CN113388607A - 一种复杂dna的合成方法及其应用 - Google Patents

一种复杂dna的合成方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113388607A
CN113388607A CN202110554148.XA CN202110554148A CN113388607A CN 113388607 A CN113388607 A CN 113388607A CN 202110554148 A CN202110554148 A CN 202110554148A CN 113388607 A CN113388607 A CN 113388607A
Authority
CN
China
Prior art keywords
type
sequence
restriction enzyme
restriction
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110554148.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113388607B (zh
Inventor
马石金
肖晓文
吴佑林
谢天
杜军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Qingke Biotechnology Co ltd
Tsingke Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Qingke Biotechnology Co ltd
Tsingke Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Qingke Biotechnology Co ltd, Tsingke Biotechnology Co Ltd filed Critical Nanjing Qingke Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110554148.XA priority Critical patent/CN113388607B/zh
Publication of CN113388607A publication Critical patent/CN113388607A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113388607B publication Critical patent/CN113388607B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及DNA合成技术领域，具体涉及一种复杂DNA的合成方法及其应用。本发明提供的复杂DNA的合成方法包括：分析待合成DNA，确定其含有的分割序列的位置以及II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶完整识别位点信息，选择拟使用的II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶，在分割序列的最后一个碱基之后将待合成DNA分割为多个序列片段，在每个序列片段的末端添加碱基，使其能够被II型限制性内切酶、IIS型限制性内切酶酶切且形成配对的粘性末端，分别合成各序列片段，利用II型限制性内切酶酶切、IIS型限制性内切酶酶切后，连接酶切产物。该方法为复杂DNA序列的合成提供了简便、快速、高效的方法。

Description

一种复杂DNA的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及DNA合成技术领域，具体涉及一种复杂DNA的合成方法及其应用。
背景技术
随着基因工程和合成生物学的发展和广泛应用，DNA合成技术已成为农业、食品、医药、材料等领域普遍使用的技术。目前，基因合成的方法主要包括连接酶法和PCR法，现有的PCR法和连接酶法主要适用于常规DNA序列的合成，对于存在大量重复序列、GC含量较高或较低、存在复杂二级结构的序列的合成效率和准确性均较差。然而，在进行生物体的基因修饰、全基因合成等操作时，上述复杂DNA的合成也经常涉及。因此，开发能够适用于复杂DNA合成的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种复杂DNA的合成方法及其应用，该方法能够弥补传统PCR法和连接酶法的不足，用于存在大量重复序列、GC含量较高或较低、存在复杂二级结构等复杂DNA的合成。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种复杂DNA的合成方法，该方法包括：
对待合成DNA进行序列分析，确定其含有的分割序列的位置以及II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶完整识别位点信息，所述分割序列为在第一II型限制性内切酶完整识别序列中缺少其切割后所形成粘性末端一侧的碱基所得到的序列，
根据序列分析结果，选择拟使用的第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶，其中，第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶为不同的II型限制性内切酶，
所述待合成DNA的序列中不含有所选择的第一II型限制性内切酶、、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的完整识别序列，
在选择的第一II型限制性内切酶对应的分割序列的最后一个碱基之后将待合成DNA分割为n个序列片段，依次记为A1、A2、A3至An，n＞1且为整数，
在序列片段A1的3’末端添加碱基，以使其能够被选择的第一II型限制性内切酶第二II型限制性内切酶酶切，在序列片段An的5’末端添加碱基以使其能够被选择的IIS型限制性内切酶酶切、且酶切后形成第一II型限制性内切酶对应的粘性末端、3’末端添加第二II型限制性内切酶的完整识别序列，在序列片段A2-An-1的5’末端添加碱基以使其能够被选择的IIS型限制性内切酶酶切、且酶切后形成第一II型限制性内切酶对应的粘性末端、3’末端添加碱基以使其能够被选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶酶切，
分别合成添加碱基后的所述序列片段，利用所述序列片段经添加碱基所形成的限制性内切酶完整识别序列对应的限制性内切酶进行酶切后，连接各酶切产物。
本发明通过将待合成序列分成更短的序列片段，在序列片段的末端引入原始序列中不存在的II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的识别位点，利用II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的配合作用，将各序列片段连接得到待合成DNA。对于含有较多重复序列、GC含量较高或较低、含有复杂二级结构的复杂DNA序列，利用上述方法能够显著提高DNA合成的效率和准确性。
优选地，所述分割序列为缺少所述第一II型限制性内切酶完整识别序列的5’或3’末端1-2个碱基的序列。进一步优选地，所述分割序列为5-6个碱基的序列。
优选地，在序列片段A1的3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基，在序列片段An的5’末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与所述第一II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，在序列片段A2-An-1的5’末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与所述第一II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基。
在进行序列片段的酶切连接时，首先将序列片段两两分组，具体地：除序列片段A1外，依次将相邻的两个序列片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的序列片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的序列片段，将各组经酶切的两个序列片段连接后，再依次对得到的连接片段进行编号，将相邻的两个连接片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的片段，将各组经酶切的两个片段连接后，重复上述步骤，直至获得除序列片段A1外的所有序列片段的连接产物。
进一步地，将除序列片段A1外的所有序列片段的连接产物利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切后与经所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切的序列片段A1连接，得到待合成DNA。
本发明中，所述第一II型限制性内切酶为切割后产生5’端突出的4个碱基粘性末端的II型限制性内切酶。
优选地，所述第一II型限制性内切酶优选为选自AflII、AgeI、BamHI、BssHII、BglII、EcoRI、HindIII、MluI、NcoI、SpeI、SalI、XbaI、XhoI、NotI、AscI中的一种或多种。
对于上述各种II型限制性内切酶，优选的分割序列如下：对于AflII，所述分割序列为CTTAA或TTAAG，对于AgeI，所述分割序列为ACCGG或CCGGT，对于BamHI，所述分割序列为GGATC或GATCC，对于BssHII，所述分割序列为GCGCG或CGCGC，对于BglII，所述分割序列为AGATC或GATCT，对于EcoRI，所述分割序列为GAATT或AATTC，对于HindIII，所述分割序列为AAGCT或AGCTT，对于MluI，所述分割序列为ACGCG或CGCGT，对于NcoI所述分割序列为CCATG或CATGG，对于SpeI，所述分割序列为ACTAG或CTAGT，对于SalI，所述分割序列为GTCGA或TCGAC，对于XbaI，所述分割序列为TCTAG或CTAGA，对于XhoI，所述分割序列为CTCGA或TCGAG，对于NotI，所述分割序列为GCGGCC或GGCCGC，对于AscI，所述分割序列为GGCGCG或CGCGCC。
对于第二II型限制性内切酶，本发明没有特殊要求，仅满足待合成的目标序列中不含有该酶的识别位点即可。
本发明中，所述IIS型限制性内切酶优选为选自BbsI、BsaI、BsmBI中的一种或多种。
本发明还提供所述复杂DNA的合成方法在生物体的基因修饰、人工基因组合成、蛋白质生产、生物大分子药物制备中的应用。
其中，所述生物大分子药物包括但不限于核酸药物(包括疫苗等)、蛋白质药物(包括抗体等)。
本发明的有益效果在于：本发明提供的复杂DNA的合成方法中，首先利用DNA序列中包含的特定碱基作为分割序列，将待合成DNA分割为若干个短片段，通过添加辅助碱基形成完整的II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶识别位点，形成的II型限制性内切酶及IIS型限制性内切酶原本并不存在于待合成序列中，通过分别合成各短片段，再利用形成的完整识别位点对短片段进行酶切处理后，获得匹配的粘性末端，实现短片段之间的连接。本发明的DNA合成方法为复杂DNA序列的合成提供了简便、快速的方法，具有较高的合成效率和准确性。
附图说明
图1为本发明实施例2中待合成序列的重复序列分析结果。
图2为本发明实施例2中待合成序列的酶切位点分析。
图3为本发明实施例2中各序列片段5’和3’末端经添加碱基后形成的限制性内切酶识别位点情况。
图4为本发明实施例2中两个序列片段的酶切、连接过程的示意图。
图5为本发明实施例2中各序列片段连接过程的示意图。
图6为本发明实施例2中将合成的SEQ ID NO.1所示DNA片段构建至pUC57(2.7Kb)商业化载体后的酶切电泳验证结果。
图7为本发明实施例2中合成的SEQ ID NO.1所示DNA片段的3个一代测序反应示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种复杂DNA的合成方法，具体步骤如下：
(1)对待合成DNA进行序列分析，确定其含有的分割序列的位置以及含有的II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶完整识别位点的情况和识别位点的具体位置，其中，分割序列为缺少第一II型限制性内切酶完整识别序列的5’或3’末端部分碱基的序列(缺少第一II型限制性内切酶切割后所形成粘性末端一侧的碱基)，不同II型限制性内切酶对应的分割序列如表1所示；
表1限制性内切酶及其对应的分割序列
II型限制性内切酶名称 分割序列
AflII CTTAA或TTAAG
AgeI ACCGG或CCGGT
BamHI GGATC或GATCC
BssHII GCGCG或CGCGC
BglII AGATC或GATCT
EcoRI GAATT或AATTC
HindIII AAGCT或AGCTT
MluI ACGCG或CGCGT
NcoI CCATG或CATGG
SpeI ACTAG或CTAGT
SalI GTCGA或TCGAC
XbaI TCTAG或CTAGA
XhoI CTCGA或TCGAG
NotI GCGGCC或GGCCGC
AscI GGCGCG或CGCGCC
(2)根据步骤(1)的序列分析结果，选择拟使用的第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶(BbsI、BsaI、BsmBI中的一种)，可选的第一II型限制性内切酶为切割后产生5’端突出的4个碱基粘性末端的II型限制性内切酶，具体如表1所示，第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶为不同的酶，且待合成DNA的序列中不能含有所选择的第一、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的完整识别序列；
在选择的第一II型限制性内切酶对应的分割序列的最后一个碱基之后将待合成DNA分割为n个序列片段，依次标记为A1、A2、A3至An，n＞1且为整数；
在序列片段A1的3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶的完整识别序列，第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基，在序列片段An的5’末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与所述第一II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，在序列片段A2-An-1的5’末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与第一所述II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶的完整识别序列，第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基；
(3)分别合成步骤(2)中添加碱基后的各序列片段。除序列片段A1外，依次将相邻的两个序列片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的序列片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的序列片段，将各组经酶切的两个序列片段连接后，再依次对得到的连接片段进行编号，将相邻的两个连接片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的片段，将各组经酶切的两个片段连接后，重复上述步骤，直至获得除序列片段A1外的所有序列片段的连接产物。
(4)将除序列片段A1外的所有序列片段的连接产物利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切后与经所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切的序列片段A1连接，得到待合成DNA。
实施例2
本实施例利用实施例1提供的复杂DNA的合成方法对复杂DNA进行合成。
SEQ ID NO.1所示序列中含有大量的重复序列(图1)，以至于单纯依赖PCR手段来获得整段序列非常困难，而且从1000-5000bp这一4000bp的区域内没有任何可以利用的单一酶切位点(图2)，给序列构建带来极大的难度。另外，经序列分析，发现“GGATCT”的结构，给同尾酶(BamHI-BglII)的拼接带来了可能性，但是该序列末端的BglII酶切位点的存在给同尾酶拼接带来了限制，若利用该同尾酶结构会将序列切断。
因此，利用实施例1提供的合成方法对SEQ ID NO.1所示序列进行合成。
经序列分析显示，该序列中存在多个GGATC，该序列结构可作为BamHI的分割序列，且该序列中不含有BamHI、HindIII、BbsI的完整识别序列，因此，选择BamHI作为第一II型限制性内切酶，HindII作为第二II型限制性内切酶，并辅助IIS型限制性内切酶BbsI进行设计；
在GGATC的最后一个碱基(C)之后将待合成DNA分割为9个序列片段，分别为序列片段1(SEQ ID NO.1的1位至1092位)，序列片段2(SEQ ID NO.1的1093位至1560位)，序列片段3(SEQ ID NO.1的1561位至2184位)，序列片段4(SEQ ID NO.1的2185位至2808位)，序列片段5(SEQ ID NO.1的2809位至3432位)，序列片段6(SEQ ID NO.1的3433位至4056位)，序列片段7(SEQ ID NO.1的4057位至4680位)，序列片段8(SEQ ID NO.1的4681位至5304位)，序列片段9(SEQ ID NO.1的5305位至5892位)。
在序列片段1的3’末端添加碱基cNNNNNNAAGCTT(其中N为任意碱基)以使得3’末端沿5’至3’方向依次形成所选择的第一II型限制性内切酶BamHI和第二II型限制性内切酶HindIII的完整识别序列，在第2-8个序列片段的5’末端沿5’至3’方向依次添加IIS型限制性内切酶BbsI的完整识别位点GAAGACaa以及与BamHI经酶切后形成粘性末端配对的碱基GATC，3’末端添加碱基cNNNNNNAAGCTT以使得3’末端沿5’至3’方向依次形成所选择的第一II型限制性内切酶BamHI和第二II型限制性内切酶HindIII的完整识别序列，在第9个序列片段的5’末端沿5’至3’方向依次添加IIS型限制性内切酶完整识别位点GAAGACaa以及与BamHI经酶切后形成粘性末端配对的碱基GATC、3’末端添加第二II型限制性内切酶HindIII的完整识别序列AAGCTT。各序列片段5’和3’末端经添加碱基后形成的限制性内切酶识别位点情况如图3所示。
分别合成上述添加碱基后的各序列片段，除序列片段1外，依次将相邻的两个序列片段分为一组(序列片段2和3为一组，序列片段4和5为一组，序列片段6和7为一组，序列片段8和9为一组)，在每组中，利用第一II型限制性内切酶BamHI和第二II型限制性内切酶HindIII双酶切排序靠前的序列片段(序列片段2、4、6和8)，利用所选择的IIS型限制性内切酶BbsI和第二II型限制性内切酶HindIII双酶切排序靠后的序列片段(序列片段3、5、7和9)，将各组经酶切的两个序列片段连接后，再依次对得到的连接片段进行编号，将相邻的两个连接片段分为一组，在每组中，利用第一II型限制性内切酶BamHI和第二II型限制性内切酶HindIII双酶切排序靠前的片段，利用IIS型限制性内切酶BbsI和第二II型限制性内切酶HindIII双酶切排序靠后的片段，将各组经酶切的两个片段连接后，重复上述步骤，直至获得除序列片段A1外的所有序列片段的连接产物。
将除序列片段1外的所有序列片段的连接产物利用IIS型限制性内切酶BbsI和第二II型限制性内切酶HindIII双酶切后与经所选择的第一II型限制性内切酶BamHI和第二II型限制性内切酶HindIII双酶切的序列片段1连接，得到SEQ ID NO.1所示的DNA。
上述两个序列片段的酶切、连接过程的示意图如图4所示，各序列片段连接过程的示意图如图5所示。
以上合成方法在使用酶切进行拼接时，选用BamHI-BsaI的组合，而避免使用BamHI-BglII组合，不会被靠近序列3’端的BglII影响，而导致酶切切断整个序列。
经载体酶切和测序验证，证明利用上述方法成功合成了SEQ ID NO.1所示的DNA片段。将合成的SEQ ID NO.1所示DNA片段构建至pUC57(2.7Kb)商业化载体后的酶切电泳验证结果如图6所示。该DNA片段的3个一代测序反应示意图如图7所示。
对于该DNA片段，尝试采用传统的PCR法和连接酶法进行合成，但均未成功。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京擎科生物科技有限公司 南京擎科生物科技有限公司
<120> 一种复杂DNA的合成方法及其应用
<130> KHP211113804.1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5892
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccatgggg cctatgccgc atctgaaggt tcacaaaact ggacccattc aaggtcacag 60
aaaatatcac gctaaacacg gaaagacaaa cagcggacct ctcgattctc tgattttctt 120
ctcgaaaggc ctgaacaaaa agaaatgcgg tgcctccgtt gatgtattct tagatatatc 180
gaagcgcaag cacgccaaaa attgggatga agcgcttgac gtgactttcg gaactgtcaa 240
aggcatttct ggaatcctcg atggctggat acccggattt ggttccaaat tcggaaatct 300
ctttgtcgga attctcagaa ttgcgatctg ctccaaggag aagaagctaa caacattatt 360
gagagatagc ccgaatatat gccaccccga attcggaact aaatggggct ggtcgaagct 420
aaccggaaag ttcgagagtt acaaggagat catcaagttt tacaaactag agaagattcg 480
cgaagaactc gacactttgc tgaaaagaag caaggatgga gagaagtggg agaagactga 540
agggtcatcg aaattcatta taacgactgt acgaagtcta atagaattgc tggaacgaga 600
accgtcgaaa tgggataaga acttcctgca agtgatattc gtgaaactgt tcacgatcat 660
gggcgctctt ggaaacagtt atcatccgaa attcggaggt tatattgttg acggatttgc 720
tgaatactta gaagacgtgg acactaaata cgaattaggt ttcatacaga aaatcaaaga 780
gatcaaacaa cgaataactg tctgcaatag gcacactctc aacgagactt tgaacaaatc 840
taaggacact gatttcgaaa aagaatataa aactgatgat gacgttaata atgaaggcga 900
tgagcaggga actaaggata aagactacaa acctgcgaaa ccaaatgaac ctaagaaaaa 960
cgaaaacgac gatgacccat cctctaacgg agggaaagga ggcgaaccct ctactaatga 1020
gagtaaagaa cataaaaacg gcaaacctga aggttcaaga aaaccagaac gtcctgggaa 1080
accagaggga tctaagaaaa ccggaaacga taatgacgat gacacagact tcaaaggtaa 1140
gaaagtgact gaagatagag gggaatcctc tactgataaa attaaagata aaaaggacaa 1200
gtctgaaggt tcaaaaaaac cagaacgtcc tgggaaacca gagaaatcta agaaaaccgg 1260
aaacgataat gacgatgaga cagactccaa aagtaagaaa gtaactgaag atagaggcga 1320
atcctctact gataaaatta aagaaaaaaa ggacaagcct gaaggttcaa gaaaaccgga 1380
acgtcctggg aaaccagagg gatctaagaa aaccggaaac gataatgacg atgagacaga 1440
cttcaaaggt aagaaagtaa ctgaagatag aggcgaatcc tctactgata aaattaaaga 1500
taaaaaggac aagcctgaag gttcaagaaa accggaacgt cctgggaaac cagagggatc 1560
taagaaaacc ggaaacgata atgacgatga gacagactcc aaaggtaaaa aagtaactga 1620
agatagaggc gaatcctcta ctgataaaat taaagataaa aaggacaagc ctgaaggctc 1680
aagaaaaccg gaacgtcctg ggaaaccaga gggatctaag aaaaccggaa acgataatga 1740
cgatgagaca gactccaaat gtaagaaagt aactgaagat agaggcgaat cctctactga 1800
taaaattaaa gataaaaagg acaagcctga aggttcaaga aaaccagaac gtcctgggaa 1860
accagaggga tctaagaaaa ccggaaacga taatgacgat gagacagact ccaaaggtaa 1920
gaaagcaact gaagatagag gcgaatcctc tactgataaa attaaagata aaaaggacaa 1980
gcctgaaggt tcaagaaaac cggaacgtcc tgggaaacca gagggatcta agaaaaccgg 2040
aaacgataat gacgatgaga cagactccaa aggtaagaaa gtaactgaag atagaggcga 2100
atcctctact gataaaatta aagataaaaa ggacaagcct gaagattcaa gaaaaccgga 2160
acgtcctggg aaaccagagg gatctaagaa aaccggaaac gataatgacg atgagacaga 2220
ctccaaaggt aagaaagtaa ctgaagatag aggcgaatcc tctactgata aaattaaaga 2280
taaaaaggac aagcctgaag gttcaagaaa accggaacgt cctgggaaac cagagggatc 2340
taagaaaacc ggaaacgata atgacgatga gacagactcc aaaggtaaga aagtaactga 2400
agatagaggc gaatcctcta ctgataaaat taaagataaa aaggacaagc ctgaaggttc 2460
aagaaaaccg gaacgtcctg ggaaaccaga gggatctaag aaaactggaa acgataatga 2520
cgatgagaca gactccaaag gtaagaaagt aactgaagat agaggcgaat cctctactga 2580
taaaattaaa gataaaaagg acaagcctga aggttcaaga aaaccggaac gtcctgggaa 2640
accagaggga tctaagaaaa ccggaaacga taatgacgat gagacagact ccaaaggtaa 2700
gaaagtaact gaagatagag gcgaatcctc tactgataaa attaaagata aaaaggacaa 2760
gcctgaaggt tcaagaaaac cggaacgtcc tgggaaacca gagggatcta agaaaaccgg 2820
aaacgataat gacgatgaga cagactccaa aggtaagaaa gtaactgaag atagaggcga 2880
atcctctact gataaaatta aagataaaaa ggacaagcct gaaggttcaa gaaaaccgga 2940
acatcctggg aaaccagagg gatctaagaa aaccggaaac gataatgacg atgagacaga 3000
ctccaaaggt aagaaagtaa ctgaagatag aggcgaatcc tctactgata aaattaaaga 3060
taaaaaggac aagcctgaag gttcaagaaa accggaacgt cctgggaaac cagagggatc 3120
taagaaaacc ggaaacgata atgacgatga gacagactcc aaaggtaaga aagtaactga 3180
agatagaggc gaatcctcta ctgataaaat taaaaataaa aaggacaagc ctgaaggttc 3240
aagaaaaccg gaacgtcctg ggaaaccaga gggatctaag aaaaccggaa acgataatga 3300
cgatgagaca gactccaaag gtaagaaagt aactgaagat agaggcgaat cctctactga 3360
taaaattaaa gataaaaagg acaagcctga aggttcaaga aaaccggaac gtcctgggaa 3420
accagaggga tctaagaaaa ccggaaacga taatgacgat gagacagact ccaaaggtaa 3480
aaaagtaact gaagatagag gcgaatcctc tactgataaa attaaagata aaaaggacaa 3540
gcctgaaggc tcaagaaaac cggaacgtcc tgggaaacca gagggatcta agaaaaccgg 3600
aaacgataat gacgatgaga cagactccaa atgtaagaaa gtaactgaag atagaggcga 3660
atcctctact gataaaatta aagataaaaa ggacaagcct gaaggttcaa gaaaaccaga 3720
acgtcctggg aaaccagagg gatctaagaa aaccggaaac gataatgacg atgagacaga 3780
ctccaaaggt aagaaagcaa ctgaagatag aggcgaatcc tctactgata aaattaaaga 3840
taaaaaggac aagcctgaag gttcaagaaa accggaacgt cctgggaaac cagagggatc 3900
taagaaaacc ggaaacgata atgacgatga gacagactcc aaaggtaaga aagtaactga 3960
agatagaggc gaatcctcta ctgataaaat taaagataaa aaggacaagc ctgaagattc 4020
aagaaaaccg gaacgtcctg ggaaaccaga gggatctaag aaaaccggaa acgataatga 4080
cgatgagaca gactccaaag gtaagaaagt aactgaagat agaggcgaat cctctactga 4140
taaaattaaa gataaaaagg acaagcctga aggttcaaga aaaccggaac gtcctgggaa 4200
accagaggga tctaagaaaa ccggaaacga taatgacgat gagacagact ccaaaggtaa 4260
gaaagtaact gaagatagag gcgaatcctc tactgataaa attaaagata aaaaggacaa 4320
gcctgaaggt tcaagaaaac cggaacgtcc tgggaaacca gagggatcta agaaaactgg 4380
aaacgataat gacgatgaga cagactccaa aggtaagaaa gtaactgaag atagaggcga 4440
atcctctact gataaaatta aagataaaaa ggacaagcct gaaggttcaa gaaaaccgga 4500
acgtcctggg aaaccagagg gatctaagaa aaccggaaac gataatgacg atgagacaga 4560
ctccaaaggt aagaaagtaa ctgaagatag aggcgaatcc tctactgata aaattaaaga 4620
taaaaaggac aagcctgaag gttcaagaaa accggaacgt cctgggaaac cagagggatc 4680
taagaaaacc ggaaacgata atgacgatga gacagactcc aaaggtaaga aagtaactga 4740
agatagaggc gaatcctcta ctgataaaat taaagataaa aaggacaagc ctgaaggttc 4800
aagaaaaccg gaacatcctg ggaaaccaga gggatctaag aaaaccggaa acgataatga 4860
cgatgagaca gactccaaag gtaagaaagt aactgaagat agaggcgaat cctctactga 4920
taaaattaaa gataaaaagg acaagcctga aggttcaaga aaaccggaac gtcctgggaa 4980
accagaggga tctaagaaaa ccggaaacga taatgacgat gagacagact ccaaaggtaa 5040
gaaagtaact gaagatagag gcgaatcctc tactgataaa attaaaaata aaaaggacaa 5100
gcctgaaggt tcaagaaaac cggaacgtcc tgggaaacca gagggatcta agaaaaccgg 5160
aaacgataat gacgatgaga cagactccaa aggtaagaaa gtaactgaag atagaggcga 5220
atcctctact gataaaatta aagataaaaa ggacaagcct gaaggttcaa gaaaaccgga 5280
acgtcctggg aaaccagagg gatctaagaa aaccggaaac gataatgacg atgagacaga 5340
ctccaaaggt aagaaagtaa ctgaagatag aggcgaatct tttaatagta acacatcaga 5400
aggtgctgaa cgtggaactc cttgcaaaaa taaaggaaat agtgatggaa aatctagaag 5460
cactgataat agtggaactc agtctcagga gaaaaagaaa aagtcgcacg gatctaaaaa 5520
gataatcaat aacaaccagt ccgaatccaa agatttccaa agatacagtg aactcaagcg 5580
atcgcaatat agtgaaaacg acgaaaacct ctcaaacaat cagaacgata atgaaaatgg 5640
taacactgta cgatcctctg agagcgcgta ccaatttaat caacaggaat caaagaaatc 5700
tagccagaga tctttcagaa gttttcaatc aaatagtgaa aataacgatc ccaatgaatc 5760
taccaaggaa atcagctcta gccagtcctc atcggagagc gcttcatcgt ctcggagcag 5820
ttatcattct agcagcatgc aaagaaacca aaagacatcg tttgatgatg atcaaaatga 5880
ataggcggcc gc 5892

Claims (10)

1.一种复杂DNA的合成方法，其特征在于，包括：
对待合成DNA进行序列分析，确定其含有的分割序列的位置以及II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶完整识别位点信息，所述分割序列为在第一II型限制性内切酶完整识别序列中缺少其切割后所形成粘性末端一侧的碱基所得到的序列，
根据序列分析结果，选择拟使用的第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶，其中，第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶为不同的II型限制性内切酶，
所述待合成DNA的序列中不含有所选择的第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的完整识别序列，
在选择的第一II型限制性内切酶对应的分割序列的最后一个碱基之后将待合成DNA分割为n个序列片段，依次记为A1、A2、A3至An，n＞1且为整数，
在序列片段A1的3’末端添加碱基，以使其能够被选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶酶切，在序列片段An的5’末端添加碱基以使其能够被选择的IIS型限制性内切酶酶切、且酶切后形成第一II型限制性内切酶对应的粘性末端、3’末端添加第二II型限制性内切酶的完整识别序列，在序列片段A2-An-1的5’末端添加碱基以使其能够被选择的IIS型限制性内切酶酶切、且酶切后形成第一II型限制性内切酶对应的粘性末端、3’末端添加碱基以使其能够被选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶酶切，
分别合成添加碱基后的所述序列片段，利用所述序列片段经添加碱基所形成的限制性内切酶完整识别序列对应的限制性内切酶进行酶切后，连接各酶切产物。
2.根据权利要求1所述的复杂DNA的合成方法，其特征在于，所述分割序列为缺少所述第一II型限制性内切酶完整识别序列的5’或3’末端1-2个碱基的序列。
3.根据权利要求1或2所述的复杂DNA的合成方法，其特征在于，在序列片段A1的3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基，在序列片段An的5’末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与所述第一II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，在序列片段A2-An-1的5’末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与所述第一II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，除序列片段A1外，依次将相邻的两个序列片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的序列片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的序列片段，将各组经酶切的两个序列片段连接后，再依次对得到的连接片段进行编号，将相邻的两个连接片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的片段，将各组经酶切的两个片段连接后，重复上述步骤，直至获得除序列片段A1外的所有序列片段的连接产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将除序列片段A1外的所有序列片段的连接产物利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切后与经所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切的序列片段A1连接，得到待合成DNA。
6.根据权利要求1～5任一项所述的复杂DNA的合成方法，其特征在于，所述第一II型限制性内切酶为切割后产生5’端突出的4个碱基粘性末端的II型限制性内切酶。
7.根据权利要求6所述的复杂DNA的合成方法，其特征在于，所述第一II型限制性内切酶为选自AflII、AgeI、BamHI、BssHII、BglII、EcoRI、HindIII、MluI、NcoI、SpeI、SalI、XbaI、XhoI、NotI、AscI中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的复杂DNA的合成方法，其特征在于，对于AflII，所述分割序列为CTTAA或TTAAG，对于AgeI，所述分割序列为ACCGG或CCGGT，对于BamHI，所述分割序列为GGATC或GATCC，对于BssHII，所述分割序列为GCGCG或CGCGC，对于BglII，所述分割序列为AGATC或GATCT，对于EcoRI，所述分割序列为GAATT或AATTC，对于HindIII，所述分割序列为AAGCT或AGCTT，对于MluI，所述分割序列为ACGCG或CGCGT，对于NcoI所述分割序列为CCATG或CATGG，对于SpeI，所述分割序列为ACTAG或CTAGT，对于SalI，所述分割序列为GTCGA或TCGAC，对于XbaI，所述分割序列为TCTAG或CTAGA，对于XhoI，所述分割序列为CTCGA或TCGAG，对于NotI，所述分割序列为GCGGCC或GGCCGC，对于AscI，所述分割序列为GGCGCG或CGCGCC。
9.根据权利要求1～8任一项所述的复杂DNA的合成方法，其特征在于，所述IIS型限制性内切酶为选自BbsI、BsaI、BsmBI中的一种或多种。
10.权利要求1～9任一项所述的复杂DNA的合成方法在生物体的基因修饰、人工基因组合成、蛋白质生产、生物大分子药物制备中的应用。
CN202110554148.XA 2021-05-20 2021-05-20 一种复杂dna的合成方法及其应用 Active CN113388607B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110554148.XA CN113388607B (zh) 2021-05-20 2021-05-20 一种复杂dna的合成方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110554148.XA CN113388607B (zh) 2021-05-20 2021-05-20 一种复杂dna的合成方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113388607A true CN113388607A (zh) 2021-09-14
CN113388607B CN113388607B (zh) 2021-12-28

Family

ID=77618230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110554148.XA Active CN113388607B (zh) 2021-05-20 2021-05-20 一种复杂dna的合成方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113388607B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774404A (zh) * 2021-12-27 2022-07-22 天津大学 一种dna串联重复序列的合成方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222165A (zh) * 2016-08-09 2016-12-14 武汉伯远生物科技有限公司 一种长片段和复杂片段dna的高效体外合成方法
CN107974448A (zh) * 2016-10-21 2018-05-01 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种序列复杂基因的合成方法
CN108531471A (zh) * 2017-03-01 2018-09-14 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种长基因合成方法
WO2020201434A1 (en) * 2019-04-02 2020-10-08 Oxford University Innovation Limited Universal dna assembly

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222165A (zh) * 2016-08-09 2016-12-14 武汉伯远生物科技有限公司 一种长片段和复杂片段dna的高效体外合成方法
CN107974448A (zh) * 2016-10-21 2018-05-01 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种序列复杂基因的合成方法
CN108531471A (zh) * 2017-03-01 2018-09-14 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种长基因合成方法
WO2020201434A1 (en) * 2019-04-02 2020-10-08 Oxford University Innovation Limited Universal dna assembly

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIYING MA等: "DNA synthesis,assembly and applications in synthetic biology", 《CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY》 *
彭凯等: "DNA合成、组装与纠错技术研究进展", 《合成生物学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774404A (zh) * 2021-12-27 2022-07-22 天津大学 一种dna串联重复序列的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113388607B (zh) 2021-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107586835B (zh) 一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法及其应用
US5652128A (en) Method for producing tagged genes, transcripts, and proteins
US5482845A (en) Method for construction of normalized cDNA libraries
US6309834B1 (en) Method for simultaneous identification of differentially expressed mRNAs and measurement of relative concentrations
US5707807A (en) Molecular indexing for expressed gene analysis
Bruenn et al. Yeast viral double-stranded RNAs have heterogeneous 3′ termini
JPH02182188A (ja) ファクター８および関連生産物の製造
JPH04503752A (ja) インビトロでのｄｎａの増幅、ゲノムクローニングおよびマッピングの、改良された方法
WO2004113534A1 (en) Method for producing a synthetic gene or other dna sequence
CN111511912A (zh) 标记来自单个细胞的核酸分子以进行定相测序
CN110835635B (zh) 不同启动子启动多个串联sgRNA表达的质粒构建方法
US6461814B1 (en) Method of identifying gene transcription patterns
CN113388607B (zh) 一种复杂dna的合成方法及其应用
WO1998008981A1 (en) METHODS FOR IDENTIFICATION AND ISOLATION OF SPECIFIC NUCLEOTIDE SEQUENCES IN cDNA AND GENOMIC DNA
CN109790577A (zh) 从核酸测序制备物除去衔接子二聚体的方法
WO2001075180A9 (en) Sequence-dependent gene sorting techniques
AU2021350637A1 (en) Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences
Wu et al. Synthetic oligodeoxynucleotides for analyses of DNA structure and function
CN104693309A (zh) 重组人乙型肝炎病毒核心蛋白融合蛋白
CN112725331B (zh) 一种高通量突变体文库的构建方法
EP0040466B1 (en) Adaptor molecules for dna and their application to synthesis of gene-derived products
US4889799A (en) Reagent kit producing shortened target DNA segments usable in sequencing large DNA segments
RIGGS et al. Synthesis, cloning, and expression of hormone genes in Escherichia coli
CN116004592B (zh) 一种实现DNA上C/G到T/A编辑的RsCBE系统
WO2023060539A1 (en) Compositions and methods for detecting target cleavage sites of crispr/cas nucleases and dna translocation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 100176 Floor 6, West Half Unit, Building 3, Yard 105, Jinghai 3rd Road, Daxing District, Beijing Economic-Technological Development Area

Patentee after: Beijing Qingke Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee after: NANJING QINGKE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 100176 Room 401, building 5, yard 156, Jinghai 4th Road, Daxing Economic and Technological Development Zone, Beijing

Patentee before: Beijing Qingke Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee before: NANJING QINGKE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.