CN111909950B

CN111909950B - 用于提高刺糖孢菌中多杀菌素产量的基因及其应用

Info

Publication number: CN111909950B
Application number: CN201910386424.9A
Authority: CN
Inventors: 夏海洋; 马小舒; 覃重军
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN115927429A; CN111909950A

Abstract

本发明提供了用于提高刺糖孢菌中多杀菌素产量的基因及其应用。具体地，本发明提供了一种多杀菌素生产菌株的构建方法，在出发菌株中，增强多杀菌素合成相关蛋白的活性或导入外源性的多杀菌素合成相关蛋白。通过实验证实，多杀菌素合成相关蛋白的活性增强或包含外源性的多杀菌素合成相关蛋白的遗传改造工程菌株，多杀菌素的生产能力显著提高。

Description

用于提高刺糖孢菌中多杀菌素产量的基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程或分子生物学领域，具体地，本发明涉及用于提高刺糖孢菌中多杀菌素产量的基因及其应用。

背景技术

刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)属于糖多孢菌属，可产生多种新型大环内酯类化合物A83543(1)。目前，从该类菌发酵液中至少分离到30种结构类似物，依次命名为Spinosyn A，B，C等，其中以Spinosyn A和D活性最高(2)。美国陶氏益农公司于1997年推出以Spinosyn A和D为活性物的新型高效生物杀虫剂多杀菌素(Spinosad)。多杀菌素杀虫谱广，对蜘蛛、线虫、昆虫均有控制作用，特别是对鳞翅目和双翅目害虫有较好的毒杀作用；该类物质在环境中易降解，对哺乳动物、鸟类以及捕食性昆虫相对低毒，表现出更好的环境安全性。

Spinosyns类物质主要由三部分组成，核心骨架为21碳形成的12元大环内酯，另加一个鼠李糖和一个福乐胺糖。刺糖多孢菌不同菌株产生这类化合物的比例组分有所不同，如NRRL 18395、18537、18538、18539主要产生Spinosyn A、B、C、D、E、F、G、H和J；NRRL18823主要合成Spinosyn Q、R、S和T；NRRL18719和NRRL18720主要产生Spinosyns J组分；NRRL18743主要合成Spinosyn K、O、P、U、V、W和Y。

多杀菌素目前市场需求旺盛，但是目前多限于刺糖多孢菌产量提高的困难，不能达到产业化的水平，因此，本领域迫切需要开发一种能够用于高效改造刺糖孢菌基因的方法，以便能够快速提高多杀菌素的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够用于高效改造刺糖孢菌基因的方法，以便能够快速提高多杀菌素的产量。

本发明公开了一系列刺糖多孢菌来源的调控蛋白和调控基因，即本发明多杀菌素合成相关蛋白及编码基因，该蛋白和编码基因可以用于调控刺糖多孢菌中多杀菌素的产量。

本发明的另一目的在于提供一系列可用于刺糖多孢菌遗传改造的系列基因，进而借助含有该系列基因的重组载体导入刺糖多孢菌中，用于提高多杀菌素的产量。

本发明的第一方面，提供了一种多杀菌素生产菌株的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

在出发菌株中，增强多杀菌素合成相关蛋白的活性或导入外源性的多杀菌素合成相关蛋白，其中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括一种或多种选自下组的多肽：

(a)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有多杀菌素合成相关蛋白活性的由(a)衍生的多肽；和/或

(c)氨基酸序列与SEQ ID NO.:6-10中任一所示序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、95％、更佳地≥98％)，具有多杀菌素合成相关蛋白活性的多肽。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括将如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的两端添加1-5个氨基酸残基而形成的，具有多杀菌素合成相关蛋白活性的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白至少包括具有如SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括至少2种(较佳地3种、4种、5种)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括具有如SEQ ID NO.:8和9所示的氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括具有如SEQ ID NO.:8和10所示的氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，所述增强多杀菌素合成相关蛋白的活性包括：

(i)提高多杀菌素合成相关蛋白的表达量和/或蛋白自身活性；和/或

(ii)减少多杀菌素合成相关蛋白的降解和/或失活。

在另一优选例中，所述增强多杀菌素合成相关蛋白的活性包括：导入外源性多杀菌素合成相关蛋白的编码基因或上调多杀菌素合成相关蛋白的编码基因的表达，优选地导入外源性所述蛋白的编码基因。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因选自下组：cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因包括一种或多种选自下组的多核苷酸：

(1)具有如SEQ ID NO.:1-5任一所示核苷酸序列中的编码区序列；

(2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1-5任一所示核苷酸序列中的编码区序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码多杀菌素合成相关蛋白的多核苷酸；和/或

(3)与(1)或(2)所述的序列互补的多核苷酸。

(1)具有如SEQ ID NO.:1-5中任一所示核苷酸序列的多核苷酸；

(2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1-5中任一所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码多杀菌素合成相关蛋白的多核苷酸；或

(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因包括具有如SEQ IDNO.:3和4所示的核苷酸序列(或其编码序列)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因包括具有如SEQ IDNO.:3和5所示的核苷酸序列(或其编码序列)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述上调多杀菌素合成相关蛋白的编码基因的表达包括上调所述编码基因的转录水平和/或翻译水平。

在另一优选例中，所述增强多杀菌素合成相关蛋白的活性可通过以下方法之一或组合实现：表达同源或异源的所述蛋白的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的调控序列(如启动子)以增强转录速度(如转录启动速度)，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或修改编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制。

在另一优选例中，所述增强多杀菌素合成相关蛋白的活性包括改造所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因的启动子为红霉素启动子，较佳地为红霉素启动子PermE*。

在另一优选例中，所述增强多杀菌素合成相关蛋白的活性包括在菌株中表达所述多杀菌素合成相关蛋白。

在另一优选例中，与出发菌株相比，所述多杀菌素生产菌株中的多杀菌素合成相关蛋白的含量和/或活性至少提高了20％，较佳地，至少提高了30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或300％。

在另一优选例中，与出发菌株相比，所述多杀菌素生产菌株中的多杀菌素合成产量至少提高了20％，较佳地，至少提高了30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，更佳地，至少提高了100-500％。

在另一优选例中，所述构建方法包括步骤：

(a1)提供携带外源性多杀菌素合成相关蛋白编码基因的表达载体；

(b1)将所述的表达载体转入出发菌株中，得到重组菌株；和

(c1)培养所述的重组菌株。

在另一优选例中，所述表达载体中还含有红霉素启动子，较佳地位于所述编码基因上游(5’端)。

在另一优选例中，所述表达载体中的多杀菌素合成相关蛋白编码基因的启动子为红霉素启动子。

在另一优选例中，所述方法还包括增强菌株中多杀菌素合成途径。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成途径包括各种编码各类调控蛋白和相关酶，例如(但不限于)丙二酰辅酶A、PPTase等。

在另一优选例中，所述方法还包括测定所得菌株的多杀菌素产量。

在另一优选例中，所述出发菌株本身可以包含多杀菌素合成途径或者不包含多杀菌素合成途径。

在另一优选例中，所述出发菌株本身具有多杀菌素合成能力。

在另一优选例中，所述导入外源性的多杀菌素合成相关蛋白包括在出发菌株中导入多杀菌素合成途径，其中所述多杀菌素合成途径中含有多杀菌素合成相关蛋白或其编码基因。

在另一优选例中，所述多杀菌素生产菌株的出发菌株为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)NRRL8395。

在另一优选例中，所述多杀菌素生产菌株的出发菌株为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。

在另一优选例中，所述出发菌株基因组之间，每个相应的多杀菌素合成相关蛋白编码基因具有至少92％，较佳地至少95％，更佳地至少98％、99％的同源性。

在另一优选例中，所述多杀菌素生产菌株是多杀菌素高产菌株。

在另一优选例中，所述“高产”是指，与其出发菌株相比，所述菌株的多杀菌素的表达量或生产能力至少提高了20％，较佳地，至少提高了30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，更佳地，至少提高了100-500％。

本发明的第二方面，提供了一种多杀菌素生产菌株，所述菌株中多杀菌素合成相关蛋白的活性增强或包含外源性的多杀菌素合成相关蛋白，其中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括一种或多种选自下组的多肽：

(a)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有多杀菌素合成相关蛋白活性的由(a)衍生的多肽；

在另一优选例中，所述多杀菌素生产菌株采用本发明第一方面所述的方法制备的。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的活性增强包括导入了或上调表达多杀菌素合成相关蛋白的编码基因(优选导入外源性该蛋白的编码基因)。

(1)具有如SEQ ID NO.:1-5中任一所示核苷酸序列的多核苷酸；

(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述多杀菌素生产菌株中的多杀菌素合成途径增强或导入了外源性多杀菌素合成途径。

在另一优选例中，所述多杀菌素生产菌株与其出发菌株相比，多杀菌素生产能力显著提高，多杀菌素生产能力为工业生产级。

本发明的第三方面，提供了如本发明第二方面所述的多杀菌素生产菌株的用途，用于产生多杀菌素和/或产生以多杀菌素为前体下游产物。

本发明的第四方面，提供了一种制备多杀菌素的方法，包括步骤：

1)发酵培养本发明第二方面所述的多杀菌素生产菌株，从而得到多杀菌素；和

2)任选从1)的发酵培养体系中获得多杀菌素。

本发明的第五方面，提供了一种赋予或增强菌株多杀菌素生产能力的方法，包括步骤：

(a)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述方法包括步骤：在出发菌株中导入或上调表达多杀菌素合成相关蛋白的编码基因(优选导入外源性该蛋白的编码基因)。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(b1)将所述的表达载体转入出发菌株中，得到重组菌株；

(c1)培养所述的重组菌株。

在另一优选例中，所述“赋予”或“增强”菌株多杀菌素生产能力指的是经过改造后，原先不具备多杀菌素生产和/或积累能力的菌株具有了多杀菌素工业化生产能力，和/或原先多杀菌素生产和/或积累能力较差的菌株具有了增强的多杀菌素工业化生产能力。

在另一优选例中，所述增强菌株多杀菌素生产能力包括提高菌株的多杀菌素产量。

本发明的第六方面，提供了一种多杀菌素合成相关蛋白或其基因的促进剂的用途，用于增强菌株的多杀菌素生产能力，其中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括一种或多种选自下组的多肽：

(a)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述促进剂包括促进多杀菌素合成相关蛋白或其编码基因的表达、或提高多杀菌素合成相关蛋白表达量、或增强多杀菌素合成相关蛋白活性的化合物或制剂。

在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、多肽、小分子配体、或其组合。

在另一优选例中，所述的核酸分子选自下组：miRNA、shRNA、siRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述菌株为刺糖多孢菌。

本发明的第七方面，提供了多杀菌素合成相关蛋白组合，所述的多杀菌素合成相关蛋白组合含有至少两种选自下组的多肽：

(a)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述的组合至少包括SEQ ID NO.:8和9所示的序列。

在另一优选例中，所述的组合至少包括SEQ ID NO.:8和10所示的序列。

本发明的第八方面，提供了多杀菌素合成途径相关基因组合，所述的基因组合含有至少两种分别编码本发明第七方面所述多杀菌素合成相关蛋白组合中的多肽的多核苷酸。

(1)具有如SEQ ID NO.:1-5任一所示核苷酸序列中的编码区序列；

(3)与(1)或(2)所述的序列互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的基因组合含有至少两种选自下组的多核苷酸：

(1)具有如SEQ ID NO.:1-5中任一所示核苷酸序列的多核苷酸；

(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的组合至少包括SEQ ID NO.:3和4所示的序列(或其编码序列)。

在另一优选例中，所述的组合至少包括SEQ ID NO.:3和5所示的序列(或其编码序列)。

本发明的第九方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’-3’端依次含有红霉素启动子和多杀菌素合成相关蛋白的编码基因，其中所述多杀菌素合成相关蛋白包括一种或多种选自下组的多肽：

(a)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽；

在另一优选例中，所述红霉素启动子的序列如SEQ ID NO.:41所示。

GGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTAGGATCCAGCGCC(SEQ ID NO.:41)

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因至少包括具有如SEQ IDNO.:5所示的核苷酸序列的基因。

本发明的第十方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第八方面所述基因组合，和/或本发明第九方面所述的表达盒。

本发明的第十一方面，提供了如本发明第七方面所述的多杀菌素合成相关蛋白组合、本发明第八方面所述的多杀菌素合成途径相关基因组合、本发明第九方面所述的表达盒、或本发明第十方面所述的载体的用途，用于制备本发明第二方面所述多杀菌素生产菌株、和/或用于赋予或增强菌株多杀菌素生产能力。

在另一优选例中，所述菌株为刺糖多孢菌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明所用载体质粒pCM265示意图。

图2显示了本发明构建的包涵系列基因的重组质粒物理图谱。

图3显示了利用系列基因提高多杀菌素产量。

图4显示了本发明构建的系列基因启动子替换重组质粒物理图谱。

图5显示了利用启动子替换的基因提高多杀菌素产量。

图6显示了本发明构建的系列基因组合的重组质粒插入片段示意图。

图7显示了利用基因组合提高多杀菌素产量。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，比较了大量的转录组，从糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中发现了一系列可以调控多杀菌素产量的基因和蛋白(即本发明所述的多杀菌素合成相关蛋白及其编码基因)。在不同多杀菌素产生菌中上调该系列基因的表达、导入该系列基因或增强该蛋白的活性均能显著提高多杀菌素的产量。此外，本发明人还通过对该系列基因启动子的改变和基因的组合进一步提高了多杀菌素的产量。基于本发明的系列基因用于刺糖多孢菌的遗传改造，快速显著提高多杀菌素发酵产量。在此基础上，完成了本发明。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，外源性的基因或序列泛指菌株本身染色体或质粒中不含有的基因或其片段，通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因，则该基因对于该菌株是“外源性”的。其中“非内源性”的基因或序列通常指在同类菌株或不同菌株染色体内所含有的，但是并不在充当宿主细胞的具体野生或突变菌株染色体内含有的特定基因或序列。

如本文所用，“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。

如本文所用，蛋白质或多核苷酸“衍生物”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。衍生物可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。衍生物也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。如本文所用，“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

如本文所用，“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

如本文所用，“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文所用，“分离”是指将物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

术语“编码蛋白的多核苷酸”是指包括编码此蛋白的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

多杀菌素合成相关蛋白及其编码基因

如本文所用，术语“多杀菌素合成相关蛋白”、“本发明多肽”均指在多杀菌素生产菌株中具有调控多杀菌素表达从而与多杀菌素产量相关的蛋白。

在本发明的一个实施方式中，所述的多杀菌素合成相关蛋白可以来源于刺糖多孢菌NRRL18395(Saccharopolyspora spinosa)，例如氨基酸序列如SEQ ID NO.:6-10所示。此外，显然，具有与SEQ ID NO.:6-10的活性等同的活性的任何序列，虽然它不是来源于刺糖多孢菌，也包括在本发明的范围内。例如，可包括SEQ ID NO.:6-10的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO.:6-10的氨基酸序列的保守序列和在一个或多个位置一个氨基酸或者几个氨基酸(可依据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型的变化，优选2-20个，更优选2-10个，最优选2-6个氨基酸残基)的置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，只要能保持或提高其合成多杀菌素的活性；还可以包括与SEQ ID NO.:6-10同源性大于80％，优选90％，更优选95％以上且具有多杀菌素合成相关蛋白活性的多肽，并且氨基酸的置换、缺失、插入、添加或倒位还包括天然存在于具有多杀菌素合成相关蛋白活性的微生物中的突变序列或者人工修饰的序列。

在本发明中，术语“多杀菌素合成相关蛋白”包括一种或多种选自下组的多肽：

(a)具有如SEQ ID NO.:6-10中任一所示的氨基酸序列的多肽；

其中，“多杀菌素合成相关蛋白活性”是指所述多杀菌素合成相关蛋白的活性，具体地，指与多杀菌素合成相关的活性，或调控(促进)多杀菌素合成的活性。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白为sspn_001120基因编码的蛋白，登录号为WP_029535169，氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

MATQPMSVAPSVQRSTVSPAAEEVAWAPPTWDEVVRQHADRVYRLAYRLTGNQHDAEDLTQETFIRVFRSLASYKPGTFEGWLHRITTNLFLDMARRRSRLRMEGLPEDSDRLPGGGPSPEQVFNDTHLDPDLQTALDELPPEFRAAVVLCDVEGLSYEEIGATLGVKLGTVRSRIHRGRQMLKATLEARREHPREV(SEQ ID NO.:6)

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白为sspn_003467基因编码的蛋白，登录号为WP_101376622，氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

MAPKPTMSMSKVDALPLRERVVAEIRETILTGQVEPGAILPETELANQLGVSRGPVRDALATLEREGLVTSKPNRRARVVVLGLRDVEEIYSLRGSMETLAAQRAATNATDADLQKMRKVLAKMDAALEGQDLVELSRLDAAFHDHIYEASRHDRLYQAWADLRSQVTLFLISRNTNAVTSRDIVIGEHEALLEALTARDADLLVRLTEEHLRGAYERLRDALIMSSRANA(SEQ ID NO.:7)

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白为sspn_004309基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

MTFLTGSRRFIKDRRHLRLRDRGTADRRWAGTLGDRIGRRKLLLAGGAAFGAASLLAAFATSAEMLIVARALLGITGAALLPPTLSLINNMSLGAQATRCSSPALSSSSSCSTCN(SEQ ID NO.:8)

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白为sspn_005347基因编码的蛋白，登录号为WP_010311961，氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

MTMNGPEECPSSRPAADGLDAAVALFHSLSDGTRLAITLRLADGEARVADLVGELGLAQSTVSAHVACLRDCGLVVGRPEGRQVYYSLARPELLELLASAETLLAATGRAVALCPNYGTDSGPGRVAQVAEVPGE(SEQ IDNO.:9)

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白为sspn_006588基因编码的蛋白，登录号为WP_010310498，氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

MYGAERQQLLAQRARRDGRIDVTAAAAEFEVAPETIRRDLAALERQGLVRRVYGGAIPVERLDFEPGVSLRDQTNASEKERIARAALDRVPSRGTVLLDAGTTTARLAGLLPADRELTVVTNSLPVANQLATRNNYNVHLLGGRIRGTTLATVESWALDVLRGLTIDVGFFGANGFSAARGCTTPDPAESAVKAAMVAACRRRVLLADHSKYGDDQFSRFAELSEIDVVVTDEGLDEAALGELEQIEAEVVLA(SEQ ID NO.:10)

如本文所用，术语“多杀菌素合成相关蛋白的编码基因”、“多杀菌素合成相关基因”、“本发明基因”、“本发明系列基因”均指在多杀菌素生产菌株中具有调控多杀菌素表达从而与多杀菌素产量相关的基因。

在本发明的一个实施方式中，所述的多杀菌素合成相关蛋白的编码基因来源于刺糖多孢菌NRRL18395(Saccharopolyspora spinosa)，核苷酸序列如SEQ ID NO.:1-5所示，也可称系列基因，其编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6-10所示。此外，显然，具有与SEQ ID NO.:1-5的活性等同的活性的任何序列，虽然它不是来源于刺糖多孢菌，也包括在本发明的范围内。

(1)具有如SEQ ID NO.:1-5中任一所示核苷酸序列的多核苷酸；

(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因为sspn_001120，编码区序列如SEQ ID NO.:1中的加粗部分所示。SEQ ID NO.:1中的下划线部分为非编码区序列(包括上游启动子区和下游非编码区等)。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因为sspn_003467，编码区序列如SEQ ID NO.:2中的加粗部分所示。SEQ ID NO.:2中的下划线部分为非编码区序列(包括上游启动子区和下游非编码区等)。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因为sspn_004309，编码区序列如SEQ ID NO.:3中的加粗部分所示。SEQ ID NO.:3中的下划线部分为非编码区序列(包括上游启动子区和下游非编码区等)。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因为sspn_005347，编码区序列如SEQ ID NO.:4中的加粗部分所示。SEQ ID NO.:4中的下划线部分为非编码区序列(包括上游启动子区和下游非编码区等)。

在另一优选例中，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因为sspn_006588，编码区序列如SEQ ID NO.:5中的加粗部分所示。SEQ ID NO.:5中的下划线部分为非编码区序列(包括上游启动子区和下游非编码区等)。

在本发明的一个实施方式中，本发明的一系列调控基因可用于刺糖多孢菌遗传改造，借助已申请专利(申请号201410203581.9)质粒载体，维持该系列基因在刺糖多孢菌中稳定遗传，为刺糖多孢菌的基因工程改造提供有效的分子遗传操作元件，快速实现改良刺糖多孢菌及提高多杀菌素产量。

本发明构建方法

基于发明人出乎意料地发现增强多杀菌素合成相关蛋白的活性可以极大提高生产菌株的多杀菌素产量，本发明进一步提供一种多杀菌素生产菌株的构建方法，所述方法包括：增强出发菌株中多杀菌素合成相关蛋白的活性；或在出发菌株中，导入外源性的多杀菌素合成相关蛋白。

本文所用的术语“增强”是指增加、提高、增大或升高某种蛋白，例如蛋白的表达量和/或活性。在本发明中，所述增强多杀菌素合成相关蛋白的活性可以包括提高多杀菌素合成相关蛋白的表达量和/或蛋白自身活性、和/或减少多杀菌素合成相关蛋白的降解。鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员也不难理解本文所用的“增强”还可以包括通过表达蛋白的外源编码基因而增强其活性。

在具体的实施方式中，增强蛋白的活性可以通过外源添加某种物质或突变增强该蛋白的自身活性。

在具体的实施方式中，增强蛋白的活性包括提高菌株内该蛋白的含量，可以通过表达蛋白的内源或异源性编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或对编码基因的调控序列进行改造(例如改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度)，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区或稀有密码子以增强翻译强度，和/或修改编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现。

如上面所述，调控序列包括能够起始转录的启动子，用于转录调控的任何操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列，调控转录和翻译终止的序列。对调控序列的修改包括但不限于，如：在多核苷酸序列中缺失、插入、保守突变或非保守突变、或其组合引入修改，也可以通过用具有增强活性的多核苷酸序列置换原始的多核苷酸序列。

载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的，并且其可以使用本领域已知的热河载体构建。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的DNA和RNA，其可以以任何形式插入到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。

表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明意外发现一系列来源于刺糖多孢菌的基因及其编码的多杀菌素合成相关蛋白，增强菌株中多杀菌素合成相关蛋白的活性(例如提高多杀菌素合成相关蛋白的表达量)可以极大提高生产菌株的多杀菌素产量。

(2)将本发明基因与红霉素启动子组合联用，可以显著提高刺糖多孢菌中多杀菌素的产量。

(3)通过组合两个或多个本发明系列基因可以显著提高刺糖多孢菌中多杀菌素的产量。

(4)通过本发明构建方法制备的多杀菌素生产菌株的多杀菌素产量，相比出发菌株显著提高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料和方法

1发明使用的菌株和质粒

本发明涉及的菌株和质粒列出于表1中。

表1本发明所用的菌株及质粒

2研究方法

2.1重组质粒接合转移蹈入刺糖多孢菌

质粒通过接合转移导入刺糖多孢菌。接合转移培养基为2CMC培养基：可溶性淀粉10g,磷酸氢二钾1g，硫酸镁2g，微量元素1ml/L，氯化钠1g,胰蛋白胨2g,硫酸铵2g,酪蛋白氨基酸2g,琼脂1.5％，加水至一升。使用前添加2.5M至终浓度20mM。接合转移方法参照文献。

2.2重组菌株的验证

根据pCM265质粒的整合特性，利用attP/attB整合后的位点attL/attR设计合成下表引物，用于验证转接合转移子的整合情况。

2.3发酵培养产生多杀菌素及其产量检测。

重组菌株发酵产生多杀菌素参考Yang等文献，发酵完成取1ml发酵液加入4ml无水甲醇，超声波处理0.5-1h，12000r/min离心10min，取上清液直接用于HPLC分析。HPLC分析条件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6×12.5(5μm)色谱柱，检测波长246nm；流动相甲醇:乙腈:水(含0.05％乙酸铵)＝45:45:10；流速1.0ml/min。利用标准品外标法计算多杀菌素产量。

实施例1：系列基因的克隆及重组质粒的构建

以刺糖多孢菌的基因组DNA为模板，分别采用引物，PCR扩增出刺糖多孢菌中sspn_001120,sspn_003467,sspn_004309,sspn_005347,sspn_006588等基因片段，通过XbaI与HindIII位点，分别的克隆到整合型表达载体pCM265中，依次获得携带相关基因的载体pMX1,pMX2,pMX3,pMX4,pMX5(图2)，所用引物如下表。

实施例2：含系列基因重组菌株构建及多杀菌素发酵检测。

含系列基因的重组质粒pMX1,pMX2,pMX3,pMX4,pMX5导入大肠杆菌S17-1菌株，重组质粒通过大肠杆菌-刺糖多孢菌间结合转移，导入刺糖多孢菌JY44-2菌株中，分别获得菌株JY44-201，JY44-202，JY44-203，JY44-204，JY44-205,并通过发酵检测系列调控基因对多杀菌素产量的促进作用，各发酵产量菌株见图2，系列基因均能明显提高多杀菌素产量，基因sspn_005437的提高幅度高达50％。

实施例3：系列基因启动子替换重组质粒的构建

以刺糖多孢菌的基因组为模板，分别采用引物，PCR扩增出pMX1,pMX2,pMX3,pMX4,pMX5中带有sspn_001120,sspn_003467,sspn_004309,sspn_005347,sspn_006588基因CDS区的pCM265载体片段，并在片段两端引入Nde1和Not1酶切位点。以及带有Nde1,Not1酶切位点的红霉素启动子部分，再通过Nde1和Not1酶切获得用红霉素组成型启动子替换的相关基因片段，分别克隆至带有sspn_001120,sspn_003467,sspn_004309,sspn_005347,sspn_006588基因CDS区的pCM265载体片段中，分别获得相应的重组载体pMX1P，pMX3P，pMX4P，pMX5P,pMX6P。

所用引物如下表。

重组质粒通过大肠杆菌-刺糖多孢菌间结合转移，导入的刺糖多孢菌的JY44-2菌株中,分别获得重组菌株JY44-21P，JY44-23P，JY44-24P，JY44-25P，JY44-26P，并通过发酵检测多个含启动子替换的调控基因质粒的菌株，产量比对照菌株JY44-2高，启动子替换的sspn_006588对对多杀菌素产量提高达80％。

实施例4：系列基因组合重组质粒的构建

以刺糖多孢菌的基因组为模板，分别采用引物，PCR扩增出刺糖多孢菌中sspn_001120,sspn_003467,sspn_005347,sspn_006588等基因，将基因sspn_001120,sspn_003467,sspn_005347,sspn_006588克隆至pMX3的Xba1位点，分别获得表达载体pMX41,pMX43,pMX45,pMX46。重组质粒通过大肠杆菌-刺糖多孢菌间结合转移，导入的刺糖多孢菌的JY44-2菌株中，分别获得重组菌株JY44-241JY44-243，,JY44-245，JY44-246，并通过发酵检测系列调控基因对多杀菌素产量的促进作用，所用引物如下表。

实施案例5：不同基因的组合对多杀菌素产量的影响。

含系列基因组合的重组质粒，导入的刺糖多孢菌的JY44-2菌株中，分别获得重组菌株JY44-241JY44-243，JY44-245，JY44-246进行发酵，发酵结果如图7所示。包含sspn_004309和sspn_005437组合的菌株产量提高近90％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 用于提高刺糖孢菌中多杀菌素产量的基因及其应用

<130> P2018-1627

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 1

cgggatcgcg cctgctcgtg gcccacgggc ccggcaccca ccggcgtctc gggtatcaca 60

acgcgaaagg ttatcggcgt tgccgacagc gatgttccgc gcgcccgaat tcgttagggg 120

gccgtttccg gcaggccaag atgagacccg gatcacatca ggttctcagc cagttctcag 180

gcgtctttaa tcgctacctc accagggcat acgagactaa gcacgtcata accgacaccc 240

agcggcgtct cctcgacgac aacgccggga acaacggagg cgacatgtcc gttcttggag 300

atgcaaccac acaggaggtg gcttttcgcc caatggcaac acagccgatg agtgtggccc 360

cgagtgtcca acggagcacc gtctcgcccg cagcggaaga ggtcgcctgg gccccgccga 420

cgtgggacga ggtggtacgg cagcacgccg accgggtcta ccggctggcg taccgcctga 480

ccggcaacca gcacgacgcc gaagacctga cccaggagac cttcatccgg gtgttccggt 540

cgctcgcgtc gtacaagccg ggaacgttcg aggggtggct gcaccggatc accacgaact 600

tgttcctgga catggcccgc cgcaggtccc gcctgcgcat ggagggcctg cccgaggaca 660

gcgaccggct gcccggcggt ggcccgagtc cggagcaggt cttcaacgac acccacctcg 720

accccgacct gcagacggcg ctggacgagc tgccgccgga gttccgggcg gcggtcgtgc 780

tctgcgacgt cgaggggctc tcctacgagg agatcggcgc caccttgggc gtgaagctgg 840

gtactgtgcg tagcaggatc caccgcgggc gccagatgtt gaaggccacc ttggaagctc 900

gccgcgagca tccccgggag gtttgacgaa tgacggtttt gcgtgggtgg gggctgccgg 960

agcagcacct cgcgctggac gcgatcgtcg cgttggtgga cggggaactc agcccgagcg 1020

cccacg 1026

<210> 2

<211> 1096

<212> DNA

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 2

cggcggcttg cttgcgtgaa tacctttgtg cggcaaagac tttgacccga ctcaccccgc 60

cggggaaact caagttccgg gctaccggga agtgcttcct cggttgacag cggcgtcgat 120

tttgctcgcg agcgtcggtg cgccatcggc ggaggtgatc cgcccgccgt cggtggagcc 180

gcaagacgcg ccggaagtcg atgcccagag cctcaccact ggttgcctac gggtgatcac 240

gtgttggatc cggtggagtc gcacgttagc ccaaactgtt gacagtttac aatctggtgc 300

atggcgccga aaccgacgat gtcgatgagc aaggtagatg cgctgccgct tcgcgagcga 360

gttgtcgccg agatcaggga aaccatcctg accggtcaag tggagcccgg cgcaatcctc 420

ccggagacgg agcttgccaa tcagctcggg gtcagccgcg gtccagtgcg ggacgcgttg 480

gcgaccctgg agcgcgaggg gctggtcacc tcgaagccga atcgtcgggc cagggtggtc 540

gttctggggt tgcgcgatgt cgaggagatt tacagcctcc gcggctcgat ggagacactc 600

gccgcgcagc gggcggccac caatgccacc gacgcggacc tgcagaagat gcgcaaggtg 660

ctcgccaaga tggatgccgc gctggagggc caggacctag tcgagctcag tcgcctggac 720

gcggccttcc acgaccacat ctacgaggcg tcgagacatg accggctgta ccaggcctgg 780

gccgatttgc gctcccaggt gacgctgttt ctcatttcgc gcaacaccaa cgcggtgacc 840

tcgcgcgaca tcgtcatcgg cgagcacgaa gcgctgctgg aggcactcac cgcacgcgat 900

gccgatctgc tggtgcgcct cacggaggag caccttcggg gtgcttacga gcggctgcgg 960

gatgccttga tcatgtcgtc gcgggccaac gcgtgagctg gctcgaagcg gcgcatgggg 1020

cagtagccgt ctttcaaaac tgttaacact ttccgtcaaa ttgttgacag tttgcggacg 1080

cctctgtgag ggtggg 1096

<210> 3

<211> 748

<212> DNA

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 3

cgctgcgccc gagcaccacc cggcgcggcg cgaagttggt ggcggggggc gcgatcatct 60

tctcgcagat cgccgagctg acccgacccg cgatcgtcaa cggcgccccc ggggcggttg 120

cgatctcggg aagccgaccg atctcgctcg cggcgttcac ggtcgcccgc ggaaaggtcg 180

tggcgctcga catcctcacc gacccggacc gcctccacga cctcgacctg acgttcctcg 240

acgactgact ggaacgagcg ccaacggccc aacctccccc accccggacg gactccgagc 300

atgaccttcc ttaccggctc ccgacgattc attaaggatc gtcgacatct acggcttcgt 360

gatcgcggga ctgctgatcg gcgatgggcg ggcactctcg gcgaccggat cggccgccga 420

aagctgctgc tcgccggcgg ggcggccttc ggcgccgcgt cgctgctggc cgcgttcgcc 480

accagcgcgg agatgctgat cgtggcacgt gcgctgctcg ggatcacggg ggccgcgctg 540

ctgcctccga cgctttcgct gatcaataac atgtctctcg gggcgcaggc gacccggtgt 600

tcatcgccgg cgctatccag ttcttcgtcg tgcagtacct gcaactagtg ctgggaatgt 660

cgtcgttggt ggccgggttg tggacggttc cggtgatgct ggccgtcatc cccggaacgc 720

tcggggtccc tgcgctgacc cgccgcac 748

<210> 4

<211> 798

<212> DNA

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 4

atcccatctt tccggggtcg tctgtccact tgtgccgaga ccccgctttg tcgcaggggg 60

aggacatgtg ccctggtcgg gcgtcttatc ttgtgggggt cggtgctcag ttaccgctgc 120

cgaccggcgt tcatggcgcg gggtcacgcg ctcgggcgca tataccccct acacgtatat 180

ctgcactatg cctgggtcgc ggtttcaatt gaaactgtgg cccaccgggc ggtgtgcgcc 240

gggcggtgcc ggggcgagtg gttatcgatg gaatccgcta tcatcgtggt atgacgatga 300

atggtccgga ggagtgcccg tcgtccaggc cggcggcgga cgggttggat gcggcggtgg 360

cgttgttcca cagcttgtcg gacggcaccc ggttggcgat cacgcttcga ctggccgacg 420

gcgaagcccg ggtggcggac ctggtgggcg agctggggtt ggcccagtcc acggtgtcgg 480

cgcacgtggc gtgcctgcgg gactgcggac tggtggtcgg acggcccgag gggcggcaag 540

tgtactactc gctcgcgcga ccggagttgc tggaactgct ggcatcggcc gagacgctgc 600

tggccgcgac tggtcgggcc gtggccctat gcccgaacta cggcaccgac agcggtcccg 660

gccgagttgc gcaggtcgcc gaggtgcctg gtgagtgagg cggagaagtc gccggacggc 720

tgcggtgacg ggtgctgccc ggcatcggcg gagacgaatg ccggcctaag cgatgagcgt 780

cgggcggtgc tggggcgg 798

<210> 5

<211> 1162

<212> DNA

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 5

ggggcggtca gcgaatcggg tagggcgtag tacgagcgga accacaaccc ggctgaatcg 60

acaagcatca gaagaccagt cacagttcgc cagcttgtca cgtcctcgcc caccggtgtg 120

cacgacctgc cgggcaggcg cgtgccccat gccggggacc tcgacgatcc gggcccccgg 180

aatcggcgcg gtggcggatg cccggaattc gccaccgcgc ctcgtgtctc gaagccttga 240

caatacggca acaaggggca caatcaagca acaccagaca ttaaccggag gacaacgggc 300

atgtacgggg cggagcgcca gcagctgctg gcgcagcggg cacgacgcga cgggcgcatc 360

gacgtcaccg ccgcagcggc cgagttcgag gtggcacccg agaccatccg ccgtgatctc 420

gccgcgctcg aacgccaagg cctggtgcgg cgcgtctacg gcggcgccat cccggtcgag 480

cggctcgact tcgaacccgg ggtgtcgctg cgagaccaga ccaatgccag cgagaaggag 540

cgcatcgccc gcgccgcgct ggaccgggtg cccagccggg gcaccgtgct gctggacgcg 600

ggcaccacga ccgcgcggct ggcgggcctg ctgcccgccg accgcgagct gaccgtcgtc 660

accaactcac tgccggtggc caaccagctg gccacccgca acaactacaa cgtgcacctg 720

ctcggcgggc ggatccgcgg caccacgctg gcgacggttg agtcctgggc actcgacgtg 780

ctgcgcggcc tcaccatcga tgtggggttc ttcggcgcca acggcttctc ggccgcccgc 840

ggctgcacca ccccggaccc ggcggagtcc gcggtgaagg cggcgatggt ggccgcctgc 900

cgcaggcggg tgctgctggc cgaccacagc aagtacggcg acgaccagtt cagccggttc 960

gccgagctgt ccgagatcga cgtcgtggtg accgacgagg gcctcgacga ggcggcgctc 1020

ggcgagctcg aacagatcga agcggaagtg gtgctggcgt gatcgtgacc gtgacgccga 1080

acccgagcct ggaccgcacc gtccaggtgg accggctggt tccaggtgcg gtgcaccgag 1140

ccttccgggc gcacctggac cc 1162

<210> 6

<211> 197

<212> PRT

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 6

Met Ala Thr Gln Pro Met Ser Val Ala Pro Ser Val Gln Arg Ser Thr

1 5 10 15

Val Ser Pro Ala Ala Glu Glu Val Ala Trp Ala Pro Pro Thr Trp Asp

20 25 30

Glu Val Val Arg Gln His Ala Asp Arg Val Tyr Arg Leu Ala Tyr Arg

35 40 45

Leu Thr Gly Asn Gln His Asp Ala Glu Asp Leu Thr Gln Glu Thr Phe

50 55 60

Ile Arg Val Phe Arg Ser Leu Ala Ser Tyr Lys Pro Gly Thr Phe Glu

65 70 75 80

Gly Trp Leu His Arg Ile Thr Thr Asn Leu Phe Leu Asp Met Ala Arg

85 90 95

Arg Arg Ser Arg Leu Arg Met Glu Gly Leu Pro Glu Asp Ser Asp Arg

100 105 110

Leu Pro Gly Gly Gly Pro Ser Pro Glu Gln Val Phe Asn Asp Thr His

115 120 125

Leu Asp Pro Asp Leu Gln Thr Ala Leu Asp Glu Leu Pro Pro Glu Phe

130 135 140

Arg Ala Ala Val Val Leu Cys Asp Val Glu Gly Leu Ser Tyr Glu Glu

145 150 155 160

Ile Gly Ala Thr Leu Gly Val Lys Leu Gly Thr Val Arg Ser Arg Ile

165 170 175

His Arg Gly Arg Gln Met Leu Lys Ala Thr Leu Glu Ala Arg Arg Glu

180 185 190

His Pro Arg Glu Val

195

<210> 7

<211> 231

<212> PRT

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 7

Met Ala Pro Lys Pro Thr Met Ser Met Ser Lys Val Asp Ala Leu Pro

1 5 10 15

Leu Arg Glu Arg Val Val Ala Glu Ile Arg Glu Thr Ile Leu Thr Gly

20 25 30

Gln Val Glu Pro Gly Ala Ile Leu Pro Glu Thr Glu Leu Ala Asn Gln

35 40 45

Leu Gly Val Ser Arg Gly Pro Val Arg Asp Ala Leu Ala Thr Leu Glu

50 55 60

Arg Glu Gly Leu Val Thr Ser Lys Pro Asn Arg Arg Ala Arg Val Val

65 70 75 80

Val Leu Gly Leu Arg Asp Val Glu Glu Ile Tyr Ser Leu Arg Gly Ser

85 90 95

Met Glu Thr Leu Ala Ala Gln Arg Ala Ala Thr Asn Ala Thr Asp Ala

100 105 110

Asp Leu Gln Lys Met Arg Lys Val Leu Ala Lys Met Asp Ala Ala Leu

115 120 125

Glu Gly Gln Asp Leu Val Glu Leu Ser Arg Leu Asp Ala Ala Phe His

130 135 140

Asp His Ile Tyr Glu Ala Ser Arg His Asp Arg Leu Tyr Gln Ala Trp

145 150 155 160

Ala Asp Leu Arg Ser Gln Val Thr Leu Phe Leu Ile Ser Arg Asn Thr

165 170 175

Asn Ala Val Thr Ser Arg Asp Ile Val Ile Gly Glu His Glu Ala Leu

180 185 190

Leu Glu Ala Leu Thr Ala Arg Asp Ala Asp Leu Leu Val Arg Leu Thr

195 200 205

Glu Glu His Leu Arg Gly Ala Tyr Glu Arg Leu Arg Asp Ala Leu Ile

210 215 220

Met Ser Ser Arg Ala Asn Ala

225 230

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 8

Met Thr Phe Leu Thr Gly Ser Arg Arg Phe Ile Lys Asp Arg Arg His

1 5 10 15

Leu Arg Leu Arg Asp Arg Gly Thr Ala Asp Arg Arg Trp Ala Gly Thr

20 25 30

Leu Gly Asp Arg Ile Gly Arg Arg Lys Leu Leu Leu Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ala Phe Gly Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ala Phe Ala Thr Ser Ala Glu

50 55 60

Met Leu Ile Val Ala Arg Ala Leu Leu Gly Ile Thr Gly Ala Ala Leu

65 70 75 80

Leu Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ile Asn Asn Met Ser Leu Gly Ala Gln

85 90 95

Ala Thr Arg Cys Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser

100 105 110

Thr Cys Asn

115

<210> 9

<211> 135

<212> PRT

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 9

Met Thr Met Asn Gly Pro Glu Glu Cys Pro Ser Ser Arg Pro Ala Ala

1 5 10 15

Asp Gly Leu Asp Ala Ala Val Ala Leu Phe His Ser Leu Ser Asp Gly

20 25 30

Thr Arg Leu Ala Ile Thr Leu Arg Leu Ala Asp Gly Glu Ala Arg Val

35 40 45

Ala Asp Leu Val Gly Glu Leu Gly Leu Ala Gln Ser Thr Val Ser Ala

50 55 60

His Val Ala Cys Leu Arg Asp Cys Gly Leu Val Val Gly Arg Pro Glu

65 70 75 80

Gly Arg Gln Val Tyr Tyr Ser Leu Ala Arg Pro Glu Leu Leu Glu Leu

85 90 95

Leu Ala Ser Ala Glu Thr Leu Leu Ala Ala Thr Gly Arg Ala Val Ala

100 105 110

Leu Cys Pro Asn Tyr Gly Thr Asp Ser Gly Pro Gly Arg Val Ala Gln

115 120 125

Val Ala Glu Val Pro Gly Glu

130 135

<210> 10

<211> 253

<212> PRT

<213> 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)

<400> 10

Met Tyr Gly Ala Glu Arg Gln Gln Leu Leu Ala Gln Arg Ala Arg Arg

1 5 10 15

Asp Gly Arg Ile Asp Val Thr Ala Ala Ala Ala Glu Phe Glu Val Ala

20 25 30

Pro Glu Thr Ile Arg Arg Asp Leu Ala Ala Leu Glu Arg Gln Gly Leu

35 40 45

Val Arg Arg Val Tyr Gly Gly Ala Ile Pro Val Glu Arg Leu Asp Phe

50 55 60

Glu Pro Gly Val Ser Leu Arg Asp Gln Thr Asn Ala Ser Glu Lys Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Arg Ala Ala Leu Asp Arg Val Pro Ser Arg Gly Thr Val

85 90 95

Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Thr Ala Arg Leu Ala Gly Leu Leu Pro

100 105 110

Ala Asp Arg Glu Leu Thr Val Val Thr Asn Ser Leu Pro Val Ala Asn

115 120 125

Gln Leu Ala Thr Arg Asn Asn Tyr Asn Val His Leu Leu Gly Gly Arg

130 135 140

Ile Arg Gly Thr Thr Leu Ala Thr Val Glu Ser Trp Ala Leu Asp Val

145 150 155 160

Leu Arg Gly Leu Thr Ile Asp Val Gly Phe Phe Gly Ala Asn Gly Phe

165 170 175

Ser Ala Ala Arg Gly Cys Thr Thr Pro Asp Pro Ala Glu Ser Ala Val

180 185 190

Lys Ala Ala Met Val Ala Ala Cys Arg Arg Arg Val Leu Leu Ala Asp

195 200 205

His Ser Lys Tyr Gly Asp Asp Gln Phe Ser Arg Phe Ala Glu Leu Ser

210 215 220

Glu Ile Asp Val Val Val Thr Asp Glu Gly Leu Asp Glu Ala Ala Leu

225 230 235 240

Gly Glu Leu Glu Gln Ile Glu Ala Glu Val Val Leu Ala

245 250

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

gatgcccgtg gtggagatg 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

gcgtcgttgg ttcgtctcag 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

gacgccgatt gggtcttca 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

cgcactggtt acgcagggat 20

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

cccaagcttt cagttccccg gtggggcg 28

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

tgctctagat gcagacggcg ctggacgag 29

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

cccaagcttc ccaccctcac agaggcgtcc 30

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

tgctctagaa tgcccagagc ctcaccactg gt 32

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

cccaagcttc tagttgcagg tactgcacga cgaag 35

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

tgctctagac gctgcgcccg agcaccac 28

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

cccaagcttc gcccgacgct catcgctta 29

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

tgctctagag gtcgtctgtc cacttgtgcc g 31

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

cccaagcttg ggtccaggtg cgcccgg 27

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

tgctctagag gcggtcagcg aatcgggta 29

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

ataagaatgc ggccgcctag aagcccgacc cgagcacg 38

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

gggaattcca tatgatccta ccaaccggca cgattgtg 38

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

ataagaatgc ggccgcgcgc cgcctgacta gctgacc 37

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

ggaattccat atgccgggag gtttgacgaa tgacg 35

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

ggaattccat atgatgacct tccttaccgg ctcccg 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

ggaattccat atggtttaca atctggtgca tggcgc 36

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

ggaattccat atgtccgcta tcatcgtggt atgacgatg 39

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

ggaattccat atgcggagga caacgggcat gtacg 35

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

tgctctagag ttccccggtg gggcg 25

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

tgctctagat gcagacggcg ctggacgag 29

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

tgctctagac ccaccctcac agaggcgtcc 30

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

tgctctagaa tgcccagagc ctcaccactg gt 32

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

tgctctagac gcccgacgct catcgctta 29

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

tgctctagag gtcgtctgtc cacttgtgcc g 31

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

tgctctagag ggtccaggtg cgcccgg 27

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

tgctctagag gcggtcagcg aatcgggta 29

<210> 41

<211> 197

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

ggggacgtcc atgcgagtgt ccgttcgagt ggcggcttgc gcccgatgct agtcgcggtt 60

gatcggcgat cgcaggtgca cgcggtcgat cttgacggct ggcgagaggt gcggggagga 120

tctgaccgac gcggtccaca cgtggcaccg cgatgctgtt gtgggcacaa tcgtgccggt 180

tggtaggatc cagcgcc 197

Claims

1.一种多杀菌素生产菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

在出发菌株中，导入外源性的多杀菌素合成相关蛋白，其中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括如SEQ ID NO: 6和8所示的氨基酸序列的多肽的组合。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述多杀菌素合成相关蛋白还包括如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的多肽。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述多杀菌素合成相关蛋白还包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽。

4.一种多杀菌素生产菌株，其特征在于，所述菌株中包含外源性的多杀菌素合成相关蛋白，其中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括如SEQ ID NO: 6和8所示的氨基酸序列的多肽的组合。

5.如权利要求4所述的多杀菌素生产菌株的用途，其特征在于，用于产生多杀菌素和/或产生以多杀菌素为前体下游产物。

6.一种制备多杀菌素的方法，其特征在于，包括步骤：

1) 发酵培养权利要求4所述的多杀菌素生产菌株，从而得到多杀菌素；和

2) 任选从1)的发酵培养体系中获得多杀菌素。

7.一种赋予或增强菌株多杀菌素生产能力的方法，其特征在于，包括步骤：

8.一种多杀菌素合成相关蛋白或其基因的促进剂的用途，其特征在于，用于增强菌株的多杀菌素生产能力，其中，所述多杀菌素合成相关蛋白包括如SEQ ID NO: 6和8所示的氨基酸序列的多肽的组合。

9.多杀菌素合成相关蛋白组合、多杀菌素合成途径相关基因组合、表达盒、载体的用途，其特征在于，用于赋予或增强菌株多杀菌素生产能力，所述多杀菌素合成相关蛋白组合包括如SEQ ID NO: 6和8所示的氨基酸序列的多肽的组合，所述的基因组合含有编码所述多杀菌素合成相关蛋白组合中的多肽的多核苷酸，所述表达盒从5’-3’端依次含有红霉素启动子和多杀菌素合成相关蛋白的编码基因，其中所述多杀菌素合成相关蛋白包括如SEQID NO: 6和8所示的氨基酸序列的多肽的组合，所述的载体含有所述基因组合和/或所述的表达盒。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述菌株为刺糖多孢菌。

11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述多杀菌素合成相关蛋白还包括具有如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的多肽。

12.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述多杀菌素合成相关蛋白的编码基因还包括具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列的基因。