CN112830960A - 香蕉MuMADS1和MaMADS55互作在调控MaGWD1基因表达上的应用 - Google Patents

香蕉MuMADS1和MaMADS55互作在调控MaGWD1基因表达上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了香蕉MuMADS1和MaMADS55互作在调控MaGWD1基因表达上的应用。本发明首次采用香蕉转录因子MuMADS1和MaMADS55，能够与香蕉MaGWD1启动子区结合，与MaGWD1基因互作，且调控其表达。例如转录因子MuMADS1基因和/或转录因子MaMADS55基因与香蕉MaGWD1启动子导入香蕉果实中，可以显著促进MaGWD1基因的上调表达，采用转录因子MuMADS1基因和/或转录因子MaMADS55基因构建VIGS沉默系统，可以显著抑制MaGWD1基因表达，有效抑制淀粉含量降低，有效抑制葡聚糖‑水双激酶活性，同时有效抑制香蕉果实中果糖、葡萄糖、蔗糖等含量升高。

Description

香蕉MuMADS1和MaMADS55互作在调控MaGWD1基因表达上的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种香蕉MuMADS1和MaMADS55互作在调控MaGWD1基因表达上的应用。
背景技术
香蕉((Musa acuminata)在社会和农业经济的发展中起着核心作用。香蕉是全球重要的水果和经济作物，占全球新鲜水果产量的16％(Dale等人，2017)。而淀粉是香蕉果实的主要成分，一般情况下收获时香蕉果实中的淀粉含量可达到鲜重的20％至25％(DoNascimento等，2006)。香蕉是常见的淀粉转化型果实，收获后的香蕉果实成熟期间淀粉迅速降解并转化为可溶性糖，其转化效率直接影响水果的硬度、甜度和货架期等(Saraiva等，2013)。因此，阐明采后香蕉果实中淀粉降解的分子机制有助于揭示香蕉果实品质的形成和调控。
淀粉降解是一个复杂的过程，涉及关键酶基因的表达和转录因子(TFs)的转录调控。葡聚糖水二激酶(GWD)是淀粉代谢的第一个限速酶，它催化葡萄糖基残基的C6磷酸酯的形成并将ATP的末端c-磷酸基团转移到水中，形成正磷酸(Mahlow等人，2014年)。香蕉果实成熟过程中Musa acuminata glucan water dikinase 1葡聚糖水二激酶1(MaGWD1，Ma03_g15660)上调并与淀粉降解密切相关(Xiao等人，2018)，但其确切功能尚不明确。
尽管已分离出香蕉果实成熟过程中涉及淀粉降解和调控的一些基因和转录因子，但仅鉴定到一个调控网络并由转录因子介导。MADS-box是重要的转录因子家族，它们通过蛋白质-蛋白质相互作用来调节植物的生长和发育，并直接与靶基因启动子中的CA/T(r)G框结合(Martel等，2011；Vrebalov等，2009；Itkin等，2009)。MuMADS1(也是MaMADS36，Ma05_t18560.1)和MaMADS55(Ma09_t21260.1)是两个MADS-box家族基因，在香蕉果实成熟期间高表达，并可能调节淀粉降解和果实品质(Liu等人，2009；2015a；2017)；2018)。然而MuMADS1转录因子和MaMADS55转录因子是否能够与MaGWD1基因互作并调控其表达，目前还未见报道。因此，开展MuMADS1转录因子、MaMADS55转录因子和MaGWD1基因的研究，对增进了我们对香蕉果实淀粉降解调控网络的理解，改善香蕉果实品质具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供香蕉MuMADS1和MaMADS55互作在调控MaGWD1基因表达上的应用。
本发明的第一个方面是提供转录因子MuMADS1和MaMADS55、或者转录因子MuMADS1基因和MaMADS55基因、或者含有转录因子MuMADS1基因的重组载体和含有转录因子MaMADS55基因的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶(GWD)活性中的应用。
本发明的第二个方面是提供转录因子MuMADS1、或者转录因子MuMADS1基因、或者含有转录因子MuMADS1基因的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶(GWD)活性中的应用。
优选地，转录因子MuMADS1与转录因子MaMADS55互作、或者转录因子MuMADS1基因与转录因子MaMADS55基因互作、或者含有转录因子MuMADS1基因的重组载体和含有转录因子MaMADS55基因的重组载体互作来调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶(GWD)活性。
本发明的第三个方面是提供转录因子MaMADS55、或者转录因子MaMADS55基因、或者含有转录因子MaMADS55基因的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶(GWD)活性中的应用。
优选地，转录因子MaMADS55与转录因子MuMADS1互作、或者转录因子MaMADS55基因与转录因子MuMADS1基因、或者含有转录因子MaMADS55基因的重组载体与含有转录因子MuMADS1基因的重组载体互作来调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控GWD酶(葡聚糖-水双激酶)活性。
本发明的第四个方面是提供一种香蕉MaGWD1启动子，其核苷酸序列图SEQ IDNO.1所示。
本发明的第五个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第四个方面所述的香蕉MaGWD1启动子。
其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pGreenII 0800载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
本发明的第六个方面是提供如本发明第四个方面所述的香蕉MaGWD1启动子、或者本发明第五个方面所述的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶(GWD)活性中的应用。
其中，第四个方面所述的香蕉MaGWD1启动子与转录因子MuMADS1和/或转录因子MaMADS55互作，促进MaGWD1基因的上调表达。
本发明的第七个方面是提供一种VIGS沉默系统，其特征在于，所述VIGS沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒pTRV1，所述表达病毒载体为含有转录因子MuMADS1基因的烟草脆裂病毒pTRV2和/或含有转录因子MaMADS55基因的烟草脆裂病毒pTRV2。
优选地，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:3。
优选地，如果表达病毒载体为含有转录因子MuMADS1基因的烟草脆裂病毒pTRV2和含有转录因子MaMADS55基因的烟草脆裂病毒pTRV2，则含有转录因子MuMADS1基因的烟草脆裂病毒pTRV2和含有转录因子MaMADS55基因的烟草脆裂病毒pTRV2的比例为1:1。
本发明的第八个方面是提供如本发明第七个方面所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉MaGWD1基因表达、和/或抑制香蕉果实总淀粉含量降低、和/或抑制香蕉果实中蔗糖含量上升、和/或抑制香蕉果实中葡萄糖含量上升、和/或抑制香蕉果实中果糖含量上升、和/或抑制葡聚糖-水双激酶(GWD)活性中的应用。
本发明的第九个方面是提供一种抑制香蕉果实中MaGWD1基因表达的方法，其特征在于，采用本发明第七个方面所述的VIGS沉默系统转染香蕉果实。
优选地，将香蕉果实浸没在含有权利要求7所述VIGS沉默系统的菌液中，采用真空渗透的方式侵染香蕉果实。
优选地，含有权利要求7所述VIGS沉默系统的菌液OD600浓度为0.8。
优选地，侵染时间为15min-30min。
优选地，侵染后香蕉果实培育温度为23℃。
本发明首次采用香蕉转录因子MuMADS1和MaMADS55，能够与香蕉MaGWD1启动子区结合，与MaGWD1基因互作，调控其表达，例如将转录因子MuMADS1基因和/或转录因子MaMADS55基因与香蕉MaGWD1启动子导入香蕉果实中，可以显著促进MaGWD1基因的上调表达，，又例如，采用转录因子MuMADS1基因和/或转录因子MaMADS55基因构建VIGS沉默系统，能够有效沉默MaGWD1基因，抑制其表达，并有效抑制香蕉果实淀粉的降解，有效抑制葡聚糖-水双激酶(GWD)活性，同时有效抑制香蕉果实中果糖、葡萄糖、蔗糖等含量升高。本发明增进了我们对香蕉果实淀粉降解调控网络的理解，为控制香蕉或其他植物果实淀粉降解提供了研究思路和技术依据，并为改善香蕉或其他植物果实品质提供了理论基础。
附图说明
图1为MuMADS1和MaMADS55与MaGWD1启动子的结合分析。A，酵母单杂交载体构建示意图；B，酵母单杂交互作验证结果，图中MaGWD1-promoter-Y1H为用来做Y1H的转化AbAi载体的MaGWD1启动子，AD+Empty为pGADT7空载体，AD+MuMADS1为含MuMADS1的pGADT7，AD+MaMADS55为含MaMADS55 pGADT7。
图2为MuMADS1和MaMADS55复合体对于MaGWD1的转录调控作用。A，双荧光素报告系统载体构建示意图；B，双荧光素报告系统检测结果；C，效应子和报告子载体构建示意图；D，效应子和报告子共转化香蕉果实薄片后启动GUS表达分析；E，GUS活性分析结果。图中，PSK为pGreenII 62-SK空载体，D1为MaGWD1启动子取代35S启动子的pBI121报告载体pBI121-MaGWD1(对照组)，D2为pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MuMADS55，D3为pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MuMADS1，D4为pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MuMADS55+pCAMBIA1304-MuMADS1。
图3为MuMADS1和MaMADS55的功能分析。A，VIGS瞬时沉默香蕉果实薄片中的MuMADS1和MaMADS55后I2-KI染色分析；B，I2-KI染色后果实薄片的可溶性糖含量分析；C，VIGS瞬时沉默香蕉果实薄片的总淀粉含量分析；D，VIGS瞬时沉默香蕉果实薄片的GWD(葡聚糖-水双激酶)活性分析；E，内源MuMADS1、MaMADS55和MaGWD1基因的表达分析。图中M55代表该处理组为TRV2-MaMADS55+TRV1侵染组，M55-1、M55-2、M55-3分别代表该处理组中的三次重复；M1代表该处理组为TRV2-MuMADS1+TRV1侵染组，M1-1、M1-2、M1-3分别代表该处理组中的三次重复；M55+M1代表该处理组为TRV2-MaMADS55+TRV2-MuMADS1+TRV1共同侵染组，M55+M1-1、55+M1-2、M55+M1-3分别代表处理组中的三次重复，M55量表示MaMADS55基因相对表达量，M1量表示MuMADS1基因相对表达量，MaGWD1量表示MaGWD1基因相对表达量。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1实验材料
(1)香蕉(M.acuminata L.AAA group cv Brazilian)取自热带生物技术研究所(中国海南省清迈市20N，110E)香蕉种植园，收获后立即运至实验室。选择健康的中果梳并将其分成单个果指，选取完整无损伤的果指使用浓度为0.1％次氯酸钠进行表面杀菌10分钟后将其晾干，存放于相对湿度80％的22°培养箱中备用。挑选成熟度相近且果型较直的果指，将其切成2至4毫米厚的切片，用于后续VIGS实验。
(2)基因的获得
1、香蕉转录因子MuMADS1基因(Ma05_t18560.1基因ID号)的获得
以香蕉cDNA为模板，以MuMADS1p1:ATGGGAAGGGGTAAGATTGA，MuMADS1p2:CGCCGCTGAATCCGCCTTGG为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为705bp的序列，测序结果表明其与基因组序列一致。
2、香蕉转录因子MaMADS55基因(Ma09_t01340.1基因ID号)的获得
以香蕉cDNA为模板，以MaMADS55p1:ATGGGGAGGGGGAGAGTGG，MaMADS55p2:AGCAAGCCATCCTGGCACG为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为729bp的序列，测序结果表明其与基因组序列一致。
3、香蕉MaGWD1基因启动子的获得
以香蕉DNA为模板，以MaGWD1promoter p1:GGCTTGATCCGAATCCATTTG，MaGWD1promoter p2:GGAGGGAGAGAAAGAGAGCGA为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为1,944bp的序列，其序列如SEQ IDNo.1所示。
一、酵母单杂交实验
使用Matchmaker酵母单杂交系统进行酵母单杂交试验。我们克隆了1,944bp长的MaGWD1启动子，经EcoRI和SalI酶切位点双酶切、琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.TM GelExtraction Kit,OMEGA)回收、T4-DNA连接酶16℃连接，将其连在报告基因AUR1-C的上游，该基因是来自酵母菌株pAbAi的抗生素抗性基因，可赋予对金担子素A的抗性(Xiao等，2013)。将构建好的载体质粒(下文用pAbAi-MaGWD1表示)线性化后转化至Y1H Gold感受态，涂布于含不同浓度AbA抗生素的SD/-Ura固体培养基上，用于筛选AbA浓度。
将转录因子MuMADS1基因经过无缝克隆、Nimble Mix酶37℃连接，构建于猎物载体pGADT7(下文用pGADT7-MuMADS1)，将转录因子MaMADS55基因经过经无缝克隆、Nimble Mix酶37℃连接，构建于猎物载体pGADT7(下文用pGADT7-MaMADS55表示)。然后pAbAi-MaGWD1与pGADT7-MuMADS1共转化Y1H酵母细胞，pAbAi-MaGWD1与pGADT7-MaMADS55共转化Y1H酵母细胞，在含有金担子素A的SD/-Leu培养基上在29℃下培养3天。
结果见图1。通过构建转录因子MuMADS1基因于猎物载体pGADT7 AD，MaMADS55基因于猎物载体pGADT7 AD，MaGWD1启动子于诱饵载体pAbAi，然后将pAbAi-MaGWD1与pGADT7-MaMADS55共转化Y1H酵母细胞，pAbAi-MaGWD1与pGADT7-MuMADS1共转化Y1H酵母细胞，结果显示，当pAbAi-MaGWD1分别与pGADT7-MuMADS1和pGADT7-MaMADS55共转化时，在金担子素A存在的情况下，酵母细胞生长良好；相反当pAbAi-MaGWD1与空的pGADT7-AD质粒共转化时，酵母细胞不生长(图1B)。这些结果表明MuMADS1和MaMADS55能够与MaGWD1启动子互作，直接靶向结合MaGWD1基因。
二、双荧光素酶报告实验
为了探究MuMADS1和MaMADS55与MaGWD1启动子的结合活性，我们将MaGWD1启动子经过BamHI/SalI酶切位点双酶切、琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.TM Gel ExtractionKit,OMEGA)回收、T4-DNA连接酶16℃连接，插入pGreenII 0800-LUC双重报告载体作为报告子(下文用pGreenII 0800-MaGWD1表示)(Hellens等，2005)。后将MuMADS1基因经过NotΙ/BbaΙ酶切位点双酶切、琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit,OMEGA)回收、T4-DNA连接酶16℃连接，插入载体pGreenII 62-SK中构建效应子(下文用pGreenII62SK-MuMADS1表示)，将MaMADS55基因经过NotΙ/BbaΙ酶切位点双酶切、琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit,OMEGA)回收、T4-DNA连接酶16℃连接，插入载体pGreenII 62-SK中构建效应子(下文用pGreenII 62SK-MaMADS55表示)。将所得效应子和报告子共渗入烟草叶片中培养48小时后，使用双荧光素酶检测试剂盒(美国Promega)和Luminoskan Ascent微孔板光度计(Thermo Fisher Scientific)测量LUC和REN荧光素酶的活性。根据LUC/REN的比值评估MuMADS1和MaMADS55对于MaGWD1启动子的转录激活能力。对于每种组合，我们采用六个生物学重复。
结果见图2。将MuMADS1基因和MaMADS55基因分别构建到pGreenII 62SK效应载体中，将MaGWD1启动子构建到pGreenII 0800报告载体中(图2A)，然后将pGreenII 62SK-MuMADS1+pGreenII 0800-MaGWD1(比例5:1)，pGreenII 62SK-MaMADS55+pGreenII0800-MaGWD1(比例5:1)和pGreenII 62SK-MuMADS1+pGreenII 62SK-MaMADS55+pGreenII 0800-MaGWD1(比例5:5:2)分别转化烟草，pGreenII 62SK用作阴性对照。结果表明，pGreenII62SK-MuMADS1+pGreenII 0800-MaGWD1的荧光素酶(LUC)/海肾荧光素酶(REN)的比值为3.47，是CK-(0.95)的3.69倍；pGreenII 62SK-MaMADS55+pGreenII 0800-MaGWD1的LUC/REN比为3.61，是CK-的3.80倍。；pGreenII 62SK-MuMADS1+pGreenII 62SK-MaMADS55+pGreenII0800-MaGWD1的LUC/REN比为7.28，是CK-的7.66倍(图2B)。这些结果表明MuMADS1和MaMADS55可以分别结合MaGWD1启动子来诱导LUC的过表达，不仅如此MuMADS1还可以与MaMADS55协同调节MaGWD1启动子以增加LUC表达，说明MuMADS1和MaMADS55的表达可促进MaGWD1基因上调表达，且MuMADS1和MaMADS55的协同表达产生的促进MaGWD1基因上调表达的效果更加佳。
三、GUS染色分析
将MuMADS1基因经过无缝克隆、Nimble Mix酶37℃连接，插入pCAMBIA1304载体来构建效应子(下文用pCAMBIA1304-MuMADS1表示)，将MaMADS55基因经过经无缝克隆、NimbleMix酶37℃连接，插入pCAMBIA1304载体来构建效应子(下文用pCAMBIA1304-MaMADS55表示)，用农杆菌介导法将pBI121的35S启动子替换为MaGWD1启动子构建报告子(下文用pBI121-MaGWD1表示)，将上述所得的效应子和报告子共转化香蕉果实切片。根据Jefferson(1987)方法，将香蕉果实切成形状和厚度大致相同的薄片，浸泡于0.5％次氯酸钠溶液中15min备用。将农杆菌菌液重悬至OD600＝0.6-0.8，加入150μmol/L乙酰丁香酮(AS)，室温暗处静置孵育2-3h，将适量的香蕉薄片放入孵育好的菌液中，进行真空辅助侵染，再将香蕉薄片均匀放置于1/2MS固体培养基上28℃暗培养3天，每组重复三次。选取大小相近的薄片置于离心管中，采用GUS染色试剂盒(Real-Times，China)进行侵染，测定GUS活性。
结果见图2。将MuMADS1基因和MaMADS55基因分别构建到植物表达载体pCAMBIA1304中，并将MaGWD1启动子取代35S启动子构建到pBI121载体中用作报告载体(图2C)，然后将pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MuMADS1(比例1:4)，pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MaMADS55(比例1:4)和pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MuMADS1+pCAMBIA1304-MaMADS55(比例1:2:2)共转化香蕉果实切片，空报告载体为对照。结果显示，对照组GUS活性为3.13pmol 4-MUG.min-1.μg-1，pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MuMADS1共侵染香蕉果实切片实验组GUS活性为4.65pmol 4-MUG.min-1.μg-1，pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MaMADS55共侵染香蕉果实切片实验组GUS活性为4.81pmol 4-MUG.min-1.μg-1，pBI121-MaGWD1+pCAMBIA1304-MuMADS1+pCAMBIA1304-MaMADS55共侵染香蕉果实切片实验组GUS活性为8.27pmol 4-MUG.min-1.μg-1，与单独使用MaGWD1启动子与pCAMBIA1304-MuMADS1、单独使用MaGWD1启动子与pCAMBIA1304-MaMADS55相比，将MaGWD1启动子与pCAMBIA1304-MuMADS1+与pCAMBIA1304-MaMADS55共侵染香蕉果实切片实验组中的GUS染色最深且GUS活性最高(图2D和2E)。这些结果表明MuMADS1和MaMADS55可以调控MaGWD1的表达；此外，MuMADS1和MaMADS55互作大大增强了对于MaGWD1转录调控作用。说明MuMADS1和MaMADS55可促进MaGWD1基因上调表达，且MuMADS1和MaMADS55的协同表达产生的促进MaGWD1基因上调表达的效果更加佳。
四、病毒介导的基因沉默(VIGS)
烟草脆裂病毒载体(pTRV:pTRV1和pTRV2)由海南大学施海涛老师馈赠。以香蕉cDNA为模板进行PCR，将MuMADS1基因经过KpnΙ/SmaΙ酶切位点双酶切、琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit,OMEGA)回收、T4-DNA连接酶16℃连接，插入pTRV2载体来构建病毒载体(下文用pTRV2-MuMADS1表示)；将MaMADS55基因经过KpnΙ/SmaΙ酶切位点双酶切、琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit,OMEGA)回收、T4-DNA连接酶16℃连接，插入pTRV2载体来构建病毒载体(下文用pTRV2-MaMADS55表示)。
将pTRV1、pTRV2、pTRV2-MuMADS1和pTRV2-MaMADS55转化农杆菌菌株GV3101，28℃培养2天后挑取单克隆做PCR验证，得到含有pTRV1的农杆菌GV3101(pTRV1菌)、含有载体pTRV2的农杆菌GV3101(pTRV2菌)、含有载体pTRV2-MuMADS1的农杆菌GV3101(pTRV2-MuMADS1菌)和含有载体pTRV2-MaMADS55农杆菌GV3101(pTRV2-MaMADS55菌)。阳性克隆使用添加Rif/Kan抗生素的YEP液体培养基28℃培养至OD600值为0.8，使用侵染缓冲液(10mmol/LmgCl2、10mmol/L MES、200μmol/L乙酰丁香酮)重悬，然后将pTRV2菌的重悬液与pTRV1的重悬液以3：1的比例混合作为CK，将pTRV2-MuMADS1菌的重悬液与pTRV1的重悬液以3：1的比例混合(下文用pTRV1+pTRV2-MuMADS1表示)，将pTRV2-MaMADS55菌的重悬液与pTRV1的重悬液以3：1的比例混合(下文用pTRV1+pTRV2-MaMADS55表示)，将pTRV2-MuMADS1菌的重悬液、pTRV2-MaMADS55菌的重悬液与pTRV1的重悬液以1.5:1.5:1的比例混合(下文用pTRV1+pTRV2-MuMADS1+pTRV2-MaMADS55表示)，调OD600值至0.8。将香蕉果实切成厚度大致为2-4mm的薄片，浸泡于0.5％次氯酸钠溶液中15min备用，在600mmHg下将香蕉果实切片完全浸入重悬液真空侵染15min-30min。释放真空后，将果实切片放置在Murashige&Skoog(MS)培养基中于23℃培养3d。我们在每种处理中对香蕉果实切片进行采样，以进行I2-KI染色，基因表达以及生理指标分析。
(1)I2-KI染色
将处理过的香蕉果实切片浸入0.5％I2-KI溶液中染色150s。将染色的果实切片用去离子水洗涤并立即用滤纸吸干多余的水分使用Nikon Eclipse ci(日本尼康)进行图片采集，并使用Pannoramic DESK(匈牙利Panoramic)进行扫描。
结果见图3，与CK相比，pTRV1+pTRV2-MaMADS55和pTRV1+pTRV2-MuMADS1转化体中的I2-KI染色较深，但pTRV1+pTRV2-MuMADS1+pTRV2-MaMADS55实验组的染色最深(图3A)。该结果表明，MuMADS1和MaMADS55均可抑制淀粉降解，但MuMADS1和MaMADS55的共转化产生的抑制淀粉降解的效果最佳。
(2)荧光定量PCR
使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen，DP441，北京，中国)和不含RNase的DNase(NEB，M0303S，美国)提取侵染过的香蕉果实切片中总RNA。使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA，并以1:50的比例进一步稀释20μL，并使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)进行反转录。在Stratagene Mx3000P Real-TimePCR系统上，采用
Figure BDA0002938524870000101
Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa)，通过2–ΔΔCt的方法(Livak和Schmittgen，2001)通过qRT-PCR分析进行定量。使用MaRPS2(HQ853246)和MaUBQ2(HQ853254)作为内参(Chen等，2011)。
结果见图3。在pTRV1+pTRV2-MaMADS55转化实验组中内源性MaMADS55的表达被抑制，相对于CK降低了0.56，MuMADS1的表达也稍有降，相对于CK降低了0.03，重要的是内源性MaGWD1的表达也被抑制，相对于CK降低了0.15。在pTRV1+pTRV2-MuMADS1转化实验组中内源性MaMADS55的表达被抑制，相对于CK降低了0.21，MuMADS1的表达也被显著抑制，相对于CK降低了0.54，重要的是内源性MaGWD1的表达也被显着抑制，相对于CK降低了0.46。在pTRV1+pTRV2-MuMADS1+pTRV2-MaMADS55转化实验组中内源性MaMADS55的表达被抑制，相对于CK降低了0.67，MuMADS1的表达也被显著抑制，相对于CK降低了0.64，重要的是内源性MaGWD1的表达也被显著抑制，相对于CK降低了0.73(图3E)。这些结果表明MaMADS55和MuMADS1可以协同调控MaGWD1的表达。
(3)生理指标测定
按照Miao等人的方法检测总淀粉含量(2014)。根据Hou等人的方法测量葡聚糖-水双激酶(GWD)活性(2017)。使用高效液相色谱(HPLC；Waters，Milford，CT，USA)(Duarte-Delgado et al.，2015)分析可溶性糖(果糖，葡萄糖和蔗糖)的含量。所有实验重复三次，所有数据均表示为三个或六个独立生物学重复的平均值±标准误差(S.E.)。样本间的统计学差异采用t检验进行评估(p<0.05)。
结果见图3。pTRV1+pTRV2-MaMADS55，pTRV1+pTRV2-MuMADS1和pTRV1+pTRV2-MuMADS1+pTRV2-MaMADS55转化实验组的蔗糖含量分别为12.46mg.g-1FW、8.50mg.g-1FW、5.18mg.g-1FW与CK组22.52mg.g-1FW相比分别为降低了44.7％、62.3％和77.0％，葡萄糖含量分别为4.88mg.g-1FW、4.10mg.g-1FW、2.12mg.g-1FW，与CK组5.62mg.g-1FW相比分别为降低了13.2％、27.0％和62.3％，果糖含量分别为4.35mg.g-1FW、3.62mg.g-1FW、2.82mg.g-1FW，与CK组5.16mg.g-1FW相比分别为降低了15.7％、29.8％和45.3％(图3B)。
相反地，pTRV1+pTRV2-MaMADS55，pTRV1+pTRV2-MuMADS1和pTRV1+pTRV2-MuMADS1+pTRV2-MaMADS55转化实验组的总淀粉含量分别为405.11mg.g-1FW、516.08mg.g-1FW和675.45mg.g-1FW，相对于CK 385.64分别增加了5.0％，33.8％和75.2％。
pTRV1+pTRV2-MaMADS55，pTRV1+pTRV2-MuMADS1和pTRV1+pTRV2-MuMADS1+pTRV2-MaMADS55实验组的GWD(葡聚糖-水双激酶)活性分别为2.82nmol min-1mg-1、2.84nmol min- 1mg-1、2.10nmol min-1mg-1，相对于CK组3.61nmol min-1mg-1分别显着降低了21.9％，21.3％和41.8％(图3D)。
这些结果均表明MaMADS55和MuMADS1通过调节MaGWD1的表达来共同调节淀粉降解。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 香蕉MuMADS1和MaMADS55互作在调控MaGWD1基因表达上的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1944
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ggcttgatcc gaatccattt ggcatcaaaa cgaatcctca attatttttt tcttcttctt 60
catcttctct ctctttattc atttttcttc gcgtgcgcca aagccatttc ctctttctcc 120
tcttattatt ttccttttta tctttccttt ccgcttcttc ttcgcgtcgt ttgtcctttt 180
cttctcttta attccctctt ctgctttgtt gctctctctc tctctctctc tttcttccct 240
ccacttccct cttctttctt tcttttggat cactttttta tgatttaatc cctataattt 300
ttttatttat aatcaattcc tttgctaaaa ttagaaatat aatatttatt atgatatcct 360
aattaatcaa atcagaagtg aactaagatt gatttattat gaatatacca tgttaatatc 420
aatttaaata ttttgaataa tagtttcgac ttaataaagt taacaagtca atgaccccat 480
tagatcggat cataataatt aatattataa ttgattaaat attgaggcat gatgaaaaat 540
tgaagtaaga aaaatttatt cgtacaaaag acatttcaca tcactagaga gatcgtaagt 600
tatgccttac atgcatcaca tagtagagtc atcactgtct tacatgcata atattttgaa 660
tttgatagat gttatattaa atcttaacaa aaatatcaaa tatttaagta gaagagatta 720
taatatctca attagtctca cattcaaaat aaaattatta acttaagttt aaatattttt 780
aaccaagaat cacttatctc attagatgag attgtgatac agtgacacta attttccaaa 840
cttcattctt ctcgttagat atatcatccc atgactactt taataccaag ttaaatatga 900
ttctaaattt cttttttacg taatccgatt tattttccaa cgagaacatc atgttcgttc 960
aaagagtcca agtttcctgc ggaaacccaa acaaatagta ggctaaagaa aagaacacaa 1020
agtaagcgag tgagataagc gagcgcccga cataattatc tatcgtcttt tcttgcggaa 1080
tggcgggcga gcgggaatcg cttccgtggt aagcaagtaa gtgtcccttc ttagcttagc 1140
ccacagtggc gtccaccgcc accccgttat cacctttgtt tctttctttg ggttgtgggt 1200
ccgccgccca tgggaatttg cccaaagact ggaccttcca acgacacccc atctctctat 1260
gcatttagag aagctaagtg cgaggaataa cgagccttgt tcttggaaca agcgccattg 1320
cagatggggt gaggagcgat ggtttacatg ctaactcaga tgtatctcgg attcgaattt 1380
gtcggatcaa ttattttaat taacctgaat tttctttttt cctgtcataa ttatcaagtg 1440
gtctgtataa ggcactcatt cgatatcgat agatgttctt ctacccttcc ccccacttgc 1500
acaaatatca cggatagtca caaccttccc gtgccgtgcc tcccacccct cgtataacaa 1560
tctaatcaca tgatggtgtg tggccgccat cattctctcc caagcaacca cgtgtaaaca 1620
aaaatatcac gctaagactc ctctattgtc gatcatcctt acggtggggc tctccttaac 1680
ttactcgtgt ccagaaccag cacctcatcc tcacacacca acacaccatt ctcttccact 1740
accagcacac cacgtggtaa atccggttca ctccgccctg gcatcctgag gtcgtccagg 1800
aaccagggat gtccctccaa cgaaagtatg ctacgtgagc cgtaccaccc ggttctagtc 1860
acgtgcgtga tcggggcgtt gatcttttcc ccgcctctct ctctctctct ctctctctct 1920
atctcgctct ctttctctcc ctcc 1944

Claims (10)

1.转录因子MuMADS1和MaMADS55、或者转录因子MuMADS1基因和MaMADS55基因、或者含有转录因子MuMADS1基因的重组载体和含有转录因子MaMADS55基因的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶活性中的应用。
2.转录因子MuMADS1、或者转录因子MuMADS1基因、或者含有转录因子MuMADS1基因的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶活性中的应用。
3.转录因子MaMADS55、或者转录因子MaMADS55基因、或者含有转录因子MaMADS55基因的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶活性中的应用。
4.一种香蕉MaGWD1启动子，其特征在于，其核苷酸序列图SEQ ID NO.1所示。
5.一种重组载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求4所述的香蕉MaGWD1启动子。
6.如权利要求4所述的香蕉MaGWD1启动子、或者权利要求5所述的重组载体在调控香蕉MaGWD1基因表达、和/或调控香蕉果实总淀粉含量、和/或调控香蕉果实中蔗糖含量、和/或调控香蕉果实中葡萄糖含量、和/或调控香蕉果实中果糖含量、和/或调控葡聚糖-水双激酶活性中的应用。
7.一种VIGS沉默系统，其特征在于，所述VIGS沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒pTRV1，所述表达病毒载体为含有转录因子MuMADS1基因的烟草脆裂病毒pTRV2和/或含有转录因子MaMADS55基因的烟草脆裂病毒pTRV2；
优选地，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:3；
优选地，如果表达病毒载体为含有转录因子MuMADS1基因的烟草脆裂病毒pTRV2和含有转录因子MaMADS55基因的烟草脆裂病毒pTRV2，则含有转录因子MuMADS1基因的烟草脆裂病毒pTRV2和含有转录因子MaMADS55基因的烟草脆裂病毒pTRV2的比例为1:1。
8.如权利要求7所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉MaGWD1基因表达、和/或抑制香蕉果实总淀粉含量降低、和/或抑制香蕉果实中蔗糖含量上升、和/或抑制香蕉果实中葡萄糖含量上升、和/或抑制香蕉果实中果糖含量上升、和/或抑制葡聚糖-水双激酶活性中的应用。
9.一种抑制香蕉果实中MaGWD1基因表达的方法，其特征在于，采用权利要求7所述的VIGS沉默系统转染香蕉果实。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，，将香蕉果实浸没在含有权利要求7所述VIGS沉默系统的菌液中，采用真空渗透的方式侵染香蕉果实；
优选地，含有权利要求7所述VIGS沉默系统的菌液OD600浓度为0.8；
优选地，侵染时间为15min-30min；
优选地，侵染后香蕉果实培育温度为23℃。
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