CN102119216A - Spt事件侧翼的植物基因组dna及用于鉴定spt事件的方法 - Google Patents

Abstract

提供了涉及包含制种技术的转基因植物的组合物和方法。具体地，提供了具有赋予制种技术的E6611.32.1.38事件的玉米植物。在已述染色体位置携带E6611.32.1.38事件的植物包含所述的基因组/转基因接合。位于整合的E6611.32.1.38事件侧翼的植物基因组DNA可以用于设计会特异性针对E6611.32.1.38事件的测定法。E6611.32.1.38事件的基因组插入位点的表征为增强的育种效率做准备并且使利用分子标记在育种群体及其子代中追踪转基因插入物成为可能。提供了用于玉米E6611.32.1.38事件的鉴定、检测和使用的多种方法和组合物。

Description

SPT事件侧翼的植物基因组DNA及用于鉴定SPT事件的方法

发明领域

本发明的实施方案涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明的实施方案涉及含有制种技术(seed production technology)(SPT)事件和位于转基因序列侧翼的植物基因组DNA的转基因玉米植物。

发明背景

植物中外源基因的表达已知能被其在植物基因组中的位置所影响，也许是由于整合位点附近的染色质结构(例如异染色质)或转录调节元件(例如增强子)的接近(Weising，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet 22：421-477)。同时，位于基因组中不同位置的转基因的存在以不同方式影响植物的总体表型。因此，通常，为了鉴定以引入的目的基因的最适表达为特征的事件而必需筛选大量事件。例如，已经在植物和其他生物体中观察到在事件之间，引入的基因的表达水平可以存在广泛的变化。表达的空间或时间模式中也可以存在差别，例如，不同植物组织中转基因的相对表达的差别，这可能不符合预期来自引入的基因构建体中存在的转录调节元件的模式。还观察到转基因插入可以影响内源基因表达。因此，产生数百至数千的不同事件并且为了具有用于商业目的的所需转基因表达水平和模式的单一事件而筛选那些事件是常见的。具有所需转基因表达的水平或模式的事件对于使用常规育种方法通过有性远交将转基因渗入到其他遗传背景中是有用的。这些杂种的子代保持最初转化体的转基因表达特性。该策略用于确保许多良好适应于局部生长条件的品种中可靠的基因表达。

能够检测植物或种子或这些植物或种子的子代中特定事件的存在或不存在是有利的，这不仅涉及转基因自身，还涉及其在宿主植物或种子的基因组中的位置。能够为了确定有性杂交的子代是否含有目的转基因而检测事件的存在是特别有利的。此外，用于检测特定事件的方法对于以下是有帮助的：符合需要源自重组作物植物的食品的上市前许可和标签的规定，或环境监测、监测田地中作物的性状或监测源自作物收获的产品中的用途，以及确保各方对规章性或合同性条款的遵守中的用途。事件特异性检测方法可以鉴定插入的DNA和受体基因组之间独特的接合(junction)。

发明概述

如本文所述，玉米通过SPT事件的插入已被修饰。相关描述也提供在美国专利申请公开第US2009/0038026号和美国专利申请公开第2006/0288440号。表12中总结了用于生成事件E6611.32.1.38的PHP24597的T-DNA中的遗传元件。

提供了涉及含有特定外源DNA的转基因玉米植物的组合物和方法，所述特定外源DNA通过标准玉米转化被引入，在本文被称为“制种技术(SPT)事件”或“事件E6611.32.1.38”或“E6611.32.1.38”或“事件DP-32138-1”或“DP-32138-1”或“事件32138”或“32138”。转化的植物或种子也可以称为“32138”或“32138玉米”。还提供了对于生成转基因事件有用的构建体，和对于鉴定导致包含SPT事件的转基因植物的特定转基因事件有用的材料和方法。

还提供了保藏为ATCC专利保藏第PTA-9158号种子和源自其的植物、植物细胞、植物部分、谷类和植物产品。本申请人在2008年4月15日于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC

)，Manassas，VA 20110-2209 USA)进行了至少2500粒玉米事件32138(指定为E6611.32.1.38)的种子的保藏，并且该保藏被指定为ATCC保藏第PTA-9158号。这些保藏会根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款保持。进行这些保藏仅仅是作为本领域技术人员的方便，而不是承认根据35 U.S.C.§112需要保藏。2008年4月15日于ATCC保藏的种子取自由先锋国际良种公司(Pioneer Hi-Bred International，Inc.)，7250NW 62^nd Avenue，Johnston，IA 50131-1000保持的保藏。在该申请未决期间，专利与商标局长(Commissioner of Patents and Trademarks)和局长根据请求所确定的有权人可以获得该保藏。一旦本申请的任何权利要求被准许，本申请人会根据37C.F.R.§1.808将使公众可获得所做保藏样品。该玉米事件32138的种子的保藏会保持在作为公共保藏处的ATCC保藏处，时间为30年或最近的请求后5年或本专利可实施的年限，以较长的为准，并且如果在该期间中其变为非有活力的，则会被替换。此外，本申请人已满足37 C.F.R.§§1.801-1.809中所有的要求，包括在保藏时提供样品活力的说明。本申请人无权免除法律对于生物材料的转移或其在商业中的运输所施加的限制。本申请人不放弃追究对该专利赋予他们的权利或根据植物品种保护法(Plant Variety Protection Act)(7 USC 2321及以下)适用于事件32138的权利的任何侵犯。禁止未经许可的种子繁殖。种子可以被监管。

本发明的其他实施方案涉及本文所述的特异侧翼序列，所述侧翼序列可以用于开发生物样品中E6611.32.1.38的特异性鉴定方法。其他实施方案涉及E6611.32.1.38的左边界和/或右边界侧翼区，其可以用于特异性引物和探针的开发。本发明的其他实施方案涉及基于这些特异性引物或探针的使用的生物样品中E6611.32.1.38的存在的鉴定方法。

按照本发明的另一实施方案，提供了检测样品中对应于事件E6611.32.1.38的DNA的存在的方法。在特定实施方案中，方法包含：(a)将包含DNA的样品与DNA引物组接触，当所述引物组与从包含事件E6611.32.1.38的植物中提取的基因组DNA在核酸扩增反应中使用时，所述引物组产生对于事件E6611.32.1.38是诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生所述扩增子和(c)检测所述扩增子。

例如图11中所示序列的包含新的转基因/侧翼插入区的DNA分子，或与所述DNA分子同源的或互补的分子是本发明的实施方案。

其他实施方案包含DNA序列，所述DNA序列包含SEQ ID NO：1或图11的新的侧翼和转基因侧翼/插入区。包含足够长度的SEQ ID NO：1或图11的转基因插入物序列的多核苷酸和足够长度的SEQ ID NO：1或图11的玉米基因组和/或侧翼序列的多核苷酸的DNA序列是本发明的另外的实施方案，所述DNA序列作为引物序列可用于产生对于包含事件E6611.32.1.38的植物是诊断性的扩增子产物。

本发明的其他实施方案包括包含32138玉米的T-DNA区的DNA序列的转基因部分的至少11个或更多个核苷酸的DNA序列，或其互补物，以及相似长度的SEQ ID NO：1或图11所示的侧翼玉米DNA序列，或其互补物。这些DNA序列可以作为DNA引物用于DNA扩增方法。使用这些引物产生的扩增子对于事件E6611.32.1.38是诊断性的。因此，本发明的实施方案还包括由DNA引物产生的扩增子，所述DNA引物与单独的32138玉米的转移的T-DNA区或其与鉴定出的侧翼序列的组合是同源的或互补的。

按照本发明的另一实施方案，提供了检测样品中对应于事件E6611.32.1.38的DNA分子的存在的方法，该方法包含：(a)将包含从植物中提取的DNA的样品与DNA探针接触，所述探针包含在严紧杂交条件下与从事件E6611.32.1.38中提取的DNA杂交并且在严紧杂交条件下不与对照植物DNA杂交的分子；(b)使样品和探针处于严紧杂交条件下，和(c)检测探针与DNA的杂交。更具体地，本发明的另一实施方案包含检测样品中对应于事件E6611.32.1.38的DNA分子的存在的方法，该方法由以下组成：(a)将包含从玉米植物提取的DNA的样品与由例如接合序列的对于该事件是独特的序列所组成的DNA探针分子接触，其中所述DNA探针分子在严紧杂交条件下与从包含玉米事件E6611.32.1.38的植物提取的DNA杂交并且在严紧杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使样品和探针处于严紧杂交条件下，和(c)检测探针与DNA的杂交。

本发明的另一实施方案还涉及用于鉴定生物样品中事件E6611.32.1.38的DNA检测试剂盒。所述试剂盒包含用于PCR鉴定操作步骤中的第一引物和第二引物，所述第一引物特异性地识别E6611.32.1.38的左或右边界侧翼区，所述第二引物特异性地识别E6611.32.1.38的外源DNA内的序列。本发明的其他实施方案涉及用于鉴定生物样品中事件E6611.32.1.38的试剂盒，所述试剂盒包含特异性探针，所述特异性探针具有对应于以下序列或与以下序列互补的序列：与事件E6611.32.1.38的特异区具有80％至100％的序列同一性的序列。探针的序列对应于包含事件E6611.32.1.38的5′或3′侧翼区的部分的特异区。

本发明的其他实施方案涉及为了不同目的使用本发明的实施方案所包括的方法和试剂盒，所述不同目的例如但不限于以下：鉴定植物、植物材料或产品中的事件E6611.32.1.38，所述产品例如但不限于包含或源自植物材料的食品或饲料产品(新鲜的或加工过的)；为了转基因和非转基因材料之间的分离，鉴定转基因植物材料；以及确定包含玉米事件E6611.32.1.38的植物材料的质量。所述试剂盒还可以含有检测方法的实施所必需的试剂和材料。

在另一方面中，本发明提供用于产生包含事件E6611.32.1.38的子代植物的方法。所述子代植物可以是近交(inbred)或杂交植物。在其他应用中，本发明提供用于实施对于事件E6611.32.1.38的标记(marker)辅助育种的方法。按照本发明的另一方面，提供了包含事件E6611.32.1.38的稳定转化的玉米植物。

附图概述

图1提供了PHP24597的质粒图谱。质粒大小为52869bp。

图2提供了来自质粒PHP24597的T-DNA区的图谱。所使用的探针的位置如图谱下方盒所示并且标识为以下：

编号	探针名称
		1	5126启动子
2	Ms45

3	Pg47启动子
		4	zm-bt1
5	zm-aa1
		6	In2-1终止子
7	35S增强子
		8	Ltp2启动子
9	DsRed2
		10	pinII终止子

图3提供了DP-32138-1玉米中插入物的图谱和基于来自本研究的Southern印迹分析数据的插入物的限制性消化示意图。标明了BamH I、Bgl II、Bmt I、EcoR I、Hind III和Xho I限制性酶位点。Southern印迹分析表明PHP24597 T-DNA的单一拷贝已经插入玉米基因组。T-DNA区外部的酶位点的位置不是按比例的。星号(*)表明这些酶位点的相对位置是不确定的，这是由于生成自这些位点的大尺寸片段。垂直虚线表明位于左边界接合外部的BamH I和Bgl II位点，其在Southern印迹上显示出受阻的消化。

图4提供了没有限制性位点的PHP24597的示意图。

图5提供了PHP24597的T-DNA区的示意图，其标明Ms45基因组区、zm-aa1基因和DsRed2(Alt1)基因以及它们各自的调节元件。T-DNA的大小为9950bp。

图6提供了带有用于构建体特异性PCR的引物(08-0-2544/08-0-2582)位置的来自质粒PHP24597的T-DNA的示意图。该图不是按比例绘制。T-DNA的大小为9950bp。

图7展示了来自32138玉米和非遗传修饰的对照玉米的叶DNA的构建体特异性PCR分析的结果。使用靶向于32138玉米中存在的PHP24597T-DNA的独特5126启动子/Ms45基因接合的引物组08-0-2544/08-0-2582来进行PCR扩增。预期的扩增子的大小为233bp。样品按照以下上样：泳道安排：

图8展示了来自32138玉米和非遗传修饰的对照玉米的叶DNA的玉米转化酶基因PCR分析的结果。使用靶向于玉米转化酶基因的引物组02-O-197/02-O-198的内源玉米转化酶基因的PCR扩增用作PCR扩增的阳性对照。预期的扩增子的大小为225bp。样品按照以下上样：

泳道安排：

图9展示了32138玉米的叶DNA样品的PCR分析的敏感性。使用靶向于32138玉米中存在的PHP24597 T-DNA的独特5126启动子/Ms45基因接合的引物组08-0-2544/08-0-2582来进行PCR扩增。预期的扩增子的大小为233bp。样品用减小量的32138玉米DNA(3-10泳道)和非遗传修饰的对照DNA(12泳道)按照以下上样：

泳道安排：

图10是32138玉米中测序过的插入物和基因组边界区的示意图。该图表明生成自32138玉米基因组DNA的经过克隆和测序的PCR片段：片段A(07-0-2286/07-0-2277)、片段B(08-0-2329/08-0-2398)、片段C(08-0-2402/07-0-2024)、片段D(08-0-2505/08-0-2504)和片段E(08-0-2408/08-0-2526)。垂直虚线代表基因组边界/插入物接合。片段F(08-0-2528/08-0-2538)和G(08-0-2539/08-0-2530)分别代表5′和3′基因组边界区。图10不是按照比例绘制。

图11提供了32138玉米中T-DNA插入物和基因组边界区的序列。5′和3′基因组边界区是有下划线的：分别是bp 1至2114和bp 119997至13998。如图15所示，“基因组边界区”内位于位置2115-11996的完整插入物上游直接是T-DNA的部分插入物。

图12展示了32138玉米和对照玉米植物中5′和3′基因组边界区的PCR分析的结果。

12A：引物对08-0-2528/08-0-2538从5′侧翼基因组DNA内扩增PCR产物(294bp)。样品按照以下上样：

泳道	样品
		1	低DNA质量标记
2	空白
		3	对照玉米植物C-1
4	对照玉米植物C-2
		5	空白
6	32138玉米植物T-1
		7	32138玉米植物T-2
8	32138玉米植物T-3
		9	32138玉米植物T-4

10	无模板对照
		11	空白
12	低DNA质量标记

12B：引物对08-0-2539/08-0-2530从3′基因组边界区内扩增PCR产物(297bp)。样品按照以下上样：

泳道	样品
		1	低DNA质量标记
2	空白
		3	对照玉米植物C-1
4	对照玉米植物C-2
		5	空白
6	32138玉米植物T-1
		7	32138玉米植物T-2
8	32138玉米植物T-3
		9	32138玉米植物T-4
10	无模板对照
		11	空白
12	低DNA质量标记

图13是质粒PHP24597的示意图，其标明带有碱基对位置的EcoR I和BamH I限制性酶位点。右边界和左边界区位于T-DNA(图2)侧翼，所述T-DNA预期在土壤杆菌属介导(Agrobacterium-mediated)的转化中被传递的。用于Southern分析的探针的位置在质粒图谱的内部以标字母的盒标出。A：RB探针；B：LB探针；C：spc探针；D：virG探针；E：tet探针。用于分析的其他的酶的位置如下：

酶	位置(bp)
		Bmt I	8503、36160、38359、39502、45917

Hind III

179、34837、45900、46809、47930、49445

图14是来自质粒PHP24597的T-DNA的示意图，其标明BamH I、Bmt I、EcoR I和Hind III的限制性酶位点和Ms45、zm-aa1和DsRed2(Alt1)编码和调节区。T-DNA的大小为9950bp。所使用的探针的位置在图谱下以标数字的盒展示并且进一步识别为以下：

编号	探针名称
		1	5126启动子
2	Ms45
		3	Pg47启动子
4	zm-bt1
		5	zm-aa1
6	In2-1终止子
		7	35S增强子
8	Ltp2启动子
		9	DsRed2(Alt1)
10	pinH终止子

图15是展示5′侧翼序列和插入位点的细节的示意图。提供了23-bp或27-bp部分插入物的可选的特征。

序列概述

SEQ ID NO：1是32138玉米的13998-碱基对区，其包含2114bp的5′基因组边界序列、2002bp的3′基因组边界序列和9882bp的来自PHP24597的插入的T-DNA。

SEQ ID NOS：2-5是PCR反应中使用的引物序列；也可参见表17。

SEQ ID NOS：6-19是PCR反应中使用的引物序列；也可参见表16。

SEQ ID NO：20是来自质粒PHP24597的Ms45基因的剪接的外显子翻译的推定氨基酸序列。全长MS45蛋白长度为412个氨基酸并且分子量约为47kDa。

SEQ ID NO：21是来自质粒PHP24597的zm-bt1转运肽+zm-aa1区翻译的推定氨基酸序列。包括转运肽(氨基酸1-75)的完整翻译产物长度为495个氨基酸并且分子量约为54kDa。移除转运肽的加工过的ZM-AA1蛋白长度为420个氨基酸并且分子量约为46kDa。

SEQ ID NOS：22和23分别是用于检测32138事件的qPCR方法的正向和反向引物。

SEQ ID NO：24是用于检测32138事件的qPCR方法的荧光标记(label)探针的序列。

SEQ ID NO：25是在用于检测32138事件的qPCR方法中使用SEQ ID NOS：22-24得到的扩增子。该扩增子跨越3′接合。

SEQ ID NOS：26和27分别是用于检测32138事件的基于凝胶(gel-based)的方法的正向和反向引物。

SEQ ID NO：28是在用于检测32138事件的基于凝胶的方法中使用SEQ ID NOS：26-27得到的扩增子。该扩增子跨越3′接合。

SEQ ID NOS 29和30分别是用于32138事件的检测的正向和反向引物。

SEQ ID NO：31是用于32138事件的检测的荧光标记探针的序列。

SEQ ID NO：32是在检测32138事件中使用SEQ ID NOS：29-31得到的扩增子。

SEQ ID NO：33是来自质粒PHP24597的DsRed2(Alt1)基因翻译的推定氨基酸序列。DsRed2蛋白长度为225个氨基酸并且分子量约为26kDa。

SEQ ID NO：34表示带有标出的右和左边界重复的PHP24597的T-DNA。表12提供了遗传元件的描述和位置。

SEQ ID NO：35提供了标明的DsRed2(Alt1)编码序列。

SEQ ID NO：36提供了事件32138的部分插入物和左边界侧翼序列。

SEQ ID NO：37提供了事件32138的部分插入物和右边界侧翼序列。缩写词

本文使用了一些缩写词，包括以下：

5126              来自玉米的花药特异性基因

Bp                碱基对

DIG               地高辛配基

ID                标识符

In2-1             来自玉米的苯磺酰胺诱导型2-1基因

Kb                千碱基或千碱基对

LB                左T-DNA边界

Ltp2              来自大麦(Hordeum vulgare)的糊粉特异性脂

转移蛋白2基因

Ms45              玉米育性恢复基因

Ms45基因组        Ms45基因和相关的3′非翻译区

NaOH              氢氧化钠

NCBI              美国国立生物技术信息中心

PCR               聚合酶链反应

pinII             来自马铃薯(Solanum tuberosum)的蛋白酶抑

制剂II基因

RB                右T-DNA边界

SDS               十二烷基磺酸钠

SSC               0.015M柠檬酸钠、0.15M氯化钠、pH 7.0

T-DNA             转移的DNA

zm-aa1            来自玉米的α-淀粉酶基因的截断体

zm-bt1            来自玉米Brittle-1基因的转运肽

发明详述

提供以下定义和方法用以更好地界定本发明以及在本发明实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

如本文所用，术语“事件E6611.32.1.38特异性”是指适于有区别地鉴定植物、植物材料或产品中事件E6611.32.1.38的多核苷酸序列，所述产品例如但不限于包含或源自植物材料的食品或饲料产品(新鲜的或加工过的)。

如本文所用，术语“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种。如本文所用，术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包含，例如植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。谷类意图表示由商业种植者为种植或繁殖物种之外的用途所生产的成熟种子。再生植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，如果这些植物包含E6611.32.1.38事件。可以在本发明的方法中使用的植物的种类通常与易接受转化技术的高等植物的种类同样广泛，包括单子叶植物和双子叶植物两者。

“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。“天然基因(Native gene)”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因(Chimeric gene)”是指不是天然基因的任何基因，其包含天然未一同发现的调节和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列或衍生自相同来源、但是以与天然中发现的不同的方式安排的调节序列和编码序列。“内源基因(Endogenous gene)”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源(Foreign)”是指在目的位置中正常不会发现的材料。因此“外源DNA”可以包含植物的重组DNA和/或新近引入的、重排的DNA。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组DNA或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。如本文所用，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“3′侧翼”或“3′基因组边界区”或“基因组3′边界序列”等。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“5′侧翼”或“5′基因组边界区”或“基因组5′边界序列”等。E6611.32.1.38事件的侧翼区的非限制性实例如SEQ ID NO：1(bp 1-2114和bp 11997-13998)和图11(参见下划线区)所示。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体特征性的和独特的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的方式连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。E32138事件的接合点可清晰见于图11和图15。

涉及到核酸时，如本文所用，“异源”是来源于外源物种的核酸，或如果来源于相同物种，通过有意的人为干预在组成和/基因组基因座中对其天然形式进行了实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接到异源核苷酸序列的启动子可以来自与所述核苷酸序列来源的物种不同的物种，或者，如果来源于相同或类似物种，所述启动子不是天然发现可操作地连接到所述核苷酸序列。异源蛋白可以来源于外源物种，或如果来源于相同或类似物种，对其最初形式进行了实质性修饰。

“调节序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)的并且影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的核苷酸序列。总的来说，编码序列是位于启动子序列的3′。启动子序列可以包含近端和较远端上游元件。所述较远端上游元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且其可以是启动子的固有元件或插入以增强启动子的活性水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体来源于天然基因或由来源于天然发现的不同启动子的不同元件组成或甚至包含合成的核苷酸节段。本领域技术人员应当理解到，不同启动子可以在不同组织或细胞类型中或发育的不同阶段中或应答于不同环境条件指导基因表达。引起核酸片段在大部分时间里在大部分细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。在植物细胞中有用的各种类型的新启动子被不断发现；许多实例可以见于Okamuro和Goldberg，(1989)Biochemistry of Plants 15：1-82的汇编中。应当进一步意识到，因为大部分情况下调节序列的确切界限未被完全界定，所以不同长度的核酸片段可以具有相同的启动子活性。

“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的完全加工过的mRNA上游。翻译前导序列可以影响很多参数，包括初级转录物到mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。翻译前导序列的实例已有描述(Turner和Foster，(1995)Mol.Biotechnol.3：225-236)。

“3′非编码序列”是指位于编码序列的下游的核苷酸序列并且包括多腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常以实现将多腺苷酸束(tracts)添加到mRNA前体的3′末端为特征。不同3′非编码序列的用途由Ingelbrecht，et al.，(1989)Plant Cell 1：671-680举例说明。

“蛋白”或“多肽”是按照由编码多肽的多核苷酸中的编码序列决定的特定顺序排列的氨基酸的链。

“DNA构建体”是提供一个或多个表达盒的连接在一起的DNA分子的组装。DNA构建体可以是能够在细菌细胞中自我复制并且含有对于引入DNA分子有用的不同内切核酸酶酶限制性位点的质粒，所述DNA分子提供功能性遗传元件，即启动子、增强子、内含子、前导、编码序列、3′终止区等；或DNA构建体可以是DNA分子的线性组装，例如表达盒。包含在DNA构建体内的表达盒含有对于提供信使RNA的转录所必需的遗传元件。表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的实施方案的表达盒设计为在植物细胞中表达。

本发明的实施方案的DNA分子可以提供在表达盒中用于在目的生物体中表达。所述盒可以包括可操作地连接到编码序列的5′和3′调节序列。“可操作地连接”意图表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作的连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的调节序列可以起始和介导目的多核苷酸的转录。可操作地连接的元件可以是相邻的或非相邻的。当涉及两个蛋白编码区的接合时，可操作地连接意图表示所述编码区位于相同读框内。盒可以另外含有至少一个待共转化入生物体的其他基因。可选地，其他基因可以提供在多重表达盒或多重DNA构建体上。该表达盒提供时可以具有多个用于待处于调节区的转录调节下的多核苷酸的插入的限制性位点和/或重组位点。表达盒可以另外含有选择标记基因。

在转录的5′-3′方向上，表达盒可以包含在植物中有功能的转录和翻译调节区(即启动子)、编码区和转录和翻译终止区。转录调节区(例如启动子)对宿主生物体可以是天然的或类似的或外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或可选地合成序列。在表达盒构建体中，表达盒可以另外含有5′前导序列。该前导序列可以作用以增强翻译。调节区(例如启动子、转录调节区、RNA加工或稳定性区、内含子、多腺苷酸化信号和翻译终止区)和/或编码区对于宿主细胞或对于彼此可以是天然的/类似的或异源的。

在制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以便为处于正确方向的和如适当地正确读框的DNA序列做准备。最后阶段，连接物(adapters)和接头(linkers)可以用于连接DNA片段，或者可以包括其他操作来为方便的限制性位点、过剩的DNA的移除、限制性位点的移除等做准备。为此，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性、退火、再取代，例如转换和颠换。表达盒还可以包含用于转化细胞选择的选择标记基因。选择标记基因用于转化的细胞或组织的选择。

应当理解到，如本文所用，术语“转基因(体)(transgenic)”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因(体)”包括最初被这样改变的那些转基因体以及由最初的转基因体的有性杂交或无性繁殖生成的那些。如本文所用，术语“转基因(体)”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

转基因“事件”通过以下产生：用包括包含目的转基因的核酸表达盒的异源DNA构建体转化植物细胞，得自转基因在植物基因组中的插入的植物群体的再生以及以特定基因组位置中的插入为特征的特定植物的选择。

通常，转化大量植物细胞，产生植物群体，从所述群体中选择特定植物。术语“事件”是指最初转化体和转化体的子代，其包括插入基因组中特定和独特位置的外源DNA，即事件DNA。术语“事件”还指通过有性远交、自花授粉或反复回交产生的子代，其中至少一株在育种中使用的植物是含有事件DNA的最初转化体的任何代。

事件表型上是以转基因的表达为特征。在遗传水平，事件是植物的遗传组成的部分。术语“事件”还指通过转化体和另一品种之间的有性远交而产生的子代，其中所述子代包含异源DNA。即使与回交亲本反复的回交后，来自转化的亲本的插入的DNA和侧翼DNA仍存在于杂交的子代中处于相同染色体位置。术语“事件”还指来自最初转化体的DNA，其包含插入的DNA和与插入的DNA直接相邻的侧翼序列，所述最初转化体的DNA预期传递给接受包括目的转基因的插入的DNA的子代，所述子代是包括插入的DNA的一个亲本系(例如最初转化体和来自自交的子代)和不含有插入的DNA的亲本系的有性杂交的结果。

因此，转基因“事件”是包含“事件DNA”并且由“事件DNA”定义的植物。这样，“事件E6611.32.1.38”包含“E6611.32.1.38事件DNA”。植物可以包含两个或更多不同事件DNAs并因此包含两个或更多不同事件。此外，缺乏给定转基因事件X的植物不包含所谈到的事件DNA X。事件DNA可以通过植物育种领域技术人员已知的任何育种方案、方法或工具从植物传递给植物，从代传递给代。

植物的转化通常采用选择标记和选择方法以区别培养物的转化的细胞和非转化的细胞。在一些实例中，选择标记基因保留在转基因植物中；在其他实例中，移除外源DNA中引入的选择标记基因或其他序列是理想的。同源重组是一种可用于删除存在于转基因植物中的标记基因的方法(美国专利第6,580,019号，在此通过引用将其全部并入)。可用于从植物中移除序列的另一有用工具涉及位点特异性重组酶及其分别的位点特异性靶位点的使用。

按照本发明，可以使用许多不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统和酵母的FLP/FRT系统。噬菌体P1Cre/lox和酵母FLP/FRT系统构成两个对于位点特异性整合或转基因的切离特别有用的系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)会特异性地与其分别的位点特异性重组序列(分别是lox或FRT)相互作用，以倒转或切离中间的序列。对于这两个系统中每一个的序列是相对短的(对于lox为34bp且对于FRT为47bp)，因此便于与转化载体使用。FLP/FRT和Cre/lox重组酶系统已经被证明在植物细胞中有效地发挥功能。在特定实施方案中，使用Cre/lox重组酶系统来移除选择标记序列，特别是NPT II标记基因，其侧翼是lox P重组位点。(Russell，et al.，(1992)Mol.Gen.Genet.234：45 59)。

提供了包含至少部分的异源插入物DNA和植物基因组侧翼DNA的DNA分子(本文称为“接合序列”或“接合”)。

术语“事件E6611.32.1.38 DNA”是指包含插入基因组的特定位置中的图2的T-DNA(也可参见SEQ ID NO：1的bp 2115-11996)和相邻侧翼DNA的DNA节段，所述侧翼DNA预期能从含有插入的DNA的亲本植物传递给子代植物。更具体地，事件E6611.32.1.38 DNA还指包含植物基因组中植物天然基因组DNA和整合的转基因DNA的界面(interface)的DNA区中的每一个，例如其中5′末端在植物天然基因组DNA中并且3′末端在整合的转基因DNA中的一界面周围的区。此外，当外源DNA的序列存在于宿主基因组中其特定位置时，所述外源DNA的序列可以变化，例如部分的序列可以改变、缺失或扩增并仍然构成所述事件DNA，如果所述外源DNA继续存在于基因组中相同的位置。

E6611.32.1.38植物可以通过首先将第一和第二亲本植物有性杂交来育种。第一亲本植物是生长自转基因E6611.32.1.38植物或其子代的植物，即源自用本发明实施方案的赋予制种技术的表达盒的转化。第一亲本植物由第二亲本植物授粉，从而产生多个第一子代植物，并且选择包含SPT事件的第一子代植物。第一子代植物可以自花授粉，从而产生多个第二子代植物；并且从第二子代植物中选择包含SPT事件的植物。这些步骤还可以包括将包含SPT事件的子代植物与第二亲本植物或第三亲本植物回交，从而产生包含SPT事件的植物。SPT事件是通过雌性配子而不是雄性配子来传递。

两株不同的转基因植物也可以有性杂交以产生含有两个独立分离的外源基因的后代。合适的子代的自交可以产生对于两个外源基因都是纯合的植物。还涉及与亲本植物的回交和与非转基因植物的远交以及营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可见于一些参考文献中的一篇，例如Fehr，in Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox(用于栽培种发育的育种方法)，ed.，American Society of Agronomy，Madison Wis.(1987)。

术语“种质”是指个体、个体的组或代表基因型、品种、物种或培养物的克隆、或其遗传材料。

“系(line)”或“品系(strain)”是同一系谱(parentage)的个体的组，其通常近交至一定程度并且通常是等基因的或近似等基因的。

培育近交玉米系通常用于玉米杂种的生产中以及在用于产生新的和不同的近交玉米系的育种群体中用作种质。近交玉米系通常用作通过传统育种和/或分子基因渗入技术的新性状基因渗入的靶。近交玉米系需要是高度同质的、纯合的和可繁殖的，从而可用作商业杂种亲本。许多分析方法可用于确定近交系的纯合性和表型稳定性。

短语“杂种植物”是指来自遗传上不同的个体之间的杂交的植物。

如本文所用，“杂交的”或“杂交”意图表示配子的融合，例如对于植物来说，通过授粉以产生子代(即细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物由遗传上不同的植物进行授粉)和自花授粉(自花授粉，即花粉和胚珠来自相同植物或遗传上相同的植物)。

术语“基因渗入”是指所需的遗传基因座的等位基因从一个遗传背景到另一个的传送。在一方法中，所需等位基因可以通过两个亲本之间的有性杂交而基因渗入，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。

“转化”是指将核酸片段传递到宿主生物的基因组中，导致遗传上的稳定遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。植物转化方法的实例包括土壤杆菌属介导的转化(De Blaere，et al.，(1987)Meth.Enzymol.143：277)和粒子加速或“基因枪”转化技术(Klein，et al.，(1987)Nature(London)327：70-73；美国专利第4,945,050号，在此通过引用并入本文)。下文公开其他转化方法。

因此，本发明的分离的多核苷酸可以并入能够被引入宿主细胞并在宿主细胞中复制的重组构建体、通常地DNA构建体。该构建体可以是包含能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的复制系统和序列的载体。许多适于植物细胞的稳定转染或转基因植物的建立的载体已描述于例如Pouwels，et al.，(1985；Supp.1987)Cloning Vectors：A Laboratory Manual(克隆载体：实验手册)，Weissbach和Weissbach(1989)Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)，(Academic Press，New York)；和Flevin，et al.，(1990)Plant Molecular Biology Manual(植物分子生物学手册)，(Kluwer Academic Publishers)。通常，植物表达载体包括，例如5′和3′调节序列转录控制下的一个或多个克隆植物基因和显性选择标记。这些植物表达载体还可以含有启动子调节区(例如控制诱导型或组成型、环境调节的或发育调节的、或细胞特异性或组织特异性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

“探针”是附加了常规可检测的标记或报告分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶的分离的多核苷酸。该探针与靶多核苷酸的链是互补的，例如，在一些实施方案中，与来自事件E6611.32.1.38的分离的DNA的链是互补的，其无论是来自包括来自该事件DNA的植物或样品。探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括聚酰胺和特异性地结合靶DNA序列并且可以用于检测靶DNA序列存在的其他探针材料。

如本文所用，“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交形成引物和靶DNA链之间的杂交体而与互补靶DNA链退火，然后凭借例如DNA聚合酶的聚合酶沿着靶DNA链伸展。引物对涉及其靶多核苷酸扩增用途，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。“PCR”或“聚合酶链反应”是用于特定DNA节段的扩增的技术(参见美国专利第4,683,195号和第4,800,159号；在此通过引用并入)。可以使用本文公开的引物的任意组合以达到，对(pair)允许E6611.32.1.38事件或特异区的检测。引物对的非限制性实例包括如表16所示的SEQ ID NOS：6和7、8和9、10和11、12和13、14和15、16和17以及18和19。

探针和引物具有足够的核苷酸长度以结合靶DNA序列并特异性地检测和/或鉴定具有E6611.32.1.38事件的多核苷酸。应当意识到，操作者可以确定杂交条件或反应条件以实现该结果。通常，使用长度为5、8、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700个核苷酸或更多或约11-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800或更多的核苷酸。这些探针和引物可以在高严紧性杂交条件下特异性地与靶序列杂交。探针和引物可以与靶序列具有连续核苷酸的完全DNA序列同一性，尽管通过常规方法可以设计不同于靶DNA序列并保留特异性地检测和/或鉴定靶DNA序列能力的探针。因此，探针和引物可以与靶多核苷酸共享约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性或互补性，或可以与靶序列存在1、2、3、4、5、6或更多连续核苷酸的差异。探针可以用作引物，但是其通常设计用来结合靶DNA或RNA而不是用在扩增过程中。

特异性引物可以用于扩增整合片段，以产生可以用作鉴定生物样品中事件E6611.32.1.38的“特异性探针(specific probe)”的扩增子。可选地，在PCR反应中可以使用探针以允许扩增事件的检测(即Taqman探针或MGB探针，也称为实时PCR)。当探针与生物样品的多核苷酸在允许探针与样品的结合的条件下杂交时，该结合可以被检测到并且因此允许指示生物样品中事件E6611.32.1.38的存在。该结合探针的鉴定在本领域中已有描述。在一实施方案中，特异性探针是在优化的条件下特异性地与事件5′或3′侧翼区内的区域杂交并且还包含部分与其相邻的外源DNA的序列。特异性探针可以包含与E6611.32.1.38事件的特异区至少80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至100％同一的(或互补的)序列。特异性针对E6611.32.1.38事件的定量实时PCR测定法可以包含，例如SEQ ID NOS：29和30的引物对和SEQ ID NO：31的荧光探针。

用于制备和使用探针和引物的方法描述于，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，2.sup.nd ed，vol.1-3，ed.Sambrook，et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989(下文“Sambrook，et al.，1989”)；Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学实验操作步骤)，ed.Ausubel，et al.，Greene Publishing and Wiley-lnterscience，New York，1992(定期更新)(下文“Ausubel，et al.，1992”)；和Innis，et al.，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR操作步骤：方法和应用指南)，Academic Press：San Diego，1990。PCR引物对可以衍生自已知序列，所述衍生例如通过使用为该目的准备的计算机程序，例如Vector NTI版本6中的PCR引物分析工具(Informax Inc.，Bethesda Md.)、PrimerSelect(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)和Primer(版本0.5.COPYRGT.，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，Mass.)。此外，使用本领域技术人员已知指南，可以可视化扫描序列和人工鉴定引物。

如本文所用，“试剂盒”是指用于实施本发明的方法实施方案、更特别地用于生物样品中E6611.32.1.38事件的鉴定和/或检测的目的的试剂组。为质量控制(例如种子批的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件E6611.32.1.38的检测的目的，可以使用试剂盒，并且其组分可以具体地调整。如本文所用，“植物材料”是指获得自或来源于植物的材料。

在具体的实施方案中，提供了用于鉴定生物样品中事件E6611.32.1.38的试剂盒。试剂盒包含第一和第二引物，其中所述第一和第二引物扩增包含E6611.32.1.38和/或侧翼DNA特异区的多核苷酸。在其他实施方案中，试剂盒还包含用于E6611.32.1.38和/或侧翼DNA特异区的检测的多核苷酸。试剂盒可以包含，例如，包含SEQ ID NO：1、2、3、4或5的多核苷酸的片段的第一引物，其中第一或第二引物为了扩增所述E6611.32.1.38和/或侧翼DNA特异区，与该多核苷酸共享足够的序列同一性或互补性。引物对可以包含SEQ ID NO：1的片段和SEQ ID NOS：2-3和6-19中任意的片段。引物可以是足够扩增E6611.32.1.38区的任意长度，包括例如至少6、7、8、9、10、15、20、15或30或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。

还提供了包含至少一种可以特异性地检测E6611.32.1.38和/或侧翼DNA特异区的多核苷酸的DNA检测试剂盒，其中所述多核苷酸包含至少一种足够长度的与SEQ ID NO：1同源或互补的连续核苷酸的DNA分子。

基于本文公开的侧翼DNA和插入物序列的引物和探针可以用于通过常规方法验证(并且如果必要的话，更正)已公开的序列，例如通过再克隆这些序列和将这些序列测序。本发明的核酸探针和引物在严紧条件下与靶DNA序列杂交。任何常规核酸杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其他核酸分子特异性地杂交。如本文所用，如果所述两个分子能够形成反平行的、双链核酸结构，该两核酸分子被认为能够特异性地彼此杂交。

在杂交技术中，使用了与具有E6611.32.1.38特异事件的靶多核苷酸选择性地杂交的多核苷酸的全部或部分。当“严紧条件”或“严紧杂交条件”涉及多核苷酸探针时，意指探针与其靶序列杂交比与其他序列杂交达到可检测地更高程度所处的条件(例如至少2倍于背景)。关于使用特定扩增引物对的靶多核苷酸的扩增(例如通过PCR)，“严紧条件”是在DNA热扩增反应中，允许引物对与靶多核苷酸(具有对应的野生型序列(或其互补物)的引物会与之结合)杂交并且优选地产生可鉴定的具有E6611.32.1.38特异区的扩增产物(扩增子)的条件。严紧条件是序列依赖性的并且在不同情况下会不同。通过控制杂交的严紧性和/或洗涤条件，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探查(homologous probing))。可选地，可以调整严紧性条件以允许序列中一些错配，以便可以检测到较低程度的同一性(异源探查(heterologous probing))。通常，探针长度少于约1000个核苷酸或长度少于500个核苷酸。

如本文所用，基本上互补的或同一的序列是在高严紧性条件下，会分别与与其比较的核酸分子或该核酸分子的互补物特异性地杂交的多核苷酸。例如约45℃下6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、随后2×SSC 50℃洗涤的促进DNA杂交的适当的严紧性条件对于本领域技术人员是已知的或可见于Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学操作步骤)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。通常，用于杂交和检测的严紧条件会是其中pH为7.0至8.3下盐浓度小于约1.5M钠离子、通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐类)并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度至少约30℃以及对于长探针(例如多于50个核苷酸)温度至少约60℃的条件。严紧条件也可以用添加例如甲酰胺的去稳定剂来实现。示例性的低严紧性条件包括以30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲液37℃杂交并且在50℃至55℃下以1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M磷酸三钠)中洗涤。示例性的中严紧性条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中37℃下杂交并且在55℃至60℃下在0.5×至1×的SSC中洗涤。示例性的高严紧性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中37℃下杂交并且在60℃至65℃在0.1×的SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％的SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，经常地约4至约12小时。洗涤的持续时间是至少足以达到平衡的时间长度。

在杂交反应中，特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，T_m(热熔解点)可以用Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem 138：267-284的公式近似：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对长度。T_m是互补靶序列的50％与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，T_m下降约1℃；因此，可以调整T_m、杂交和/或洗涤条件从而与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％的同一性的序列，那么T_m可以降低10℃。通常，严紧条件选择为比确定的离子强度和pH下对于具体序列及其互补物的热熔解点(T_m)低约5℃。但是，高严紧条件可以采用比热熔解点(T_m)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中严紧条件可以采用比热熔解点(T_m)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严紧性条件可以采用比热熔解点(T_m)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。利用该公式、杂交和洗涤组成以及所需T_m，普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的严紧性的变化是内在描述的。如果所需的错配程度导致了低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，那么优选地是增加SSC浓度，以便可以使用较高的温度。对于核酸杂交的广泛的指导见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交)，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel，et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学操作步骤)，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。参见Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)和Haymes，et al.，(1985)In：Nucleic Acid Hybridization，a Practical Approach(核酸杂交实践方法)，IRL Press，Washington，D.C.。

如本文所用，当多核苷酸分子之一的每个核苷酸都与另一多核苷酸分子的核苷酸互补时，分子被认为表现出“完全互补性”。如果两个分子在至少常规的“低严紧性”条件下可以以允许它们彼此保持退火的足够的稳定性互相杂交，两个分子被认为是“最低程度地互补的(minimally complementary)”。相似地，如果分子在常规的“高严紧性”条件下可以以允许它们彼此保持退火的足够的稳定性互相杂交，分子被认为是“互补的”。常规的严紧性条件由Sambrook，et al.，1989和Haymes，et al.，(1985)In：Nucleic Acid Hybridization，a Practical Approach(核酸杂交实践方法)，IRL Press，Washington，D.C.描述。因此，自完全互补性的偏离是允许的，只要该偏离不完全地妨碍分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子用作引物或探针，其只需要足够地序列互补以能够在使用的特定的溶剂和盐浓度下形成稳定双链结构。

本方法和组合物中使用的任何多核苷酸及其片段和变体可以与E6611.32.1.38事件的转基因插入物的区、E6611.32.1.38事件的接合序列或E6611.32.1.38事件的侧翼序列共享序列同一性。确定各种序列的关系的方法是已知的。如本文所用，“参考序列(reference sequence)”是用作序列比较基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集(subset)或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的节段，或完整的cDNA或基因序列。如本文所用，“比较窗(comparison window)”涉及多核苷酸序列的连续的和指定的节段，其中与用于两个多核苷酸的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即空位)。通常，比较窗长度为至少20个连续的核苷酸并且任选地可以是30、40、50、100或更长。本领域技术人员理解，为了避免由于在多核苷酸序列中空位的包括而与参考序列的高相似性，通常引入空位罚分(gap penalty)并且从匹配的数目中减去空位罚分。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。因此，任意两个序列之间的序列同一性百分比的确定可以使用数学运算法则实现。这些数学运算法则的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的运算法则；Smith，et al.，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对运算法则；Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对运算法则；Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部比对搜索方法(search-for-local alignment method)；Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的运算法则，如在Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中进行了修改。

可以利用这些数学运算法则的计算机工具进行序列的比较以确定序列同一性。这些工具包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可获得自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(版本2.0)和GCG Wisconsin遗传软件包，版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可获得自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA)。可以使用默认参数执行使用这些程序的比对。CLUSTAL程序详细描述于Higgins，et al.，(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins，et al.，(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet，et al.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang，et al.，(1992)CABIOS 8：155-165和Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller，(1988)见上的运算法则。比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分可以用于ALIGN程序。Altschul，et al.，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul，(1990)见上的运算法则。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序执行，得分＝100、字符长度＝12，以获得与编码本发明的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用BLASTX程序执行，得分＝50、字符长度＝3，以获得与本发明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用空位BLAST(BLAST 2.0中)，其描述于Atschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389。可选地，PSI-BLAST(BLAST 2.0中)可用于执行检测分子间远源关系的迭代搜索。参见Altschul，et al.，(1997)见上。当使用BLAST、空位BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以通过人工检查执行比对。

除非另作说明，本文提供的序列同一性/相似性的值是指使用GAP版本10和以下参数获得的值：对于核苷酸序列的同一性百分比和相似性百分比，使用GAP权重为50并且长度权重为3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的同一性百分比和相似性百分比，使用GAP权重为8并且长度权重为2以及BLOSUM62评分矩阵；或任何其等同程序。“等同程序”意指，对于讨论的任意两个序列，在与GAP版本10生成的比对相比时，生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配以及相同的序列同一性百分比的对应的比对的任何序列比较程序。

GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的运算法则来寻找两个完整序列的比对，该比对最大化匹配的数目并且最小化空位的数目。GAP顾及到所有可能的比对和空位位置，并且产生具有最大数目的匹配碱基和最少空位的比对。其允许在匹配碱基的单元中提供空位生成罚分和空位延伸罚分。对于其插入的每一空位，GAP必须利用匹配的空位生成罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，则对于每一插入的空位，GAP必须另外利用空位长度乘空位延伸罚分。GCG Wisconsin遗传软件包的版本10中，对于蛋白序列的默认空位生成罚分值和空位延伸罚分值分别是8和2。对于核苷酸序列，默认的空位生成罚分是50而默认的空位延伸罚分是3。空位生成和空位延伸罚分可以表示为选自0-200的整数。因此，例如空位生成和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。

GAP是最佳比对家族的一个成员。该家族可以有很多成员，但是没有其他成员具有更好的质量。GAP展示了四项对于比对的价值数字：品质(Quality)、比率(Ratio)、同一性和相似性。品质是为了比对序列的最大化的度量标准。比率是品质除以较短的节段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略跨越空位的符号。当用于符号对的评分矩阵值大于或等于0.5(相似性阈值)时，相似性才会评分。GCG Wisconsin遗传软件包的版本10中使用的评分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

如本文所用，就两个多核苷酸或多肽序列而言，“序列同一性”或“同一性”涉及两个序列中的残基，当在指定的比较窗用于最大对应而比对时，其是相同的。当序列同一性百分比用于涉及蛋白时，应当意识到，不相同的残基位置经常凭借保守型氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被其他具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能性质。当序列在保守型取代不同时，序列同一性百分比可以向上调整以校正取代的保守型本性。凭借这些保守型取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行此调整的手段是本领域技术人员熟知的。通常这涉及将保守型取代作为部分的而不是完全的错配来评分，从而增加序列同一性百分比。因此，例如当相同的氨基酸给出1的评分并且非保守型取代给出0的评分的情况下，保守型取代给出0和1之间的评分。保守型取代的评分按照例如PC/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，California)中执行的计算。

如本文所用，“序列同一性百分比”是通过以下计算：测定相同的核酸碱基或氨基酸残基出现在两个序列中的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并且将结果乘以100。

如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”是指靶多核苷酸的多核苷酸扩增的产物，所述靶多核苷酸是核酸模板的部分。例如，为了确定来自有性杂交的植物是否含有E6611.32.1.38事件，从植物组织样品中提取的DNA可以接受多核苷酸扩增方法，所述方法使用包括来源于与插入的异源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物和来源于插入的异源DNA的第二引物的DNA引物对，以产生对于E6611.32.1.38事件DNA的存在是诊断性的扩增子。借助对于E6611.32.1.38事件是“诊断性”，意指辨别生物样品中E6611.32.1.38事件存在和不存在的任何方法或测定法的使用。可选地，第二引物可以来源于接合序列。在其他实施方案中，引物对可以来源于插入的DNA两侧的侧翼序列，以便产生包含表达构建体的整个插入物多核苷酸以及位于转基因插入物侧翼的序列的扩增子。扩增子具有长度并且具有对于事件也是诊断性的序列(即具有来自E6611.32.1.38事件的接合DNA)。扩增子在长度上可以从引物对的联合长度加一个核苷酸碱基对到通过DNA扩增操作步骤可以产生的任意长度的扩增子。来源于侧翼序列的引物对的成员可以位于与插入的DNA序列有一定距离；该距离可以从一个核苷酸碱基对至高达扩增反应的限度或约20000核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别地排除在DNA热扩增反应中可能形成的引物二聚体。

核酸扩增可以通过本领域中已知的各种核酸扩增方法中的任意来实现，包括聚合酶链反应(PCR)。多种扩增方法是本领域已知的并且除了其他，描述于美国专利第4,683,195号和4,683,202号以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR操作步骤：方法和应用指南)，ed.Innis，et al.，Academic Press，San Diego，1990。PCR扩增方法已经发展到扩增高达22Kb的基因组DNA和高达42Kb的噬菌体DNA(Cheng，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699)。这些方法以及DNA扩增领域中已知的其他方法可以用于本发明的实施方案的实践。应当理解到，特定PCR操作步骤中的许多参数可能需要调整到特定的实验条件并且可能稍微修改但允许相似结果的收集。这些调整对于本领域技术人员是显而易见的。

由这些方法产生的扩增子可以通过多种技术检测，包括但不限于遗传位分析(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov，et al.，(1994)Nucleic Acid Res.22：4167-4175)，其中设计了与相邻的侧翼DNA序列和插入的DNA序列两者重叠的DNA寡核苷酸。所述寡核苷酸固定在微孔板的孔中。目的区的PCR后(使用在插入的序列中的一个引物和在相邻侧翼序列中的一个引物)，单链PCR产物可以与固定的寡核苷酸杂交并且作为模板用于使用DNA聚合酶和特异性针对预期的下一碱基的标记的ddNTPs的单碱基延伸反应。读数可以是基于荧光的或基于ELISA的。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，信号指示插入物/侧翼序列的存在。

另一检测方法是如Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)所述的焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术。在该方法中，设计了与相邻DNA和插入物DNA接合重叠的寡核苷酸。该寡核苷酸与来自目的区的单链PCR产物(在插入的序列中的一个引物和在侧翼序列中的一个引物)杂交并且在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5′磷酸硫酸和荧光素的存在下孵育。dNTPs单独添加并且掺入引起被测量的光信号。由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸，光信号指示转基因插入物/侧翼序列的存在。

如Chen，et al.，(Genome Res.9：492-498，1999)所述的荧光偏振(Fluorescence Polarization)也是可以用于检测本发明的扩增子的方法。使用该方法，设计了与侧翼和插入的DNA接合重叠的寡核苷酸。该寡核苷酸与来自目的区的单链PCR产物(在插入的DNA中的一个引物和在侧翼DNA序列中的一个引物)杂交并且在DNA聚合酶和荧光标记ddNTP的存在下孵育。单碱基延伸引起ddNTP的掺入。掺入可以使用荧光计以偏振的改变测量。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，偏振的改变表明转基因插入物/侧翼序列的存在。

Taqman

(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif.)被描述为检测和定量DNA序列的存在的方法并且在制造商提供的使用说明书中被充分理解。简单地，设计了与侧翼和插入物DNA接合重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针和PCR引物(在插入物DNA序列中的一个引物和在侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs的存在下进行循环。FRET探针的杂交引起FRET探针上荧光部分从猝灭部分的断裂和释放。由于成功的扩增和杂交，荧光信号表明侧翼/转基因插入物序列的存在。

如Tyangi，et al.，(Nature Biotech.14：303-308，1996)中所述，分子信标(Molecular Beacons)已被描述用于序列检测。简单地，设计了与侧翼和插入物DNA接合重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构造成其含有保持荧光和猝灭部分紧密邻近的二级结构。FRET探针和PCR引物(在插入物DNA序列中的一个引物和在侧翼序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs的存在下进行循环。成功的PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交引起探针二级结构的移除以及荧光和淬灭部分的空间分离。产生荧光信号。由于成功的扩增和杂交，荧光信号表明侧翼/转基因插入物序列的存在。

使用特异性针对于扩增子内发现序列的探针的杂交反应是用于检测由PCR反应产生的扩增子的另一种方法。

根据本公开和相关附图所提供的教导，这些发明所属领域的技术人员会想到本文所示的本发明的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解到，本发明并不限于所公开的具体实施方案，修改和其他实施方案将包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文使用了特定术语，但是它们仅以一般且描述的意义使用，并非出于限制性目的。

提供了涉及包含SPT事件的转基因植物的组合物和方法。具体地，提供了具有事件E6611.32.1.38的植物和更特别地玉米植物。具有事件E6611.32.1.38的玉米植物已经由制种技术事件的插入而被修饰。SPT事件E6611.32.1.38包含驱动MS45基因组DNA的5126启动子、驱动连接于编码α-淀粉酶的ZM-AA1的编码Brittle1转运肽的ZM-BT1 TP的PG47启动子以及与LTP2启动子联合以驱动编码多种香菇珊瑚(DISCOSOMA sp.)红色荧光蛋白的DS-RED2(ALT1)的CaMV35S增强子(参见图1；也可参见美国专利申请序列第11/833,363号，其于2007年8月3日提交并且2009年2月5日以2009/0038026公开；和美国专利申请公开第2006/0288440号)。该事件插入作图到3号染色体84.1至84.5，标记MZA12392至MZA 2358。因此，包含事件E6611.32.1.38的植物展现出增强的制种技术能力。

赋予制种技术的多核苷酸被连接到相同DNA构建体并且被插入在玉米基因组中表征过的位置，从而产生E6611.32.1.38事件。在已述染色体位置携带E6611.32.1.38事件的植物包含如SEQ ID NO：1以及图11和15所示的基因组/转基因接合。E6611.32.1.38事件的基因组插入位点的表征为增强的育种效率做准备并且使利用分子标记在育种群体及其子代中追踪转基因插入物成为可能。本文提供了用于含有玉米E6611.32.1.38事件的植物、植物部分、种子和谷类产品的鉴定、检测和使用的多种方法和组合物。

在一些实施方案中，赋予玉米E6611.32.1.38事件的多核苷酸被工程化为分子堆叠(molecular stack)。在其他实施方案中，所述分子堆叠还包含至少一个其他的转基因多核苷酸。所述多核苷酸可以赋予制种技术的其他方面或赋予不相关的性状。

在某些实施方案中，为了生成具有所需性状组合的植物，植物被目的多核苷酸序列的任意组合所叠加。如本文所用，性状是指源于特定序列或序列组的表型。生成的组合也可以包括任何一种或多种目的多核苷酸的多拷贝。

在一些实施方案中，玉米E6611.32.1.38事件还可以与至少一个其他性状组合，以产生还包含多种所需性状组合的植物，所述所需性状组合包括但不限于，动物饲料所需的性状，例如高油含量(例如美国专利第6,232,529号)；平衡的氨基酸含量(例如hordothionins(美国专利第5,990,389号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,703,409号；美国专利第5,850,016号)；大麦高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO 98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359和Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增强消化性，例如修饰的贮藏蛋白(美国专利申请序列第10/053,410号，2001年11月7日提交)；和硫氧还蛋白(美国专利申请序列第10/005,429号，2001年12月3日提交))；以上公开在此通过引用并入本文。所需性状组合还包括包括低亚麻酸含量，参见例如Dyer，et al.，(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.59：224-230和高油酸含量；参见例如Fernandez-Moya，et al.，(2005)J.Agric.Food Chem.53：5326-5330。

在其他实施方案中，玉米E6611.32.1.38事件还可以与其他所需性状组合，诸如，例如伏马毒素(fumonisin)解毒基因(美国专利第5,792,931号)；无毒性和抗病性基因(Jones et al.(1994)Science 266：789；Martin et al.(1993)Science 262：1432；Mindrinos et al.(1994)Cell 78：1089)和加工过程或加工的产品所需的性状，例如改良的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5,952,544号；WO 94/11516))；改良的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；和多聚体或生物塑料(例如美国专利第5,602,321号；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)，其促进聚羟基链烷酸酯(PHAs)的表达)；以上公开通过引用并入本文。也可以将制种技术多核苷酸与提供农艺学性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状例如雄性不育(例如，参见美国专利第5,583,210号)、提高的茎杆强度、改变的开花时间或转化技术性状，例如细胞周期调控或基因打靶(例如WO 99/61619、WO 00/17364和WO 99/25821)；以上公开通过引用并入本文。

在另一实施方案中，玉米E6611.32.1.38事件还可以与Rcg1序列或其生物活性变体或片段组合。Rcg1序列是玉米中炭疽茎腐病抗性基因。参见，例如美国专利申请序列第11/397,153号、第11/397,275号和第11/397,247号，以上每一个在此通过引用并入。

这些叠加的组合可以通过任何方法生成，所述方法包括但不限于通过任何常规方法学或遗传转化对植物进行育种。如果序列是通过遗传上转化植物来叠加，那么目的多核苷酸序列可以在任何时间、以任何顺序进行组合。在共转化操作步骤中，性状可以用转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果要引入两个序列，那么所述两个序列可以包含在不同的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。序列的表达可以由相同启动子或不同启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以通过与抑制盒或过表达盒的任意组合进行组合，来在植物中产生所需性状组合。还应当意识到，多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统，在所需的基因组位置进行叠加。参见例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上全部在此通过引用并入。

如本文所用，术语“多核苷酸”并非意图局限于包含DNA的多核苷酸。本领域技术人员应当意识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸与核糖核苷包括天然存在的分子和合成的类似物。本文提供的多核苷酸还包括序列的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

提供了可以用在玉米E6611.32.1.38事件的检测和/或鉴定的各种方法中的分离的多核苷酸。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或其生物活性部分是基本上或根本上无如在其天然存在的环境中发现的通常伴随所述多核苷酸或与所述多核苷酸相互作用的组分的。因此，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸基本上无其他细胞材料或培养基，或当化学合成时，基本上无化学前体或其他化学品。

在具体实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO：1和图11与图15所示的接合DNA序列的多核苷酸。接合DNA序列的片段和变体适于有区别地鉴定事件E6611.32.1.38。如本文其他部分讨论，这些序列发现作为引物和/或探针是有用的。

在其他实施方案中，提供了可以检测E6611.32.1.38事件或E6611.32.1.38特异区的多核苷酸。这些序列包括SEQ ID NOS：2-3、6-19所示的任何多核苷酸及其变体和片段。检测E6611.32.1.38事件或E6611.32.1.38特异区的多核苷酸的片段和变体适于有区别地鉴定事件E6611.32.1.38。如本文其他部分讨论，这些序列发现作为引物和/或探针是有用的。还提供了包含SEQ ID NO：2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、24、26、27、29、30、31中所示序列或其互补物、或者由SEQ ID NO：2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、24、26、27、29、30、31中所示序列或其互补物组成的分离的DNA核苷酸引物或探针序列。

“变体”意图表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在5′和/或3′末端具有缺失(即截断)的多核苷酸；天然多核苷酸中一个或多个内部位点的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或天然多核苷酸中一个或多个位点的一个或多个核苷酸的取代。

提供了用于鉴定事件E6611.32.1.38的各种方法和组合物。这些方法发现在鉴定和/或检测任意生物材料中的E6611.32.1.38事件中是有用的。这些方法包括，例如验证种子纯度的方法和为了E6611.32.1.38事件在种子批中筛选种子的方法。在一实施方案中，提供了鉴定生物样品中事件E6611.32.1.38的方法并且该方法包括将样品与第一和第二引物接触，扩增包含E6611.32.1.38特异区的多核苷酸。

生物样品可以包含希望在其中确定具有事件E6611.32.1.38的DNA是否存在的任何样品。例如，生物样品可以包括任何植物材料或包含或来源于植物材料的材料，其例如但不限于食品或饲料产品。在具体实施方案中，生物样品包括玉米组织。

基于本文公开的侧翼DNA和插入物序列的引物和探针可以通过常规方法用于验证(并且如果必要的话，更正)所公开的序列，所述常规方法例如再克隆这些序列和将这些序列测序。多核苷酸探针和引物特异性地检测靶DNA序列。任何常规核酸杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。“特异性地检测”意指，多核苷酸可以用作引物来扩增E6611.32.1.38特异区或多核苷酸可以用作在严紧条件下与具有E6611.32.1.38事件或E6611.32.1.38特异区的多核苷酸杂交的探针。允许E6611.32.1.38事件或E6611.32.1.38事件的特异区的特异性检测的杂交的水平或程度足以将具有E6611.32.1.38特异区的多核苷酸与缺乏该区的多核苷酸区分开，从而允许有区别地鉴定E6611.32.1.38事件。“共享足够的序列同一性或互补性”以允许E6611.32.1.38特异事件的扩增意指，序列与具有E6611.32.1.38特异区的多核苷酸的片段或跨越全长共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性或互补性。

关于使用特定的扩增引物对的靶多核苷酸的扩增(例如通过PCR)，“严紧条件”是在DNA热扩增反应中，允许引物对与靶多核苷酸(具有对应的野生型序列(或其互补物)的引物会与之结合)杂交并且优选地产生可鉴定的具有E6611.32.1.38特异区的扩增产物(扩增子)的条件。在PCR方式中，可以设计寡核苷酸引物用在PCR反应中，以扩增E6611.32.1.38特异区。设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域是熟知的并且公开于Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。还可参见Innis，et al.，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR操作步骤：方法和应用指南)(Academic Press，New York)；Innis and Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(PCR策略)(Academic Press，New York)；和Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(PCR方法手册)(Academic Press，New York)。扩增的方法还描述于美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和Chen，et al.，(1994)PNAS 91：5695-5699。这些方法以及DNA扩增领域中已知的其他方法可以用于本发明的实践。应当理解到，特定PCR操作步骤中的许多参数可能需要调整到特定的实验条件并且可能稍微修改但允许相似结果的收集。这些调整对于本领域技术人员是显而易见的。

扩增的多核苷酸(扩增子)可以是允许E6611.32.1.38事件或E6611.32.1.38特异区的检测的任何长度。例如，扩增子长度可以是约10、50、100、200、300、500、700、100、2000、3000、4000、5000个核苷酸或更长。在具体实施方案中，检测了E6611.32.1.38事件的特异区。

本文提供的方法中可以使用允许E6611.32.1.38特异区被扩增和/或检测的任何引物。例如，在具体实施方案中，引物包含SEQ ID NO：1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、26、27、29或30的多核苷酸的片段，其中所述引物与所述多核苷酸共享足够的序列同一性或互补性以扩增所述E6611.32.1.38或侧翼DNA特异区。引物对可以包含SEQ ID NO：1的片段和SEQ ID NO：2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、26、27、29或30的片段。引物可以是足以扩增E6611.32.1.38区的任何长度，包括例如至少6、7、8、9、10、15、20、15或30或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。

如本文其他部分所讨论，可以使用PCR扩增E6611.32.1.38事件或特异区的任何方法，包括例如实时PCR。参见，例如Livak，et al.，(1995) Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system for detectin

因此，在具体的实施方案中，提供了检测生物样品中事件E6611.32.1.38及其子代的存在的方法。所述方法包含(a)从所述生物样品中提取DNA样品；(b)提供DNA引物分子对；(c)提供DNA扩增反应条件；(d)实施DNA扩增反应，从而产生DNA扩增子分子并且(e)检测该DNA扩增子分子，其中在DNA扩增反应中所述DNA扩增子分子的检出表明玉米事件E6611.32.1.38的存在。为了使核酸分子用作引物或探针，其只需要在序列上足够地互补以能够在使用的特定的溶剂和盐浓度下形成稳定双链结构。

还提供了检测样品中对应于E6611.32.1.38事件的DNA的存在的方法。在一实施方案中，所述方法包含(a)将生物样品与多核苷酸探针接触，所述探针在严紧杂交条件下与来自玉米事件E6611.32.1.38的DNA杂交并且特异性地检测E6611.32.1.38事件；(b)使样品和探针处于严紧杂交条件下并且(c)检测探针与DNA的杂交，其中杂交的检出表明E6611.32.1.38事件的存在。

实施方案在以下实施例中进一步说明。应当理解到，这些实施例只是以举例说明的形式给出。通过以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征并且在不偏离本发明精神和范围下，可以进行实施方案的各种改变和改动以使其适应各种用处和条件。因此，根据以上描述，实施方案的各种改动，除了本文所展示和描述的那些，对于本领域技术人员是显而易见的。这些改动也将落入随附权利要求书的范围内。

实施例

实施例1：事件DP-32138-1的表征

玉米(Zea mays L)事件DP-32138-1，也称为32138玉米，已经通过使用质粒PHP24597(图1)的土壤杆菌属介导的转化产生，其基本上按照Zhao，et al.，(2001)Molecular Biology(之前是Molecular Breeding)8：323-333；美国专利第5,981,840号；和PCT专利公开WO98/32326，所有以上在此通过引用并入。该质粒的T-DNA区示意性地展示在图2中并且其序列提供在SEQ ID NO：34。表11和表12分别描述了质粒PHP24597上和T-DNA上的遗传元件及其位置的总结。转化引起三个含有作为可视标记的育性恢复基因组序列Ms45、α-淀粉酶基因Zm-aa1和DsRed2(Alt1)基因的基因盒的插入。这三个基因盒是制种系统的元件，用以产生为了杂种种子的生成而不需要机械地或人工地给植物去雄的雄性不育系。

第一个盒含有Ms45基因组序列，其是包含Ms45基因和相关的3′非翻译区的玉米基因组DNA的区(Albertsen，et al.，1993；Albertsen，et al.，1995)。Ms45基因包括四个外显子，三个通过剪接移除的内含子。花药绒毡层中由Ms45基因编码的MS45蛋白的表达是玉米植物能育的雄性花粉的产生所需要的(Cigan，et al.，2001)。全长MS45蛋白由412个氨基酸组成并且具有约47kDa的分子量(SEQ ID NO：20)。Ms45基因的表达是由玉米花药特异性5126启动子控制(Cigan和Albertsen，1997)。Ms45基因的终止子是来自玉米基因组的内源Ms45 3′非翻译区序列，其包括在Ms45基因组序列中(Albertsen，et al.，1993)。

第二个盒含有截断的编码ZM-AA1蛋白的玉米α-淀粉酶(zm-aa1)基因。zm-aa1编码区的前面是来自将ZM-AA1蛋白靶向于造粉体的玉米Brittle-1(zm-bt1)基因的转运肽(Sullivan，et al.，1991)。ZM-AA1蛋白防止新生的花粉谷类中淀粉的蓄积，从而使花粉免于正常发育和发芽。包括转运肽的完整的翻译产物包含495个氨基酸并具有约54kDa的分子量(SEQ ID NO：21)。转运肽移除的加工过的ZM-AA1蛋白长度是420个氨基酸残基并具有约46kDa的分子量。加工过的ZM-AA1蛋白与天然的蛋白的区别在于其缺乏见于天然蛋白的21个N-末端氨基酸残基，包括起始的甲硫氨酸残基。zm-aa1基因和附加的转运肽的表达是由Pg47启动子控制，其是来自玉米花粉特异性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的5′调节区(Allen和Lonsdale，1993)。zm-aa1基因的终止子是来自玉米In2-1基因的3′终止子序列(Hershey和Stoner，1991)。

第三个盒含有DsRed2(Alt1)基因。DsRed2(Alt1)基因是最初的DsRed2基因的修饰形式(Clontechniques，2001)，其中移除了内部的BstE II限制性位点而未改变所表达的蛋白的氨基酸序列。DsRed2(Alt1)编码序列提供在SEQ ID NO：35。DsRed2(Alt1)基因编码DsRed2蛋白。玉米种子的糊粉层中DsRed2蛋白的表达在含有DNA插入物的种子中产生红色的着色，从而允许在选种中含有事件DP-32138-1的种子的区分。全长DsRed2蛋白具有225个氨基酸的长度并且约26kDa的分子量(SEQ ID NO：33)。DsRed2(Alt1)基因的表达由大麦脂质转移蛋白(Ltp2)启动子控制，其提供了基因的糊粉特异性转录(Kalla，et al.，1994)。位于Ltp2启动子的5′的是来自花椰菜花叶病毒的增强子区(CaMV 35S增强子)(Franck，et al.，1980；Odell，et al.，1985)。DsRed2(Alt1)基因的终止子是来自马铃薯的蛋白酶抑制剂II基因的3′终止子序列(pinII终止子)(Keil，et al.，1986；An，et al.，1989)。

事件32138的Southern印迹分析-方法

在DP-32138-1玉米进行Southern印迹分析以验证插入物拷贝数目和完整性以及生成插入物的物理限制性酶图谱。来自DP-32138-1玉米的个体植物的基因组DNA样品通过用限制性酶BamH I、Bgl II、Bmt I、EcoR I、Hind III和Xho I的消化以及用BamH I/Hind III和Bgl II/Hind III的双消化进行分析。这些消化物与针对以下的探针杂交：Ms45基因组区和zm-aa1和DsRed2(Alt1)基因，以及T-DNA中剩余的遗传元件包括5126启动子、Pg47启动子、zm-bt1转运肽、In2-1终止子、CaMV 35S增强子、Ltp2启动子和pinII终止子。检查在边界基因组中位点的使用Bmt I和Xho I的分析表明DP-32138-1玉米中存在PHP24597 T-DNA的单一拷贝。EcoR I分析表明PHP24597 T-DNA已完整插入基因组，因为内部EcoR I限制性位点是存在的。使用剩余的酶的分析与这些数据协同使用以生成DP-32138-1玉米中T-DNA插入物的物理限制性图谱。

测试物质

本研究中的测试物质定义为DP-32138-1玉米的T1S1红色种子，PHI记录号T-F-07-132C。所有的种子从先锋国际良种公司(Pioneer，Johnston，IA)获得并且系谱信息存放在育种工作人员(staff breeder)处。本研究中使用的测试物质种子选自通过其红色分离的群体以确保它们含有DP-32138-1事件。

对照物质

对照物质限定为来自未在遗传上修饰的玉米系的种子。未修饰的系具有代表测试物质背景的遗传背景；但是其不含有DP-32138-1插入。所有的种子从先锋获得并且系谱信息存放在育种工作人员处。

PHI记录号	描述
		C-F-07-69C	705
PHIS01-70C	Hi-II
		C-F-04-98C	Hi-II
C-F-07-131C	Hi-II(ms45)(对于ms45基因是纯合的Hi-II系)

参考物质

质粒PHP24597用作Southern分析的阳性对照，以验证探针杂交并验证插入的T-DNA的内部片段的大小。使用的质粒DNA制备自从先锋获得的质粒储备。所述质粒储备是用于转化以产生DP-32138-1玉米的质粒的拷贝并且用限制性酶消化来验证质粒图谱。本研究中使用的探针来源于该质粒或来源于含有等同遗传元件的质粒。

凝胶电泳和Southern印迹分析的DNA分子量标记用于测定大约的分子量和DNA片段的量。对于Southern分析，地高辛配基(DIG)标记的DNA分子量标记VII(Roche，Indianapolis，IN)用作杂交片段的大小标准。ΦX174 RF DNA/Hae III片段用于测定用于Southern分析的琼脂糖凝胶上足够的迁移。低质量DNA Ladder(Invitrogen，Carlsbad，CA)用作大约的定量标准。

样品收集

T-F-07-132C、C-F-07-131C和C-F-07-69C中每个的10粒种子种植在位于DuPont实验站(DuPont Experimental Station(Wilmington，DE))的调节性科学(Regulatory Science)生长室中以产生用于提取和分析的植物组织。每罐种1粒种子并且罐用研究编号、植物标识、种植该种子的人的字首和种植日期独特地辨别。所有的植物以为健康植物生长而调节的光、温度和水来种植。

植物的第一叶收获发生在植物非常小的时候(V2-V3叶阶段)。对于每个对照和测试物质植物，收集来自生长点以上的足够的叶材料并且直接置于干冰上的Geno/Grinder^TM管中(SPEX CertiPrep，Inc.，Metuchen，NJ)。然后样品转移到冷冻箱并保持冷冻(＜-50℃)直到加工。第二和第三叶收集发生在植物已充分地再生长后并且在R1阶段之前；收集最嫩的叶并且置于预先标记的、可重新封装的袋中。采样袋直接置于干冰上。然后样品转移到冷冻箱并保持冷冻(＜-50℃)直到加工。Hi-II对照玉米植物的冷冻的叶组织从先前的内部研究获得。所有的叶样品用植物标识、收获日期、研究编号和收获人的字首独特地标记。

事件特异性PCR分析

使用Extract-N-Amp^TM植物PCR试剂盒，使用所述的程序(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)从每个叶样品中提取DNA。使用ABI PRISM

7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)对每个DNA样品进行实时PCR。设计TaqMan

探针和引物组以检测来自DP-32138-1事件的靶序列。此外，使用了针对参考玉米内源基因的第二TaqMan

探针和引物组，以验证每个反应中可扩增的DNA的存在。分析由定量的阳性/阴性的检出(calls)的定量实时PCR测定组成。提取的DNA使用TaqMan通用PCR主混合液(无AmpErase

UNG)(TaqMan

 Universal PCR Master Mix，No AmpErase

 UNG(Applied Biosystems，Inc.))中优化的和验证过的引物和探针的浓度进行检测。初始孵育为95℃持续10分钟，然后按照以下的40个循环：95℃持续15秒、60℃持续1分钟。

对于事件的阳性或阴性确定是基于插入物靶标PCR的C_T(阈值循环)与玉米内源参考靶标的C_T的比较。如果事件和内源PCR靶标扩增到C_T阈值以上，那么该植物对于所述事件评分为阳性。如果内源靶标扩增而事件靶标没有，那么该植物评分为阴性。如果对于特定样品两个靶标均未扩增，那么其被确定为低质量样品或失败的运行并且重复该测定。

DNA提取和定量

从测试和对照植物的叶组织提取基因组DNA。使用Geno/Grinder^TM(SPEX CertiPrep，Inc.)仪器，将组织在含有研磨珠的管中粉碎并且使用标准尿素提取缓冲液程序分离基因组DNA。提取后，使用Pico Green

试剂(Molecular探针，Inc.，Eugene，OR)在荧光分光光度计上对DNA进行定量并且将DNA在琼脂糖凝胶上可视化以验证来自Pico Green分析的值以及确定DNA质量。

DNA的消化和电泳分离

为了DP-32138-1插入物的表征，从测试和对照植物提取的基因组DNA样品用BamH I、Bgl II、Bmt I、EcoR I、Hind III和Xho I或两种限制性酶的组合：BamH I/Hind III和Bgl II/Hind III(New England Biolabs，Ipswich，MA)进行消化。

用限制性酶消化后，产生的片段通过琼脂糖凝胶按照大小进行电泳分离并且使用分子量标准[ΦX174 RF DNA/Hae III片段(Invitrogen)]以确定凝胶上片段的足够的迁移和分离。

Southern转移

将含有分离的DNA片段的琼脂糖凝胶原位脱嘌呤(depurinate)、变性和中和，并使用如用于TURBOBLOTTER^TM快速向下转移系统(Schleicher和Schuell，Keene，NH)所述的方法转移到20×SSC缓冲液中的尼龙膜。转移到膜后，DNA通过UV交联(Stratalinker，Stratagene，La JoIIa，CA)与膜结合。

探针标记和Southern印迹杂交

当与尼龙膜结合的DNA片段与标记探针杂交时，所述DNA片段以分离的条带被检测到。用于Southern杂交的探针提供在表1中并且它们的位置展示在图2中。针对Ms45基因组区、zm-aa1基因、DsRed2(Alt1)基因、5126启动子、Pg47启动子、Ltp2启动子、zm-bt1转运肽、In2-1终止子、pinII终止子和CaMV 35S增强子元件的探针用于Southern杂交。含有与zm-aa1基因组合的zm-bt1转运肽的探针(zm-bt1-aa1探针)而不是针对两个元件的分别的探针用于初步Southern印迹分析。使用特定引物通过PCR从质粒PHP24597生成了元件的片段并且进行凝胶纯化(Qiagen，Valencia，CA)。除了Pg47启动子，每个探针覆盖各自遗传元件的大部分，只有由于PCR标记程序施加的要求的小的区留在外面。DNA探针通过PCR生成自这些片段，该PCR将地高辛配基(DIG)标记的核苷酸([DIG-11]-dUTP)并入所述片段。分离的片段的PCR标记按照PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)中提供的程序进行。

标记的探针与尼龙膜上的靶DNA杂交，用于使用基本上如DIG Easy Hyb溶液(Roche)所述的程序的特定片段的检测。DIG标记的DNA分子量标记VII(Roche)用于测定Southern印迹上杂交片段的大小，所述分子量标记VII在如下文所述的DIG检测后可以被看见。

杂交探针的检测

使用带有DIG洗涤和封闭缓冲液套装的CDP-Star化学发光核酸检测系统(Roche)，将与在严紧洗涤后与尼龙膜结合的DNA杂交的DIG-标记的探针和DIG-标记的DNA标准品可视化。印迹曝光于X射线胶片一个或多个时间点以检测杂交片段并可视化分子量标准品。图像是通过用发光图像分析仪LAS-3000(Fujifilm Medical Systems，Stamford，CT)的检测进行数字捕捉。数字图像与最初X射线胶片曝光比较，作为对于该报告中用途的证实。检测的条带的大小对每个消化物和每个探针进行记录。

探针的脱除(Stripping)和后续杂交

杂交和检测后，将DIG-标记的探针从膜脱除，以准备用于与不同探针后续再杂交的印迹。膜在蒸馏的去离子水中简单漂洗，然后在0.2M NaOH和0.1％SDS的溶液中在37℃进行脱除并持续摇动。然后膜在2×SSC中漂洗并且直接用于后续杂交或保存为以后使用。碱法脱除程序有效地移除用这些实验中使用的碱不稳定的DIG所标记的探针。

事件32138的Southern印迹分析-结果和讨论

DP-32138-1的T1S1保持系植物的基因型验证和初步Southern印迹分析

所有个体植物通过事件特异性PCR分析，测试DP-32138-1插入物的存在。所有10株DP-32138-1 T1S1植物对于插入物是阳性的。表2总结了对于DP-32138-1植物的事件特异性PCR测定法的结果。所有对照植物对于DP-32138-1插入物测试为阴性(数据未展示)。事件特异性PCR分析的结果证实了种子的通过视觉的筛选。此外，这些事件特异性PCR结果还证实了PHP24597 T-DNA插入物的左边界在含有DP-32138-1插入物的植物中仍然稳定。

从10株个体DP-32138-1植物和21株对照植物(10株Hi-II(ms45)植物、10株705植物和1株Hi-II植物)中提取的基因组DNA通过初步Southern印迹分析Ms45基因组、zm-bt1-aa1和DsRed2(Alt1)遗传元件的存在。来自这些植物的DNA用EcoR I或BamH I消化，印迹并且用Ms45、zm-bt1-aa1和DsRed2探针探查。来自这些Southern印迹的结果直接对应于事件特异性PCR测定法的结果。所有DP-32138-1植物含有Ms45基因组、zm-bt1-aa1和DsRed2(Alt1)遗传元件(表2)并且对照植物对于所述基因是阴性的(数据未展示)。该初步Southern印迹分析还表明插入的DNA在所有DP-32138-1植物中是相同的，因为每个探针的条带样式对于所有植物是相同的。因为特定的近交系中的对照植物样品具有不同的杂交模式，所以这些印迹也用于选择用于下文所述的Southern印迹分析的对照并且验证所选择对照会说明由于内源基因组的所有条带。相同的印迹与针对zm-bt1-aa1编码序列的探针的杂交导致很多对照植物中也可以看到的重叠的内源条带。该探针被分成单独的zm-bt1和zm-aa1探针用于如下文所述的本研究中DNA样品的子集的详细表征。

DP-32138-1的详细Southern印迹分析

选择全部六种限制性酶用在DP-32138-1玉米的详细Southern印迹分析中：BamH I、Bgl II、Bmt I、EcoR I、Hind III和Xho I，这些酶展示在PHP24597 T-DNA图谱上(图2)。此外，用BamH I/Hind III和Bgl II/Hind III的双消化用于Southern分析。BamH I和EcoR I限制性位点的位置展示在PHP24597的质粒图谱上(图1)并且对于分析中使用的酶的限制性位点的碱基对位置在表1中给出。PHP24597被添加到705玉米对照DNA，消化和包括在印迹上以提供对于探针杂交的阳性对照和对于完全包括在T-DNA内的DNA片段的大小参考。表1和表18提供关于使用的探针的进一步的信息。

质粒PHP24597的示意图(图1)表明对于BamH I和EcoR I的限制性酶位点以及Ms45、zm-aa1和DsRed2编码区。左边界和右边界位于在土壤杆菌属介导的转化中预期被插入的T-DNA侧翼(图2)。质粒大小为52869bp。本研究中使用的另外的酶的位置在以下给出：

酶	位置(bp)
		Bgl II	1713、2519、7030、38258、41055、42018、45737、46167、49645
Bmt I	8503、36160、38359、39502、45917
		Hind III	179、34837、45900、46809、47930、49445
Xho I	2134、5587、34814、36128、37028、37074、37711、45532

质粒PHP24597的T-DNA区的示意图(图2)表明对于BamH I、Bgl II、BmtI、EcoR I、Hind III和Xho I的限制性酶位点以及Ms45、zm-aa1和DsRed2编码和调节区。本研究中使用的酶的位置在以下给出：

酶	位置(bp)
		BamH I	1456、4271、6773、8792
Bgl II	1713、2519、7030
		Bmt I	8503
EcoR I	191、7407、9869
		Hind III	179
Xho I	2134、5587

每个限制性消化物与10个不同的覆盖PHP24597 T-DNA中的遗传元件：Ms45、zm-bt1、zm-aa1和DsRed2的探针以及针对调节区5126启动子、Pg47启动子、In2-1终止子、35S增强子、Ltp2启动子和pinII终止子的探针杂交。所有探针的详细描述提供在表1中并且探针的位置展示在T-DNA图谱上(图2)。这些探针中每一个只与T-DNA中的一个元件杂交。对于每个探针的杂交条带的实际数目取决于具体酶限制性位点相对于遗传元件的位置并且用本研究中使用的酶，对于PHP24597 T-DNA的单一插入，实际数目的变化从1个至3个条带。

从这些消化物和杂交中会观察到两种类型的片段：a)边界片段，其中酶位点位于PHP24597 T-DNA内，位于杂交片段的一个末端，并且第二酶位点预期在玉米基因组内，以及b)内部片段，其中已知的酶位点位于探针区侧翼并且所述片段完全包含在PHP24597 T-DNA内。边界片段大小对于每个事件是独特的并且提供了根据观察到的条带的数目显示特定元件的拷贝数的手段。在插入物内、探针区外切割一次的酶所产生的一个杂交条带表明在基因组中单一基因座存在插入的T-DNA的一个拷贝。由于片段中包含基因组DNA，由全长T-DNA的插入而形成的边界片段通常大于由T-DNA序列预测的大小。由于玉米基因组中未知的切割位点的位置，边界片段的确切大小不能事先预测。内部片段提供了手段，所述手段评估插入的T-DNA的完整性和所述T-DNA未自有意排列改变。

Southern印迹数据用于生成DP-32138-1 T-DNA插入物的限制性图谱(图3)。标明了BamH I，Bgl II，Bmt I，EcoR I，Hind III和Xho I限制性酶位点。Southern印迹分析表明PHP24597 T-DNA的单一拷贝已插入玉米基因组中。T-DNA区外的酶位点的位置不是按比例的。星号(*)表明这些酶位点的相对位置是不确定的，这是由于从这些位点生成的片段的大尺寸。垂直虚线标明位于左边界接合外的BamH I和Bgl II位点，所述位点在Southern印迹上显示受阻的消化。

本研究中使用的Ms45、zm-bt1、zm-aa1、5126启动子、Pg47启动子和In2-1终止子探针来源于内源玉米基因组DNA序列。作为结果，用这些探针的Southern印迹在由于DP-32138-1插入物的条带之外，还展示出由于与内源序列杂交的许多条带。这些条带通过其存在于一个或多个对照植物系(705、Hi-II或Hi-II(ms45))而被确认。本研究中采用的DP-32138-1代(T1S1)来源于Hi-II(ms45)背景(具有回交的ms45等位基因的Hi-II)的最初转化株，与705杂交，然后自交。因此，T1S1植物展示出来源于Hi-II和705对照系两者的内源条带，所述条带根据消化物和使用的探针在T1S1个体之间有所变化。此外，杂交条带中的一些在Hi-II和Hi-II(ms45)对照系自身中的植物之间显示出差异，因此为了说明在DP-32138-1植物中观察到的所有内源条带，在一些Southern印迹上需要包括来自这些对照系的每一个的两个植物。

除了Pg47启动子，每个探针覆盖各自的遗传元件的大部分，只有由于PCR标记程序施加的要求的小的区留在外面。对于Pg47启动子，与包含约2.7kb元件的探针片段的测试杂交导致与含有基因组DNA的所有泳道的高度杂交。如本文所述，进行了测试但未在本研究中使用的全长Pg47启动子探针在图2的图谱中以Pg47启动子元件下方的实线显示。进一步研究导致位于Pg47启动子的3′末端的424bp的片段，该片段与减少数目的内源条带杂交并因此提供DP-32138-1玉米中关于该元件的可用信息。

DP-32138-1玉米中插入的DNA的拷贝数

选择限制性酶Bmt I和Xho I来验证DP-32138-1玉米中插入的PHP24597T-DNA的拷贝数。

Bmt I具有位于T-DNA内的单一限制性位点，并且根据使用的探针会在对于T-DNA的每个单一插入的右和左边界造成边界片段(图2)。BmtI的位点位于T-DNA中bp 8503，并且对于单一插入的T-DNA预期会产生大于约8500bp和大于约1400bp的片段。大于8500bp的片段会与5126启动子、Ms45、Pg47启动子、zm-bt1、zm-aa1、In2-1终止子、35S增强子和Ltp2启动子探针杂交，而大于1400bp的片段会与Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针杂交。因为Bmt I位点位于Ltp2启动子元件内，与该探针的杂交会允许在Southern印迹上同时看到两个片段。

在Bmt I Southern分析中，在DP-32138-1玉米中，大于8600bp的条带与5126启动子、Ms45、zm-bt1、zm-aa1、In2-1终止子、35S增强子和Ltp2启动子探针杂交(表3)。此外，使用5126启动子、Ms45、zm-bt1、zm-aa1和In2-1终止子探针时，在所有样品中观察到内源条带。使用Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针时，也观察到大于8600bp的条带(表3)，所述条带通过与pinII终止子和5126启动子杂交相比，可以鉴定为使用Ltp2启动子探针所见的两个条带中较大的。在Bmt I印迹上使用Pg47启动子未鉴定出特异性条带，这是由于共迁移内源条带的强度。但是，使用位于Pg47启动子元件侧翼的探针(Ms45和zm-bt1)的大于8600bp的条带的存在表明，Pg47启动子条带很可能位于被8600bp标记以上的内源条带所遮掩的印迹区内。此外，根据下文所讨论的Xho I分析，Pg47元件的单一拷贝确定被插入DP-32138-1玉米中。

Xho I具有位于PHP24597 T-DNA内的两个限制性位点(图2)，并且对于每个单一插入，预期会产生一个内部片段和位于右和左边界的两个边界片段。所述两个限制性位点位于bp位置2134和5587(图2)。用该酶的消化会产生来自单一T-DNA插入物的三个片段：与5126启动子和Ms45探针杂交的大于约2100bp的边界片段，与Ms45、Pg47启动子和zm-bt1探针杂交的3453bp的内部片段，以及与zm-bt1、zm-aa1、In2-1终止子、35S增强子、Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针杂交的大于约4400bp的第二边界片段。

来自DP-32138-1玉米的Xho I-消化的DNA与5126启动子探针的杂交除造成了由内源玉米序列导致的两个条带之外，还造成了来自T-DNA插入物的约3600bp的单一条带(表4)。与Ms45探针的杂交造成了如预期的两个条带：使用5126启动子探针时也见到的约3600bp的边界条带和与3453bp的质粒片段匹配的内部条带(表4)。使用Pg47启动子探针时观察到相同的3453bp的内部片段(表4)。PHP24597质粒条带在很多杂交中是弱的，但是可以在Southern印迹的胶片上观察到。zm-bt1探针显示出正如从元件中的Xho I位点的位置所预期的两个插入物来源的条带：使用Ms45和Pg47启动子探针时看见的3453内部条带和大于8600bp的边界条带(表4)。使用Ms45、Pg47启动子和zm-bt1探针时，再次观察到内源条带。在与In2-1终止子(表4)、35S增强子和Ltp2启动子(表4)以及DsRed2和pinII终止子(表4)探针的杂交中，也见到大于8600bp的边界条带。使用In2-1终止子探针时，观察到内源条带。使用任何这些探针时，未观察到额外的插入物来源的条带。Xho I-消化的DNA与zm-aa1探针的杂交未提供任何关于DP-32138-1插入物的信息，因为如通过侧翼zm-bt1和In2-1探针所示，预期的大于8600bp的条带所位于的区域被强的内源条带遮掩。但是，因为zm-bt1和In2-1探针与使用DsRed2盒的探针时被观察到的相同的大于8600bp的条带杂交，并且如上文Bmt I分析中所述，单一条带与zm-aa1探针杂交，所以zm-aa1基因的单一拷贝确定被插入DP-32138-1玉米中。

因此，使用Bmt I和Xho I消化的DP-32138-1的Southern分析说明玉米基因组中有T-DNA插入物的单一拷贝。除了那些元件(限制性位点位于元件内)，对于每个遗传元件只有单一条带，正如对于来自单一拷贝插入物的片段所预期的。根据限制性酶位置，含有限制性位点的T-DNA中的元件也展示出对于单一拷贝插入物的预期的条带数目。单一边界条带的存在和没有额外的插入物来源的条带说明，DP-32138-1玉米基因组中只有PHP24597 T-DNA的单一拷贝。

DP-32138-1玉米中插入的DNA的完整性

限制性酶EcoR I用于验证PHP24597 T-DNA插入物的完整性。该酶在PHP24597 T-DNA中具有三个限制性位点：位于右边界和5126启动子元件之间的bp位置191的一个位点、位于pinII终止子区和左边界之间的bp位置9869的一个位点和位于In2-1终止子和CaMV 35S增强子元件之间的bp位置7407的第三位点(图2)。使用EcoR I的消化应该从PHP24597质粒对照和含有完整的T-DNA插入物的植物两者中产生两个7216bp和2462bp的内部片段。观察到的条带将取决于在给定的Southern印迹中使用的探针。与5126启动子、Ms45、Pg47启动子、zm-bt1、zm-aa1和In2-1终止子探针的杂交会造成7216bp的条带，而35S增强子、Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针会与2462bp的条带杂交。使用给定探针的适当条带的存在和对于该探针的任何其他插入物来源条带的不存在提供了T-DNA是完整的并且插入时未被截断的有力指示。

EcoR I消化的DNA与5126启动子和Ms45探针的杂交造成了单一插入物来源的7216bp的条带，该条带与内部质粒条带匹配(表5)。使用Pg47启动子和zm-bt1探针(表5)和zm-aa1和In2-1终止子探针(表5)时，观察到相同的7216bp的条带。7216bp的条带在zm-aa1印迹上由于玉米内源背景而被杂交条带的存在稍微遮掩，并且不能被验证。根据下文所讨论的使用BamH I和Bgl II分析，该元件确定被完整插入，因为使用这些酶的消化从T-DNA中释放适当大小的内部片段。此外，这些分析中的每一个只显示预期的内部片段并没有由于DP-32138-1插入物的其他条带。此外，存在许多由于内源玉米序列与5126启动子、Ms45、Pg47启动子、zm-bt1、zm-aa1和In2-1终止子探针杂交的条带，其在表5中用星号(*)和灰色阴影标出。在质粒泳道和DP-32138-1玉米泳道两者中，当7216bp的条带与这些探针杂交时，观察到其在凝胶上前进到稍低于预期大小的表观分子大小。该异常的大小似乎对于该片段是特异的，因为与分子量标记相比，2462bp的EcoR I片段前进到预期的大小。在7216bp片段的电泳迁移中可能有移位，这是由于对照玉米DNA样品的存在造成其在凝胶上展现稍微小于实际大小的表观大小。使用35S增强子和Ltp2启动子探针时(表5)以及DsRed2和pinII终止子探针(表5)，观察到2462bp的插入物来源的条带。在这些Southern印迹中未观察到特异性针对DP-32138-1植物的其他条带。表5总结了EcoR I印迹上预期的和观察到的条带。

EcoR I印迹说明DP-32138-1中的PHP24597T-DNA是完整的，因为只有预期的两个7216bp和2462bp的条带在使用其各自探针时被观察到。所述两个片段包含整个PHP24597 T-DNA，除了T-DNA末端附近的EcoR I位点与左和右边界元件之间的小的区。只有两个预期的条带的存在和特异性针对DP-32138-1植物的其他条带的不存在表明PHP24597T-DNA完整插入玉米基因组中。

DP-32138-1玉米中插入的DNA的物理图谱

选择另外三个限制性酶来提供DP-32138-1插入物的完整分析：Hind III，BamH I和Bgl II。使用这些酶中的每一个的消化物与在前面的印迹中使用的10个探针杂交，并且来源于这些杂交的信息与上述数据联合以生成DP-32138-1中T-DNA插入物和周围的玉米基因组DNA的详细的限制性图谱(图3)。使用BamH I/Hind III和Bgl II/Hind III进行另外的双消化以阐明使用BamH I和Bgl II的单一消化物所见到的插入物的部分。

在PHP24597T-DNA中位于右边界和5126启动子之间的bp 179有一个Hind III位点(图2)。本研究中使用的所有探针会与大于约9800bp的单一边界片段杂交(表6)。

来自DP-32138-1的Hind III消化的DNA与本研究中使用的探针的杂交产生了大于8600bp的单一插入物来源的条带，除了Pg47启动子探针(表6)。除了插入物来源的条带外，在Hind III消化物中观察到与5126启动子、Ms45、Pg47启动子、zm-bt1、zm-aa1和In2-1终止子探针的内源杂交，其在表6中用星号(*)和灰色阴影标出。对于Pg47启动子探针，插入物来源的条带被一系列非常强的8600bp分子量标记以上的内源条带遮掩。但是，因为在DP-32138-1植物中不存在可以确定为来自插入物的其他条带，并且侧翼Ms45和zm-bt1探针两者与相同的大于8600bp的条带杂交，所以很可能Pg47启动子探针条带确实是从其他杂交预期的大小，但仅仅是被内源条带掩盖。如上文对于使用Pg47探针的Xho I和EcoR I分析所讨论的，该元件的单一的、完整的拷贝确定被插入DP-32138-1玉米中。因为上端的分子量标记是8600bp并且Hind III条带位于该标记条带上方，所以不能确定Hind III条带的确切大小，尽管其似乎是足够大的能超越其9800bp的最小预期大小。如下文在Hind III双消化中所讨论的，另外的数据显示基因组中的Hind III位点位于距DP-32138-1插入物的左边界约1200至1400bp，从而提供了证据，即所述插入物从碱基对位置179是完整的。

PHP24597T-DNA中对于BamH I有四个限制性位点，其位于bp位置1456、4271、6773和8792(图2)。使用该酶的消化会造成对于单一T-DNA插入物的5个预期的片段：与5126启动子和Ms45探针杂交的大于约1500bp的边界片段、与Ms45探针杂交的2815bp的内部片段、与Pg47启动子、zm-bt1和zm-aa1探针杂交的2502bp的内部片段、会与zm-aa1、In2-1、35S增强子和Ltp2启动子探针杂交的2019bp的第三内部片段和与DsRed2和pinII终止子探针杂交的大于约1200bp的第二边界片段(表7)。尽管位于bp位置4271的BamH I位点是位于Pg47启动子元件内并且因此完全的Pg47启动子探针会与2815bp和2502bp的片段两者杂交，但是使用本研究中使用的424bp的Pg47启动子探针时，只见到2502bp的片段，这是由于其在元件的3′末端的位置(表7)。

在来自DP-32138-1的BamH I消化的DNA与5126启动子和Ms45探针的杂交时观察到约3800bp的条带(表7)。使用Ms45探针时，也观察到预期的2815bp的内部条带(表7)。与Pg47启动子、zm-bt1和zm-aa1探针的杂交造成了与质粒对照条带匹配的2502bp的条带(表7)。zm-aa1探针还与匹配质粒条带的2019bp的内部条带杂交，同样的还有In2-1终止子、35S增强子和Ltp2启动子探针(表7)。在Ms45和zm-aa1盒中使用所有探针观察到内源条带。使用DsRed2和pinII终止子探针时，观察到两个边界条带：约4600bp的高度杂交条带和约6100bp的非常暗的条带(表7)。表7给出使用该消化物预期的和观察到的条带。为了研究暗的6100bp条带来自于造成4600bp条带的基因组BamH I位点的受阻消化的可能性，如下文所述实施了使用BamH I/Hind III的双消化。

为了证明使用BamH I消化物以及DsRed2和pinII终止子探针所见的约6100bp的暗的第二条带是由于玉米基因组中BamH I位点的受阻的消化，实施了使用BamH I和Hind III的双消化。选择Hind III是由于如上文所述，在玉米基因组中其限制性位点的位置接近DP-32138-1插入物的左边界接合。使用这两个酶的消化应该产生来自位于T-DNA中bp 8792的BamH I位点和玉米基因组中Hind III位点的大于1200bp的边界片段。因为Hind III位点的位置比基因组BamH I位点似乎更接近左边界，使用这两个酶的消化应该释放与来自单一T-DNA插入物的DsRed2和pinII终止子探针杂交的、单一的、独特的片段。使用双消化物时只有单一条带的存在会提供以下证据：BamH I Southern印迹上约6100bp的暗的第二条带确实来自于基因组BamH I位点的受阻的切割，所述基因组BamHI位点是约4600bp片段的成因。但是，如果使用双消化和这两个探针时再次观察到两个条带，那么这将是存在元件的多于一个拷贝的证据。

BamH I/Hind III消化的玉米DNA与DsRed2和pinII终止子探针的杂交造成DP-32138-1植物中约2600bp的单一条带并且没有其他条带(表8)。该2600bp片段小于BamH I分析中观察到的约4600bp片段，因此，基因组Hind III位点的位置可以估计为距左边界接合约1400bp并且位于左边界和基因组BamH I位点之间。使用双消化时任何其他条带的缺乏证明在DP-32138-1基因组中只有PHP24597 T-DNA的该区的一个拷贝。此外，这说明使用BamH I消化物所见到的约6100bp的暗的条带确实是由于该酶在玉米基因组中位于最接近左边界接合的限制性位点的受阻的切割。对于在该BamH I位点上受阻的切割的一个可能的解释是限制性位点或邻近DNA序列的甲基化，其导致较低的BamH I的消化效率(Brown，1998)。BamH I/Hind III消化的玉米DNA与剩余的用于表征DP-32138-1玉米的探针的杂交都显示出预期的基于PHP24597 T-DNA图谱的条带。

Bgl II在PHP24597T-DNA内具有三个限制性位点，其位于bp位置1713、2519和7030(图2)。使用Bgl II的插入的T-DNA的消化会产生四个片段：与5126启动子和Ms45探针杂交的大于约1700bp的边界片段、与Ms45探针杂交的806bp的内部片段、与Ms45、Pg47启动子、zm-bt1和zm-aa1探针杂交的4511bp的另一内部片段以及与In2-1终止子、35S增强子、Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针杂交的大于约2900bp的第三边界片段(图2)。

Southern印迹上可见使用不同探针和来自DP-32138-1的Bgl II消化的DNA所预期的所有四个条带。5126启动子和Ms45探针都与约3600bp的边界条带杂交(表9)。Ms45探针也与两个806bp和4511bp的对应于质粒对照条带的内部条带杂交(表9)。4511bp条带由于与Ms45探针的约140bp的小的重叠而是暗的，而806bp条带与内源条带重叠约800bp，但是可以通过与对照植物泳道相比增加的条带强度检测。与质粒条带匹配的4511bp内部条带还可以使用Pg47启动子、zm-bt1和zm-aa1探针检测(表9)。In2-1终止子探针检测到约4900bp的高度杂交边界条带(表9)。正如使用其他消化物，使用Ms45和zm-aa1盒的所有探针时，检测到许多不同强度的内源条带。与35S增强子、Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针的杂交造成两个条带的检出：约4900bp的高度杂交边界条带和约7400bp的暗得多的条带(表9)。很可能7400bp条带产生自使用Bgl II在玉米基因组DNA中应该造成4900bp边界条带的位点的受阻消化，和为了检验此假设实施了如下文所述的使用Bgl II/Hind III的双消化。根据PHP24597 T-DNA的图谱(图2)，很可能使用In2-1终止子探针也会检测到7400bp的条带，但是由于与该条带的弱杂交以及在印迹的该区中内源条带的存在而未观察到它。

与上述BamH I/Hind III分析相似，实施了使用Bgl II和Hind III的双消化以证明使用Bgl II消化物和35S增强子、Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针所见的约7400bp的暗的第二条带是由于在玉米基因组中Bgl II位点的受阻的消化。使用这两个酶的消化和与35S增强子、Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针的杂交应该产生来自玉米基因组中位于bp 7030的Bgl II位点和Hind III位点的大于2900bp的边界片段。因为Hind III位点的位置比基因组Bgl II位点似乎更接近左边界，所以使用这两个酶的消化应该释放来自单一T-DNA插入物的、与这些探针杂交的、单一的、独特的片段。使用双消化物时只有单一条带的存在会提供以下证据：Bgl II Southern印迹上的约7400bp的暗的第二条带确实产生自基因组Bgl II位点的受阻的切割，所述基因组Bgl II位点是约4900bp片段的成因。但是，如果使用双消化和这两个探针时再次观察到两个条带，那么这将是存在元件的多于一个拷贝的证据。

Bgl II/Hind III消化的玉米DNA与35S增强子、Ltp2启动子、DsRed2和pinII终止子探针的杂交造成DP-32138-1植物中约4100bp的单一条带(表10)。该4100bp的片段小于在Bgl II分析中观察到的约4900bp的片段并且将基因组Hind III位点置于左边界接合和Bgl II位点之间，距边界约1200bp。此外，使用双消化时任何其他插入物相关条带的缺乏证明在DP-32138-1基因组中只有PHP24597 T-DNA的该区的一个拷贝，并且单独使用Bgl II消化物所见到的约7400bp的暗的条带很可能是由于该酶在玉米基因组中位于最接近左边界接合的位点的受阻切割。对于在Bgl II位点上受阻消化的一个可能的解释是限制性位点或邻近DNA序列的甲基化，其导致较低的Bgl II的消化效率(Brown，1998)。Bgl II/Hind III消化的玉米DNA与剩余的用于表征DP-32138-1玉米的探针的杂交都显示出预期的基于PHP24597 T-DNA图谱的条带。由Bgl II/Hind III Southern印迹所确定的基因组Hind III限制性位点的位置(距左边界1200bp)和由BamH I/Hind III分析所确定的位置(距左边界1400bp)之间的差异很可能是由于Southern印迹之间的电泳迁移移位和基于本研究中使用的DIG VII标记的条带大小近似的固有误差。

从Hind III、BamH I、Bgl II、BamH I/Hind III和Bgl II/Hind III消化物获得的信息与来源于Bmt I、Xho I和EcoR I印迹的数据联合以生成T-DNA插入物和周围玉米基因组的限制性图谱(图3)。消化物和杂交与DP-32138-1玉米的基因组中单一的、完整的PHP24597 T-DNA的存在是一致的。

实施例1结论

进行了DP-32138-1玉米的Southern印迹分析以验证插入物拷贝数和完整性并且生成插入物的物理限制性酶图谱。来自DP-32138-1玉米的个体植物的基因组DNA样品通过使用限制性酶BamH I、Bgl II、Bmt I、EcoR I、Hind III和Xho I的消化以及用BamH I/Hind III和Bgl II/Hind III的双消化进行分析。这些消化物与以下探针杂交，所述探针针对Ms45基因组区和zm-aa1和DsRed2(Alt1)基因、以及T-DNA中剩余的遗传元件，包括5126启动子、Pg47启动子、zm-bt1转运肽、In2-1终止子、CaMV 35S增强子、Ltp2启动子和pinII终止子。检查边界基因组中位点的使用Bmt I和Xho I的分析表明PHP24597 T-DNA的单一的、完整的拷贝存在于DP-32138-1玉米中。EcoR I分析表明PHP24597 T-DNA已经完整插入基因组中，因为内部EcoR I限制性位点是存在的。使用剩余的酶的分析用于与这些数据联合以生成DP-32138-1玉米中T-DNA插入物的物理限制性图谱。

表1：用于Southern杂交的DNA探针的描述

1.探针位置是基于PHP24597 T-DNA图谱(图2)。

2.探针位置是基于PHP24597质粒图谱(图1)。

3.Ms45探针是由在杂交溶液中组合的3个非重叠的标记的片段组成。

4.zm-aa1探针是由在杂交溶液中组合的2个非重叠的标记的片段组成。

5.zm-bt1-aa1探针是由在杂交溶液中组合的2个非重叠的标记的片段组成。该探针只用于初步Southern印迹分析。

表2：生长自测试物质种子的植物的事件特异性聚合酶链式反应分析和初步Southern印迹分析的结果

1.阳性结果表明植物中DP-32138-1靶序列的高于C_T阈值的扩增。阴性结果表明没有DP-32138-1靶序列的高于C_T阈值的扩增。阳性或阴性确定表明植物中玉米内源参考被扩增。

2.阳性结果表明Southern印迹上对于Ms45、zm-bt1-aa1或DsRed2(Alt1)的条带的存在，而阴性结果表明适当的条带不存在。

表3：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；Bmt I消化物

注意：星号(*)和灰色阴影表明指定的条带是由于与内源序列杂交，其可以通过DP-32138-1和对照植物中相同条带的存在来确定。

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小四舍五入至最近的100bp。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4.边界片段是其中1个限制性位点在插入的T-DNA内并且另一个位点位于侧翼基因组DNA内、从而提供对于给定插入物的独特大小的片段的那些。

5.～2500bp的内源条带只在DP-32138-1植物中的一个和Hi-II对照植物中见到。

表4：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；Xho I消化物

注意：星号(*)和灰色阴影表明指定的条带是由于与内源序列杂交，其可以通过DP-32138-1和对照植物中相同条带的存在来确定。

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小以100bp四舍五入。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4.边界片段是其中1个限制性位点在插入的T-DNA内并且另一个位点位于侧翼基因组DNA内、从而提供对于给定插入物的独特大小的片段的那些。

5 观察到的大小与预期的大小相同，这是由于向质粒条带相等的迁移。

表5：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；EcoR I消化物

注意：星号(*)和灰色阴影表明指定的条带是由于与内源序列杂交，其可以通过DP-32138-1和对照植物中相同条带的存在来确定。

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小以100bp四舍五入。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4 观察到的大小与预期的大小相同，这是由于向质粒条带相等的迁移。

5.～4300bp的内源条带只在DP-32138-1植物中的一个和Hi-II对照植物中的一个中见到。

表6：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；Hind III消化物

注意：星号(*)和灰色阴影表明指定的条带是由于与内源序列杂交，其可以通过DP-32138-1和对照植物中相同条带的存在来确定。

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小以100bp四舍五入。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4.边界片段是其中1个限制性位点在插入的T-DNA内并且另一个位点位于侧翼基因组DNA内、从而提供对于给定插入物的独特大小的片段的那些。

5 基于PHP24597 T-DNA图谱(图2)，该片段预期的大小＞9800bp。但是，因为印迹上最大的分子量标记条带是～8600bp并且所述条带前进到该标记上方，所以观察到的所述条带的大小报告为＞8600bp。

6 ＞8600bp和～3800bp的内源条带只在DP-32138-1植物中的一个以及Hi-II和Hi-II(ms45)对照植物中见到。

表7：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；BamH I消化物

注意：星号(*)和灰色阴影表明指定的条带是由于与内源序列杂交，其可以通过DP-32138-1和对照植物中相同条带的存在来确定。

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小以100bp四舍五入。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4.边界片段是其中1个限制性位点在插入的T-DNA内并且另一个位点位于侧翼基因组DNA内、从而提供对于给定插入物的独特大小的片段的那些。

5 观察到的大小与预期的大小相同，这是由于向质粒条带相等的迁移。

表8：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；BamH I/Hind III消化物

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小以100bp四舍五入。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4.边界片段是其中1个限制性位点在插入的T-DNA内并且另一个位点位于侧翼基因组DNA内、从而提供对于给定插入物的独特大小的片段的那些。

表9：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；Bgl II消化物

注意：星号(*)和灰色阴影表明指定的条带是由于与内源序列杂交，其可以通过DP-32138-1和对照植物中相同条带的存在来确定。

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小以100bp四舍五入。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4.边界片段是其中1个限制性位点在插入的T-DNA内并且另一个位点位于侧翼基因组DNA内、从而提供对于给定插入物的独特大小的片段的那些。

5 观察到的大小与预期的大小相同，这是由于向质粒条带相等的迁移。

6 条带与内源条带重叠，但是可以通过增加的杂交强度来检测。

7 ～2900bp的内源条带只在DP-32138-1植物中的一个和705对照植物中见到。

表10：Southern印迹上预测的和观察到的杂交条带；Bgl II/Hind III消化物

1.基于来自PHP24597的T-DNA的图谱(图2)，对于与含有完整T-DNA插入物的DP-32138-1玉米基因组DNA的探针杂交的预测的大小。边界片段大小以100bp四舍五入。

2.基于PHP24597的质粒图谱(图1)，对于与质粒PHP24597的探针杂交的预测的大小。

3.观察到的片段大小是从Southern印迹上DIG-标记的DNA分子量标记VII片段估计的。由于无法测定印迹上确切的大小，所有估计值按100bp四舍五入。

4.边界片段是其中1个限制性位点在插入的T-DNA内并且另一个位点位于侧翼基因组DNA内、从而提供对于给定插入物的独特大小的片段的那些。

表11：质粒PHP24597中遗传元件的描述

表12：质粒PHP24597的T-DNA区中遗传元件的描述

实施例2.PHP24597的T-DNA区的测序

SEQ ID NO：20提供了来自质粒PHP24597的Ms45基因剪接的外显子翻译的推定的氨基酸序列。全长MS45蛋白长度为412个氨基酸并且分子量约为47kDa。

SEQ ID NO：21提供了来自质粒PHP24597的zm-bt1转运肽+zm-aa1区翻译的推定的氨基酸序列。位于位置1-75的氨基酸包含转运肽。包含转运肽的完整的翻译产物长度为495个氨基酸并且分子量约为54kDa。移除转运肽的加工过的ZM-AA1蛋白长度为420个氨基酸并且分子量约为46kDa。

SEQ ID NO：33提供了来自质粒PHP24597 DsRed2(Alt1)基因翻译的推定的氨基酸序列。DsRed2蛋白长度为225个氨基酸并且分子量约为26kDa。

SEQ ID NO：1提供了32138玉米中T-DNA插入物加上基因组边界区的序列。

实施例3.玉米事件DP-32138-1的聚合酶链式反应(PCR)分析

跨越引入的遗传元件的独特接合的聚合酶链式反应(PCR)扩增可以将32138玉米植物与其非遗传修饰的相应物区别开并且可以用于筛选插入的T-DNA的存在。本研究的目的是证实对来自32138玉米的叶组织基因组DNA的构建体特异性PCR测定法的有效性和可靠性，并且评估该方法的灵敏性。

实验设计

分离来自测试物质(来自32138玉米的种子：批号T-F-07-132C)和对照物质(来自具有代表事件背景的遗传背景的非遗传修饰玉米的种子：批号C-F-07-131C)的叶组织的基因组DNA，并且使用构建体特异性引物对对其进行定量PCR扩增。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离，以验证分离自测试物质的基因组DNA中插入的构建体的存在和分离自对照物质的基因组DNA中插入的构建体的不存在。参考标准(低DNA质量Ladder；Invitrogen Corporation货号10380-012)用于测定PCR产物大小。构建体特异性PCR方法的可靠性通过重复实验三次来评估。PCR扩增的灵敏性通过来自事件DP-32138-1的基因组DNA.的多种稀释进行评价。

DNA提取

收获来自DuPont实验站(Wilmington，DE)的、生长自从先锋国际良种公司(杜邦公司)(Pioneer Hi-Bred International，a DuPont Company)(Johnston，IA)获得的种子的植物的测试和对照叶样品(V5-V7叶阶段)。使用标准尿素提取操作步骤，实施从测试和对照叶组织中的基因组DNA提取。

基因组DNA使用NanoDrop

 1000分光光度计、使用ND-1000 V3.6软件(ThermoScientific，Wilmington，DE)进行定量。DNA样品在琼脂糖凝胶上可视化以验证定量值和确定DNA质量。

聚合酶链式反应

使用构建体特异性引物对08-0-2544/08-0-2582(SEQ ID NOS：2和3；表17)对分离自32138玉米和对照样品的叶的基因组DNA进行PCR扩增(AccuPrime Taq DNA聚合酶高保真，Invitrogen Corporation货号12346)，所述引物对靶向玉米5126启动子和Ms45基因组序列并允许32138玉米的独特的鉴定。使用该引物对的PCR产物的预期大小为233bp。第二引物对02-O-197/02-O-198(SEQ ID NOS：4和5；表17)用于扩增作为PCR扩增阳性对照的内源玉米转化酶基因(GenBank登录号AF171874.1)。使用该引物对的PCR产物的预期大小为225bp。PCR试剂和反应条件如表13中所示。本研究中，50ng的叶基因组DNA用在所有PCR反应中。

表13：PCR试剂和反应条件

PCR：聚合酶链式反应

ddH₂O：双蒸水

^*10×AccuPrime PCR缓冲液II

^**AccuPrime Taq DNA聚合酶高保真

对于32138玉米的构建体特异性PCR分析

在使用作为模板的质粒PHP24597(50ng)和所有32138玉米DNA样品的PCR反应中，观察到由构建体特异性引物组08-0-2544/08-0-2582扩增的大小约为230bp的PCR产物，但是在所有对照玉米样品和无模板对照中未观察到。该实验重复三次并获得相似结果。图7表示对来自5个32138玉米植物和5个对照玉米植物的DNA提取物的观察结果。这些结果密切符合对含有32138玉米基因组DNA的样品的预期PCR产物大小(233bp)。使用引物组02-O-197/02-O-198的、用于内源玉米转化酶基因检出的PCR反应后，对于32138玉米和对照玉米样品都观察到大小约为220bp的PCR产物(图8)。这些结果密切符合对含有玉米内源转化酶基因的基因组DNA样品的预期PCR产物大小(225bp)。在无模板对照中未观察到内源靶条带。

对于32138玉米的构建体特异性PCR分析的灵敏性

为了评估PCR扩增的灵敏性，多种浓度的32138玉米植物的单一DNA样品被添加到非遗传修饰的对照DNA，从而导致32138玉米DNA的量范围从50ng到500fg(所有PCR样品中基因组DNA的总量是50ng)。每个稀释液进行如前进行的PCR扩增。根据此分析，检出限(LOD)被确定为在50ng的总DNA中的约50pg的32138玉米DNA或0.1％的32138玉米DNA(图9)。这对于很多筛选应用是足够的灵敏性。

实施例3结论

以在所有分析的测试植物样品中构建体特异性靶条带的存在以及非遗传修饰的对照植物中的不存在为证，使用对于32138玉米的构建体特异性引物组的定量PCR分析验证了测试植物含有插入的来自PHP24597的T-DNA。该结果是可再现的。测试和对照植物都含有内源玉米转化酶基因。在所述条件下，预测的分析灵敏性为0.1％32138玉米DNA。

实施例4.事件32138的插入的DNA和侧翼区的测序

Southern印迹分析表明单一的、完整的来自质粒PHP24597的T-DNA被插入玉米基因组中以产生32138玉米；参见实施例1。本实施例提供了32138玉米中插入的T-DNA的序列并且进一步验证了单一的、完整的T-DNA被插入玉米基因组中，其具有位于5′基因组边界区的23bp或27bp的部分的T-DNA插入物。此外，本实施例描述了基因组边界区的克隆和测序，开展克隆和测序是为了获得可以用于特有地鉴定32138玉米的DNA序列。

测定插入物和基因组边界区的序列以验证插入的DNA的完整性并且表征32138玉米中存在的位于插入位点侧翼的基因组序列。总计，验证了13998bp的32138玉米基因组序列，其包含2114bp的5′基因组边界序列、2002bp的3′基因组边界序列和9882bp的插入的来自PHP24597的T-DNA。发现32138玉米中插入的T-DNA在右边界(RB)末端具有45bp的缺失并且在左边界(LB)末端具有23bp的缺失。另外，23bp的部分T-DNA插入物位于标明的基因组5′边界序列的位置2092-2114。包围该部分插入物的序列包含另外的32138玉米独特的并且可以用于特异性地鉴定32138事件的接合序列。标明在位置2115至11996的所有剩余的转基因序列是完整的并且与质粒PHP24597的T-DNA是相同的。

通过来自32138玉米和对照植物两者的基因组边界区的PCR扩增和测序，32138玉米的5′和3′基因组边界区被证实是玉米源的。总之，32138玉米中插入物和基因组边界序列的表征验证了来自质粒PHP24597的T-DNA的、单一的、完整的插入物存在于玉米基因组中，其具有位于5′基因组边界区的23bp或27bp的部分T-DNA插入物。

测试物质

测试物质被限定为含有获得自32138玉米T1S1代的事件DP-32138-1的玉米种子。只选择红色的谷粒用于本研究中。实施例1中提供了更多关于种子来源的细节。

所有的种子获得自先锋国际良种公司(Pioneer，Johnston，IA)并且系谱信息存放在育种工作人员处。记录编号为T-F-07-132C。

对照物质

对照物质被限定为来自不含有32138玉米的玉米系的种子。未修饰的玉米系具有代表事件背景的遗传背景；但是，其不含有Ms45、zm-aa1和DsRed2(Alt1)基因盒。记录编号为C-F-07-131C。实施例1中提供了更多细节。

低DNA质量Ladder(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)、高DNA质量Ladder(Invitrogen Corp.)和GeneRuler 1kb DNA Ladder(Fermentas，Glen Burnie，MD)用于电泳以估计琼脂糖凝胶上DNA片段的大小。

植物生长和样品收集

32138玉米种子和对照种子种植在位于DuPont实验站(Wilmington，DE)的调节科学(Regulatory Science)生长室中以产生用于本研究的植物组织。每罐种1粒种子并且独特地标识罐。所有的植物以为健康植物生长而调节的光、温度和水来种植。

从每个对照和32138玉米植物收集叶样品。对于每个样品，收集来自生长点以上的足够的叶材料并且置于预先标记的样品袋中。样品置于干冰上并且收集后转移到超低温冷冻箱(＜-55℃)。所有样品保持冷冻直到加工。所有的叶样品用植物标识人和收获日期独特地标记。

通过事件特异性PCR分析的基因型验证

从所有测试和对照植物取得叶样品用于事件特异性PCR分析。使用Extract-N-Amp^TM植物PCR试剂盒、使用已述的程序(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)从每个叶样品中提取DNA。

使用ABI PRISM

 7500HT序列检测系统(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)对每个DNA样品进行实时PCR。设计了TaqMan探针和引物组以检测来自32138玉米的靶序列。此外，使用了针对参考玉米内源基因的第二TaqMan

探针和引物组以验证每个反应中可扩增的DNA的存在。分析由定量的阳性/阴性检出的实时PCR测定组成。使用优化的和验证过的TaqMan

通用PCR主混合物(无AmpErase

UNG)(TaqMan

Universal PCR Master Mix，No AmpErase

 UNG(Applied Biosystems，Inc.))中引物和探针浓度测定提取的DNA。初始孵育为95℃持续10分钟，然后按照以下40个循环：95℃持续15秒、60℃持续1分钟。

对于32138玉米的阳性或阴性确定是基于事件特异性的靶标PCR的C_T(阈值循环)与玉米内源参考靶标的C_T的比较。如果事件和内源PCR靶标扩增到C_T阈值以上，那么对于所述事件植物评分为阳性。如果内源靶标扩增而事件靶标没有，那么植物评分为阴性。如果对于特定样品两个靶标均未扩增，那么被确定为低质量样品或失败的运行并且重复该测定。

DNA提取和定量

磨碎冷冻的叶样品(1-2克的量)并且使用标准尿素提取缓冲液程序分离基因组DNA。提取后，将DNA在琼脂糖凝胶上可视化以确定DNA质量并且使用NanoDrop 1000分光光度计和ND-1000 V3.6软件(ThermoScientific，Wilmington，DE)进行定量。

聚合酶链式反应(PCR)

PCR引物由IDT(Coralville，IA)合成并且在PCR反应中使用0.2-0.4μM的浓度，以30-250ng的基因组DNA作为模板。分离自5株32138玉米植物的DNA用作模板DNA。来自5株32138玉米植物中的4株的PCR产物被克隆和测序。以下区是从分离自32138玉米的基因组DNA中PCR扩增的：PHP24597 T-DNA插入物、5′和3′插入物/基因组边界接合和5′和3′基因组边界区。使用的PCR系统是：AccuPrime Taq DNA聚合酶高保真(Invitrogen Corp.)，高保真PCR系统(Roche，Mannheim，Germany)，延伸长模板PCR系统(Expand Long Template PCR System)(Roche)和Advantage

-GC2基因组PCR混合液(Clontech，Palo Alto，CA)。PCR产物通过使用溴化乙锭染色的1×TBE(或1×TAE)的1-2.5％琼脂糖凝胶的电泳后，在UV光下可视化，或通过使用SYBER

绿(Invitrogen Corp.)的1.2％琼脂糖E-凝胶在蓝光下可视化。切除产物并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从凝胶中纯化产物。

PCR产物的克隆

使用TOPO TA克隆

试剂盒(pCR2.1-TOPO载体，Invitrogen)或pGemT-Easy载体系统(Promega)克隆PCR产物。质粒使用QIAprep旋转小量制备(Spin Miniprep)试剂盒(Qiagen)进行分离，通过限制性酶消化物进行筛选并测序。

DNA测序

克隆DNA片段并递交到Pioneer作物遗传研究测序中心(Pioneer Crop Genetics Research sequencing facility)(Wilmington，DE)进行测序。来自Gene Codes Corporation(Ann Arbor，Michigan)的Sequencher^TM软件用于组装序列。使用Vector NTI 9.1.0(Invitrogen Corp)，通过将生成自32138玉米的T-DNA插入物序列与来自质粒PHP24597(用于转化以产生32138玉米的质粒)的T-DNA区的序列比较而进行序列注释。

来自质粒PHP24597的T-DNA的测序

对用于产生32138玉米的质粒PHP24597的T-DNA区进行测序并且与生成自32138玉米的插入的序列比较。

32138玉米中插入的T-DNA的测序

为了证实32138玉米中来自质粒PHP24597的插入的T-DNA的DNA序列，根据来自质粒PHP24597的T-DNA的序列信息设计了引物。在PCR中，使用来自至少4株不同的32138玉米植物的基因组DNA作为模板生成了5个重叠的PCR产物。对来自32138玉米植物的这些PCR产物进行克隆和测序。

5′和3′侧翼基因组边界区的测序

使用数轮反向PCR(Silver和Keerikatte，(1989)；Ochman，et al.，(1988)；Triglia，et al.，(1988))进行5′和3′侧翼边界区的最初序列表征，所述反向PCR中使用锚定于插入的T-DNA的5′和3′末端的不同区内的引物。从反向PCR获得的序列信息用于BLASTn分析并显示出与来自NCBI(美国国立生物技术信息中心)GenBank核苷酸数据集的玉米基因组DNA序列(GenBank登录号AC196124)的同一性。然后该序列用于设计跨越32138玉米的5′和3′插入物/基因组接合的引物。对生成自从4株32138玉米植物分离的基因组DNA的PCR产物进行克隆和测序以证实5′和3′插入物/基因组接合和基因组边界区。为了证明鉴定出的5′和3′基因组边界序列是玉米起源的，在来自32138玉米和对照植物的基因组DNA上的该5′和3′基因组区内进行了PCR。对来自4株32138玉米植物和2个对照植物的克隆的PCR产物进行测序。

通过事件特异性PCR分析的基因型验证

用于本研究的所有个体植物通过事件特异性PCR分析测试32138插入物的存在。所有32138玉米植物对于插入物都是阳性的，然而所有对照植物对于插入物都是阴性的。表13中总结了对于32138植物和对照植物的事件特异性PCR测定法的结果。

插入的DNA和基因组边界区的序列表征

质粒PHP24597的T-DNA序列信息用于设计引物以证实32138玉米中插入的序列(表14和表15)。对通过反向PCR从32138玉米基因组DNA获得的初步序列进行BLASTn分析，并且该初步序列显示与来自NCBI(美国国立生物技术信息中心)GenBank核苷酸数据集的玉米基因组DNA序列(GenBank登录号AC196124)的同一性。然后来自AC196124的序列信息被用于设计引物以延伸另外的基因组边界区(表14和表15)。

为了表征32138玉米中插入的T-DNA，设计了PCR引物来扩增以下5个单独的、重叠的PCR产物中的T-DNA插入物：片段A(07-0-2286/07-0-2277；SEQ ID NOS：6和7)、片段B(08-0-2329/08-0-2398；SEQ ID NOS：8和9)、片段C(08-0-2402/07-0-2024；SEQ ID NOS：10和11)、片段D(08-0-2505/08-0-2504；SEQ ID NOS：12和13)、片段E(08-0-2408/08-0-2526；SEQ ID NOS：14和15)(图10和表15与表16)。正如所预期的，预测的PCR产物只生成自32138玉米基因组DNA样品并不存在于对照样品中。从4株32138玉米植物克隆和序列来自32138玉米植物的5个PCR产物。当将32138玉米中插入的T-DNA的序列与用于产生32138玉米的质粒PHP24597的T-DNA区比较时，确定了RB末端上有45bp的缺失并且LB末端上有23bp的缺失。RB和LB末端缺失通常出现在土壤杆菌属介导的转化中(Kim，et al.，(2007)Plant J.51：779-791)。所有剩余的序列是完整的并且与质粒PHP24597中的是相同的。插入物的序列展示在SEQ ID NO：1和图11中。

为了证实另外的5′基因组边界序列，用5′基因组边界区中的正向引物(07-0-2286；SEQ ID NO：6)和插入的T-DNA中的反向引物(07-0-2277；SEQ ID NO：7)进行PCR。对得到的来自32138玉米基因组DNA样品的2198bp的PCR片段A进行克隆和测序。2114bp的5′基因组边界区序列以带有下划线的序列展示在图11中。

为了证实另外的3′基因组边界序列，用插入的T-DNA中的正向引物(08-0-2408；SEQ ID NO：14)和3′基因组边界区中的反向引物(08-0-2526；SEQ ID NO：15)进行PCR。对得到的来自32138玉米基因组DNA样品的2683bp的PCR片段E进行克隆和测序。2002bp的3′基因组边界区序列以带有下划线的序列展示在图11中。

总计，验证了来自32138玉米的基因组DNA的13998bp的序列：2114bp的5′基因组边界序列、2002bp的3′基因组边界序列和包含插入的T-DNA的9882bp(图10和图11)。

为了证明鉴定出的5′和3′侧翼边界序列是玉米源的，在32138玉米基因组DNA样品和对照DNA样品上的5′和3′基因组边界区内进行了PCR(引物对分别是08-0-2528/08-0-2538，SEQ ID NOS：16和17；和08-0-2539/08-0-2530，SEQ ID NOS：18和19)。预期的PCR片段F(对于5′基因组区是294bp)和PCR片段G(对于3′基因组区是297bp)生成自32138玉米和对照样品两者。对这些PCR产物进行克隆和测序，来自32138玉米和对照玉米的对应的产物是相同的，从而表明序列是玉米基因组源的(图12A和图12B)。

表14.通过32138玉米和对照玉米植物的事件特异性PCR分析的基因型验证小结

1.对于32138玉米的事件特异性实时PCR测定法小结。阳性(+)表明32138玉米事件的存在。阴性(-)表明32138玉米事件不存在。

表15.用于表征32138玉米中基因组边界区和插入的T-DNA的PCR引物

PCR片段	引物对	大小(bp)	扩增区
				A	07-0-2286/07-0-2277	2198	5’基因组边界区和插入物
B	08-0-2329/08-0-2398	3052	5’基因组边界区和插入物
				C	08-0-2402/07-0-2024	3550	插入物
D	08-0-2505/08-0-2504	4073	插入物
				E	08-0-2408/08-0-2526	2683	3’基因组边界区和插入物
F	08-0-2528/08-0-2538	294	5’基因组边界区
				G	08-0-2539/08-0-2530	297	3’基因组边界区

图10标明生成自32138玉米基因组DNA的克隆并测序的PCR片段：片段A(07-0-2286/07-0-2277)、片段B(08-0-2329/08-0-2398)、片段C(08-0-2402/07-0-2024)、片段D(08-0-2505/08-0-2504)和片段E(08-0-2408/08-0-2526)。垂直虚线代表基因组边界/插入物接合。片段F(08-0-2528/08-0-2538)和G(08-0-2539/08-0-2530)分别代表5′和3′基因组边界区(红箭头)。图10不是按比例绘制。

图12A中，引物对08-0-2528/08-0-2538从5′侧翼基因组DNA内扩增了PCR产物(294bp)。图12B中，引物对08-0-2539/08-0-2530从3′基因组边界区内扩增了PCR产物(297bp)。

实施例4结论

测定插入物和基因组边界区的序列以验证插入的DNA的完整性并且表征32138玉米中存在的位于插入位点侧翼的基因组序列。总计，验证了13998bp的32138玉米基因组序列，其包含2114bp的5′基因组边界序列、2002bp的3′基因组边界序列和9882bp的插入的来自PHP24597的T-DNA。发现32138玉米中插入的T-DNA具有右边界(RB)末端上的45bp的缺失和左边界(LB)末端上的23bp的缺失。此外，23bp的部分T-DNA插入物位于标明的基因组5′边界序列的位置2092-2114。包围该部分插入物的序列包含另外的32138玉米独特的并且可以用于特异性地鉴定32138事件的接合序列。标明的位于位置2115至11996的所有剩余的转基因序列是完整的并且与质粒PHP24597的T-DNA是相同的。

通过来自32138玉米和对照植物的基因组边界区的PCR扩增和测序，32138玉米的5′和3′基因组边界区被证实是玉米源的。总之，32138玉米中插入物和基因组边界序列的表征验证了来自质粒PHP24597的T-DNA的、单一的、完整的插入物存在于玉米基因组中，其具有位于5′基因组边界区的23bp或27bp的部分T-DNA插入物。

表17.PCR反应中使用的引物序列的列表

SEQ ID NO：	引物名称	序列5’-3’	靶序列
				2	08-0-2544	TCAAGCCGTGAGCAGACATGTTGCAG	5126启动子
3	08-0-2582	CGAAGAAGAGGTGAGGGTACTGCACG	Ms45基因组
				4	02-O-197	CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC	玉米转化酶基因
5	02-O-198	GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC	玉米转化酶基因

本文所用冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。作为实例，“一个元件(an element)”表示一个或多个元件。

本说明书中提及的所有公开和专利申请表示本发明所属领域技术人员的水平。所有的公开和专利申请在此通过引用并入，该引用的程度就如同专门和单独指出每一单独的公开或专利申请以通过引用并入。

尽管为了理解的清楚，以说明和举例的方式描述了上述发明的某些细节，但是很显然，可以在随附权利要求书的范围内实施某些改变和修饰。

表18.用于Southern杂交的DNA探针的描述

1.探针位置是根据PHP24597 T-DNA图谱(图14)。

2.探针位置是根据PHP24597质粒图谱(图13)。

3.Ms45探针是由在杂交溶液中组合的三个非重叠的、标记的片段组成。

4.zm-aa1探针是由在杂交溶液中组合的两个非重叠的、标记的片段。

5.tet探针是由在各自的杂交溶液中组合的两个标记的片段组成。

6.不适用，因为该元件不位于PHP24597 T-DNA区中。

参考文献

Albertsen，M.C.，Beach，L.R.，Howard，J.和Huffman，G.A.；1995；“Nucleotide Sequences Mediating Male Fertility和Method of Using Same(介导雄性育性的核苷酸序列及其使用方法)”；美国专利第5,478,369号。

Albertsen，M.C.，Fox，T.W.和Trimnell，M.R.；1993；“Tagging，cloning，and characterizing a male fertility gene in maize(对玉米中雄性育性基因加标签、克隆和表征)”；Am.J.Bot.Suppl.80：16.

Allen，R.L.和Lonsdale，D.M；1993；“Molecular characterization of one of the maize polygalacturonase gene family members which are expressed during late pollen germination(晚期花粉萌发时表达的玉米聚半乳糖醛酸酶基因家族中一个成员的分子特征)”；Plant J.3(2)：261-271.

An，G.，Mitra，A.，Choi，H.K.，Costa，M.A.，An，K.，Thornburg，R.W.和Ryan，C.A.；1989；“Functional Analysis of the 3’Control Region of the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor II Gene(马铃薯创伤诱导型蛋白酶抑制剂II基因的3’控制区的功能分析)”；Plant Cell 1：115-122.

Brown，T.A.；1998；“Restriction/Methylation(限制/甲基化)”；Molecular Biology LabFax I：Recombinant DNA.San Diego，CA，USA：Academic Press；118-121.

Cigan，A.M.，和Albertsen，M.C.；1997；“Transgenic Plants and DNA Comprising Anther Specific Promoter 5126 and Gene to Achieve Male Sterility(包含花药特异性启动子5126和实现雄性不育的基因的转基因植物和DNA)”；美国专利第5,689,051号。

Cigan，A.M.，Unger，E.，Xu，R.，Kendall，T.，和Fox，T.W.；2001；“Phenotypic complementation of ms45 maize requires tapetal expression of MS45(ms45玉米的表型互补需要MS45的绒毡层表达)”；Sex.Plant Reprod.14：135-142.

Franck，A.，Guilley，H.，Jonard，G.，Richards，K.和Hirth，L.；1980；“Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA(花椰菜花叶病毒DNA的核苷酸序列)”；Cell 21(1)：285-294.

Fling，M.E.，Kopf，J.和Richards，C.；1985；“Nucleotide sequence of the transposon Tn7 gene encoding an aminoglycoside-modifying enzyme，3’(9)-O-nucleotidyltransferase(编码氨基糖苷修饰酶3’(9)-O-核苷酸转移酶的转座子Tn7基因的核苷酸序列)”；Nucleic Acids Res.13：7095-7106.

Hershey，H.P.和Stoner，T.D.；1991；“Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn(玉米中通过取代的苯磺酰胺诱导的RNA物质的cDNA克隆的分离和表征)”；Plant Mol.Biol.17(4)：679-690.

Kalla，R.，Shimamoto，K.，Potter，R.，Nielsen，P.S.，Linnestad，C.和Olsen，O.-A.；1994；“The promoter of the barley aleurone-specific gene encoding a putative 7kDa lipid transfer protein confers aleurone cell-specific expression in transgenic rice(编码推定的7kDa脂质转移蛋白的大麦糊粉特异性基因的启动子赋予转基因水稻中糊粉细胞特异性表达)”；Plant J.6(6)：849-860.

Keil，M.，Sanches-Serrano，J.，Schell，J.和Willmitzer，L.；1986；“Primary structure of a proteinase inhibitor II gene from potato(来自马铃薯的蛋白酶抑制剂II基因的一级结构)”；Nucleic Acids Res.14：5641-5650.

Kim，S.-I.，Veena和Gelvin，S.B.；2007；“Genome-wide Analysis of Agrobacterium T-DNA Integration Sites in the Arabidopsis Genome Generated Under Non-selective Conditions(在非选择条件下生成的拟南芥基因组中土壤杆菌属T-DNA整合位点的广泛基因组分析)”；Plant J.51：779-791.

Komari，T.，Hiei，Y.，Saito，Y.，Murai，N.和Kumashiro，T.；1996；“Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers(携带用于通过根瘤土壤杆菌介导的高等植物的共转化和转化株从选择标记分离的两个单独T-DNA的载体)”；Plant J.10(1)：165-174.

Living Colors^TM DsRed2：Improved red fluorescent protein for use in living cells(Living Colors^TM DsRed2：用于活细胞的改进的红色荧光蛋白).2001.Clontechniques July 2001：2-3.

Ochman，H.，Gerber，A.S.和Hartl，D.L.；1988；“Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction(反向聚合酶链式反应的遗传学应用)”；Genetics 120：621-623.

Odell，J.T.，Nagy，F.和Chua，N.-H.；1985；“Identification of DNA sequences required for activity of the eauliflower mosaic virus 35S promoter(花椰菜花叶病毒35S启动子的活性所需DNA序列的鉴定)”；Nature 313：810-812.

Silver，J和Keerikatte，V.；1989；”Novel Use of Polymerase Chain Reaction to Amplify Cellular DNA Adjacent to an Integrated Provirus(用于扩增与整合的前病毒相邻的细胞DNA的聚合酶链式反应的新的用途)”；Journal of Virology 63：1924.

Sullivan，T.D.，Strelow，L.I.，Illingworth，C.A.，Phillips，R.L.，和Nelson，Jr.，O.E.；1991；“Analysis of Maize Brittle-1 Alleles and a Defective Suppressor-Mutator-Induced Mutable Allele(玉米Brittle-1等位基因和缺陷性抑制子-增变子-诱导型可突变等位基因的分析)”Plant Cell 3：1337-1348.

Tomizawa，J-I.，Ohmori，H.，和Bird，R.E.；1977；“Origin of replication of colicin E1 plasmid DNA(大肠杆菌素E1质粒DNA的复制原点)”；Proc.Natl.Acad.Sci.74(5)：1865-1869.

Triglia，T.，Peterson，M.G.，和Kemp，D.J.；1988；“A Procedure for in vitro Amplification of DNA Segments that Lie Outside the Boundaries of Known Sequences(位于已知序列的边界外部的DNA节段的体外扩增程序)”；Nucl.Acids Res.16：8186.

Claims (18)

1.用于鉴定生物样品中事件E6611.32.1.38的方法，其包括使用特异性识别SEQ ID NO：1的T-DNA插入物内的序列的探针或第一引物和特异性识别SEQ ID NO：1的任一侧翼序列内的序列的另一探针或第二引物检测E6611.32.1.38特异区。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括使用利用至少两条引物的聚合酶链式反应，从所述生物样品中存在的核酸扩增DNA片段，其中所述第一引物识别SEQ ID NO：1的T-DNA插入物内的序列，并且第二引物识别SEQ ID NO：1的任一侧翼序列内的序列。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一引物选自SEQ ID NOS：7、9、10、11、12、13和14，并且所述第二引物选自SEQ ID NOS：6、8、15、16、17、18和19。

4.检测生物样品中事件E6611.32.1.38或其子代的存在的方法，其包括：

(a)从所述生物样品提取DNA样品；

(b)提供DNA引物对，其中所述引物中的一条识别SEQ ID NO：1的任一侧翼序列内的序列，并且所述引物中的另一条识别SEQ ID NO：1的T-DNA插入物内的序列；

(c)提供DNA扩增反应条件；

(d)进行DNA扩增反应，从而产生DNA扩增子分子；和

(e)检测所述DNA扩增子分子，其中所述DNA扩增子分子在所述DNA扩增反应中的检出表明事件E6611.32.1.38的存在。

5.分离的DNA分子，其包含通过权利要求4所述方法产生的任一扩增子。

6.检测样品中对应于E6611.32.1.38事件的DNA的存在的方法，所述方法包括：

(a)将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严紧杂交条件下与来自事件E6611.32.1.38的DNA杂交并且在所述严紧杂交条件下不与非E6611.32.1.38植物DNA杂交；

(b)使所述样品和探针处于严紧杂交条件；和

(c)检测所述探针与所述DNA的杂交，其中杂交的检出表明E6611.32.1.38事件的存在。

7.分离的DNA核苷酸引物序列，其包含选自SEQ ID NOS：2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19的序列或其互补物。

8.分离的DNA分子，其包含由SEQ ID NO：6和7；或SEQ ID NO：8和9；或SEQ ID NO：14和15的引物对扩增的接合(junction)序列。

9.用于筛选种子的事件E6611.32.1.38的存在的方法，其包括使用特异性引物或探针的E6611.32.1.38特异区的检测，所述引物或探针特异性识别事件E6611.32.1.38的接合(junction)序列。

10.分离的DNA序列对，每一所述DNA序列包含至少10个核苷酸并且当在DNA扩增程序中共同使用时，会产生对于事件E6611.32.1.38是诊断性的扩增子。

11.如权利要求10所述的分离的DNA序列对，其中所述对的第一成员选自SEQ ID NOS：7、9、10、11、12、13和14，并且所述对的第二成员选自SEQ ID NOS：6、8、15、16、17、18和19。

12.如权利要求5所述的扩增子，其中所述扩增子具有SEQ ID NO：25、28或32的序列。

13.包含事件E6611.32.1.38的植物。

14.由权利要求13所述植物产生的种子。

15.转基因植物、细胞、组织、种子或其含有DNA的部分，其代表性种子已经以登录号PTA-9158保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。

16.植物或其含有DNA的部分，所述植物或其含有DNA的部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸2115至11996的DNA插入物。

17.植物或其含有DNA的部分，所述植物或其含有DNA的部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸2071至2170的DNA。

18.植物或其含有DNA的部分，所述植物或其含有DNA的部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸11951至12050的DNA。

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