进行的SN2型攻击，产生两个具有2',3'-环磷酸盐和5'-羟基末端的RNA片段。更具反应性的易裂解磷酸二酯键可以包括5'-UpA-3'(R1＝U1，R2＝A)和5'-CpA-3'(R1＝C，R2＝A)，因为这些步骤中的骨架可以最容易地采用“成线”构象，其是相邻磷酸二酯连接上的2'-OH进行SN2型亲核试剂攻击所需的。此外，干扰素调节的dsRNA激活的抗病毒途径产生2'-5'寡腺苷酸，其与锚蛋白重复序列结合，导致RNA酶L内切核糖核酸酶的激活。RNA酶L在UA和UU二核苷酸处有效切割ssRNA。最后，富U序列是RNA传感蛋白(包括Toll样受体7和8以及RIG-I)的强效激活剂，其使整体尿苷含量降低并成为降低治疗性mRNA的免疫原性的潜在有吸引力的方法。
在一些情况下，所述多核苷酸中UU和UA序列的数量或百分比低于某个阈值。例如，在所述多核苷酸中，包含UU和UA的二核苷酸序列的百分比可以小于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少。在一些情况下，在所述多核苷酸中，序列中UU或UA的数量可以小于50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或更少。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约115个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约110个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约105个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约100个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约95个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约90个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约85个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约80个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约75个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约70个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约65个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约60个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约55个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约50个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约45个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约40个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约35个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约45个UU或TT二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约30个UU或TT二核苷酸。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约115个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约110个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约105个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约100个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约95个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约90个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约85个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约80个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约75个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约70个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约65个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约60个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约55个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约50个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约45个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约40个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约35个UA或TA二核苷酸。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约30个UA或TA二核苷酸。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约200个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约195个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约190个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约185个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约180个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约175个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约170个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约165个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约160个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约155个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约150个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约145个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约140个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约135个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约130个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约125个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约120个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约115个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约110个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约105个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约100个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约95个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约90个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约85个UU和UA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约80个UU和UA。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约200个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约195个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约190个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约185个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约180个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约175个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约170个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约165个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约160个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约155个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约150个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约145个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约140个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约135个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约130个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约125个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约120个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约115个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约110个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约105个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约100个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约95个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约90个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约85个TT和TA。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含少于约80个TT和TA。
密码子使用
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少两个编码精氨酸的同义密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少两个编码精氨酸的同义密码子，并且所述密码子选自AGG、AGA、CGG、CGA、CGT和CGC。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少三个编码精氨酸的同义密码子，并且所述密码子选自AGG、AGA、CGG、CGA、CGT和CGC。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少四个编码精氨酸的同义密码子，并且所述密码子选自AGG、AGA、CGG、CGA、CGT和CGC。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少五个编码精氨酸的同义密码子，并且所述密码子选自AGG、AGA、CGG、CGA、CGT和CGC。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸包含四个编码精氨酸的同义密码子，并且所述密码子选自AGG、AGA、CGG和CGC。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％是AGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约65％是AGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约60％是AGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是AGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是AGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是AGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是AGG密码子。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％是AGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约65％是AGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约60％是AGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是AGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是AGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是AGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是AGA密码子。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％是CGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约65％是CGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约60％是CGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGG密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGG密码子。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％是CGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约65％是CGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约60％是CGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGA密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGA密码子。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％是CGT(或CGU)密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约65％是CGT(或CGU)密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约60％是CGT(或CGU)密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGT(或CGU)密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGT(或CGU)密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGT(或CGU)密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGT(或CGU)密码子。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％是CGC密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约65％是CGC密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约60％是CGC密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGC密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGC密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约55％是CGC密码子。在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约50％是CGC密码子。
在如本文所述的合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸可以包含开放阅读框(ORF)序列。ORF序列可以由密码子使用概况表征，包括：(1)密码子的总数，(2)密码子的种类数(例如，不同密码子类型的总数)，(3)每个(唯一)密码子的数量，以及(4)所有同义密码子(如果存在)中每个密码子的(使用)频率。密码子使用概况可以被改变或与相应野生型序列进行比较。例如，与野生型序列相比，特定密码子的频率或数量可以减少或增加。所述多核苷酸的密码子频率的变化可能比野生型序列有益。例如，改变的密码子频率可能产生免疫原性较低的多核苷酸。具有改变的密码子频率的多核苷酸可能产生更快表达的多核苷酸或导致更大量的表达产物的多核苷酸。具有改变的密码子频率的多核苷酸可能具有增加的稳定性，如增加的血清半衰期，或者可能对水解或可能导致多核苷酸降解的其他反应不太敏感。
在一些实施方案中，与相应野生型序列相比，所述多核苷酸包含改变的核苷酸使用。改变的核苷酸使用也可以称为“密码子优化”序列或通过“密码子优化”的方式产生。
在一些情况下，编码所述多肽中特定氨基酸的密码子可以被同义密码子取代或替代。例如，编码亮氨酸的密码子可以被编码亮氨酸的另一个密码子取代。以这种方式，所得的翻译产物可以与序列不同的多核苷酸相同。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码异亮氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码缬氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码丙氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码甘氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码脯氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码苏氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码亮氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码精氨酸的密码子被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。所述相应野生型序列中的至少一种类型的编码丝氨酸的密码子可以被所述核酸序列中的同义密码子类型取代。
在一些实施方案中，特定氨基酸的特定密码子包含该特定氨基酸的密码子总数(所述多核苷酸)的百分比或量。这可以称为“密码子频率”。例如，所述多核苷酸中编码特定氨基酸的总密码子的至少50％可以由第一密码子序列编码。例如，所述多核苷酸中编码特定氨基酸的总密码子的至少55％可以由第一密码子序列编码。所述多核苷酸中编码特定氨基酸的总密码子的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多可以由第一密码子序列编码。在一些情况下，所述多核苷酸中编码特定氨基酸的总密码子的不超过5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更少由第一密码子序列编码。所述合成多核苷酸的至少约90％编码苯丙氨酸的密码子可以是TTC(与TTT相反)。所述合成多核苷酸的至少约60％编码半胱氨酸的密码子可以是TGC(与TGT相反)。所述合成多核苷酸的至少约70％编码天冬氨酸的密码子可以是GAC(与GAT相反)。所述合成多核苷酸的至少约50％编码谷氨酸的密码子可以是GAG(与GAA相反)。所述合成多核苷酸的至少约60％编码组氨酸的密码子可以是CAC(与CAT相反)。所述合成多核苷酸的至少约60％编码赖氨酸的密码子可以是AAG(与AAA相反)。所述合成多核苷酸的至少约60％编码天冬酰胺的密码子可以是AAC(与AAT相反)。所述合成多核苷酸的至少约70％编码谷氨酰胺的密码子可以是CAG(与CAA相反)。所述合成多核苷酸的至少约80％编码酪氨酸的密码子可以是TAC(与TAT相反)。所述合成多核苷酸的至少约90％编码异亮氨酸的密码子可以是ATC。
在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的多个不同密码子序列编码。例如，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中不超过2个不同密码子序列编码。在一些情况下，所述多核苷酸包含不超过2种类型的编码异亮氨酸的密码子。
在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的不超过3个不同密码子序列编码。所述多核苷酸可以包含不超过3种类型的编码丙氨酸(Ala)的密码子。所述多核苷酸可以包含不超过3种类型的编码甘氨酸(Gly)的密码子。所述多核苷酸可以包含不超过3种类型的编码脯氨酸(Pro)的密码子。所述多核苷酸可以包含不超过3种类型的编码苏氨酸(Thr)的密码子。
在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的不超过4个不同密码子序列编码。所述多核苷酸可以包含不超过4种类型的编码精氨酸(Arg)的密码子。所述多核苷酸可以包含不超过4种类型的编码丝氨酸(Ser)的密码子。在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的不超过5个不同密码子序列编码。所述多核苷酸可以包含不超过5种类型的编码精氨酸(Arg)的密码子。所述多核苷酸可以包含不超过5种类型的编码丝氨酸(Ser)的密码子。在一些实施方案中，所述多核苷酸中的特定氨基酸可以由不超过6个不同的密码子序列编码。在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的1个或更多个不同密码子序列编码。在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的2个或更多个不同密码子序列编码。在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的3个或更多个不同密码子序列编码。在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的4个或更多个不同密码子序列编码。在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的5个或更多个不同密码子序列编码。在一些实施方案中，特定氨基酸可以由所述多核苷酸中的6个或更多个不同密码子序列编码。
在一些情况下，第一密码子序列的频率与所述多核苷酸中编码特定氨基酸的第二密码子序列的频率更高、更低或相同。例如，第一密码子的频率高于所述多核苷酸中编码特定氨基酸的第二密码子的频率。GCC密码子的频率可以高于GCT密码子的频率。GCT密码子的频率可以低于GCA密码子的频率。GCT密码子的频率可以高于GCA密码子的频率。
在一些实施方案中，所述多核苷酸中编码丙氨酸的密码子的密码子使用可以具有特定参数。例如，GCG密码子的频率可以不超过约10％或5％。GCA密码子的频率可以不超过约20％。GCT密码子的频率可以是至少约1％、5％、10％、15％、20％或25％。GCT密码子的频率可以不超过约30％、25％、20％、15％、10％或5％。GCC密码子的频率可以是至少约60％、70％、80％或90％。GCC密码子的频率不超过约95％、90％、85％、80％或75％。GCC密码子的频率可以高于GCT密码子的频率。GCT密码子的频率可以低于GCA密码子的频率。GCT密码子的频率可以高于GCA密码子的频率。
在一些实施方案中，所述多核苷酸中编码甘氨酸的密码子的密码子使用可以具有特定参数。例如，GGC密码子的频率可以低于GGA密码子的频率。例如，GGC密码子的频率可以高于GGA密码子的频率。GGG密码子的频率可以不超过约10％或5％。GGG密码子的频率可以是至少约1％。GGA密码子的频率可以不超过约30％或20％。GGA密码子的频率可以是至少约10％或20％。GGT密码子的频率可以大于约10％或5％。GGC密码子的频率可以不超过约90％、80％或70％。GGC密码子的频率可以是至少约60％、70％或80％。
在一些实施方案中，所述多核苷酸中编码脯氨酸的密码子的密码子使用可以具有特定参数。例如，CCC密码子的频率可以低于CCT密码子的频率。CCC密码子的频率可以高于CCT密码子的频率。CCC密码子的频率可以低于CCA密码子的频率。CCC密码子的频率可以高于CCA密码子的频率。CCT密码子的频率可以低于CCA密码子的频率。CCT密码子的频率可以高于CCA密码子的频率。CCG密码子的频率可以不超过约10％或5％。CCA密码子的频率可以不超过约30％、20％或10％。CCA密码子的频率可以是至少约5％、10％、15％、20％或25％。CCT密码子的频率可以不超过约60％、50％、40％或30％。CCT密码子的频率可以是至少约20％、30％、40％或50％。CCC密码子的频率可以不超过约60％、50％或40％。CCC密码子的频率可以是至少约30％、40％、50％、60％或70％。
在一些实施方案中，所述多核苷酸中编码苏氨酸的密码子的密码子使用可以具有特定参数。例如，ACA密码子的频率高于ACT密码子的频率。ACC密码子的频率可以高于ACT密码子的频率。ACC密码子的频率可以低于ACA密码子的频率。ACC密码子的频率可以高于ACA密码子的频率。ACG密码子的频率可以不超过约10％或5％。ACA密码子的频率可以不超过约60％、50％、40％或30％。ACA密码子的频率可以是至少约10％、20％、30％、40％或50％。ACT密码子的频率可以不超过约10％或5％。ACC密码子的频率可以不超过约90％、80％、70％、60％或50％。ACC密码子的频率是至少约40％、50％、60％、70％或80％。
在一些实施方案中，所述多核苷酸中编码精氨酸的密码子的密码子使用可以具有特定参数。例如，AGA密码子的频率可以低于AGG密码子的频率。AGA密码子的频率可以高于AGG密码子的频率。AGA密码子的频率可以低于CGG密码子的频率。AGA密码子的频率可以高于CGG密码子的频率。CGG密码子的频率可以高于CGA密码子的频率。CGG密码子的频率高于CGC密码子的频率。AGG密码子的频率可以不超过约10％。AGG密码子的频率可以小于约10％。AGA密码子的频率可以不超过约70％、60％或50％。AGA密码子的频率可以是至少约40％、50％、60％或70％。CGG密码子的频率可以不超过约50％、40％或30％。CGG密码子的频率可以是至少约20％、30％或40％。CGA密码子的频率可以是至少约1％。CGA密码子的频率可以不超过约10％或5％。CGT密码子的频率可能不超过约10％或5％。CGC密码子的频率可以不超过约20％、10％或5％。CGC密码子的频率可以是至少约1％、2％、3％、4％或5％。
在一些实施方案中，所述多核苷酸中编码丝氨酸的密码子的密码子使用可以具有特定参数。例如，AGC密码子的频率可以高于TCT密码子的频率。TCT密码子的频率可以高于TCG密码子的频率。TCT密码子的频率可以高于TCA密码子的频率。TCT密码子的频率可以高于TCC密码子的频率。AGT密码子的频率可以不超过约10％。AGT密码子的频率可以是至少约1％。AGC密码子的频率可以不超过约95％、90％、85％或80％。AGC密码子的频率可以是至少约70％、80％或90％。TCG密码子的频率可以不超过约10％或5％。TCA密码子的频率可以不超过约10％或5％。TCT密码子的频率可以不超过约30％、20％或10％。TCT密码子的频率可以是至少约10％或20％。TCC密码子的频率可以不超过约10％或5％。
示例编码CFTR的多核苷酸
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的mRNA。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ IDNO:1-4和23的序列的至少100个碱基具有至少约70％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少100个碱基具有至少约75％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少100个碱基具有至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的mRNA。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ IDNO:1-4和23的序列的至少200个碱基具有至少约70％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少200个碱基具有至少约75％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少200个碱基具有至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的mRNA。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ IDNO:1-4和23的序列具有至少约70％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列具有至少约75％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列具有至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1-4和23的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的mRNA。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ IDNO:1-4和23的序列的至少100个碱基具有至少约70％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少100个碱基具有至少约75％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少100个碱基具有至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的mRNA。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ IDNO:1-4和23的序列的至少200个碱基具有至少约70％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少200个碱基具有至少约75％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少200个碱基具有至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述合成多核苷酸是编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的mRNA。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ IDNO:1-4和23的序列具有至少约70％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列具有至少约75％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列具有至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1-4和23的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
表1.示例CFTR ORF序列
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非翻译区
在一些实施方案中，本公开文本的多核苷酸还包含3’-或5’-非翻译区或者3’-或5’-非编码区。在一些实施方案中，所述非翻译区或非编码区改善所述合成多核苷酸在细胞中的药代动力学特性(例如，半衰期延长)。在一些实施方案中，本公开文本的多核苷酸包含与SEQ ID NO:6-22所示中的一个具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的5’非翻译区(UTR)或3’UTR。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含5'帽结构。在一些实施方案中，5’帽结构包含与SEQ ID 6具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含3’聚腺苷尾。在一些实施方案中，所述3’聚腺苷尾包含与SEQ ID NO:7或8具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
表2.示例非翻译区序列
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核苷酸类似物
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述多核苷酸可以包含一种或多种核苷酸类似物。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物替代序列中的尿苷。例如，使用标准核苷酸(A、C、U、T、G)的序列可以在序列中的特定位置处包含尿苷。序列可以具有核苷酸类似物来代替尿苷。所述核苷酸类似物可以具有仍可被细胞翻译机制识别的结构，使得包含核苷酸类似物的多核苷酸仍可被翻译。所述核苷酸类似物可以被认为与标准核苷酸同义。例如，所述核苷酸类似物可以被认为与尿苷同义，并且所得的翻译产物就像所述核苷酸类似物是尿苷一样产生。在一些实施方案中，在所述多核苷酸内替代尿苷的至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是核苷酸类似物。在一些实施方案中，在所述多核苷酸内少于约15％的核苷酸是核苷酸类似物。在一些实施方案中，少于约30％的核苷酸是核苷酸类似物。在其他情况下，少于约27.5％、少于约25％、少于约22.5％、少于约20％、少于约17.5％、少于约15％、少于约12.5％、少于约10％、少于约7.5％、少于约5％或少于约2.5％的核苷酸是核苷酸类似物。
多核糖核苷酸可以具有相同的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸或者不同的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸的混合物。所述核苷酸类似物或经修饰的核苷酸可以具有信使RNA中天然或非天然存在的结构变化。可以使用各种类似物或经修饰的核苷酸的混合物。例如，多核苷酸内的一种或多种类似物可以具有天然修饰，而另一部分具有在mRNA中没有天然发现的修饰。此外，一些类似物或经修饰的核糖核苷酸可以具有碱基修饰，而其他经修饰的核糖核苷酸具有糖修饰。以相同的方式，所有修饰可能都是碱基修饰，或者所有修饰可能都是糖修饰或其任何合适的混合物。
核苷酸类似物或经修饰的核苷酸可以选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、1-甲基-l-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-l-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-l-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-l-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在所述合成多核苷酸的一些实施方案中，所述核苷酸类似物是嘌呤或嘧啶类似物。在一些情况下，本公开文本的多核糖核苷酸包含经修饰的嘧啶，如经修饰的尿苷。核苷酸类似物可以是假尿苷(Ψ)。核苷酸类似物可能是甲基假尿苷。核苷酸类似物可以是1-甲基假尿苷(m1Ψ)。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含1-甲基假尿苷。在一些情况下，尿苷类似物选自假尿苷1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷(s2U)、5-甲基尿苷(m5U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、4-硫代尿苷(s4U)、5-溴尿苷(Br5U)、2ˊO-甲基尿苷(U2ˊm)、2ˊ-氨基-2ˊ-脱氧尿苷(U2ˊNH2)、2ˊ-叠氮基-2ˊ-脱氧尿苷(U2ˊN3)和2ˊ-氟-2ˊ-脱氧尿苷(U2ˊF)。
在一些实施方案中，所述合成多核苷酸包含(例如，一个或多个)1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，在所述多核苷酸内替代尿苷的至少约80％的核苷酸是1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，在所述多核苷酸内替代尿苷的至少(约)5％、10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，在所述多核苷酸内替代尿苷的100％的核苷酸是1-甲基假尿苷。
核酸构建体、载体和工程化多核糖核苷酸
在一些实施方案中，本公开文本提供了编码一种或多种目的多肽的核酸分子，如多核苷酸。术语核酸包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。含有大于50％的核糖碱基或核糖核苷酸类似物的核苷酸聚合物被称为多核糖核苷酸。核苷酸聚合物可以使用编码蛋白质或其功能片段(如CFTR)的改变的核苷酸用法。工程化多核苷酸的序列可以衍生自例如DNA、RNA、mRNA转录物、基因组DNA、线粒体DNA、线粒体RNA或包含目的基因的遗传信息的另一合适的核酸。核酸构建体、载体、工程化多核糖核苷酸或组合物可以衍生自携带突变基因和多态性的核酸。
除了四种典型的核糖核苷酸，即腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷外，几种细胞RNA还含有许多结构上不同的核糖核苷酸。已经在转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)和小核RNA(snRNA)中鉴定出约一百个结构上不同的核苷酸或核苷酸类似物。在tRNA中，一些核苷酸可能是氨酰化和密码子识别作用的特异性和效率的重要决定因素。此类结构不同的核糖核苷酸可以是经修饰的核糖核苷酸或核苷酸类似物。在一些情况下，本公开文本的多核苷酸被工程化以包含核糖核苷酸类似物。
在一些情况下，核酸构建体、载体或多核苷酸被工程化以含有四种经典的核糖核苷酸，并且可以在施用于受试者后进行转录后修饰。例如，在一些情况下，本公开文本提供了包含编码CFTR的核酸构建体的组合物、载体或核酸构建体，其中编码CFTR的核酸的少于30％是核苷酸类似物。在其他情况下，编码CFTR的核苷酸的少于27.5％、少于25％、少于22.5％、少于20％、少于17.5％、少于15％、少于12.5％、少于10％、少于7.5％、少于5％或少于2.5％是核苷酸类似物。
可以形成本公开文本的多核苷酸的示例核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其杂交体。可以形成本公开文本的多核苷酸的至少一部分的示例经修饰的核苷酸包括但不限于假尿苷(T)和1-甲基假尿苷(m1Ψ)。
化学修饰可以位于一种或多种核苷或核酸分子的骨架上。它们可以位于核苷和骨架连接两者上。修饰可以在体外被工程化到多核苷酸中。经修饰的核糖核苷酸和核酸类似物也可以通过经典核糖核苷酸的共价修饰而在转录后引入。
本公开文本的核酸构建体、载体或工程化多核糖核苷酸可以包含嘌呤和嘧啶类似物。在一些情况下，本公开文本的多核糖核苷酸包含经修饰的嘧啶，如经修饰的尿苷。在一些情况下，尿苷类似物选自假尿苷(Ψ)、1-甲基假尿苷(m1Ψ)、2-硫代尿苷(s2U)、5-甲基尿苷(m5U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、4-硫代尿苷(s4U)、5-溴尿苷(Br5U)、2′O-甲基尿苷(U2′m)、2′-氨基-2′-脱氧尿苷(U2′NH2)、2′-叠氮基-2′-脱氧尿苷(U2′N3)和2′-氟-2′-脱氧尿苷(U2F)。
在一些情况下，所述一种或多种核酸构建体、一种或多种载体、一种或多种工程化多核糖核苷酸或一种或多种组合物以如下水平编码CFTR或其变体，所述水平与暴露于包含核酸构建体(其不包括编码CFTR或其变体的密码子)的组合物的细胞内的水平相比增加至少约1.5倍。在一些情况下，所述倍数是至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90或至少约100倍。
多核糖核苷酸可以具有相同的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸或者不同的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸的混合物。所述核苷酸类似物或经修饰的核苷酸可以具有信使RNA中天然或非天然存在的结构变化。可以使用各种类似物或经修饰的核苷酸的混合物。例如，多核苷酸内的一种或多种类似物可以具有天然修饰，而另一部分具有在mRNA中没有天然发现的修饰。此外，一些类似物或经修饰的核糖核苷酸可以具有碱基修饰，而其他经修饰的核糖核苷酸具有糖修饰。以相同的方式，所有修饰可能都是碱基修饰，或者所有修饰可能都是糖修饰或其任何合适的混合物。
核苷酸类似物或经修饰的核苷酸可以选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在一些情况下，至少约5％的一种或多种核酸构建体、一种或多种载体、一种或多种工程化多核糖核苷酸或组合物包括非天然存在的(例如，经修饰的、类似物或工程化的)尿苷、腺苷、鸟嘌呤或胞嘧啶(如本文所述的核苷酸)。在一些情况下，所述组合物中100％的经修饰的核苷酸是1-甲基假尿苷或假尿苷。在一些情况下，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的一种或多种核酸构建体、一种或多种载体、一种或多种工程化多核糖核苷酸或组合物包括非天然存在的尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。在一些情况下，至多约99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％的一种或多种核酸构建体、一种或多种载体、一种或多种工程化多核糖核苷酸或组合物包括非天然存在的尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。
本公开文本的一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸可以包含一个或多个启动子序列和任何相关的调节序列。启动子序列和/或相关的调节序列可以包含任何数量的经修饰的或未修饰的核苷酸以及任何数量的核酸类似物。启动子序列和/或任何相关的调节序列可以包含例如至少2个碱基或碱基对、3个碱基或碱基对、4个碱基或碱基对、5个碱基或碱基对、6个碱基或碱基对、7个碱基或碱基对、8个碱基或碱基对、9个碱基或碱基对、10个碱基或碱基对、11个碱基或碱基对、12个碱基或碱基对、13个碱基或碱基对、14个碱基或碱基对、15个碱基或碱基对、16个碱基或碱基对、17个碱基或碱基对、18个碱基或碱基对、19个碱基或碱基对、20个碱基或碱基对、21个碱基或碱基对、22个碱基或碱基对、23个碱基或碱基对、24个碱基或碱基对、25个碱基或碱基对、26个碱基或碱基对、27个碱基或碱基对、28个碱基或碱基对、29个碱基或碱基对、30个碱基或碱基对、35个碱基或碱基对、40个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、75个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、150个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、至少10000个碱基或碱基对或更多。启动子序列和/或相关的调节序列可以包含任何数量的经修饰的或未修饰的核苷酸，例如至多10000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、75个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、40个碱基或碱基对、35个碱基或碱基对、30个碱基或碱基对、29个碱基或碱基对、28个碱基或碱基对、27个碱基或碱基对、26个碱基或碱基对、25个碱基或碱基对、24个碱基或碱基对、23个碱基或碱基对、22个碱基或碱基对、21个碱基或碱基对、20个碱基或碱基对、19个碱基或碱基对、18个碱基或碱基对、17个碱基或碱基对、16个碱基或碱基对、15个碱基或碱基对、14个碱基或碱基对、13个碱基或碱基对、12个碱基或碱基对、11个碱基或碱基对、10个碱基或碱基对、9个碱基或碱基对、8个碱基或碱基对、7个碱基或碱基对、6个碱基或碱基对、5个碱基或碱基对、4个碱基或碱基对、3个碱基或碱基对、或2个碱基或碱基对。
在一些情况下，启动子序列或相关调节区域中的少于所有的核苷酸是核苷酸类似物或经修饰的核苷酸。例如，在一些情况下，启动子或相关调节区域中的少于或等于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的核苷酸。在一些情况下，启动子或相关调节区域中的所有核苷酸是核酸类似物或经修饰的核苷酸。
本公开文本的一种或多种核酸构建体、一种或多种载体、一种或多种工程化多核糖核苷酸或组合物可以包含工程化的5'帽结构，或者5'帽可以在细胞内添加至多核糖核苷酸中。mRNA的5'帽结构可以参与结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，并且通过CBP与聚(A)结合蛋白的缔合而负责细胞中mRNA的稳定性和翻译能力，从而形成成熟的假环状mRNA物质。5'帽结构还可以参与核输出，增加mRNA的稳定性并且在mRNA剪接过程中协助去除5'近端内含子。
一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸可以是5'端加帽的，从而在mRNA分子的末端鸟苷帽残基和5'末端转录的有义核苷酸之间产生5'-GpppN-3'-三磷酸连接。所述帽结构可以包含经修饰或未修饰的7-甲基鸟苷，其经由5'-5'三磷酸桥与第一核苷酸连接。然后该5'-鸟苷酸帽可以被甲基化，以产生N7-甲基-鸟苷酸残基(帽0结构)。mRNA的5'端的末端核苷酸和/或先前末端(anteterminal)转录的核苷酸的核糖也可以任选地被2′-O-甲基化(帽1结构)。通过鸟苷酸帽结构的水解和切割进行的5'-脱帽可以靶向核酸分子(如mRNA分子)，以进行降解。
在一些情况下，帽可以包含另外的修饰，包括mRNA的5'端的前2个核糖的2'羟基的甲基化。例如，真核生物帽1在第一个核糖上具有甲基化的2'-羟基，而帽2在前两个核糖上具有甲基化的2'-羟基。5'帽可以在化学上类似于RNA分子的3'端(帽核糖的5'碳是键合的，并且在加帽的转录物的5'和3'端上的游离3'-羟基)。这种双重修饰可以提供对5'外切核酸酶的显著抗性。可以与工程化多核糖核苷酸一起使用的5'帽结构的非限制性例子包括但不限于m7G(5')ppp(5')N(帽0)、m7G(5')ppp(5')N1mpNp(帽1)和m7G(5')-ppp(5)N1mpN2mp(帽2)。
对本公开文本的经修饰的mRNA的修饰可以产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽并因此增加mRNA的半衰期，同时促进有效翻译。因为帽结构水解需要切割5'-ppp-5'三磷酸连接，所以在加帽反应期间可以使用经修饰的核苷酸。例如，来自New England Biolabs(马萨诸塞州伊普斯维奇市)的痘苗病毒加帽酶可以根据制造商的说明与鸟苷α-硫代磷酸核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中产生硫代磷酸连接。可以使用另外的经修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸和硒代磷酸核苷酸。另外的修饰包括但不限于糖环的2'-羟基上的、mRNA的5'末端和/或5'先前末端核苷酸的核糖的2'-O-甲基化。可以使用多个不同的5'帽结构来生成多核糖核苷酸的5'帽。
经修饰的mRNA可以在转录后被加帽。根据本公开文本，5'末端帽可以包括内源性帽或帽类似物。根据本公开文本，5'末端帽可以包括鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
此外，一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸可以含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。在没有5'帽结构的情况下，IRES序列可以启动蛋白质合成。IRES序列也可以是唯一的核糖体结合位点，或者其可以充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的工程化多核糖核苷酸可以编码由核糖体翻译的几种肽或多肽(“多顺反子(polycistronic或multicistronic)多核苷酸”)。在此描述的工程化多核苷酸可以包含至少1个IRES序列、两个IRES序列、三个IRES序列、四个IRES序列、五个IRES序列、六个IRES序列、七个IRES序列、八个IRES序列、九个IRES序列、十个IRES序列，或另一合适数量存在于工程化多核糖核苷酸中。可以根据本公开文本使用的IRES序列的例子包括而不限于来自以下病毒的那些：烟草蚀纹病毒(TEV)、小核糖核酸病毒(例如，FMDV)、有害生物病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。IRES序列可以例如源自可商购的载体，如从ClontechTM、GeneCopoeiaTM或Sigma-AldrichTM可得的IRES序列。IRES序列可以例如是至少150个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、或10000个碱基或碱基对。IRES序列可以至多是10000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、或10个碱基或碱基对。
本公开文本的一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸可以包含一个或多个非翻译区。非翻译区可以包含任何数量的经修饰的或未修饰的核苷酸。基因的非翻译区(UTR)被转录但不被翻译成多肽。在一些情况下，非翻译序列可以增加核酸分子的稳定性和翻译效率。例如，可以将UTR的调节特征掺入本公开文本的经修饰的mRNA分子中，以增加分子的稳定性。还可以掺入具体特征，以确保在转录物被误导到不希望的器官部位的情况下对转录物进行受控下调。一些5'UTR在翻译启动中发挥作用。5'UTR可以包含Kozak序列，所述序列参与核糖体启动许多基因翻译的过程。Kozak序列可以具有共有序列GCC(R)CCAUGG，其中R是位于起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)。Kozak序列可以包含GCCACC。5'UTR可以形成参与翻译延伸因子的结合的二级结构。在一些情况下，通过使通常在特定靶器官的大量表达基因中发现的特征工程化，可以增加本公开文本的工程化多核苷酸分子的稳定性和蛋白质产量。例如，引入肝脏表达的mRNA(如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白AB/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5'UTR可以用于增加工程化多核苷酸在肝脏中的表达。同样地，使用来自肌肉蛋白(MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素、Herculin)的5'UTR可以用于增加工程化多核苷酸在所需细胞或组织中的表达—对于内皮细胞(Tie-1、CD36)，对于髓样细胞(C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD1 lb、MSR、Fr-1、i-NOS)，对于白细胞(CD45、CD18)，对于脂肪组织(CD36、GLUT4、ACRP30、脂联素)以及对于肺上皮细胞(SP-A/B/C/D)。
其他非UTR序列可以并入本公开文本的多核糖核苷酸的5'UTR(或3'UTR)中。5'和/或3'UTR可以提供多核糖核苷酸的稳定性和/或翻译效率。例如，内含子或内含子序列的部分可以掺入工程化多核糖核苷酸的侧翼区域。内含子序列的掺入还可以提高多核糖核苷酸的翻译速率。
3'UTR可以具有嵌入其中的腺苷和尿苷段。这些富AU特征在高转换率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富AU元件(ARE)可以分为以下类别：I类ARE在富U区域内含有几个分散的AUUUA基序考贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有这种类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-α。III类ARE的定义不太明确。这些富U区域不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这一类的两个经过充分研究的例子。与ARE结合的蛋白质可能会使信使不稳定，而ELAV家族的成员(如HuR)可以增加mRNA的稳定性。HuR可以结合所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中可以导致HuR结合，从而稳定体内信使。
3'UTR富AU元件(ARE)的工程化可以用于调节工程化多核糖核苷酸的稳定性。ARE的一个或多个拷贝可以被工程化到多核糖核苷酸中，以调节多核糖核苷酸的稳定性。可以鉴定、去除或突变ARE以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。使用工程化多核糖核苷酸，转染实验可以在相关细胞系中进行，并且可以在转染后的多个时间点测定蛋白质的产生。例如，可以用不同的ARE工程化分子转染细胞，并通过使用ELISA试剂盒测定转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的相关蛋白和测定蛋白。
非翻译区可以包含任意数量的核苷酸。非翻译区可以具有约1至约10个碱基或碱基对、约10至约20个碱基或碱基对、约20至约50个碱基或碱基对、约50至约100个碱基或碱基对、约100至约500个碱基或碱基对、约500至约1000个碱基或碱基对、约1000至约2000个碱基或碱基对、约2000至约3000个碱基或碱基对、约3000至约4000个碱基或碱基对、约4000至约5000个碱基或碱基对、约5000至约6000个碱基或碱基对、约6000至约7000个碱基或碱基对、约7000至约8000个碱基或碱基对、约8000至约9000个碱基或碱基对、或约9000至约10000个碱基或碱基对的长度。非翻译区可以具有例如至少1个碱基或碱基对、2个碱基或碱基对、3个碱基或碱基对、4个碱基或碱基对、5个碱基或碱基对、6个碱基或碱基对、7个碱基或碱基对、8个碱基或碱基对、9个碱基或碱基对、10个碱基或碱基对、20个碱基或碱基对、30个碱基或碱基对、40个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、60个碱基或碱基对、70个碱基或碱基对、80个碱基或碱基对、90个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、6000个碱基或碱基对、7000个碱基或碱基对、8000个碱基或碱基对、9000个碱基或碱基对、或10000个碱基或碱基对的长度。
本公开文本的工程化多核糖核苷酸可以包含一个或多个内含子。内含子可以包含任意数量的经修饰的或未修饰的核苷酸。内含子可以包含例如至少1个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、150个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、或5000个碱基或碱基对。在一些情况下，内含子可以包含例如至多10000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、或100个碱基或碱基对。
在一些情况下，内含子中一定百分比的核苷酸被修饰。例如，在一些情况下，内含子中少于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的核苷酸被修饰。在一些情况下，内含子中的所有核苷酸都被修饰。
本公开文本的工程化多核糖核苷酸可以包含聚A序列。聚A序列(例如，聚A尾)可以包含任何数量的核苷酸。聚A序列可以具有约1至约10个碱基或碱基对、约10至约20个碱基或碱基对、约20至约50个碱基或碱基对、约50至约100个碱基或碱基对、约100至约500个碱基或碱基对、约500至约1000个碱基或碱基对、约1000至约2000个碱基或碱基对、约2000至约3000个碱基或碱基对、约3000至约4000个碱基或碱基对、约4000至约5000个碱基或碱基对、约5000至约6000个碱基或碱基对、约6000至约7000个碱基或碱基对、约7000至约8000个碱基或碱基对、约8000至约9000个碱基或碱基对、或约9000至约10000个碱基或碱基对的长度。在一些例子中，聚A序列的长度是至少约100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个核苷酸。聚A序列可以具有例如至少1个碱基或碱基对、2个碱基或碱基对、3个碱基或碱基对、4个碱基或碱基对、5个碱基或碱基对、6个碱基或碱基对、7个碱基或碱基对、8个碱基或碱基对、9个碱基或碱基对、10个碱基或碱基对、20个碱基或碱基对、30个碱基或碱基对、40个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、60个碱基或碱基对、70个碱基或碱基对、80个碱基或碱基对、90个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、6000个碱基或碱基对、7000个碱基或碱基对、8000个碱基或碱基对、9000个碱基或碱基对、或10000个碱基或碱基对的长度。聚A序列可以具有至多100个碱基或碱基对、90个碱基或碱基对、80个碱基或碱基对、70个碱基或碱基对、60个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、40个碱基或碱基对、30个碱基或碱基对、20个碱基或碱基对、10个碱基或碱基对、或5个碱基或碱基对的长度。
在一些情况下，聚A序列中一定百分比的核苷酸被修饰。例如，在一些情况下，聚A序列中少于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的核苷酸被修饰。在一些情况下，聚A中的所有核苷酸都被修饰。
接头序列可以包含任意数量的核苷酸。接头可以附接到经修饰的核碱基的N-3或C-5位置处。与核碱基附接的接头可以是二甘醇、二丙二醇、三甘醇、三丙二醇、四甘醇、四甘醇、二价烷基、烯基、炔基部分、酯、酰胺或醚部分。接头序列可以具有约1至约10个碱基或碱基对、约10至约20个碱基或碱基对、约20至约50个碱基或碱基对、约50至约100个碱基或碱基对、约100至约500个碱基或碱基对、约500至约1000个碱基或碱基对、约1000至约2000个碱基或碱基对、约2000至约3000个碱基或碱基对、约3000至约4000个碱基或碱基对、约4000至约5000个碱基或碱基对、约5000至约6000个碱基或碱基对、约6000至约7000个碱基或碱基对、约7000至约8000个碱基或碱基对、约8000至约9000个碱基或碱基对、或约9000至约10000个碱基或碱基对的长度。接头序列可以具有例如至少1个碱基或碱基对、2个碱基或碱基对、3个碱基或碱基对、4个碱基或碱基对、5个碱基或碱基对、6个碱基或碱基对、7个碱基或碱基对、8个碱基或碱基对、9个碱基或碱基对、10个碱基或碱基对、20个碱基或碱基对、30个碱基或碱基对、40个碱基或碱基对、50个碱基或碱基对、60个碱基或碱基对、70个碱基或碱基对、80个碱基或碱基对、90个碱基或碱基对、100个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、6000个碱基或碱基对、7000个碱基或碱基对、8000个碱基或碱基对、9000个碱基或碱基对、或至少10000个碱基或碱基对的长度。接头的长度可以是至多10000个碱基或碱基对、5000个碱基或碱基对、4000个碱基或碱基对、3000个碱基或碱基对、2000个碱基或碱基对、1000个碱基或碱基对、900个碱基或碱基对、800个碱基或碱基对、700个碱基或碱基对、600个碱基或碱基对、500个碱基或碱基对、400个碱基或碱基对、300个碱基或碱基对、200个碱基或碱基对、或100个碱基或碱基对。
在一些情况下，接头序列中一定百分比的核苷酸被修饰。例如，在一些情况下，接头序列中少于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的核苷酸被修饰。在一些情况下，接头序列中的所有核苷酸都被修饰。
在一些情况下，一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸可以在3'非翻译区(UTR)之前包括至少一个终止密码子。在一些情况下，一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸包括多个终止密码子。终止密码子可以选自TGA、TAA和TAG。终止密码子可以是经修饰的或未修饰的。在一些情况下，一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸包括终止密码子TGA和一个另外的终止密码子。在一些情况下，一种或多种核酸构建体、一种或多种载体或一种或多种工程化多核糖核苷酸包括添加TAA终止密码子。
脂质组合物
在所述(例如，药物的)组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含：(1)可电离阳离子脂质；和(2)与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。在一些实施方案中，所述(例如，药物的)组合物还包含两性离子脂质(例如磷脂)。
可电离阳离子脂质
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质含有一个或多个基团，所述基团在生理pH下被质子化但也可以去质子化，并且在高于8、9、10、11或12的pH下不带电荷。所述可电离阳离子基团可以含有一种或多种可质子化的胺，其能够在生理pH下形成阳离子基团。所述可离子阳离子脂质化合物还可以进一步包含一种或多种脂质组分，如具有C6-C24烷基或烯基碳基团的两种或更多种脂肪酸。这些脂质基团可以通过酯连接而附接在一起，或者可以通过迈克尔加成进一步添加到硫原子中。在一些实施方案中，这些化合物可以是树状聚合物、树突状聚合物(dendron)或其组合。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是指具有可获得电荷(pKa)的氮原子的脂质和类脂分子。这些脂质在文献中可以称为阳离子脂质。这些具有氨基的分子通常具有2与6个之间的疏水链(通常为烷基或烯基，如C6-C24烷基或烯基)，但可具有至少1个或多于6个尾。在一些实施方案中，这些可电离阳离子脂质是树状聚合物，其是表现出规则树状分支的聚合物，其通过向核心或从核心依次添加或代添加分支层形成，并且其特征在于核心、至少一个内部分支层和表面分支层。(参见Petar R.Dvornic和Donald A.Tomalia in Chem.in Britain,641-645,1994年8月.)在其他实施方案中，如本文所用的术语“树状聚合物”旨在包括但不限于如下分子结构，所述分子结构具有内核、规则地附接到该内核的重复单元的内层(或“代”)、以及附接到最外代的终止基团的外表面。“树突状聚合物”是一种树状聚合物，其具有从焦点发出的分支，所述焦点直接或通过连接部分连接到或可以连接到核心，以形成更大的树状聚合物。在一些实施方案中，所述树状聚合物结构具有来自中央核心的辐射状重复基团，所述中央核心与每个分支的每个重复单元一起搭配。在一些实施方案中，本文所述的树状聚合物可以描述为小分子、中等大小的分子、脂质或类脂物质。这些术语可以用于本文所述的具有树突状外观(例如从单个焦点辐射的分子)的化合物。
虽然树状聚合物是聚合物，但树状聚合物可能比传统聚合物更优选，因为它们具有可控的结构、单一分子量、众多且可控的表面官能团，并且在达到特定代后传统地采用球状构象。树状聚合物可以通过每个重复单元的顺序反应来制备，以产生单分散的、树状和/或代结构的聚合物结构。单个树状聚合物由中央核心分子以及与该中央核心上的一个或多个功能位点附接的树状楔形物组成。根据制备过程中使用的组装单体，树状聚合物表面层可以具有布置在其上的多种官能团，包括阴离子基团、阳离子基团、亲水基团或亲脂基团。
在对核心、重复单元以及表面基团或终止基团的官能团和/或化学特性进行修饰的情况下，可以调节它们的物理特性。可以改变的一些特性包括但不限于溶解性、毒性、免疫原性和生物附着能力。树状聚合物通常通过分支中的重复单元的代或数量来描述。仅由核心分子组成的树状聚合物称为第0代，而沿所有分支的每个连续重复单元为第1代、第2代，依此类推，直到终止基团或表面基团。在一些实施方案中，半代可能仅由与胺的第一缩合反应而非与硫醇的第二缩合反应产生。
树状聚合物的制备需要通过一系列逐步反应(包括通过每个连续基团构建树状聚合物)实现的一定水平的合成控制。树状聚合物的合成可以是收敛型或发散型。在发散型树状聚合物合成过程中，分子以逐步方法从核心到外围组装，所述逐步方法涉及将一代附接到前一代，然后改变官能团以进行下一阶段的反应。官能团转化是防止不受控制的聚合所必需的。这种聚合将导致高度支化的分子，其不是单分散的并且另外被称为超支化聚合物。由于空间效应，继续与树状聚合物重复单元反应会产生球形分子，直到空间过度拥挤会阻止特定代的完全反应并破坏分子的单分散性。因此，在一些实施方案中，特别考虑G1-G10代的树状聚合物。在一些实施方案中，树状聚合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复单元，或其中可衍生的任何范围。在一些实施方案中，本文所用的树状聚合物是G0、G1、G2或G3。然而，可以通过减少支化聚合物中的间隔单元来增加可能的代数(如11、12、13、14、15、20或25代)。
此外，树状聚合物具有两个主要的化学环境：由终止代上的特定表面基团和树状结构的内部产生的环境，由于高阶结构，所述树状结构的内部可以与主体介质和表面基团隔离。由于这些不同的化学环境，已经发现树状聚合物有许多不同的潜在用途，包括在治疗性应用中的用途。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，使用丙烯酸根和甲基丙烯酸根基团与胺和硫醇的不同反应性来组装所述树状聚合物。所述树状聚合物可以包括通过丙烯酸根基团与伯胺或仲胺以及甲基丙烯酸根与巯基进行反应形成的仲胺或叔胺以及硫醚。此外，所述树状聚合物的重复单元可以含有在生理条件下可降解的基团。在一些实施方案中，这些重复单元可以含有一种或多种生发二醚、酯、酰胺或二硫化物基团。在一些实施方案中，所述核心分子是单胺，其仅允许在一个方向上进行树状聚合。在其他实施方案中，所述核心分子是具有多个不同的树状分支的聚胺，所述树状分支可以各自包含一个或多个重复单元。所述树状聚合物可以通过从该核心去除一个或多个氢原子来形成。在一些实施方案中，这些氢原子位于杂原子(如氮原子)上。在一些实施方案中，所述终止基团是亲脂基团，如长链烷基或烯基。在其他实施方案中，所述终止基团是长链卤代烷基或卤代烯基。在其他实施方案中，所述终止基团是含有可电离基团(如胺(-NH2)或羧酸(-CO2H))的脂肪族或芳族基团。在仍其他实施方案中，所述终止基团是含有一个或多个氢键供体(如氢氧化物基团、酰胺基团或酯)的脂肪族或芳族基团。
本申请的可电离阳离子脂质可以含有一个或多个不对称取代的碳或氮原子，并且可以以光学活性形式或外消旋形式分离。因此，除非明确指出具体的立体化学或异构形式，否则化学式的所有手性形式、非对映异构形式、外消旋形式、差向异构形式以及所有几何异构形式都是预期的。可电离阳离子脂质可以作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单个非对映异构体出现。在一些实施方案中，获得单一的非对映异构体。本申请的可电离阳离子脂质的手性中心可以具有S或R构型。此外，预期这些可电离阳离子脂质中的一种或多种可以作为构造异构体存在。在一些实施方案中，所述化合物具有相同的式但与核心中的氮原子的连接性不同。不希望受任何理论的束缚，相信存在这样的可电离阳离子脂质，因为起始单体首先与伯胺反应然后与存在的任何仲胺统计地进行反应。因此，构造异构体可以呈现完全反应的伯胺，然后是反应的仲胺的混合物。
用于表示本申请的可电离阳离子脂质的化学式通常仅显示可能的几种不同互变异构体中的一种。例如，已知存在许多类型的酮基团，其与相应的烯醇基团处于平衡状态。类似地，存在许多类型的亚胺基团，其与烯胺基团处于平衡状态。无论针对给定的式描述哪种互变异构体，也无论最普遍的是哪种，给定化学式的所有互变异构体都是预期的。
本申请的可电离阳离子脂质还可以具有以下优点：它们可以比现有技术中已知的化合物更有效、毒性更小、作用时间更长、更强效、产生更少的副作用、更容易吸收、和/或具有更好的药代动力学特征(例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)和/或具有其他有用的药理学、物理或化学特性，无论是用于本文所述的适应证中还是其他。
此外，构成本申请的可电离阳离子脂质的原子旨在包括这些原子的所有同位素形式。如本文所用的同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子。作为一般示例而非限制，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括13C和14C。
应认识到，形成本文提供的任何盐形式的可电离阳离子脂质的一部分的具体阴离子或阳离子不是关键的，只要盐作为一个整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其他例子及其制备和使用方法呈现于Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(2002)中，将其通过引用并入本文。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是树状聚合物或树突状聚合物。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质包含铵基团，所述铵基团在生理pH下带正电并且含有至少两个疏水基团。在一些实施方案中，所述铵基团在约6至约8的pH下带正电。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是树状聚合物或树突状聚合物。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质包含至少两个C6-C24烷基或烯基。
式(I)的树状聚合物
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质包含至少两个C8-C24烷基。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是进一步由下式定义的树状聚合物：
核心-重复单元-终止基团(D-I)
其中，所述核心通过从所述核心去除一个或多个氢原子并用所述重复单元替换所述原子而与所述重复单元连接，并且其中：
所述核心具有式：
其中：
X1是氨基或烷氨基(c≤12)、二烷氨基(c≤12)、杂环烷基(c≤12)、杂芳基(c≤12)或其取代形式；
R1是氨基、羟基或巯基，或烷氨基(c≤12)、二烷氨基(c≤12)或这两种基团中任一种的取代形式；并且
a是1、2、3、4、5或6；或者
所述核心具有式：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢、烷基(c≤18)或经取代的烷基(c≤18)；并且
y是0、1或2，条件是y和z的和是3；
R2是氨基、羟基或巯基，或烷氨基(c≤12)、二烷氨基(c≤12)或这两种基团中任一种的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；并且
z是1、2、3；条件是z和y的和是3；或者
所述核心具有式：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(c≤8)或经取代的烷基(c≤8)、-O-或烷氨基二基(c≤8)、烷氧基二基(c≤8)、芳二基(c≤8)、杂芳二基(c≤8)、杂环烷二基(c≤8)或任何这些基团的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基，或烷氨基(c≤12)、二烷氨基(c≤12)或这两种基团中任一种的取代形式；或下式的基团：
-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、/>
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；条件是e和f的和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6；或者
所述核心是烷基胺(c≤18)、二烷基胺(c≤36)、杂环烷烃(c≤12)或任何这些基团的取代形式；其中所述重复单元包含可降解的二酰基和接头；
所述可降解的二酰基具有式：
其中：
A1和A2各自独立地是-O-、-S-或-NRa-，其中：
Ra是氢、烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)；
Y3是烷二基(c≤12)、烯二基(c≤12)、芳二基(c≤12)或任何这些基团的取代形式；
或下式的基团：
其中：
X3和X4是烷二基(c≤12)、烯二基(c≤12)、芳二基(c≤12)或任何这些基团的取代形式；
Y5是共价键、烷二基(c≤12)、烯二基(c≤12)、芳二基(c≤12)或任何这些基团的取代形式；并且
R9是烷基(c≤8)或经取代的烷基(c≤8)；
所述接头基团具有式：
其中：
Y1是烷二基(c≤12)、烯二基(c≤12)、芳二基(c≤12)或任何这些基团的取代形式；
并且
其中当所述重复单元包含接头基团时，如果n大于1，则所述接头基团包含与所述接头基团的氮原子和硫原子附接的独立可降解二酰基，其中所述重复单元中的第一基团是可降解二酰基，其中对于每个接头基团，下一个重复单元包含与所述接头基团的氮原子附接的两个可降解二酰基；并且其中n是存在于所述重复单元中的接头基团的数量；并且
所述终止基团具有式：
其中：
Y4是烷二基(c≤18)或烷二基(c≤18)，其中烷二基(c≤18)上的氢原子中的一个或多个已被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3或-OC(O)CH3
替代；
R10是氢、羧基、羟基或
芳基(c≤12)、烷氨基(c≤12)、二烷氨基(c≤12)、N-杂环烷基(c≤12)、-C(O)N(R11)-烷二基(c≤6)-杂环烷基(c≤12)、-C(O)-烷氨基(c≤12)、-C(O)-二烷氨基(c≤12)、-C(O)-N-
杂环烷基(c≤12)，其中：
R11是氢、烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)；
其中所述链中的最终可降解二酰基附接至终止基团；
n是0、1、2、3、4、5或6；
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述终止基团进一步由下式定义：
其中：
Y4是烷二基(c≤18)；并且
R10是氢。在一些实施方案中，A1和A2各自独立地是-O-或-NRa-。
在式(D-I)的树状聚合物的一些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X2是N(R5)y；
R5是氢或烷基(c≤8)或经取代的烷基(c≤18)；并且
y是0、1或2，条件是y和z的和是3；
R2是氨基、羟基或巯基，或烷氨基(c≤12)、二烷氨基(c≤12)或这两种基团中任一种的取代形式；
b是1、2、3、4、5或6；并且
z是1、2、3；条件是z和y的和是3。
在式(D-I)的树状聚合物的一些实施方案中，所述核心进一步由下式定义：
其中：
X3是-NR6-，其中R6是氢、烷基(c≤8)或经取代的烷基(c≤8)、-O-或烷氨基二基(c≤8)、烷氧基二基(c≤8)、芳二基(c≤8)、杂芳二基(c≤8)、杂环烷二基(c≤8)或任何这些基团的取代形式；
R3和R4各自独立地是氨基、羟基或巯基，或烷氨基(c≤12)、二烷氨基(c≤12)或这两种基团中任一种的取代形式；或下式的基团：-N(Rf)f(CH2CH2N(Rc))eRd、
其中：
e和f各自独立地是1、2或3；条件是e和f的和是3；
Rc、Rd和Rf各自独立地是氢、烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)；
c和d各自独立地是1、2、3、4、5或6。
在式(I)的树状聚合物的一些实施方案中，所述终止基团由下式表示：
其中：
Y4是烷二基(c≤18)；并且
R10是氢。
在式(D-I)的树状聚合物的一些实施方案中，所述核心进一步定义为：
/>
在式(D-I)的树状聚合物的一些实施方案中，所述可降解二酰基进一步定义为：
在式(D-I)的树状聚合物的一些实施方案中，所述接头进一步定义为
其中Y1是烷二基(c≤8)或经取代的烷二基(c≤8)。
在式(D-I)的树状聚合物的一些实施方案中，所述树状聚合物选自：
/>
及其药学上可接受的盐。
式(X)的树状聚合物
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是式的树状聚合物。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是式的树状聚合物。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质是具有结构式：的代(g)的树状聚合物；/>
或其药学上可接受的盐，其中：
(a)所述核心包含结构式(X核心)：
其中：
Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b-；
R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f；
R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选经取代的(例如C1-C6，如C1-C3)烷基；
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在)在每次出现时各自独立地是与分支、氢或任选经取代的(例如，C1-C12)烷基的连接点；
L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、亚烷基、杂亚烷基、[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基]、[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基]、杂环烷基和亚芳基；或者，
可替代地，L1的一部分与R1c和R1d之一形成(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，含有一个或两个氮原子以及任选地选自氧和硫的另外的杂原子)；并且
x1是0、1、2、3、4、5或6；和
(b)多个(N个)分支中的每个分支独立地包含结构式(X分支):
其中：
*表示所述分支与所述核心的附接点；
g是1、2、3或4；
Z＝2(g-1)；
G＝0，当g＝1时；或当g≠1时；
(c)每个二酰基独立地包含结构式其中：
*表示所述二酰基在其近端的附接点；
**表示所述二酰基在其远端的附接点；
Y3在每次出现时独立地是任选经取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选经取代的(例如，C1-C12)亚烯基、或任选经取代的(例如，C1-C12)亚芳基；
A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-，其中：
R4是氢或任选经取代的(例如，C1-C6)烷基；
m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3；并且
R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选经取代的(例如，C1-C8)烷基；以及
(d)每个接头基团独立地包含结构式
其中：
**表示所述接头与近端二酰基的附接点；
***表示所述接头与远端二酰基的附接点；并且
Y1在每次出现时独立地是任选经取代的(例如，C1-C12)亚烷基、任选经取代的(例如，C1-C12)亚烯基、或任选经取代的(例如，C1-C12)亚芳基；以及
(e)每个终止基团独立地选自任选经取代的(例如C1-C18，如C4-C18)烷基硫醇和任选经取代的(例如C1-C18，如C4-C18)烯基硫醇。
在X核心的一些实施方案中，Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b。在X核心的一些实施方案中，Q在每次出现时独立地是共价键。在X核心的一些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-O-。在X核心的一些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-S-。在X核心的一些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-NR2，并且R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f。在X核心的一些实施方案中，Q在每次出现时独立地是-CR3aR3bR3a，并且R3a和R3b在每次出现时独立地是氢或任选经取代的烷基(例如C1-C6，如C1-C3)。
在X核心的一些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在)在每次出现时各自独立地是与分支、氢或任选经取代的烷基的连接点。在X核心的一些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在)在每次出现时各自独立地是与分支、氢的连接点。在X核心的一些实施方案中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在)在每次出现时各自独立地是与分支、任选经取代的烷基(例如，C1-C12)的连接点。
在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、亚烷基、杂亚烷基、[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基]、[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基]、杂环烷基和亚芳基；或者可替代地，L1的一部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基(例如，C4-C6，并含有一个或两个氮原子以及任选地选自氧和硫的另外的杂原子)。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是共价键。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是氢。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚烷基(例如C1-C12，如C1-C6或C1-C3)。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是杂亚烷基(例如C1-C12，如C1-C8或C1-C6)。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是杂亚烷基(例如C2-C8亚烷基氧化物，如低聚(环氧乙烷))。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-[杂环烷基]-[亚烷基]，例如[(例如，C1-C6)亚烷基]-[(例如，C4-C6)杂环烷基]-[(例如，C1-C6)亚烷基]。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基]，例如[(例如，C1-C6)亚烷基]-(亚芳基)-[(例如，C1-C6)亚烷基]。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是[亚烷基]-(亚芳基)-[亚烷基](例如，[(例如，C1-C6)亚烷基]-亚苯基-[(例如，C1-C6)亚烷基])。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是杂环烷基(例如，C4-C6杂环烷基)。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地可以是亚芳基(例如，亚苯基)。在X核心的一些实施方案中，L1的一部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基。在X核心的一些实施方案中，L1的一部分与R1c和R1d之一形成杂环烷基(例如，C4-C6杂环烷基)，并且所述杂环烷基可以含有一个或两个氮原子以及任选地选自氧和硫的另外的杂原子。
在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、C2-C12(例如C2-C8)亚烷基氧化物(例如低聚(环氧乙烷)，如-(CH2CH2O)1-4-(CH2CH2)-)、[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，)以及[(C1-C4)亚烷基]-亚苯基-[(C1-C4)亚烷基](例如，/>)。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-和-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)。在一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基))。在X核心的一些实施方案中，L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-)和[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如,-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-)。
在X核心的一些实施方案中，x1是0、1、2、3、4、5或6。在X核心的一些实施方案中，x1是0。在X核心的一些实施方案中，x1是1。在X核心的一些实施方案中，x1是2。在X核心一些实施方案中，x1是0、3。在X核心的一些实施方案中，x1是4。在X核心的一些实施方案中，x1是5。在X核心的一些实施方案中，x1是6。
在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：(例如，)。在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：/>在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：/>(例如， )。在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：/>(例如，/>)。在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：/>在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：/>(例如，/> )。在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：/>(例如/>如/>)。在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：其中Q’是-NR2-或-CR3aR3b-；q1和q2各自独立地是1或2。在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式：/> (例如， )。在X核心的一些实施方案中，所述核心包含结构式/> (例如，/> )，其中环A是任选经取代的芳基或任选经取代的(例如C3-C12，如C3-C5)杂芳基。在X核心的一些实施方案中，所述核心具有结构式
在X核心的一些实施方案中，所述核心包含表3所示的结构式及其药学上可接受的盐，其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点。在一些实施方案中，表3中的示例核心不限于所列出的立体异构体(即对映异构体、非对映异构体)。
表3.示例核心结构
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在X核心的一些实施方案中，所述核心包含选自以下的结构式：
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及其药学上可接受的盐，其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点或H。在一些实施方案中，其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点。
在X核心的一些实施方案中，所述核心包含选自以下的结构式：
及其药学上可接受的盐，其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点。
在X核心的一些实施方案中，所述核心具有结构其中*表示所述核心到所述多个分支中的一个分支或H的附接点。在一些实施方案中，至少2个分支附接到所述核心。在一些实施方案中，至少3个分支附接到所述核心。在一些实施方案中，至少4个分支附接到所述核心。
在X核心的一些实施方案中，所述核心具有结构其中*表示所述核心到所述多个分支中的一个分支或H的附接点。在一些实施方案中，至少4个分支附接到所述核心。在一些实施方案中，至少5个分支附接到所述核心。在一些实施方案中，至少6个分支附接到所述核心。
在一些实施方案中，所述多个(N个)分支包括至少3个分支、至少4个分支、至少5个分支。在一些实施方案中，所述多个(N个)分支包括至少3个分支。在一些实施方案中，所述多个(N个)分支包括至少4个分支。在一些实施方案中，所述多个(N个)分支包括至少5个分支。
在X分支的一些实施方案中，g是1、2、3或4。在X分支的一些实施方案中，g是1。在X分支的一些实施方案中，g是2。在X分支的一些实施方案中，g是3。在X分支的一些实施方案中，g是4。
在X分支的一些实施方案中，Z＝2(g-1)，并且当g＝1时，G＝0。在X分支的一些实施方案中，Z＝2(g-1)，并且当g≠1时，
在X分支的一些实施方案中，g＝1，G＝0，Z＝1，并且所述多个分支中的每个分支包含结构式所述多个分支中的每个分支包含结构式
在X分支的一些实施方案中，g＝2，G＝1，Z＝2，并且所述多个分支中的每个分支包含结构式
在X分支的一些实施方案中，g＝3，G＝3，Z＝4，并且所述多个分支中的每个分支包含结构式
在X分支的一些实施方案中，g＝4，G＝7，Z＝8，并且所述多个分支中的每个分支包含结构式
在一些实施方案中，本文所述的代(g)＝1的树状聚合物具有结构：
在一些实施方案中，本文所述的代(g)＝1的树状聚合物具有结构：
表4示出了本文所述的代1-4的树状聚合物的示例配方。二酰基、接头基团和终止基团的数目可以基于g进行计算。
表4.基于代(g)的树状聚合物基团的配方
g＝1 g＝2 g＝3 g＝4
二酰基的数量 1 1+2＝3 1+2+22＝7 1+2+22+23＝15 1+2+…+2g-1
接头基团的数量 0 1 1+2 1+2+22 1+2+…+2g-2
终止基团的数量 1 2 22 23 2(g-1)
在一些实施方案中，所述二酰基独立地包含结构式*表示所述二酰基在其近端的附接点，并且**表示所述二酰基在其远端的附接点。
在X分支的二酰基的一些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选经取代的亚烷基、任选经取代的亚烯基或任选经取代的亚芳基。在X分支的二酰基的一些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选经取代的亚烷基(例如，C1-C12)。在X分支的二酰基的一些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选经取代的亚烯基(例如，C1-C12)。在X分支的二酰基的一些实施方案中，Y3在每次出现时独立地是任选经取代的亚芳基(例如，C1-C12)。
在X分支的二酰基的一些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-。在X分支的二酰基的一些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-。在X分支的二酰基的一些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-S-。在X分支的二酰基的一些实施方案中，A1和A2在每次出现时各自独立地是-NR4-，并且R4是氢或任选经取代的烷基(例如，C1-C6)。在X分支的二酰基的一些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3。在X分支的二酰基的一些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是1。在X分支的二酰基的一些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是2。在X分支的二酰基的一些实施方案中，m1和m2在每次出现时各自独立地是3。在X分支的二酰基的一些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选经取代的烷基。在X分支的二酰基的一些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢。在X分支的二酰基的一些实施方案中，R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是任选经取代的(例如，C1-C8)烷基。
在所述二酰基的一些实施方案中，A1是-O-或-NH-。在所述二酰基的一些实施方案中，A1是-O-。在所述二酰基的一些实施方案中，A2是-O-或-NH-。在所述二酰基的一些实施方案中，A2是-O-。在所述二酰基的一些实施方案中，Y3是C1-C12(例如C1-C6，如C1-C3)亚烷基。
在所述二酰基的一些实施方案中，所述二酰基在每次出现时独立地包含结构式(例如/>如)，并且任选地R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，接头基团独立地包含结构式**表示所述接头与近端二酰基的附接点，并且***表示所述接头与远端二酰基的附接点。
在X分支的接头基团(如果存在)的一些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选经取代的亚烷基、任选经取代的亚烯基或任选经取代的亚芳基。在X分支的接头基团(如果存在)的一些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选经取代的亚烷基(例如，C1-C12)。在X分支的接头基团(如果存在)的一些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选经取代的亚烯基(例如，C1-C12)。在X分支的接头基团(如果存在)的一些实施方案中，Y1在每次出现时独立地是任选经取代的亚芳基(例如，C1-C12)。
在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团独立地选自任选经取代的烷基硫醇和任选经取代的烯基硫醇。在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团是任选经取代的烷基硫醇(例如C1-C18，如C4-C18)。在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团是任选经取代的烯基硫醇(例如C1-C18，如C4-C18)。
在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团独立地是C1-C18烯基硫醇或C1-C18烷基硫醇，并且所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、C6-C12芳基、C1-C12烷氨基、C4-C6 N-杂环烷基、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷氨基)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6 N-杂环烷基)、-C(O)-(C1-C12烷氨基)和-C(O)-(C4-C6 N-杂环烷基)，并且任何前述取代基的C4-C6N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷氨基(例如，C1-C6单烷氨基(如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二烷氨基(如))、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷氨基(例如，单烷氨基或二烷氨基))(例如，/>)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，/>)、-C(O)-(C1-C12烷氨基(例如，单烷氨基或二烷氨基))和-C(O)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，)，其中任何前述取代基的C4-C6N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个选自以下的取代基取代：C1-C12(例如，C1-C8)烷氨基(例如，C1-C6单烷氨基(如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二烷氨基(如/>))和C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基)。在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。在X分支的终止基团的一些实施方案中，每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
在X分支的终止组的一些实施方案中，每个终止基团独立地是表5中所示的结构。在一些实施方案中，本文所述的树状聚合物可以包含表5中所选的终止基团或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，表5中的示例终止基团不限于所列出的立体异构体(即对映异构体、非对映异构体)。
表5.示例终止基团/外围结构
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在一些实施方案中，式(X)的树状聚合物选自表6中列出的那些及其药学上可接受的盐。
表6.示例可电离阳离子脂质-树状聚合物
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其他可电离阳离子脂质
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述阳离子脂质包含结构式(D-I’)：
其中：
a是1，b是2、3或4；或者可替代地，b是1，a是2、3或4；
m是1，n是1；或者可替代地，m是2，n是0；或者可替代地，m是2，n是1；并且
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自H、-CH2CH(OH)R7、-CH(R7)CH2OH、-CH2CH2C(＝O)OR7、-CH2CH2C(＝O)NHR7和-CH2R7，其中R7独立地选自C3-C18烷基、具有一个C＝C双键的C3-C18烯基、针对氨基的保护基团、-C(＝NH)NH2、聚(乙二醇)链和受体配体；
条件是R1至R6中的至少两个部分独立地选自-CH2CH(OH)R7、-CH(R7)CH2OH、-CH2CH2C(＝O)OR7、-CH2CH2C(＝O)NHR7或-CH2R7，其中R7独立地选自C3-C18烷基或具有一个C＝C双键的或C3-C18烯基；并且
其中式(D-I’)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子脂质。
在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，a是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，b是2。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，m是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，n是1。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地是H或-CH2CH(OH)R7。在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地是H或在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地是H或/>在式(D-I’)的阳离子脂质的一些实施方案中，R7是C3-C18烷基(例如，C6-C12烷基)。
在一些实施方案中，式(D-I’)的阳离子脂质是13,16,20-三(2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇：
在一些实施方案中，式(D-I’)的阳离子脂质是(11R,25R)-13,16,20-三((R)-2-羟基十二烷基)-13,16,20,23-四氮杂三十五烷-11,25-二醇：
可以用于本申请的组合物和方法中的其他阳离子脂质包括如以下文献中所述的那些阳离子脂质：J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217，以及国际专利申请WO2010/144740、WO 2013/149140、WO 2016/118725、WO 2016/118724、WO 2013/063468、WO2016/205691、WO 2015/184256、WO 2016/004202、WO 2015/199952、WO 2017/004143、WO2017/075531、WO 2017/117528、WO 2017/049245、WO 2017/173054和WO 2015/095340，将这些文献出于所有目的通过引用并入本文。那些可电离阳离子脂质的例子包括但不限于表7所示的那些。
表7：示例可电离阳离子脂质
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在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质以约20至约23的量存在。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为约20、20.5、21、21.5、22、22.5至约23、或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，所述摩尔百分比为约7.5至约20。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为约7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19至约20、或其中可衍生的任何范围。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述可电离阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约25％的所述可电离阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约20％的所述可电离阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约20％的所述可电离阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约30％的所述可电离阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)5％、至少(约)10％、至少(约)15％、至少(约)20％、至少(约)25％或至少(约)30％的所述可电离阳离子脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)5％、至多(约)10％、至多(约)15％、至多(约)20％、至多(约)25％或至多(约)30％的所述可电离阳离子脂质。
在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比不超过约100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1或30:1。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比为至少约1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比为约1:1至约80:1、约2:1至约80:1、约3:1至约80:1、约4:1至约80:1、或约5:1至约80:1。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比为约1:1至约70:1、约2:1至约70:1、约3:1至约70:1、约4:1至约70:1、或约5:1至约70:1。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比为约1:1至约60:1、约2:1至约60:1、约3:1至约60:1、约4:1至约60:1、或约5:1至约60:1。在一些实施方案中，所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比为约1:1至约50:1、约2:1至约50:1、约3:1至约50:1、约4:1至约50:1、或约5:1至约50:1。
选择性器官靶向(SORT)脂质
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质(例如，纳米颗粒)组合物被优先递送至靶器官。在一些实施方案中，所述靶器官是肺、肺组织或肺细胞。如本文所用，术语“优先递送”用于指在递送时以至少25％(例如，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％)的施用量递送至靶器官(例如，肺)、组织或细胞的组合物。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含一种或多种选择性器官靶向(SORT)脂质，其导致所述组合物选择性递送至特定器官。在一些实施方案中，所述SORT脂质可以具有C6-C24的两个或更多个烷基或烯基链。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含永久带正电的部分。所述永久带正电的部分可以在生理pH下带正电，使得所述SORT脂质在将多核苷酸递送至细胞时包含正电荷。在一些实施方案中，所述带正电的部分是季胺或季铵离子。在一些实施方案中，所述SORT脂质包含反离子，或以其他方式与反离子复合，或与反离子相互作用。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是第二可电离阳离子脂质。所述SORT脂质可以是如本公开文本中其他地方所述的可电离阳离子脂质。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是永久阳离子脂质(即，包含一种或多种疏水组分和永久阳离子基团)。所述永久阳离子脂质可以含有无论在哪种pH下都具有正电荷的基团。可以用于永久阳离子脂质中的一个永久阳离子基团是季铵基团。所述永久阳离子脂质可以包含结构式：其中：
Y1、Y2或Y3各自独立地是X1C(O)R1或X2N+R3R4R5；
条件是Y1、Y2和Y3中的至少一个是X2N+R3R4R5；
R1是C1-C24烷基、C1-C24经取代的烷基、C1-C24烯基、C1-C24经取代的烯基；
X1是O或NRa，其中Ra是氢、C1-C4烷基或C1-C4经取代的烷基；
X2是C1-C6烷二基或C1-C6经取代的烷二基；
R3、R4和R5各自独立地是C1-C24烷基、C1-C24经取代的烷基、C1-C24烯基、C1-C24经取代的烯基；并且
A1是具有等于所述化合物中X2N+R3R4R5基团数的电荷的阴离子。
在所述SORT脂质的一些实施方案中，所述永久阳离子SORT脂质具有结构式：其中：
R6-R9各自独立地是C1-C24烷基、C1-C24经取代的烷基、C1-C24烯基、C1-C24经取代的烯基；条件是R6-R9中的至少一个是C8-C24的基团；并且
A2是单价阴离子。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是第二可电离阳离子脂质(即，包含一种或多种疏水组分和可电离阳离子基团)。所述可电离的带正电的部分可以在生理pH下带正电。可以用于第二可电离阳离子脂质中的一个可电离阳离子基团是叔胺基团。在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；并且
R3和R3′各自独立地是烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含特定结构的头基。在一些实施方案中，所述SORT脂质包含具有结构式的头基，其中L是接头；Z+是带正电的部分并且X-是反离子。在一些实施方案中，所述接头是可生物降解的接头。所述可生物降解的接头在生理pH和温度下可以是可降解的。所述可生物降解的接头可以被来自受试者的蛋白质或酶降解。在一些实施方案中，所述带正电的部分是季铵离子或季胺。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：其中R1和R2各自独立地是任选经取代的C6-C24烷基或任选经取代的C6-C24烯基。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含接头(L)。在一些实施方案中，L是其中：
p和q各自独立地是1、2或3；并且
R4是任选经取代的C1-C6烷基。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
R4是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是磷脂酰胆碱(例如，14:0EPC)。在一些实施方案中，所述磷脂酰胆碱化合物进一步定义为：其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质。在一些实施方案中，所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。举例来说，乙基磷酸胆碱可以是而不限于1,2-二肉豆蔻烯酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
举例来说而不限于此，具有前一段落中的结构式的SORT脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)(例如，氯化物盐)。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：(S-II’)，其中：
R4和R4′各自独立地是烷基(C6-C24)、烯基(C6-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″′是烷基(C1-C8)、烯基(C2-C8)或这两种基团中任一种的取代形式；并且
X2是单价阴离子。
举例来说而不限于此，具有前一段落中的结构式的SORT脂质是二甲基二十八烷基铵(DDAB)(例如，溴化物盐)。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
举例来说而不限于此，具有前一段落中的结构式的SORT脂质是N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质是阴离子脂质。在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3是氢、烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)或-Y1-R4，其中：
Y1是烷二基(c≤6)或经取代的烷二基(c≤6)；并且
R4是酰氧基(c≤8-24)或经取代的酰氧基(c≤8-24)。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述SORT脂质包含一种或多种选自表8中所列出的脂质。
表8.示例SORT脂质
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X-是反离子(例如，Cl-、Br-等)
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约65％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约30％至约55％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约50％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约30％至约60％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约25％至约60％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约20％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约30％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约30％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约15％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约20％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)25％、至少(约)30％、至少(约)35％、至少(约)40％、至少(约)45％、至少(约)50％、至少(约)55％、至少(约)60％或至少(约)65％的所述SORT脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)25％、至多(约)30％、至多(约)35％、至多(约)40％、至少(约)45％、至多(约)50％、至多(约)55％、至多(约)60％或至多(约)65％的所述SORT脂质。
另外的脂质
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物还包含另外的脂质，所述另外的脂质包括但不限于两性离子脂质(例如，磷脂)、类固醇或类固醇衍生物、聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇(PEG)缀合的脂质)或其组合。
在一些实施方案中，所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)不超过约50:1、不超过约40:1、不超过约30:1、或不超过约20:1。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)为至少约1:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、或至少约5:1。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)为约1:1至约50:1、至少约2:1至约50:1、至少约3:1至约50:1、至少约4:1至约50:1、或至少约5:1至约50:1。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)为约1:1至约40:1、至少约2:1至约40:1、至少约3:1至约40:1、至少约4:1至约40:1、或至少约5:1至约40:1。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)为约1:1至约30:1、至少约2:1至约30:1、至少约3:1至约30:1、至少约4:1至约30:1、或至少约5:1至约30:1。
两性离子脂质
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物还包含两性离子脂质或磷脂。在一些实施方案中，所述两性离子脂质或磷脂可以含有一个或两个长链(例如，C6-C24)烷基或烯基、甘油或鞘氨醇、一个或两个磷酸基团以及任选的有机小分子。所述有机小分子可以是氨基酸、糖或氨基取代的烷氧基，如胆碱或乙醇胺。在一些实施方案中，所述两性离子脂质或磷脂是磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，所述两性离子脂质或磷脂是二硬脂酰基磷脂酰胆碱或二油酰基磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，使用其他两性离子脂质，其中两性离子脂质限定了具有正电荷和负电荷两者的脂质和类脂分子。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述两性离子脂质或磷脂不是乙基磷酸胆碱。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述组合物还可以包含相对于总脂质组合物的摩尔百分比为约20至约23的两性离子脂质或磷脂。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为约20、20.5、21、21.5、22、22.5至约23、或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，所述摩尔百分比为约7.5至约60。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为约7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19至约20、或其中可衍生的任何范围。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约25％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约20％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约20％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约8％至约15％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约10％至约15％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约12％至约18％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)8％、至少(约)10％、至少(约)12％、至少(约)15％、至少(约)18％、至少(约)20％、或至少(约)25％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)8％、至多(约)10％、至多(约)12％、至多(约)15％、至多(约)18％、至多(约)20％、或至多(约)25％的两性离子脂质(例如，磷脂或两性离子磷脂)。
在一些实施方案中，所述两性离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比不超过约50:1、40:1、30:1、20:1、10:1或7:1。在一些实施方案中，所述两性离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比为至少约1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在一些实施方案中，所述两性离子脂质与所述合成多核苷酸的(例如，质量或重量)比为约1:1至约10:1、约1:1至约20:1、约1:1至约30:1、约1:1至约40:1、或约1:1至约50:1。
类固醇或类固醇衍生物
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物还包含类固醇或类固醇衍生物。在一些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物包含任何类固醇或类固醇衍生物。如本文所用，在一些实施方案中，术语“类固醇”是具有四环17碳环结构的一类化合物，其还可以包含一个或多个取代，包括烷基、烷氧基、羟基、氧代、酰基、或两个或更多个碳原子之间的双键。在一些实施方案中，类固醇的环结构包含三个稠合的环己基环和一个稠合的环戊基环，如下式所示：在一些实施方案中，类固醇衍生物包含具有一个或多个非烷基取代的上述环结构。在一些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物是其中式进一步定义为/>的甾醇。在本申请的一些实施方案中，所述类固醇或类固醇衍生物是胆甾烷或胆甾烷衍生物。在胆甾烷中，所述环结构进一步由下式定义：如上所述，胆甾烷衍生物包括上述环系统的一个或多个非烷基取代。在一些实施方案中，所述胆甾烷或胆甾烷衍生物是胆甾烯或胆甾烯衍生物或者甾醇或甾醇衍生物。在其他实施方案中，所述胆甾烷或胆甾烷衍生物是胆甾烯和甾醇或其衍生物。
在所述脂质组合物的一些实施方案中，所述组合物还可以包含相对于所述总脂质组合物的摩尔百分比为约40至约46的类固醇。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为约40、41、42、43、44、45至约46、或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，所述类固醇相对于所述总脂质组合物的摩尔百分比为约15至约40。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40、或其中可衍生的任何范围。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约46％的所述类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约40％的所述类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约25％至约35％的所述类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约30％至约40％的所述类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约20％至约30％的所述类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)15％、至少(约)20％、至少(约)25％、至少(约)30％、至少(约)35％、至少(约)40％、至少(约)45％、或至少(约)46％的所述类固醇或类固醇衍生物。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)15％、至多(约)20％、至多(约)25％、至多(约)30％、至多(约)35％、至多(约)40％、至多(约)45％、或至多(约)46％的所述类固醇或类固醇衍生物。
聚合物缀合的脂质
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物还包含聚合物缀合的脂质。在一些实施方案中，所述聚合物缀合的脂质是PEG脂质。在一些实施方案中，所述PEG脂质是甘油二酯，其还包含附接至甘油基团的PEG链。在其他实施方案中，所述PEG脂质是如下化合物，所述化合物含有与PEG链一起附接至接头基团的一个或多个C6-C24长链烷基或烯基或者C6-C24脂肪酸基团。PEG脂质的一些非限制性例子包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG神经酰胺缀合的PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺、PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在一些实施方案中，PEG修饰的磷脂酰乙醇胺(PE)。在一些实施方案中，PEG修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺或PEG修饰的二肉豆蔻酰基-sn-甘油。在一些实施方案中，所述PEG修饰通过所述脂质的PEG组分的分子量来测量。在一些实施方案中，所述PEG修饰具有约100至约15,000的分子量。在一些实施方案中，所述分子量为约200至约500、约400至约5,000、约500至约3,000、或约1,200至约3,000。所述PEG修饰的分子量为约100、200、400、500、600、800、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,500至约15,000。可以用于本申请中的脂质的一些非限制性例子由美国专利5,820,873、WO 2010/141069或美国专利8,450,298教导，将这些文献通过引用并入本文。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述PEG脂质具有结构式：其中：R12和R13各自独立地是烷基(c≤24)、烯基(c≤24)或这两种基团中任一种的取代形式；Re是氢、烷基(c≤8)或经取代的烷基(c≤8)，并且x是1-250。在一些实施方案中，Re是烷基(c≤8)，如甲基。R12和R13各自独立地是烷基(c≤4-20)。在一些实施方案中，x是5-250。在一个实施方案中，x是5-125或x是100-250。在一些实施方案中，所述PEG脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述PEG脂质具有结构式：其中：n1是1与100之间的整数，并且n2和n3各自独立地选自1与29之间的整数。在一些实施方案中，n1是5、10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100、或其中可衍生的任何范围。在一些实施方案中，n1是约30至约50。在一些实施方案中，n2是5至23。在一些实施方案中，n2是11至约17。在一些实施方案中，n3是5至23。在一些实施方案中，n3是11至约17。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述组合物还可以包含相对于所述总脂质组合物的摩尔百分比为约4.0至约4.6的所述PEG脂质。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5至约4.6、或其中可衍生的任何范围。在其他实施方案中，所述摩尔百分比为约1.5至约4.0。在一些实施方案中，所述摩尔百分比为约1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75至约4.0、或其中可衍生的任何范围。
在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约0.5％至约12％或约0.5％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约1％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约2％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约1％至约8％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约2％至约7％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约3％至约5％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至少(约)0.5％、至少(约)1％、至少(约)1.5％、至少(约)2％、至少(约)2.5％、至少(约)3％、至少(约)3.5％、至少(约)4％、至少(约)4.5％、至少(约)5％、至少(约)5.5％、至少(约)6％、至少(约)6.5％、至少(约)7％、至少(约)7.5％、至少(约)8％、至少(约)8.5％、至少(约)9％、至少(约)9.5％、或至少(约)10％的所述聚合物缀合的脂质。在本申请的脂质组合物的一些实施方案中，所述脂质组合物包含摩尔百分比为至多(约)0.5％、至多(约)1％、至多(约)1.5％、至多(约)2％、至多(约)2.5％、至多(约)3％、至多(约)3.5％、至多(约)4％、至多(约)4.5％、至多(约)5％、至多(约)5.5％、至多(约)6％、至多(约)6.5％、至多(约)7％、至多(约)7.5％、至多(约)8％、至多(约)8.5％、至多(约)9％、至多(约)9.5％、或至多(约)10％的所述聚合物缀合的脂质。
本文公开的(例如，药物的)组合物的一些实施方案包含特定摩尔比的组分或原子。在一些实施方案中，所述(例如，药物的)组合物包含特定摩尔比(N/P比)的脂质组合物中的氮与多核苷酸中的磷酸。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的氮与所述多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)不大于约30:1。在一些实施方案中，所述N/P比为约5:1至约30:1。在一些实施方案中，所述N/P比不超过1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1或更少。在一些实施方案中，所述N/P比是至少1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1或更多。在一些实施方案中，所述N/P比是以下值中的任一个或在以下值中的任两个的范围内：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1，13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1和50:1。
在一些实施方案中，组合物包含特定(例如，质量或重量)比率的所述脂质组合物中的多核苷酸与总脂质。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的多核苷酸与总脂质的(例如，质量或重量)比不超过约1:1、1:10、1:50或1:100。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的多核苷酸与总脂质的(例如，质量或重量)比不超过约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:75或1:100或更少。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的多核苷酸与总脂质的(例如，质量或重量)比为至少约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:75或1:100或更多。在一些实施方案中，所述脂质组合物中的多核苷酸与总脂质的(例如，质量或重量)比为以下值中的任一个或在以下值中的任两个的范围内：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:75和1:100。
在所述组合物的一些实施方案中，所述组合物可以被配制成本领域已知的任何合适的剂型。在一些实施方案中，将所述组合物配制成纳米颗粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，配制所述组合物用于通过本领域已知的任何合适途径施用，所述途径包括例如口服、直肠、阴道、经黏膜、肺施用(包括气管内或吸入)或肠施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
在一些实施方案中，配制本申请的组合物用于通过局部而非全身方式施用，例如经由直接注射所述药物组合物到靶组织中，如在持续释放配制品中。局部递送可以以多种方式受影响，根据要靶向的组织而定。所述组合物可以被配制用于气雾剂施用。所述气雾剂施用可以被递送至呼吸道上皮。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物具有0.5微米(μm)至10μm的微滴大小。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的中值微滴大小。在一些实施方案中，所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的平均微滴大小。可以使用级联冲击取样器分析或激光衍射或用于测量气雾剂微滴的其他合适技术来测量微滴大小。
在一些实施方案中，本申请的组合物可以注射到例如损伤、疾病表现或疼痛的部位。在一些实施方案中，本申请的组合物可以在用于口服、气管或食管施用的锭剂中提供。在一些实施方案中，本申请的组合物可以以液体、片剂或胶囊形式提供，以用于施用至胃或肠。在一些实施方案中，本申请的组合物可以以栓剂形式提供，以用于直肠或阴道施用。在一些实施方案中，本申请的组合物甚至可以通过使用乳膏、滴剂或甚至注射来递送至眼睛。
方法
用于增强CFTR在一个或多个细胞中的表达或活性的方法
在一些实施方案中，本文提供了用于增强囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)在细胞中的表达或活性的方法，所述方法包括：使所述细胞与如本文所述的与脂质组合物组装的合成多核苷酸接触，其中所述合成多核苷酸编码CFTR蛋白；并且其中所述脂质组合物包含：(1)可电离阳离子脂质；(2)与所述可电离阳离子脂质和所述磷脂分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而导致所述CFTR蛋白在所述细胞中的表达或活性。所述脂质组合物还可以包含两性离子脂质或磷脂。
在一些实施方案中，本文提供了用于增强囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)在细胞中的表达或活性的方法，所述方法包括：使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸编码CFTR蛋白；并且其中所述脂质组合物包含：可电离阳离子脂质；以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而在接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体；任选地其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性是通过测量包含所述细胞的多个细胞与没有所述接触的多个参考细胞相比的跨上皮离子转运特性的变化来确定的。所述脂质组合物还可以包含两性离子脂质或磷脂。
在所述方法的一些实施方案中，配制本申请的组合物用于通过局部而非全身方式施用，例如经由直接注射所述药物组合物到靶组织中，如在持续释放配制品中。局部递送可以以多种方式受影响，根据要靶向的组织而定。在所述方法的一些实施方案中，可以吸入含有本申请的组合物的气雾剂(用于鼻、气管或支气管递送)。所述组合物可以被配制用于气雾剂施用。
在一些实施方案中，重复所述接触。所述接触可以重复1、2、3次或更多次。在一些实施方案中，每周至少一次进行所述接触。在一些实施方案中，每周至少两次进行所述接触。在一些实施方案中，所述方法在每次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。在一些实施方案中，第二次接触任选地在第一次接触之后至少约1、2或3天进行。在一些实施方案中，所述方法还包括第三次接触，其中所述第三次接触任选地在第二次接触后至少约1、2或3天进行。在实施方案中，所述方法在第二次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。在一些实施方案中，所述方法在第三次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。每次接触中的组合物可以相同。重复接触后，CFTR蛋白的功能变体的治疗有效量或活性可能会增加。
所述一次或多次接触可以在体内进行。所述一次或多次接触可以在体外进行。所述一次或多次接触可以离体进行。
在一些实施方案中，所述方法实现了所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性。在一些实施方案中，治疗有效活性可以通过跨上皮测定法测量。所述跨上皮测定法可以测量与功能蛋白的功能相对应的电压或电流。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性对应于至少5微安(μA)的跨上皮电流。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性对应于至少5微安(μA)至约30μA的跨上皮电流。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性对应于至少约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)的跨上皮电流。在一些实施方案中，所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)至约20μA·cm-2·min-1的跨上皮电流。所述跨上皮电流可以经由体外测定法(如本文其他地方所述的那些)来确定。
在一些实施方案中，所述方法实现了以下：所述CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性可以是受试者的用力呼气量(FEV)的测量。FEV测量受试者在用力呼吸过程中可以呼出多少空气。可以在用力呼吸的第一(FEV1)、第二(FEV2)或第三(FEV3)秒期间测量呼出的空气量。在一些实施方案中，所述方法导致受试者具有约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％、约40％至约80％、约40％至约70％、约40％至约60％、或约40％至约50％的FEV1、FEV2或FEV3。在一些实施方案中，所述方法导致受试者具有约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％的FEV1、FEV2或FEV3。在一些实施方案中，所述方法导致受试者具有约40％至约90％的FEV1、FEV2或FEV3。
在所述方法的一些实施方案中，相对于相应对照，所述方法增加细胞中CFTR蛋白的功能变体的量。在一些实施方案中，相对于相应对照，所述方法增加所述细胞中WT CFTR蛋白的量。在一些实施方案中，所述对照包含不进行所述接触的相应细胞。在一些实施方案中，相对于相应对照，所述方法在所述细胞中使所述CFTR蛋白的功能变体的量增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3.0倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4.0倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、或至少约5.0倍。在一些实施方案中，相对于没有进行所述接触的细胞，所述方法在所述细胞中使WT CFTR蛋白的量增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3.0倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4.0倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、或至少约5.0倍。
在一些实施方案中，所述方法在所述细胞中产生治疗有效量的所述CFTR蛋白的功能变体。在一些实施方案中，所述方法在所述细胞中产生治疗有效量的WT CFTR蛋白。
在一些实施方案中，相对于相应对照，所述方法增强在所述细胞中的离子转运。在一些实施方案中，相对于相应对照，所述方法增强在所述细胞中的氯化物转运。在一些实施方案中，所述对照包含不进行所述接触的相应细胞。在一些实施方案中，相对于相应对照，所述方法在所述细胞中使离子转运增强至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3.0倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4.0倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、或至少约5.0倍。
用于治疗囊性纤维化的方法
在一些实施方案中，本文提供了用于治疗患有或怀疑患有囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)相关病症的受试者的方法。所述方法可以包括向所述受试者施用如本文所述的组合物。在一些实施方案中，所述CFTR相关病症是囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)或其组合。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。所述受试者可以是哺乳动物。所述受试者可以是人。在一些实施方案中，所述施用包括肺部施用。在一些实施方案中，所述施用包括通过雾化而吸入。在一些实施方案中，所述施用包括顶端施用。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者展现或被确定展现CFTR基因中的突变。在一些实施方案中，所述突变是R553X、G542X或F508del或其组合。在一些实施方案中，所述突变是R1162X。在一些实施方案中，所述突变是R553X、G542X、F508del或R1162X或其组合。
本公开文本的方法能够基于所述配制品或组合物的特性治疗患有囊性纤维化的受试者。具体地，本文其他地方所述的组合物可能能够穿透与囊性纤维化相关的黏液，从而将所述多核苷酸递送至所述细胞。
细胞
在本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述细胞是肺细胞。在一些实施方案中，所述肺细胞是肺气道细胞。可以通过本申请中的递送而靶向的示例肺气道细胞包括但不限于基底细胞、分泌细胞(如杯状细胞和俱乐部细胞)、纤毛细胞、离子细胞及其任何组合。在所述方法的一些实施方案中，所述细胞是气道上皮细胞。在一些实施方案中，所述细胞是支气管上皮细胞。在一些实施方案中，所述细胞是气道上皮细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基底细胞，其特征在于p63标记物的表达。在一些实施方案中，所述细胞是离子细胞，其特征在于FOXI1标记物的表达。在一些实施方案中，所述细胞是未分化的。在一些实施方案中，所述细胞是分化的。
一个或多个突变
在本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述细胞展现或被确定展现CFTR基因或转录物中的突变。在一些实施方案中，所述细胞展现或被确定展现CFTR基因的外显子11-27中的一个或多个中的突变。所述细胞展现或被确定展现CFTR基因的外显子11-27中的一个或多个中的无义突变或移码突变。在一些实施方案中，所述突变位于CFTR基因中的如下位置，在该位置，变化可产生在F508处具有突变(例如，F508del)的突变蛋白。在一些实施方案中，所述突变位于CFTR基因中的如下位置，在该位置，变化可产生在CFTR蛋白中的G542处具有突变(例如，G542X)的突变蛋白，例如，其对应于CFTR基因中的c.1624G>T。在一些实施方案中，所述突变位于CFTR基因中的如下位置，在该位置，变化可产生在CFTR蛋白中的R553处具有突变(例如，R553X)的突变蛋白。在一些实施方案中，所述突变位于CFTR基因中的如下位置，在该位置，变化可产生在CFTR蛋白中的R1162处具有突变(例如，R1162X)的突变蛋白。
在本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述突变与囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)相关。
用于肺细胞递送的方法
在一些实施方案中，提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物，从而在所述受试者的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生治疗有效量或活性的合成多核苷酸。任选地，所述合成多核苷酸的治疗有效活性可以通过测量包含肺分泌细胞或肺基底细胞的肺与参考肺(例如，在没有所述接触的情况下)相比的跨上皮离子转运特性(例如，跨上皮电流或电压)的变化来确定。所述组合物可以包含与脂质组合物(如本文所述)组装的合成多核苷酸(如本文所述)。所述合成多核苷酸可以编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。所述脂质组合物可以包含可电离阳离子脂质(如本文所述)；以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质(如本文所述)。所述肺基底细胞可以是肺基底干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物，从而在所述受试者的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生与所述受试者的肺非分泌细胞或肺非基底细胞相比更大的治疗量或活性的合成多核苷酸。所述组合物可以包含与脂质组合物(如本文所述)组装的合成多核苷酸(如本文所述)。所述合成多核苷酸可以编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。所述脂质组合物可以包含可电离阳离子脂质(如本文所述)；以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质(如本文所述)。在一些实施方案中，所述方法在肺分泌和/或基底细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性比在肺非分泌和/或非基底细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性大至少1.1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。在一些实施方案中，所述方法在肺分泌细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性比在肺非分泌细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性大至少1.1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。在一些实施方案中，所述方法在肺基底细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性比在肺非基底细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性大至少1.1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。所述肺基底细胞可以是肺基底干细胞。所述肺非分泌细胞可以是肺纤毛细胞。所述肺非基底细胞可以是肺纤毛细胞。
在一些实施方案中，提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞递送)的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物，从而在所述受试者的肺分泌细胞中产生治疗有效量或活性的合成多核苷酸。任选地，所述合成多核苷酸的治疗有效活性可以通过测量包含肺分泌细胞的肺与参考肺(例如，在没有所述接触的情况下)相比的跨上皮离子转运特性(例如，跨上皮电流或电压)的变化来确定。所述组合物可以包含与脂质组合物(如本文所述)组装的合成多核苷酸(如本文所述)。所述合成多核苷酸可以编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。所述脂质组合物可以包含可电离阳离子脂质(如本文所述)；以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质(如本文所述)。
在一些实施方案中，提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物，从而在所述受试者的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生与所述受试者的肺非分泌细胞或肺非基底细胞相比更大的治疗量或活性的合成多核苷酸。所述组合物可以包含与脂质组合物(如本文所述)组装的合成多核苷酸(如本文所述)。所述合成多核苷酸可以编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。所述脂质组合物可以包含可电离阳离子脂质(如本文所述)；以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质(如本文所述)。在一些实施方案中，所述方法在肺分泌细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性比在肺非分泌细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性大至少1.1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。所述肺非分泌细胞可以是肺纤毛细胞。在一些实施方案中，所述方法在肺基底细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性比在肺非基底细胞中产生的合成多核苷酸的量或活性大至少1.1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。所述肺非基底细胞可以是肺纤毛细胞。所述肺基底细胞可以是肺基底干细胞。
在用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法的各种实施方案中，在肺分泌细胞、肺基底细胞或其组合中检测或观察到所述合成多核苷酸的至少约50％、55％或60％(例如，肺)表达，例如，如通过测量所述合成多核苷酸编码的相应多肽的量或活性所确定的。在用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法的各种实施方案中，在肺非分泌细胞、肺非基底细胞或其组合中检测或观察到所述合成多核苷酸的不超过约50％、45％或40％(例如，肺)表达，例如，如通过测量所述合成多核苷酸编码的相应多肽的量或活性所确定的。在用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法的各种实施方案中，在肺纤毛细胞中检测或观察到所述合成多核苷酸的不超过约50％、45％或40％(例如，肺)表达，例如，如通过测量所述合成多核苷酸编码的相应多肽的量或活性所确定的。在各种实施方案中，用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送(可替代地，肺分泌和/或基底细胞递送))的方法在一个或多个肺分泌细胞或肺基底细胞中产生比在一个或多个参考细胞中大至少1.1、1.5或2倍的所述合成多核苷酸的量或活性，所述一个或多个参考细胞既不是肺分泌细胞也不是肺基底细胞。所述一个或多个参考细胞可以是一个或多个肺纤毛细胞。在各种实施方案中，所述肺非分泌细胞或肺非基底细胞是肺纤毛细胞。所述肺基底细胞可以是肺基底干细胞。在一些实施方案中，用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞递送)的方法在一个或多个肺分泌细胞中产生比一个或多个肺非分泌细胞大至少1.1、1.5或2倍的所述合成多核苷酸的量或活性。在一些实施方案中，用于靶向性肺部递送(如肺基底细胞递送)的方法在一个或多个肺基底细胞中产生比一个或多个肺非基底细胞大至少1.1、1.5或2倍的所述合成多核苷酸的量或活性。
在一些实施方案中，提供了用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或基底细胞递送)的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物，从而在所述受试者的至少(约)5％的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生治疗量或活性的所述合成多核苷酸。所述组合物可以包含与脂质组合物(如本文所述)组装的合成多核苷酸(如本文所述)。所述合成多核苷酸可以编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。所述脂质组合物可以包含可电离阳离子脂质(如本文所述)；以及与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质(如本文所述)。
在用于靶向性肺部递送(如肺分泌细胞或肺基底细胞递送)的各种方法的一些实施方案中，所述肺分泌细胞或肺基底细胞展现或被确定展现CFTR基因中的突变。在一些实施方案中，所述突变选自G542X或F508del。在一些实施方案中，所述突变是R553X、G542X或F508del或其组合。在一些实施方案中，所述突变是R1162X。在一些实施方案中，所述突变是R553X、G542X、F508del或R1162X或其组合。
CFTR蛋白的功能变体的治疗有效活性可以通过测量所述受试者的肺与参考肺(例如，在所述施用之前)相比的跨上皮离子转运特性(例如，跨上皮电流或电压)的变化来确定。
在一些实施方案中，提供了用于靶向性肺部递送(如基底细胞递送)编码CFTR蛋白的合成多核苷酸的方法，所述方法包括使包含多个基底细胞的细胞组合物与如下组合物接触，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述脂质组合物包含：(1)可电离阳离子脂质；和(2)与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而将所述合成多核苷酸递送至至少15％的所述多个基底细胞。在一些实施方案中，所述脂质组合物还包含两性离子脂质或磷脂。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含肺基底细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含基底细胞、分泌细胞(如杯状细胞和俱乐部细胞)、纤毛细胞、离子细胞及其任何组合。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含具有第一CFTR基因型的第一细胞和具有第二CFTR基因型的第二细胞。
在一些实施方案中，提供了用于靶向性肺部递送(如基底细胞靶向性递送)编码CFTR蛋白的合成多核苷酸的方法，所述方法包括使具有多种细胞类型的多个细胞与如下组合物接触，所述组合物包含如本文所述的与脂质组合物组装的所述合成多核苷酸，所述多个细胞包括基底细胞和非基底细胞，其中所述脂质组合物包含：(1)可电离阳离子脂质；和(2)与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而将所述合成多核苷酸以比递送至所述非基底细胞的量更大的量递送至所述基底细胞。在一些实施方案中，所述脂质组合物还包含两性离子脂质或磷脂。在一些实施方案中，所述基底细胞是肺基底细胞。在一些实施方案中，所述非基底细胞是肺非基底细胞。在一些实施方案中，所述非基底细胞是分泌细胞(如杯状细胞和俱乐部细胞)、纤毛细胞、离子细胞及其任何组合。在一些实施方案中，所述非基底细胞是纤毛细胞。在一些实施方案中，所述多个细胞包括具有第一CFTR基因型的第一细胞和具有第二CFTR基因型的第二细胞。
在一些实施方案中，所述组合物可以被配制成本领域已知的任何合适的剂型。在一些实施方案中，将所述组合物配制成纳米颗粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，配制所述组合物用于通过本领域已知的任何合适途径施用，所述途径包括例如口服、直肠、阴道、经黏膜、肺施用(包括气管内或吸入)或肠施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于顶端递送。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于雾化。在一些实施方案中，所述组合物是气雾剂。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于静脉内施用。
在一些实施方案中，所述组合物可以被配制成本领域已知的任何合适的剂型。在一些实施方案中，将所述组合物配制成纳米颗粒或纳米胶囊。在一些实施方案中，配制所述组合物用于通过本领域已知的任何合适途径施用，所述途径包括例如口服、直肠、阴道、经黏膜、肺施用(包括气管内或吸入)或肠施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于顶端递送。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于雾化。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于雾化，其中使用率为约0.1ml/min至约1.0ml/min。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于雾化，其中使用率为约0.2ml/min至约0.7ml/min。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于雾化，其中使用率为约0.1ml/min至约0.5ml/min。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于雾化，其中使用率为约0.5ml/min至约1.0ml/min。在一些实施方案中，所述组合物是气雾剂。在一些实施方案中，所述气雾剂的质量中值空气动力学直径(MMAD)的范围为约1.0μm至约10.0μm、约1.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约6.0μm。
实施方案列表
本发明的实施方案的以下列表将被认为公开了本发明的各种特征，这些特征可以被认为是论述它们的特定实施方案所特有的或者可以与其他实施方案中列出的各种其他特征组合。因此，仅仅因为在一个特定实施方案下论述了一个特征并不一定将该特征的使用限制在该实施方案中。
实施方案1.一种编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含一种或多种核苷类似物。
实施方案2.根据实施方案1所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含1-甲基假尿苷。
实施方案3.一种编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少100、300、500、700、900或1,000个碱基具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列包含少于约115、110、105、100、95或90个UU或TT二核苷酸。
实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列包含至少两个编码精氨酸的同义密码子。
实施方案6.根据实施方案1-4中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列包含至少三个编码精氨酸的同义密码子。
实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％、65％、60％、55％或50％是AGA密码子。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含在至少100、300、500、700、900或1,000个连续氨基酸残基上与SEQID NO:5具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸是信使核糖核酸(mRNA)。
实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸还包含3’或5’非编码区。
实施方案11.根据实施方案10所述的合成多核苷酸，其中所述3’或5’非编码区增强由所述合成多核苷酸编码的所述CFTR蛋白在细胞内的表达或活性。
实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸还包含5’帽结构。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述3’非编码区包含聚腺苷尾。
实施方案14.根据实施方案13所述的合成多核苷酸，其中所述聚腺苷尾包含至多200个腺苷。
实施方案15.根据实施方案13或14所述的合成多核苷酸，其中所述聚腺苷尾改善所述合成多核苷酸在细胞中的药代动力学特性。
实施方案16.根据实施方案15所述的合成多核苷酸，其中所述聚腺苷尾改善所述合成多核苷酸在细胞中的延长的半衰期。
实施方案17.一种药物组合物，其包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。
实施方案18.根据实施方案17所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述可电离阳离子脂质。
实施方案19.根据实施方案17或18所述的药物组合物，其中所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的质量或重量比不超过约50:1、40:1、30:1、20:1、15:1或10:1。
实施方案20.根据实施方案17-19中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是永久阳离子脂质。
实施方案21.根据实施方案17-20中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是第二可电离阳离子脂质。
实施方案22.根据实施方案21所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约65％的所述SORT脂质。
实施方案23.根据实施方案21所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述SORT脂质。
实施方案24.根据实施方案17-23中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质组合物还包含两性离子脂质(例如，磷脂)。
实施方案25.根据实施方案24所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约25％的所述两性离子脂质。
实施方案26.根据实施方案24所述的药物组合物，其中所述两性离子脂质与所述合成多核苷酸的摩尔比不超过约50:1、40:1、30:1或20:1。
实施方案27.根据实施方案17-26中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质组合物还包含类固醇或类固醇衍生物。
实施方案28.根据实施方案27所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约46％的所述类固醇或类固醇衍生物。
实施方案29.根据实施方案17-28中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质组合物还包含聚合物缀合的脂质(例如，聚(乙二醇)(PEG)缀合的脂质)。
实施方案30.根据实施方案29所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约0.5％至约10％、或约1％至约10％、或约2％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。
实施方案31.根据实施方案17-30中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)不超过约50:1、40:1、30:1或20:1。
实施方案32.根据实施方案31所述的药物组合物，其中所述N/P比为约5:1至约30:1。
实施方案33.根据实施方案17-32中任一项所述的药物组合物，其中所述合成多核苷酸与所述脂质组合物的总脂质的质量或重量比不超过约1:20、1:50或1:100。
实施方案34.根据实施方案17-33中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质包含永久带正电的部分(例如，季铵离子)。
实施方案35.根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述SORT脂质包含反离子。
实施方案36.根据实施方案17-35中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质(例如，饱和的或不饱和的)。
实施方案37.根据实施方案36中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。
实施方案38.根据实施方案17-37中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质包含具有结构式的头基，其中L是(例如，可生物降解的)接头；Z+是带正电的部分(例如，季铵离子)；并且X-是反离子。
实施方案39.根据实施方案38所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：其中R1和R2各自独立地是任选经取代的C6-C24烷基或任选经取代的C6-C24烯基。
实施方案40.根据实施方案38所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
实施方案41.根据实施方案40所述的药物组合物，其中L是其中：
p和q各自独立地是1、2或3；并且
R4是任选经取代的C1-C6烷基。
实施方案42.根据实施方案38所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
R4是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
实施方案43.根据实施方案17-35中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
实施方案44.根据实施方案17-35中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R4和R4′各自独立地是烷基(C6-C24)、烯基(C6-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″′是烷基(C1-C8)、烯基(C2-C8)或这两种基团中任一种的取代形式；并且
X2是单价阴离子。
实施方案45.根据实施方案17-35中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
实施方案46.根据实施方案17-35中任一项所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3是氢、烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)或-Y1-R4，其中：
Y1是烷二基(c≤6)或经取代的烷二基(c≤6)；并且
R4是酰氧基(c≤8-24)或经取代的酰氧基(c≤8-24)。
实施方案47.根据实施方案17-46中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是气雾剂组合物。
实施方案48.根据实施方案45所述的药物组合物，其中所述气雾剂组合物具有0.5微米(μm)至10μm的微滴大小。
实施方案49.根据实施方案45所述的药物组合物，其中所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的中值微滴大小。
实施方案50.根据实施方案45所述的药物组合物，其中所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的平均微滴大小。
实施方案51.根据实施方案17-50中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于气雾剂施用。
实施方案52.根据实施方案17-51中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于顶端递送。
实施方案53.根据实施方案17-52中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于雾化。
实施方案54.一种用于增强囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)在细胞中的表达或活性的方法，所述方法包括：
使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸编码CFTR蛋白；并且其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，
从而在接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体，任选地其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性是通过测量包含所述细胞的多个细胞与没有所述接触的多个参考细胞相比的跨上皮离子转运特性的变化来确定的。
实施方案55.根据实施方案54所述的方法，其中重复所述接触。
实施方案56.根据实施方案55所述的方法，其中每周至少一次进行所述接触。
实施方案57.根据实施方案55所述的方法，其中每周至少两次进行所述接触。
实施方案58.根据实施方案54-57中任一项所述的方法，其中所述方法在每次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。
实施方案59.根据实施方案54-58中任一项所述的方法，其中所述接触是第一次接触，并且其中所述方法包括任选地在所述第一次接触后至少1、2或3天进行的第二次接触。
实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其还包括第三次接触，任选地其中所述第三次接触在所述第二次接触后至少1、2或3天进行。
实施方案61.根据实施方案59所述的方法，其中所述方法在每次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。
实施方案62.根据实施方案60所述的方法，其中所述方法在所述第三次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。
实施方案63.根据实施方案54-62中任一项所述的方法，其中所述接触包括向受试者施用所述组合物，所述组合物包含与所述脂质组合物组装的所述合成多核苷酸。
实施方案64.根据实施方案63所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
实施方案65.根据实施方案63所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案66.根据实施方案63-65中任一项所述的方法，其中所述施用包括通过雾化而吸入。
实施方案67.根据实施方案54-66中任一项所述的方法，其中每次接触中的所述组合物是相同的。
实施方案68.根据实施方案54-67中任一项所述的方法，其中所述细胞是肺气道细胞。
实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中所述细胞是肺分泌细胞。
实施方案70.根据实施方案68或69所述的方法，其中所述细胞是支气管上皮细胞。
实施方案71.根据实施方案54-70中任一项所述的方法，其中所述细胞是未分化的。
实施方案72.根据实施方案54-70中任一项所述的方法，其中所述细胞是分化的。
实施方案73.根据实施方案54-72中任一项所述的方法，其中所述细胞来源于所述受试者。
实施方案74.根据实施方案54-73中任一项的方法，其中所述接触在体内进行。
实施方案75.根据实施方案54-73中任一项所述的方法，其中所述接触在体外进行。
实施方案76.根据实施方案54-73中任一项所述的方法，其中所述接触离体进行。
实施方案77.根据实施方案54-76中任一项所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体是野生型CFTR蛋白。
实施方案78.根据实施方案54-77中任一项所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体是全长CFTR蛋白。
实施方案79.根据实施方案54-78中任一项所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于至少约5微安培(μA)的跨上皮电流，例如，如在体外测定中所确定的。
实施方案80.根据实施方案79所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于约5微安(μA)至约30μA的跨上皮电流。
实施方案81.根据实施方案54-80中任一项所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于至少约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)的跨上皮电流，例如，如在体外测定中所确定的。
实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)至约20μA·cm-2·min-1的跨上皮电流。
实施方案83.根据实施方案54-82中任一项所述的方法，其中相对于相应对照(例如，不进行所述接触的相应细胞)，所述方法增加所述CFTR蛋白的功能变体在所述细胞中的量或活性(例如，增加至少约1.1倍)。
实施方案84.根据实施方案54-83中任一项所述的方法，其中相对于相应对照(例如，不进行所述接触的相应细胞)，所述方法增强离子(例如，氯离子)在所述细胞中的转运(例如，增强至少约1.1倍)。
实施方案85.根据实施方案54-84中任一项所述的方法，其中所述受试者展现或被确定展现囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因中的突变。
实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中所述突变是功能丧失性突变。
实施方案87.根据实施方案85所述的方法，其中所述突变是无义突变或移码突变。
实施方案88.根据实施方案85-87中任一项所述的方法，其中所述突变位于CFTR基因的外显子11-27中的一个或多个中。
实施方案89.根据实施方案85-88中任一项所述的方法，其中所述突变是R553X、G542X、F508del或R1162X或其组合；例如，所述突变是G542X或F508del。
实施方案90.一种用于肺分泌细胞或肺基底细胞递送的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而在所述受试者的肺分泌细胞中产生治疗有效量或活性的所述合成多核苷酸，任选地其中所述合成多核苷酸的所述治疗有效活性是通过测量包含所述肺分泌细胞或肺基底细胞的肺与不进行所述接触的参考肺相比的跨上皮离子转运特性的变化来确定的。
实施方案91.一种用于肺分泌细胞或肺基底细胞递送的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而与所述受试者的肺非分泌细胞或非基底细胞相比，在所述受试者的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生更大的治疗量或活性的所述合成多核苷酸。
实施方案92.根据实施方案91所述的方法，其中所述方法的特征在于：(i)在肺分泌细胞、肺基底细胞或其组合中检测到所述合成多核苷酸的至少约50％、55％或60％(例如，肺)表达；或(ii)在肺非分泌细胞、肺非基底细胞或其组合中检测到所述合成多核苷酸的不超过约50％、45％或40％(例如，肺)表达。
实施方案93.根据实施方案91或92所述的方法，其中所述肺非分泌细胞是肺纤毛细胞。
实施方案94.根据实施方案91-93中任一项所述的方法，其中所述肺非分泌细胞是肺基底细胞。
实施方案95.一种用于肺分泌细胞递送的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，从而在所述受试者的至少5％肺分泌细胞中产生治疗量或活性的所述合成多核苷酸。
实施方案96.根据实施方案95所述的方法，其中所述施用包括向所述受试者的肺施用所述组合物，所述组合物包含与所述脂质组合物组装的所述合成多核苷酸。
实施方案97.根据实施方案95或96所述的方法，其中所述肺分泌细胞是俱乐部细胞或杯状细胞。
实施方案98.一种用于治疗患有或怀疑患有囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)相关病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案17-53和101-151中任一项所述的药物组合物。
实施方案99.根据实施方案98所述的方法，其中所述CFTR相关病症是囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)。
实施方案100.根据实施方案98或99所述的方法，其中所述施用包括局部施用(例如，雾化)。
实施方案101.根据实施方案17-53中任一项所述的组合物，其中所述SORT脂质选自表8中列出的那些或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案102.根据实施方案17-53和101中任一项所述的组合物，其中所述可电离阳离子脂质是具有如下结构式的代(g)的树状聚合物或树突状聚合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
(a)所述核心包含结构式(X核心)：
其中：
Q在每次出现时独立地是共价键、-O-、-S-、-NR2-或-CR3aR3b-；
R2在每次出现时独立地是R1g或-L2-NR1eR1f；
R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢或任选经取代的(例如C1-C6，如C1-C3)烷基；
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在)在每次出现时各自独立地是与分支、氢或任选经取代的(例如，C1-C12)烷基的连接点；
L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、(例如C1-C12，如C1-C6或C1-C3)亚烷基、(例如C1-C12，如C1-C8或C1-C6)杂亚烷基(例如C2-C8亚烷基氧化物，如低聚(环氧乙烷))、[(例如C1-C6)亚烷基]-[(例如C4-C6)杂环烷基]-[(例如C1-C6)亚烷基]、[(例如C1-C6)亚烷基]-(亚芳基)-[(例如C1-C6)亚烷基](例如，[(例如C1-C6)亚烷基]-亚苯基-[(例如C1-C6)亚烷基])、(例如C4-C6)杂环烷基和亚芳基(例如亚苯基)；或者，
可替代地，L1的一部分与R1c和R1d之一形成(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，含有一个或两个氮原子以及任选地选自氧和硫的另外的杂原子)；并且
x1是0、1、2、3、4、5或6；和
(b)多个(N个)分支中的每个分支独立地包含结构式(X分支):
其中：
*表示所述分支与所述核心的附接点；
g是1、2、3或4；
Z＝2(g-1)；
G＝0，当g＝1时；或当g≠1时；
(c)每个二酰基独立地包含结构式其中：
*表示所述二酰基在其近端的附接点；
**表示所述二酰基在其远端的附接点；
Y3在每次出现时独立地是任选经取代的(例如，C1-C12)亚烷基、
任选经取代的(例如，C1-C12)亚烯基、或任选经取代的(例如，C1-C12)亚芳基；
A1和A2在每次出现时各自独立地是-O-、-S-或-NR4-，其中：
R4是氢或任选经取代的(例如，C1-C6)烷基；
m1和m2在每次出现时各自独立地是1、2或3；并且
R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或任选经取代的(例如，C1-C8)烷基；以及
(d)每个接头基团独立地包含结构式
其中：
**表示所述接头与近端二酰基的附接点；
***表示所述接头与远端二酰基的附接点；并且
Y1在每次出现时独立地是任选经取代的(例如，C1-C12)亚烷基、
任选经取代的(例如，C1-C12)亚烯基、或任选经取代的(例如，C1-C12)亚芳基；以及
(e)每个终止基团独立地选自任选经取代的(例如C1-C18，如C4-C18)烷基硫醇和任选经取代的(例如C1-C18，如C4-C18)烯基硫醇。
实施方案103.根据实施方案102所述的组合物，其中x1是0、1、2或3。
实施方案104.根据实施方案102或103所述的组合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在)在每次出现时各自独立地是与分支(例如，如*所示)、氢或C1-C12烷基(例如C1-C8烷基，如C1-C6烷基或C1-C3烷基)的连接点，其中所述烷基部分任选地被一个或多个各自独立地选自以下的取代基取代：-OH、C4-C8(例如，C4-C6)杂环烷基(例如，哌啶基(例如，)、N-(C1-C3烷基)-哌啶基(例如，/>)、哌嗪基(例如，/>)、N-(C1-C3烷基)-哌啶基(例如，/>)、吗啉基(例如，/>)、N-吡咯烷基(例如，/>)、吡咯烷基(例如，/>)或N-(C1-C3烷基)-吡咯烷基(例如，/>)、(例如，C6-C10)芳基和C3-C5杂芳基(例如，咪唑基(例如，/>)或吡啶基(例如，/>))。
实施方案105.根据实施方案104所述的组合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g(如果存在)在每次出现时各自独立地是与分支(例如，如*所示)、氢或C1-C12烷基(例如C1-C8烷基，如C1-C6烷基或C1-C3烷基)的连接点，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。
实施方案106.根据实施方案102-105中任一项所述的组合物，其中R3a和R3b在每次出现时各自独立地是氢。
实施方案107.根据实施方案102-106中任一项所述的组合物，其中所述多个(N个)分支包括至少3个(例如，至少4个或至少5个)分支。
实施方案108.根据实施方案102-107中任一项所述的组合物，其中g＝1；G＝0；并且Z＝1。
实施方案109.根据实施方案108所述的组合物，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式
实施方案110.根据实施方案102-107中任一项所述的组合物，其中g＝2；G＝1；并且Z＝2。
实施方案111.根据实施方案110所述的组合物，其中所述多个分支中的每个分支包含结构式
实施方案112.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如，/>)。
实施方案113.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心包含结构式：
实施方案114.根据实施方案113所述的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如，/> )。
实施方案115.根据实施方案113所述的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如/>如/>)。
实施方案116.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心包含结构式：其中Q’是-NR2-或-CR3aR3b-；q1和q2各自独立地是1或2。
实施方案117.根据实施方案116所述的组合物，其中所述核心包含结构式：(例如，/> )。
实施方案118.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心包含结构式(例如，/> )，其中环A是任选经取代的芳基或任选经取代的(例如C3-C12，如C3-C5)杂芳基。
实施方案119.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心具有结构式
实施方案120.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核选自表3中列出的那些或其子集。
实施方案121.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心包含选自以下的结构式：
及其药学上可接受的盐，其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点。
实施方案122.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心包含选自以下的结构式：
及其药学上可接受的盐，其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点。
实施方案123.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心具有结构其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点或H。
实施方案124.根据实施方案123所述的组合物，其中至少2个分支附接到所述核心。
实施方案125.根据实施方案123所述的组合物，其中至少3个分支附接到所述核心。
实施方案126.根据实施方案123所述的组合物，其中至少4个分支附接到所述核心。
实施方案127.根据实施方案102-111中任一项所述的组合物，其中所述核心具有结构其中*表示所述核心与所述多个分支中的一个分支的附接点或H。
实施方案128.根据实施方案127所述的组合物，其中至少4个分支附接到所述核心。
实施方案129.根据实施方案127所述的组合物，其中至少5个分支附接到所述核心。
实施方案130.根据实施方案127所述的组合物，其中至少6个分支附接到所述核心。
实施方案131.根据实施方案102-130中任一项所述的组合物，其中A1是-O-或-NH-。
实施方案132.根据实施方案131所述的组合物，其中A1是-O-。
实施方案133.根据实施方案102-132中任一项所述的组合物，其中A2是-O-或-NH-。
实施方案134.根据任何实施方案133所述的组合物，其中A2是-O-。
实施方案135.根据实施方案102-134中任一项所述的组合物，其中Y3是C1-C12(例如C1-C6，如C1-C3)亚烷基。
实施方案136.根据实施方案102-135中任一项所述的组合物，其中二酰基在每次出现时独立地包含结构式(例如/>如)，任选地其中R3c、R3d、R3e和R3f在每次出现时各自独立地是氢或C1-C3烷基。
实施方案137.根据实施方案102-136中任一项所述的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自共价键、C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、C2-C12(例如C2-C8)亚烷基氧化物(例如低聚(环氧乙烷)，如-(CH2CH2O)1-4-(CH2CH2)-)、[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，)以及[(C1-C4)亚烷基]-亚苯基-[(C1-C4)亚烷基](例如，/>)。
实施方案138.根据实施方案137所述的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基)、-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-和-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-。
实施方案139.根据实施方案137所述的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C1-C6亚烷基(例如，C1-C3亚烷基)。
实施方案140.根据实施方案137所述的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地是C2-C12(例如，C2-C8)亚烷基氧化物(例如，-(C1-C3亚烷基-O)1-4-(C1-C3亚烷基))。
实施方案141.根据实施方案137所述的组合物，其中L0、L1和L2在每次出现时各自独立地选自[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如，-(C1-C3亚烷基)-亚苯基-(C1-C3亚烷基)-)和[(C1-C4)亚烷基]-[(C4-C6)杂环烷基]-[(C1-C4)亚烷基](例如,-(C1-C3亚烷基)-哌嗪基-(C1-C3亚烷基)-)。
实施方案142.根据实施方案102-141中任一项所述的组合物，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基或烯基部分任选地被一个或多个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷氨基(例如，C1-C6单烷氨基(如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二烷氨基(如))、C4-C6 N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷氨基(例如，单烷氨基或二烷氨基))(例如，)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，)、-C(O)-(C1-C12烷氨基(例如，单烷氨基或二烷氨基))和-C(O)-(C4-C6N-杂环烷基)(例如，/>)，其中任何前述取代基的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
实施方案143.根据实施方案142所述的组合物，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个或多个(例如，一个)各自独立地选自以下的取代基取代：C6-C12芳基(例如，苯基)、C1-C12(例如，C1-C8)烷氨基(例如，C1-C6单烷氨基(如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二烷氨基(如 ))、C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基/>N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基)、-OH、-C(O)OH、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C1-C12烷氨基(例如，单烷氨基或二烷氨基))(例如，/>)、-C(O)N(C1-C3烷基)-(C1-C6亚烷基)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，/>)和-C(O)-(C4-C6 N-杂环烷基)(例如，)，其中任何前述取代基的C4-C6 N-杂环烷基部分任选地被C1-C3烷基或C1-C3羟基烷基取代。
实施方案144.根据实施方案143所述的组合物，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个取代基-OH取代。
实施方案145.根据实施方案143所述的组合物，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇，其中所述烷基部分任选地被一个选自以下的取代基取代：C1-C12(例如，C1-C8)烷氨基(例如，C1-C6单烷氨基(如-NHCH2CH2CH2CH3)或C1-C8二烷氨基(如))和C4-C6N-杂环烷基(例如，N-吡咯烷基N-哌啶基/>N-氮杂环庚烷基/>)。
实施方案146.根据实施方案142所述的组合物，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烯基硫醇或C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
实施方案147.根据实施方案146所述的组合物，其中每个终止基团独立地是C1-C18(例如，C4-C18)烷基硫醇。
实施方案148.根据实施方案147所述的组合物，其中每个终止基团独立地选自：
实施方案149.根据实施方案102-141中任一项所述的组合物，其中每个终止基团独立地选自表5中列出的那些或其子集。
实施方案150.根据实施方案17-53和101中任一项所述的组合物，其中所述可电离阳离子脂质选自表6中列出的那些或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案151.根据实施方案17-53和101中任一项所述的组合物，其中所述可电离阳离子脂质选自表6或表7中列出的那些或其药学上可接受的盐、或所述脂质及其药学上可接受的盐的子集。
实施方案101.根据权利要求54-97中任一项所述的方法，其中所述组合物是根据实施方案17-53和101-151中任一项所述的。
实施例
实施例1：DOTAP或DODAP修饰的脂质纳米颗粒的制备
脂质纳米颗粒(LNP)是用于体内核酸递送的最有效载体类别。从历史上看，有效的LNP由4种组分组成：可电离阳离子脂质、两性离子磷脂、胆固醇和脂质聚(乙二醇)(PEG)。然而，这些LNP仅导致核酸的一般递送，而不是器官或组织靶向性递送。通过IV施用的LNP通常仅将RNA递送至肝脏。因此，努力寻求新的LNP配制品以提供靶向性核酸递送。
在添加或不添加永久阳离子脂质的情况下，以15:15:30:3的摩尔比混合这四种典型类型的脂质。简而言之，通过混合树状聚合物脂质(可电离阳离子脂质)、DOPE(两性离子脂质)、胆固醇、DMG-PEG和DOTAP(永久阳离子脂质)来制备LNP。可替代地，DOTAP可以被DODAP代替，以产生包含DODAP的LNP。DOTAP和DODAP的结构示于图1中。可以使用的各种树状聚合物脂质示于图2中。
为了制备LNP配制品，将树状聚合物脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG以所需摩尔比溶解于乙醇中。将mRNA溶解于柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 4.0)中。然后通过以3:1的体积比(mRNA:脂质，v/v)将mRNA快速混合到脂质溶液中而将mRNA稀释到脂质溶液中，从而达到40:1的重量比(总脂质:mRNA)。然后将该溶液在室温孵育10min。为了形成DOTAP修饰的LNP配制品，将mRNA溶解于1×PBS或柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 4.0)中，并快速混合到含有5A2-SC8、DOPE、胆固醇、DMG-PEG和DOTAP的乙醇中，确定重量比为40:1(总脂质:mRNA)且体积比为3:1(mRNA:脂质)。配制品被命名为X％DOTAP Y(或X％DODAP Y)，其中X代表DOTAP(或DODAP)在总脂质中的摩尔百分比，并且Y代表树状聚合物脂质的类型。可替代地，配制品可以被命名为Y X％DOTAP或Y X％DODAP，其中X代表DOTAP(或DODAP)在总脂质中的摩尔百分比，并且Y代表树状聚合物脂质的类型。
实施例2：SORT LNP的稳定性：
测试了LNP的稳定性。使用微流体混合方法或十字形/T字形混合方法产生5A2-SC820％ DODAP(“肝SORT”)和5A2-SC8 50％ DOTAP(“肺SORT”)。不同的LNP配制品的特征在于大小、多分散性指数(PDI)和ζ电位，如通过针对每种配制品各进行3次的动态光散射所评估的。LNP的特征示于表9中。
表9：SORT LNP的特征
使用Ribogreen RNA测定法测试了包封效率(Zhao等人,2016)。简而言之，当mRNA溶解于酸性缓冲液(10mM柠檬酸盐，pH 4)中时，mRNA以>95％的效率包封在LNP中。对于两种类型的LNP(5A2-SC8 20％ DODAP(“肝SORT”)和5A2-SC8 50％DOTAP(“肺SORT”))，在28天内观察到这些特征。图6显示LNP在28天进程内的特征变化。
此外，为了测量LNP在溶液中的稳定性，在小鼠中观察LNP的稳定性和由此产生的mRNA表达。简而言之，给小鼠静脉内注射0.1mg/kg，并进行体内观察。注射后5小时添加萤光素并使其可视化。如图7所示，肺SORT LNP在肺中产生了组织特异性辐射，即使在14天后其仍然很高，而信号在第21天和第28天有轻微衰变。图8显示在用肺SORT或肝SORT治疗后的特定时间小鼠器官的图像。
实施例3：TR(Tomato Red)mRNA在不同细胞类型中的表达
分析了TR(Tomato Red)mRNA在hBE培养物(人支气管上皮细胞培养物)中不同细胞类型中的表达。将TR mRNA加载到20％ DODAP 4A3-SC7 LNP或10％ DOTAP 5A2-SC8 LNP中，并使用顶端推注给药(上小图)或气雾剂递送(下小图)将其递送至分化良好的人支气管上皮细胞培养物中。观察TR蛋白在各种细胞类型中的表达，并将TR阳性细胞在不同细胞类型中的百分比绘制成图。如图3的上小图所示，20％ DODAP 4A3-SC7 LNP优先引起分泌细胞表达TR，而10％ DOTAP 5A2-SC8 LNP使纤毛细胞优先表达TR。这种优先递送可以允许递送至肺的治疗物优先影响肺中的特定细胞类型。TR mRNA也被加载到没有SORT脂质(例如DODAP或DOTAP)的LNP中，以鉴定DODAP或DOTAP如何影响效力。如图3的下小图所示,与没有DOTAP或DODAP的相应LNP相比，包含DOTAP或DODAP的LNP显示出TR表达增加。
实施例4：经由吸入气雾剂递送的LNP的萤光素酶活性和组织病理学
将Luc mRNA加载到多个LNP(包括包含SORT脂质和树状聚合物的LNP)中。产生4A3-SC7 20％ DODAP、4A3-SC7 10％ DODAP、5A2-SC8和5A2-SC8 10％ DOTAP的LNP，并使其加载有Luc mRNA。通过雾化(Aerogen solo)将0.4/2/8mg的LNP(配制有Luc2 mRNA(1mg/ml))递送至pie室中，估计(未测量)每只小鼠的递送剂量为0.01、0.06或0.22mg/kg。小鼠为7周龄B6雄性白化病小鼠。在递送LNP后5小时，向小鼠施用萤光素。检测萤光素酶活性，作为递送至靶标的量度。图4显示萤光素酶在小鼠中的分布和表达，这证明表达是成功的，并且LNP的递送可以使用吸入气雾剂递送来进行。
实施例5：含EPC的LNP的毒性
通过对人支气管上皮细胞进行顶端推注给药，测试包含乙基磷酸胆碱(EPC)代替DOTAP或DODAP的LNP的毒性。释放的乳酸脱氢酶(LDH)的百分比被用作细胞死亡的度量，并指示LNP的毒性。在处理之前(处理前)和处理后24小时检测LDH的释放。如图5所示，50％DOTAP LNP的处理导致约15％的LDH释放，而EPC没有显示显著的LDH释放％。重要地是，DOTAP和EPC具有相似的季胺部分，这表明针对细胞靶向的活性可能是相似的，但EPC的毒性要小得多。
实施例6：CFTR mRNA的优化
在生产前优化CFTR mRNA的mRNA序列。简而言之，首先根据密码子使用％对野生型序列进行优化，消除UU和UA水解热点，消除TAC和TTC以外的含U密码子，并消除不需要的或偶然的限制，以获得密码子优化的ORF。CFTR mRNA的示例结构示于图9A中。使用Kozak序列AUGC的变体来维持野生型氨基酸组成。N末端Met之后的第二个残基是Gln(由CAG编码)。将包括SEQ ID NO:1的ORF序列放置在Kozak序列之后，然后是聚A。
在GenScript上合成了与CFTR基因相对应的DNA。将pUC57/CFTR用BstBI消化(CFTR的ORF是密码子优化的)。利用未修饰或经修饰的核苷酸，使用标准的体外转录程序来产生RNA。使用痘苗病毒加帽系统和帽2’-O-甲基转移酶进行加帽反应。进一步对全长CFTR mRNA进行片段分析，如图9B所示，这证明用未修饰或经修饰的核苷酸合成了全长CFTR mRNA。测试的其他常规QC参数包括浓度、无菌、mRNA功能、残留质粒和细菌DNA、dsRNA和内毒素。
实施例7：CFTR蛋白在FRT细胞中的剂量依赖性表达
简而言之，将本申请的CFTR mRNA转染到FRT细胞中。如图10A和图10B所示，CFTRmRNA的转染诱导CFTR蛋白在FRT中的表达。裂解FRT细胞并收集裂解物。对裂解物样品进行凝胶电泳，随后用抗CFTR进行蛋白印迹分析。HA标记的CFTR mRNA和未标记的CFTR mRNA均产生可检测的蛋白质，而未标记的mRNA产生的可检测蛋白质更多。与转染后48h相比，在转染后24h观察到的CFTR表达更高。
使用具有24个电极歧管的跨上皮电流钳(TECC24)和具有可渗透膜支持插入物的24孔板，在Fisher大鼠甲状腺(FRT)细胞系中评估CFTR mRNA的功能表达。将FRT细胞接种在多孔膜上并使其生长直至转染前汇合。Lipofectamine 2000被用作FRT转染的最佳试剂。转染后24小时，将FRT板置于热稳定的(36℃)平台上，并在机器人辅助或手动转换电极歧管之后在细胞占据的板和填充有测定缓冲液的参考板之间，以约1min的采集间隔测量跨上皮电阻(Rt)值。FRT测定顺序包括基线读取间隔(约8min)、10μM毛喉素诱导的CFTR激活间隔(约10min)、1μM VX-770诱导的CFTR增强间隔(约10min)和20μM INH-172诱导的CFTR抑制间隔(约10min)。相对于时间重建FRT电导迹线[Gt＝1/(Rt-50)，mS/cm]。将毛喉素/VX-770介导的响应计算为针对添加毛喉素和NIH-172之间的时间点的Gt曲线下面积(GtAUC)。该AUC计算是在基线减法之后进行的，将其计算为初始基线Gt时间点和明显的完全CFTR抑制之后获得的平稳Gt时间点之间的倾斜线(图11A，虚线)。对于不同的mRNA设计，统计比较了与CFTR介导的整个FRT层的Cl-通量的改变相对应的Gt/min的变化，将该变化外推为CFTR的功能活性。如图11所示，在用两种浓度的CFTR mRNA处理后，用TECC24电导测定法测试亲本FRT细胞，其中1μg的mRNA导致毛喉素诱导的电导为约28mS/cm2，0.5μg的mRNA导致电导为约7mS/cm2，这证明了CFTR蛋白的ReCode mRNA介导的功能性表达。图11B和图11C显示用优化的CFTR mRNA在FRT细胞中观察到的剂量依赖性CFTR功能的示例实验。图11B显示在添加CFTR调节剂之后FRT单层的代表性电导动力学迹线。使用Lipofectamine 2000，将在可渗透支持物上生长的5日龄汇合的FRT细胞用优化的mRNA转染。在用一个剂量的优化的CFTR mRNA转染后1天进行跨上皮电导的MTECC24测定。图11C显示通过毛喉素诱导的和INH 172抑制的Cl-电导而确定的CFTR活性：mRNA剂量依赖性跨上皮电导(Gt)响应：条是在毛喉素添加和抑制剂172添加时间点之间的Gt曲线下面积(AUC)/min。
实施例8：将报告mRNA递送至完全分化的hBE细胞中
分析了TR(Tomato Red)mRNA在完全分化的hBE细胞中的表达。简而言之，将hBE细胞接种在24孔板中并使其增殖。通过将板放入封闭的室中使包含Tomato Red mRNA的LNP雾化到24孔板上，并使雾化的LNP沉降到hBE细胞上。如图12所示，未处理的孔没有显示任何信号，而观察到用雾化的LNP处理的孔包含具有Tomato Red表达的细胞。测试了两种不同的递送剂量，其中与200μg剂量的处理相比，在400μg剂量后观察到表达增加。
实施例9.hBE细胞中的跨上皮电阻和等效的跨上皮电流测定，以验证本申请的所选药理学化合物和CFTR mRNA/LNP配制品的细胞耐受性和CFTR挽救功效。
使用在24孔板中的可渗透支持物上生长的并且针对顶端气液界面(ALI)分化/极化的人支气管上皮(hBE)细胞的跨上皮电阻(Rt)来评估人支气管上皮细胞对本申请的mRNA/LNP配制品的耐受性。基线Rt>50％的降低被认为是显著的，这对应于屏障上皮细胞功能的阻塞。如图13A所示，与媒介物相比，包封Tomato Red报告mRNA和CFTR mRNA的LNP不诱导Rt的显著损失，这表明人支气管上皮细胞对ReCode mRNA/LNP配制品具有良好耐受性。如所预期的，用TR报告mRNA LNP处理的hBE尽管显示较强的TR蛋白表达(红色荧光信号，图13C)，但未显示可检测的毛喉素诱导的电流(图13B)。结果表明，TR报告LNP可以用作阳性转染对照，并且CFTR治疗剂可以用作hBE中CFTR活性的阳性对照。
实施例10.在来自F508del/F508del受试者的分化的原代hBE细胞中，通过本申请的CFTR mRNA LNP配制品补偿F508del/F508del CFTR突变。
包封ReCode CFTR mRNA的LNP在F508del/F508del CFTR hBE模型中显示对CFTR的显著挽救。简而言之，将CFTR mRNA用不同的LNP组合物包封，并以顶端液体推注或使ALIhBE顶端暴露于雾化的LNP气雾剂的形式递送至F508del/F508del hBE细胞中。将从第3代具有F508del/F508del基因型的囊性纤维化患者中分离的hBE细胞接种在24孔板上，并在96小时后进行气升。用Vertex ALI培养基常规喂养3天/周后，细胞生长。5周后，hBE细胞培养物被认为是完全分化的、极化的，并准备进行TECC24功能测定。处理之前4天，用PBS中的3mM DTT从hBE培养物的顶端侧洗涤黏液。处理之前24小时，将细胞用PBS洗涤，在处理日再用PBS洗涤，用液体推注或VitroCell雾化配制品进行顶端处理，并按计划在24或24+n24小时的CO2孵育后进行测试。与针对FRT细胞所描述地类似地进行TECC24测定，除了抑制大Na+电导和记录hBE的典型小分离CFTR介导的Cl-电流所需的不同药理学试剂。具体地，hBE测定顺序包括背景电流/电阻记录间隔(约8min)、用6μM苯扎咪抑制Na+电导后的基线Cl-电流记录间隔(约8min)、10μM毛喉素+1μM VX-770诱导的CFTR激活间隔(约15min)和20μM布美他尼诱导的Cl-电流抑制间隔(约10min)。相对于时间重建hBE跨上皮等效电流迹线[Ieq＝Vt/(Rt-50)，μA/cm]。将毛喉素/VX-770诱导的Cl-电流响应计算为针对毛喉素/VX770和NIH-172添加之间的时间点的Ieq曲线下面积(Ieq AUC)。对Ieq AUC/min值进行统计学验证，并在实验样品中进行比较。如图14A所示，用包含HA-CFTR mRNA 5A2-SC8和DOTAP配制品的LNP进行的顶端推注处理恢复了在F508del/F508del hBE中的毛喉素依赖性Cl-电流，这表明其对CFTR功能的挽救与阳性药理学对照(VX-809)相等或比之更好。用Vitrocell雾化的顶端气雾剂处理F508del/F508del hBE也恢复了CFTR的活性。
实施例11.用本申请的CFTR mRNA配制品恢复CFTR在CFTR突变型hBE中的功能
包封ReCode CFTR mRNA的LNP被验证为可以挽救CFTR在CFTR突变型(如R553X/F508del)hBE中的功能。简而言之，将CFTR mRNA与不同的LNP组合物组装，并按照针对以上F508del/F508del hBE所述的相似的方案递送至CFTR突变型(如R553X/F508del)hBE细胞中。如图15A所示，使用LNP(包含4A3-SC7和DODAP)经由雾化递送HA-CFTR mRNA导致CFTR在细胞中的表达。如图15B所示，经由雾化递送包含CFTR mRNA的组合物也显示在挽救功能方面是有效的。
实施例12.在来自G542X/F508del受试者的分化的原代hBE细胞中，通过本申请的CFTR mRNA LNP配制品补偿G542X/F508del CFTR突变
包封ReCode CFTR mRNA的LNP在G542X/F508del CFTR hBE模型中显示对CFTR的显著挽救。简而言之，将CFTR mRNA用不同的LNP组合物包封，并以顶端液体推注或使ALI hBE顶端暴露于雾化的LNP气雾剂的形式递送至G542X/F508del hBE细胞中。将从第3代具有G542X/F508del基因型的囊性纤维化患者中分离的hBE细胞接种在24孔板上，并在96小时后进行气升。用Vertex ALI培养基常规喂养3天/周后，细胞生长。5周后，hBE细胞培养物被认为是完全分化的、极化的，并准备进行TECC24功能测定。处理之前4天，用PBS中的3mM DTT从hBE培养物的顶端侧洗涤黏液。处理之前24小时，将细胞用PBS洗涤，在处理日再用PBS洗涤，用液体推注或VitroCell雾化配制品进行顶端处理，并在处理后的时间点在24或24+n24、12、24、48、72或96小时的CO2孵育后进行测试。具体地，hBE测定顺序包括背景(初始)电流/电阻记录间隔(约8min)、基线Cl-电流记录间隔(约8min，在用6μM苯扎咪抑制Na+电导后)、10μM毛喉素+1μM VX-770诱导的CFTR激活间隔(约15min)和20μM布美他尼诱导的Cl-电流抑制间隔(约10min)。相对于时间重建hBE跨上皮等效电流迹线[Ieq＝Vt/(Rt-50)，μA/cm]。将毛喉素/VX-770诱导的Cl-电流响应计算为针对毛喉素/VX-770和NIH-172添加之间的时间点的Ieq曲线下面积(Ieq AUC)。对Ieq AUC/min值进行统计学验证，并在实验样品中进行比较。如图16A所示，用包含CFTR mRNA的LNP进行的顶端推注处理恢复了在G542X/F508del hBE中的毛喉素依赖性Cl-电流，这表明其对CFTR功能的挽救与阳性药理学对照(VX-809和Trikafta)相等或比之更好。图16A还显示在/>可渗透支持物上生长的ΔF508-HBE中以及在所述支持物上的ALI中毛喉素诱导的和布美他尼抑制的Cl-电流的代表性迹线。在用单剂量气雾化的CFTR mRNA LNP、VX-809和Trikafta等同物处理后1天进行MTECC24测定。图16B显示表示为等效电流AUC/min的相对CFTR功能活性。图16C显示作为治疗毒性的相对参考的初始跨上皮电阻。图16D显示CFTR的蛋白质印迹，并证明CFTR蛋白在CFTR mRNA处理的细胞中成功产生，其产生量与阳性药理学对照(用鲁玛卡托(3μM VX-809)或Trikafta(3.3μM VX-661+3μM VX-445和1μM VX-770，添加有毛喉素)处理的细胞)相似或比之更大。
在类似的测定中，根据每周两次的给药方案重复施用CFTR mRNA LNP配制品。在使用类似方案来确定CFTR功能的情况下，重复施用在每次给药后均显示CFTR功能。图17A和图17B显示与阴性对照相比，每次给药都能够产生改进的CFTR功能。
实施例13.向特定肺细胞递送mRNA。
分析了TR(Tomato Red)mRNA在hBE培养物(人支气管上皮细胞培养物)中不同细胞类型中的表达。将TR mRNA加载到LNP中，并使用顶端推注给药(上小图)或气雾剂递送(下小图)将其递送至分化良好的人支气管上皮细胞培养物中。观察TR蛋白在各种细胞类型中的表达，并将TR阳性细胞在不同细胞类型中的百分比绘制成图。如图18的上小图所示，在杯状细胞中观察到TR表达强烈，在基底细胞和俱乐部细胞中表达较少，而在纤毛细胞中表达最少。图18还显示，使用Vitrocell雾化，用RTX0001配制的Td Tomato mRNA(4mg)处理分化良好的人hBE细胞一次。通过用所示标记物共定位来确定阳性细胞％。这表明LNP配制品可以选择性地递送至特定的所选肺细胞类型，以进行递送。
实施例14.递送至受试者的CFTR mRNA的检测。
通过施用如本文其他地方所述的组合物来对患有或怀疑患有囊性纤维化的受试者给予治疗。定期监测受试者肺中的CFTR表达。取受试者的肺组织样品，其包含肺纤毛细胞。收集细胞并准备用于RNA分离。使用第一链合成试剂盒和随机六聚体由RNA产生cDNA。使用一组对CFTR具有特异性的正向和反向引物以及荧光探针、和第二组对对照或管家基因具有特异性的正向和反向引物以及荧光探针运行qPCR反应，以实现表达标准化。使用对应于CFTR探针的荧光读数来检测CFTR的表达。
实施例15.人受试者的临床试验
将包封ReCode CFTR mRNA的LNP施用于患有囊性纤维化的人受试者，以通过单次递增剂量(SAD)和多次递增剂量(MAD)研究获得最大耐受剂量、剂量限制性毒性和安全性。在3个月内对人受试者测试了SAD和MAD研究。此外，在进行开放标签延伸研究(OLE)的受试者中测试了耐受性和毒性的长期延伸研究。在9个月内对人受试者测试了OLE研究。在SAD、MAD和OLE研究中，用低剂量的包封ReCode CFTR mRNA的LNP、高剂量的包封ReCode CFTRmRNA的LNP或安慰剂对人受试者群组进行测试。此外，比较在施用包封ReCode CFTR mRNA的LNP之前和治疗之后人受试者的FEV1的百分比的绝对变化，以评估治疗功效。所述研究的概述示于图19中。
虽然在本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言将明显的是，此类实施方案仅通过举例的方式来提供。本发明不受说明书中提供的具体例子的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文对实施方案的描述和图示并不意味着限制。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文根据各种条件和变量阐述的具体描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明也将覆盖任何这样的替换、修改、变化或等同物。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，从而覆盖在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

Claims (101)

1.一种编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含一种或多种核苷类似物。
2.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含1-甲基假尿苷。
3.一种编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-4和23的序列的至少100、300、500、700、900或1,000个碱基具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列(例如，开放阅读框(ORF)序列)。
4.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列包含少于约115、110、105、100、95或90个UU或TT二核苷酸。
5.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列包含至少两个编码精氨酸的同义密码子。
6.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列包含至少三个编码精氨酸的同义密码子。
7.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列的所有编码精氨酸的密码子的不超过约70％、65％、60％、55％或50％是AGA密码子。
8.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述核酸序列编码多肽，所述多肽包含在至少100、300、500、700、900或1,000个连续氨基酸残基上与SEQ ID NO:5具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸是信使核糖核酸(mRNA)。
10.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸还包含3’或5’非编码区。
11.根据权利要求10所述的合成多核苷酸，其中所述3’或5’非编码区增强由所述合成多核苷酸编码的所述CFTR蛋白在细胞内的表达或活性。
12.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸还包含5’帽结构。
13.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其中所述3’非编码区包含聚腺苷尾。
14.根据权利要求13所述的合成多核苷酸，其中所述聚腺苷尾包含至多200个腺苷。
15.根据权利要求13所述的合成多核苷酸，其中所述聚腺苷尾改善所述合成多核苷酸在细胞中的药代动力学特性。
16.根据权利要求15所述的合成多核苷酸，其中所述聚腺苷尾改善所述合成多核苷酸在细胞中的延长的半衰期。
17.一种药物组合物，其包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述可电离阳离子脂质。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述可电离阳离子脂质与所述合成多核苷酸的质量或重量比不超过约50:1、40:1、30:1、20:1、15:1或10:1。
20.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是永久阳离子脂质。
21.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是第二可电离阳离子脂质。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约65％的所述SORT脂质。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约30％的所述SORT脂质。
24.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述脂质组合物还包含两性离子脂质(例如，磷脂)。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约5％至约25％的所述两性离子脂质。
26.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述两性离子脂质与所述合成多核苷酸的摩尔比不超过约50:1、40:1、30:1或20:1。
27.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述脂质组合物还包含类固醇或类固醇衍生物。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约15％至约46％的所述类固醇或类固醇衍生物。
29.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述脂质组合物还包含聚合物缀合的脂质(例如，聚(乙二醇)(PEG)缀合的脂质)。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述脂质组合物包含摩尔百分比为约0.5％至约10％的所述聚合物缀合的脂质。
31.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述脂质组合物中的氮与所述合成多核苷酸中的磷酸的摩尔比(N/P比)不超过约50:1、40:1、30:1或20:1。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述N/P比为约5:1至约30:1。
33.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述合成多核苷酸与所述脂质组合物的总脂质的质量或重量比不超过约1:20、1:50或1:100。
34.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质包含永久带正电的部分(例如，季铵离子)。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述SORT脂质包含反离子。
36.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是磷酸胆碱脂质(例如，饱和的或不饱和的)。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述SORT脂质是乙基磷酸胆碱。
38.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质包含具有结构式的头基，其中L是(例如，可生物降解的)接头；Z+是带正电的部分(例如，季铵离子)；并且X-是反离子。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：其中R1和R2各自独立地是任选经取代的C6-C24烷基或任选经取代的C6-C24烯基。
40.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中L是其中：
p和q各自独立地是1、2或3；并且
R4是任选经取代的C1-C6烷基。
42.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
R4是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
43.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；
X-是单价阴离子。
44.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R4和R4′各自独立地是烷基(C6-C24)、烯基(C6-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″是烷基(C≤24)、烯基(C≤24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R4″′是烷基(C1-C8)、烯基(C2-C8)或这两种基团中任一种的取代形式；并且
X2是单价阴离子。
45.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3、R3′和R3″各自独立地是烷基(C≤6)或经取代的烷基(C≤6)；并且
X-是单价阴离子。
46.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述SORT脂质具有结构式：
其中：
R1和R2各自独立地是烷基(C8-C24)、烯基(C8-C24)或这两种基团中任一种的取代形式；
R3是氢、烷基(c≤6)或经取代的烷基(c≤6)或-Y1-R4，其中：
Y1是烷二基(c≤6)或经取代的烷二基(c≤6)；并且
R4是酰氧基(c≤8-24)或经取代的酰氧基(c≤8-24)。
47.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物是气雾剂组合物。
48.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述气雾剂组合物具有0.5微米(μm)至10μm的微滴大小。
49.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的中值微滴大小。
50.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述气雾剂组合物具有0.5μm至10μm的平均微滴大小。
51.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于气雾剂施用。
52.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于顶端递送。
53.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于雾化。
54.一种用于增强囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)在细胞中的表达或活性的方法，所述方法包括：
使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸编码CFTR蛋白；并且其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，
从而在接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体，任选地其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性是通过测量包含所述细胞的多个细胞与没有所述接触的多个参考细胞相比的跨上皮离子转运特性的变化来确定的。
55.根据权利要求54所述的方法，其中重复所述接触。
56.根据权利要求55所述的方法，其中每周至少一次进行所述接触。
57.根据权利要求55所述的方法，其中每周至少两次进行所述接触。
58.根据权利要求54所述的方法，其中所述方法在每次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。
59.根据权利要求54所述的方法，其中所述接触是第一次接触，并且其中所述方法包括任选地在所述第一次接触后至少1、2或3天进行的第二次接触。
60.根据权利要求59所述的方法，所述方法还包括第三次接触，任选地其中所述第三次接触在所述第二次接触后至少1、2或3天进行。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述方法在所述第二次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述方法在所述第三次接触后至少24小时在所述细胞中产生治疗有效量或活性的CFTR蛋白的功能变体。
63.根据权利要求54所述的方法，其中所述接触包括向受试者施用所述组合物，所述组合物包含与所述脂质组合物组装的所述合成多核苷酸。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述受试者是人。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述施用包括通过雾化而吸入。
67.根据权利要求54所述的方法，其中每次接触中的所述组合物是相同的。
68.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞是肺气道细胞。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述细胞是肺分泌细胞。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述细胞是支气管上皮细胞。
71.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞是未分化的。
72.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞是分化的。
73.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞来源于所述受试者。
74.根据权利要求54所述的方法，其中所述接触在体内进行。
75.根据权利要求54所述的方法，其中所述接触在体外进行。
76.根据权利要求54-73所述的方法，其中所述接触离体进行。
77.根据权利要求54所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体是野生型CFTR蛋白。
78.根据权利要求54所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体是全长CFTR蛋白。
79.根据权利要求54所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于至少约5微安培(μA)的跨上皮电流，例如，如在体外测定中所确定的。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于约5微安(μA)至约30μA的跨上皮电流。
81.根据权利要求54所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于至少约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)的跨上皮电流，例如，如在体外测定中所确定的。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述CFTR蛋白的功能变体的所述治疗有效活性对应于约2微安(μA)/平方厘米/分钟(μA·cm-2·min-1)至约20μA·cm-2·min-1的跨上皮电流。
83.根据权利要求54所述的方法，其中相对于相应对照(例如，不进行所述接触的相应细胞)，所述方法增加所述CFTR蛋白的功能变体在所述细胞中的量或活性(例如，增加至少约1.1倍)。
84.根据权利要求54所述的方法，其中相对于相应对照(例如，不进行所述接触的相应细胞)，所述方法增强离子(例如，氯离子)在所述细胞中的转运(例如，增强至少约1.1倍)。
85.根据权利要求54所述的方法，其中所述受试者展现或被确定展现囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因中的突变。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述突变是功能丧失性突变。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述突变是无义突变或移码突变。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述突变位于CFTR基因的外显子11-27中的一个或多个中。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述突变是R553X、G542X、F508del或R1162X或其组合。
90.一种用于肺分泌细胞或肺基底细胞递送的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，
从而在所述受试者的肺分泌细胞中产生治疗有效量或活性的所述合成多核苷酸，任选地其中所述合成多核苷酸的所述治疗有效活性是通过测量包含所述肺分泌细胞或肺基底细胞的肺与不进行所述接触的参考肺相比的跨上皮离子转运特性的变化来确定的。
91.一种用于肺分泌细胞或肺基底细胞递送的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，
从而与所述受试者的肺非分泌细胞或非基底细胞相比，在所述受试者的肺分泌细胞或肺基底细胞中产生更大的治疗量或活性的所述合成多核苷酸。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述方法的特征在于：(i)在肺分泌细胞、肺基底细胞或其组合中检测到所述合成多核苷酸的至少约50％、55％或60％(例如，肺)表达；或(ii)在肺非分泌细胞、肺非基底细胞或其组合中检测到所述合成多核苷酸的不超过约50％、45％或40％(例如，肺)表达。
93.根据权利要求91所述的方法，其中所述肺非分泌细胞是肺纤毛细胞。
94.根据权利要求91所述的方法，其中所述肺非分泌细胞是肺基底细胞。
95.一种用于肺分泌细胞递送的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含与脂质组合物组装的合成多核苷酸，所述合成多核苷酸编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，其中所述脂质组合物包含：
可电离阳离子脂质；以及
与所述可电离阳离子脂质分开的选择性器官靶向(SORT)脂质，
从而在所述受试者的至少5％肺分泌细胞中产生治疗量或活性的所述合成多核苷酸。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述施用包括向所述受试者的肺施用所述组合物，所述组合物包含与所述脂质组合物组装的所述合成多核苷酸。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述肺分泌细胞是俱乐部细胞或杯状细胞。
98.一种用于治疗患有或怀疑患有囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)相关病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求17中任一项所述的药物组合物。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述CFTR相关病症是囊性纤维化、遗传性肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)。
100.根据权利要求98所述的方法，其中所述施用包括局部施用。
101.根据权利要求98所述的方法，其中所述施用包括雾化。
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