CN111321166A - 一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法及vigs沉默系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法，采用VIGS沉默系统转染香蕉果实，VIGS沉默系统包括烟草脆裂病毒pTRV1和含有SEQ ID NO.1所示序列的烟草脆裂病毒pTRV2。本发明首次实现了香蕉果实淀粉降解相关基因VIGS沉默系统的构建，能够有效沉默香蕉果实淀粉降解相关基因。本发明还进一步明确了菌液浓度、辅助病毒载体和表达病毒载体的比例、培养温度、侵染时间等条件，为成功沉默基因掌控好每个技术环节，有效抑制香蕉果实总淀粉和直链淀粉含量降低以及果糖、葡萄糖、蔗糖等含量升高。本发明为香蕉果实淀粉降解相关基因的功能验证奠定了良好的基础，为控制香蕉或其他植物果实淀粉降解提供了研究思路和技术依据。

Description

一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法及VIGS沉默系统

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法及VIGS沉默系统。

背景技术

香蕉是热带、亚热带地区重要的经济作物，是仅次于柑橘的世界第二大水果。淀粉作为香蕉果实中的主要组成成分，又促使其被联合国粮农组织(FAO)认定为仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物，是超过4亿人的口粮(Englberger et al.,2006)。然而，随着香蕉产业的快速发展和人们生活水平的迅速提高，对香蕉果实品质的要求也越来越高。然而香蕉主栽品种多为三倍体，难以通过传统育种方式获得品质优良的新品种。当无性繁殖的香蕉栽培种缺少有利的自然变异时，转基因就成为了外源基因导入香蕉实现品质改良的有效手段。可是由于香蕉这种作物的特殊性以及香蕉遗传转化的难度，在香蕉中鉴定品质相关基因的功能并获得品质改良的香蕉果实需要3-5年甚至更长的时间。随着生物技术的快速发展，将现代生物技术运用于香蕉品质改良中，可以解决一些用常规方法难以解决的问题。

病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)属于转录后的基因沉默，是植物体内存在的一种防御病毒入侵的自然机制。它指携带植物功能基因cDNA片段的重组病毒，在侵染植物体后诱导植物发生基因沉默而出现表型突变，可以通过植物表型或生理指标上的变化来快速反映该基因的功能。VIGS是20世纪90年代新兴的一种技术，发展迅速，已广泛应用于生物学诸多领域的研究。病毒诱导的基因已经在多种果蔬上应用，如温小红以‘澳洲青萍’果实为材料，探究了乙烯转录因子对果实的成熟衰老的影响沉默基因并且对沉默后果肉呈现的表型变化进行了解释；宋恬利用基因沉默的方法对扁桃的花器官进行了沉默，以及对其表型进行初步分析，探索了低温条件下对花药发育器官的调控；洪敏利用VIGS干扰枇杷果实中PSY基因的表达，探究了PSY基因在枇杷果实类胡萝卜素积累过程中的调控作用；台德强以观赏海裳变色叶品种‘紅花’为试验材料，建立VIGS体系，测定并分析花色菩等类黄酌物质含量及花色普相关基因表达量，并优化了在组培苗、幼果中沉默环境条件；戴文珊利用病毒介导的基因沉默技术获得了FcWRKY40金柑沉默材料并且阐述了此基因在植物盐胁迫抗性中起正调控作用；此外，VIGS这一技术也在葡萄、樱桃有应用。与传统的基因功能验证手段相比，病毒诱导的基因沉默具有时间短，速度快，高通量，不需要依赖于稳定的遗传转化，并且提供了沉默一个基因家族单个或者多个基因的潜力等优势。但未在香蕉中得到应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种基于VIGS沉默系统抑制香蕉果实淀粉降解的方法及VIGS沉默系统，能够有效沉默香蕉果实淀粉降解相关基因，可有效抑制香蕉果实淀粉的降解，抑制香蕉果实中果糖、葡萄糖、蔗糖等产生。

本发明的第一个方面是提供一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法，采用VIGS沉默系统转染香蕉果实，其中，所述VIGS沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒pTRV1，所述表达病毒载体为含有目的基因DNA片段的烟草脆裂病毒pTRV2，所述目的基因DNA片段如序列表中SEQ ID NO.1所示序列。

优选地，所述VIGS沉默系统中辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:(1-3)，更优选为1:(2-3)。

优选地，所述方法包括以下步骤：

将香蕉果实浸没在含有本发明第一个方面所述VIGS沉默系统的菌液中，采用真空渗透的方式侵染香蕉果实；将侵染的果实放置于黑暗条件且相对湿度控制在70％-80％的智能培养箱中，放置一周，期间注意湿度及果实情况，之后检测淀粉含量变化。

优选地，菌液OD600浓度为0.4-1.2，更优选为0.4-1。

优选地，侵染天数为5-7天，更优选为5天。

优选地；侵染后香蕉果实培育温度为17-29℃，更优选为20-26℃。

在一个具体的抑制香蕉果实总淀粉含量降低的实施方式中，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为23℃；菌液OD600浓度为0.8；菌液中辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:3。

在一个具体的抑制香蕉果实直链淀粉含量降低的实施方式中，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为23℃；菌液OD600浓度为1，菌液中辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:2。

本发明的第二个方面是提供一种VIGS沉默系统，所述VIGS沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒pTRV1，所述表达病毒载体为含有目的基因DNA片段的烟草脆裂病毒pTRV2，所述目的基因DNA片段如序列表中SEQ ID NO.1所示序列。

优选地，所述VIGS沉默系统中辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:(1-3)，更优选为1:(2-3)。

本发明的第三个方面是提供如本发明第二个方面所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉果实总淀粉含量降低中的应用。

优选地，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:3。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉果实直链淀粉含量降低中的应用。

优选地，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:2。

本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉果实中果糖和/或葡萄糖和/或蔗糖含量升高中的应用。

优选地，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:3。

本发明第三、四、五个方面的应用所采用的方法为采用VIGS沉默系统转染香蕉果实。

优选地，将香蕉果实浸没在含有本发明第一个方面所述VIGS沉默系统的菌液中，采用真空渗透的方式侵染香蕉果实；将侵染的果实放置于黑暗条件且相对湿度控制在70％-80％的智能培养箱中，放置一周，期间注意湿度及果实情况，之后检测总淀粉、直链淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖等的含量变化。

优选地，菌液OD600浓度为0.4-1.2，更优选为0.4-1。

优选地，侵染天数为5-7天，更优选为5天。优选地，侵染后香蕉果实培育温度为17-29℃，更优选为20-26℃。

在一个具体的抑制香蕉果实总淀粉含量降低的实施方式中，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为23℃；菌液OD600浓度为0.8。

在一个具体的抑制香蕉果实直链淀粉含量降低的实施方式中，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为23℃；菌液OD600浓度为1。

在一个具体的抑制香蕉果实果糖含量升高的实施方式中，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为20-23℃；菌液OD600浓度为0.8-1。

在一个具体的抑制香蕉果实葡萄糖含量升高的实施方式中，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为20-23℃；菌液OD600浓度为0.8-1。

在一个具体的抑制香蕉果实蔗糖含量升高的实施方式中，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为20-23℃；菌液OD600浓度为0.8-1。

影响VIGS沉默效果的因素很多。首先是沉默基因序列和长度选择，本发明利用扩增长度为586bp的如SEQ ID NO.1所示片段来沉默同源家族基因，取得了较好的沉默效果。本发明采用烟草脆裂病毒pTRV1为辅助病毒载体，烟草脆裂病毒pTRV2连接目的基因片段作为表达病毒载体，优化二者比例和菌液浓度，能有效地将目标基因沉默，并获得系统的沉默效果。此外，本发明控制侵染时间5-7天(优选5天)，可以快速高速地鉴定基因功能，并获得良好的沉默基因效果，而且还利用TRV沉默基因后的植物材料对温度比较敏感，本发明在黑暗培养箱控温控湿的条件下进行，也获得了较好的实验结果。因此，成功沉默基因需要严格掌控好每个技术环节。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次实现了香蕉果实淀粉降解相关基因(MaBAM9b基因)VIGS沉默系统的构建，能够有效沉默香蕉果实淀粉降解相关基因，有效抑制香蕉果实淀粉的降解。本发明还进一步明确了菌液浓度、辅助病毒载体和表达病毒载体的比例、培养温度、侵染时间等条件，为成功沉默基因严格掌控好每个技术环节，有效抑制香蕉果实总淀粉和直链淀粉含量降低，同时有效抑制香蕉果实中果糖、葡萄糖、蔗糖等含量升高。本发明为香蕉果实淀粉降解相关基因(MaBAM9b基因)的基因功能验证奠定了良好的基础，也为控制香蕉或其他植物果实淀粉降解提供了研究思路和技术依据。

附图说明

图1为MaBAM9b目的片段扩增结果。M：M2000、1：MaBAM9b目的片段。

图2为MaBAM9b质粒双酶切检测结果。M：M2000 1：PTRV2-MaBAM9b载体。

图3为碘-碘化钾浓度时间筛选结果。A：30s，B：1min，C：1.5min，D：2min，E：2.5min，F：3min，1：0.1％，2：0.25％，3：0.5％，4：0.75％，5：1％。

图4为不同温度处理碘-碘化钾染色结果。A：17℃，B：20℃，C：23℃，D：26℃，E：29℃，F：CK对照。

图5为不同菌液浓度处理碘-碘化钾染色结果。a：0.4，b：0.6，c：0.8，d：1.0，e：1.2，f：CK对照。

图6为不同菌液比例处理碘-碘化钾染色结果。

图7为不同温度处理条下的香蕉果实薄片中总淀粉含量。

图8为不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中总淀粉含量。

图9为不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中总淀粉含量。

图10为不同温度处理条下的香蕉果实薄片中直链淀粉含量。

图11为不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中直链淀粉含量。

图12为不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中直链淀粉含量。

图13为不同温度处理条下的香蕉果实薄片中葡萄糖含量。

图14为不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中葡萄糖含量。

图15为不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中葡萄糖含量。

图16为不同温度处理条下的香蕉果实薄片中蔗糖含量。

图17为不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中蔗糖含量。

图18为不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中蔗糖含量。

图19为不同温度处理条下的香蕉果实薄片中果糖含量。

图20为不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中果糖含量。

图21为不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中果糖含量。

图22为不同温度处理条下的香蕉果实薄片中β-淀粉酶活性检测结果。

图23为不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中β-淀粉酶活性检测结果。

图24为不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中β-淀粉酶活性检测结果。

图25为不同温度处理条下的香蕉果实薄片中MaBAM9b基因表达量。

图26为不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中MaBAM9b基因表达含量。

图27为不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中MaBAM9b基因表达含量。

图28为不同侵染时间处理碘-碘化钾染色结果。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、植物材料与试剂

植物材料：香蕉果实的处理：香蕉果实当天运回实验室后，去轴落梳，选取轴上第2、第3梳的果实切分为单个果指，去除边果及表面有机械损伤的果实，挑选取大小均匀，无病虫害的果实，去掉果顶花器，用0.1％次氯酸钠表面消毒10min，取出晾干后放置于22℃，相对湿度在80％左右的环境中黑暗静置一周。

香蕉切片处理：切片前将香蕉果实表面及刀具消毒，用锋利的水果刀切除果实顶部及果实底部大小不均匀部分，沿果实赤道面横切，切成大小一致，厚度为0.4cm左右的果实薄片，放置于0.1％的亚硫酸氢钠中浸泡10min，边切边放。

取部分香蕉果实用液氮速冻后，放于-80℃超低温冰箱中用于总RNA的提取。

载体：烟草脆裂病毒载体(TRV：PTRV1和PTRV2)。

试剂：多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自天根)、RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit(购自赛默飞世尔)、TB Green^TMPremix Ex Taq^TMII(Tli RNaseHPlus)(购自宝生物工程(大连)有限公司)

HS DNA Polymerase、pMD^TM19-TVector Cloning Kit及T4 DNA Ligase、TB Green^TMPremix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)(购自宝生物工程(大连)有限公司)，FastDigest快速限制性内切，酶、Plasmid mini kit及Cycle-Pure kit(OMEGA)、大肠杆菌DH5α菌株(购自天根)、农杆菌感受态GV3101(上海唯地生物技术有限公司)，蛋白胨、酵母提取物、培养基琼脂粉、电泳级琼脂糖均购自Takara公司；其他均为国产分析纯。实验中的PCR引物均由上海生工公司合成，测序工作由上海生工公司完成。

二、实验方法

1、香蕉果实总RNA提取

(1)匀浆处理：

在研钵中用液氮将香蕉果实材料迅速研磨成粉末，加入700μL裂解液SL(665μL裂解液SL+35μLβ-巯基乙醇)，立即涡旋剧烈震荡混匀。

(2)12,000rpm离心2min。

(3)将所得上清液吸取至过滤柱CS上，下有2mL收集管中，12,000rpm室温离心2min，除去废液，丢过滤柱CS。

(4)缓慢向2mL收集管中加入260μL无水乙醇，吸打混匀后转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，除去废液，再次使用2mL收集管。

(5)吸取350μL去蛋白液RW1加入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，除去废液，再次使用2mL收集管。

(6)吸取80μL的DNase I工作液(10μL DNase I+70μLRDD溶液)加至吸附柱CR3中央，室温下静置15min。

(7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，除去废液，再次使用2mL收集管。

(8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心15sec，除去废液，再次使用2mL收集管。

(9)重复步骤8。

(10)12,000rpm空离2min，将吸附柱CR3放入1.5mL RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加27μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心1min，得到RNA溶液。

2、cDNA第一链合成

按表1顺序将样品加好后混合均匀，离心，在PCR仪中65℃孵育5min，紧接着置于冰水混合物中冷激，离心，放置回冰上。

按表2顺序将预混液混合均匀后离心，放PCR仪中进行以下程序：42℃孵育60min，最终70℃反应5min，反转录所得cDNA产物放于-80℃备用。

表1 cDNA第一链反应体系1

表2 cDNA反应体系2

3、MaBAM9b基因克隆与病毒载体构建

从香蕉NCBI核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)获得MaBAM9b全长cDNA序列，因后续病毒载体中插入的目的片段序列和大小影响沉默效率，一般以插入300到500左右为宜，根据此设计特异引物，设计时，在引物两端各加入Xba l和BamH I具体引物序列如下：

MaBAM9bF：GGTCTAGATCCGGACTTCGGCAACTTT

MaBAM9bR：CGGGATCCCGCCATGCTCCTGATGAAC

以巴西蕉果实cDNA为模板，扩增基因片段。PCR扩增条件如下：94℃预变性3min，94℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后取出加入25μL Taq mix，72℃延伸10min。上述PCR产物经纯化试剂盒回收后与pMD^TM19-T(Takara)载体连接，16℃连接12小时及以上，连接体系如表3。PCR扩增得到特异性条带，如图1所示，扩增条带大小586bp左右。回收后连接到克隆载体pMD19T，测序结果表明其与基因组序列一致。

表3 MaBAM9b与克隆载体连接体系

然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株。转化步骤如下：

(1)DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，约5分钟待菌块融化，加入pMD-19T-MaBAM9b并用枪头轻柔搅拌混匀，于冰水混合物中静置30分钟。

(2)42℃水浴热激90秒，迅速放回冰水混合物中静置2分钟。

(3)向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB液体培养基，混匀后于37℃，200rpm培养60min。

(4)5000rpm离心一分钟收集菌体，去除400μL上清液后，吹打重悬菌体，吸取100μL均匀涂抹于氨苄抗性LB平板上。

(5)将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

(6)待长出单克隆后进行菌落PCR筛选阳性克隆并测序，测序工作由上海生工公司完成。

测序正确的单克隆，活化后摇菌，提取质粒，进行PCR扩增。PCR扩增条件如下：94℃预变性3min，94℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经纯化回收后，与载体PTRV2质粒分别进行双酶切反应，反应条件为37℃，45min，反应体系如表4。双酶切检测结果如图2所示，酶切后所得到目的片段大小与预期大小一致，测序结果证明与NCBI核酸数据库序列一致，说明病毒载体构建成功。

表4 MaBAM9bPCR产物与PTRV2质粒双酶切反应体系

将双酶切产物纯化回收，T4连接酶16℃连接12小时，连接体系如表5：

表5 MaBAM9bPCR产物与PTRV2质粒双酶切产物连接体系

连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，挑取单克隆检测，PCR检测阳性提取质粒进行双酶切验证，双酶切检测到目的条带送测，测序由上海生工完成。测序正确的阳性克隆活化后提取质粒，转化GV3101农杆菌菌株。转化步骤如下：

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

(2)每100μL感受态加入1μL质粒DNA，管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

(3)加入700μL无抗生素YEP液体培养基，于28℃，200rpm培养3小时。

(4)6000rpm离心1min收集菌体，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的YEP板(板中同时加入50μg/ml kan，20μg/ml rif)上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

(5)挑取克隆进行菌液PCR检测。

4、农杆菌侵染

将含有载体PTRV1的农杆菌GV3101(PTRV1菌)、载体PTRV2的农杆菌GV3101(PTRV1菌)、载体PTRV2-MaBAM9b的农杆菌GV3101(PTRV2-MaBAM9b菌)分别涂布在相应抗生素的YEP板(板中同时加入50μg/ml kan，20μg/ml rif)上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。挑取单克隆于YEP液体培养基于28℃恒温摇床上，200r/min摇晃培养，OD600约为0.6到0.8时停止培养；将45ml菌液于超干净工作台中移至50mL离心管中，于室温条件5000r/min离心5min，弃上清，再用pH5.6-5.7侵染缓冲液(10mmol/L MgCl2、10mmol/L MES、200μmol/L乙酰丁香酮)菌液重悬离心弃去上清。室温黑暗放置2h后，将pTRV1菌液与PTRV2菌液混合作为空载对照，采用真空渗透的方式侵染巴西蕉果实，以重悬液没过果实为宜。病毒诱导的基因沉默是PTRV1与PTRV2与目标基因共同作用的结果，因此不同菌液比例和重悬后菌液OD浓度影响侵染效果，此外侵染后植物的培育温度影响病毒侵染和增值，为了探索合适的侵染条件，做了以下几种处理：

(1)不同菌液浓度处理：PTRV1菌液与PTRV2-MaBAM9b菌液分别按照1:1、1:2、1:3比例混合；

(2)重悬后不同菌液OD600浓度处理：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2；

(3)侵染后香蕉果实培育温度：17℃、20℃、23℃、26℃、29℃；

(4)侵染时间：1d、3d、5d、7d。

不同处理后，将侵染的果实放置于黑暗条件/相对湿度控制在70％-80％的智能培养箱中，放置一周，期间注意湿度及果实情况(真空渗透对果实表皮造成一定损伤)，每个样品设置多次重复。每次取果后测定相关生理指标并保存果肉。

5、碘-碘化钾染色

(1)碘-碘化钾浓度时间筛选

将存放的香蕉果实取出，切片前将香蕉果实表面及刀具消毒，用锋利的水果刀切除果实顶部及果实底部大小不均匀部分，沿果实赤道面横切，切成大小一致，厚度为0.4cm左右的果实薄片，放置于0.1％的亚硫酸氢钠中浸泡10min，边切边放。碘化钾的配置：避光环境下将4.4g碘化钾溶于30ml蒸馏水中研磨混匀，充分溶解后再加入1.1g结晶碘，加蒸馏水定容至500ml后移入棕色广口瓶中避光保存。将配置好的碘-碘化钾分别稀释成0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％浓度备用，将香蕉薄片放入玻璃培养皿中，将上述浓度的碘-碘化钾溶液分别倒入，做好编号，进行6个时间段的染色处理，时间段分别为30s、1min、1.5min、2min、2.5min、3min，染色完成后确保同一时间取出，立即拍照，实验设置3次重复。结果如图3所示：碘-碘化钾浓度为0.1％、0.25％的在各个时间段均无法完成染色，碘-碘化钾浓度为0.75％、1％的在长时间或者短时间内由于浓度过高导致香蕉薄片染色过深或者不均匀，因此，碘-碘化钾浓度为0.5％在2.5min染色效果最佳。

(2)碘-碘化钾染色

将香蕉薄片在0.5％浓度的碘-碘化钾溶液中染色2.5min，结果如图4-6和图28所示：

图4中，温度处理中从左至右依次为17℃、20℃、23℃、26℃、29℃、CK对照，由此看出20℃、23℃、26℃染色明显较深，其中，23℃处理可以看出颜色最深，初步说明淀粉含量最高，其次17℃、29℃处理颜色较浅，CK对照香蕉薄片着色部分最少，对应的淀粉含量最低；

图5中，菌液中从浓度处理中从左至右依次为OD600浓度为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、CK对照，由图可知，OD600浓度为0.6、0.8颜色较深，可见淀粉含量较高，而CK对照果片着色面积少于其他处理，由此可推淀粉含量最低；

图6中，不同菌液比例处理中PTRV1菌液与PTRV2-MaBAM9b菌液配比从左至右依次为1:1、1:2、1:3及CK，由图可知，1:2、1:3处理着色较深，果片中淀粉含量较高。

图28中，不同侵染时间处理中从左至右依次为1d、3d、5d、7d，从图中可知，侵染时间为5d、7d时颜色较深，果片中淀粉含量了较高，尤其是侵染时间为5d时颜色最深，果片中淀粉含量最高。

6、沉默后生理指标测定

(1)总淀粉含量的测定

将沉默处理后的果实烘干磨粉备用，相关淀粉含量的测定由苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒完成，操作步骤如下：

试剂的组成和配制：

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；

a、淀粉提取：

称取0.01g新鲜样本于研钵中研碎，加入1mL试剂一，充分匀浆后转移到EP管中，80℃水浴提取30min，3000g，25℃离心5min，弃上清，留沉淀。沉淀中加入0.5mL蒸馏水，放入95℃水浴中糊化15min(盖紧，以防止水分散失)。冷却后，加入0.35mL试剂二，25℃提取15min，振荡3-5次。加入0.85mL蒸馏水，混匀，3000g，25℃离心10min，取上清液待测。

b、测定操作表(在1.5mL EP管中依次加入下列试剂)：

分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。

调节水浴锅至95度。

工作液的配制：临用前在试剂三中加入7.5mL蒸馏水后，缓慢加入42.5mL浓硫酸，不断搅拌，充分溶解，待用；用不完的试剂4℃保存一周；

样本测定：取0.2mL样本和1mL工作液至EP管中，95度水浴10min(盖紧，防止水分散失)，自然冷却至室温，在620nm波长下记录测定吸光度值A，计算总淀粉含量，结果如表6-9和图7-9所示：

结果表明，温度处理中，放置于23℃的香蕉果实测得淀粉含量最高，显著高于CK对照及其他处理，26℃及29℃处理测得淀粉含量与CK无明显差异，说明较高的温度可能对沉默效果有影响；菌液浓度处理中，OD600浓度为0.8测得淀粉含量高于CK对照及其他处理；不同菌液比例中，PTRV1菌液与PTRV2-MaBAM9b菌液配比1:1、1:2、1:3测得淀粉含量均高于CK对照，其中1:3测得含量略高于其他两个处理。当取PTRV1菌液与PTRV2-MaBAM9b菌液配比1:3，OD600浓度为0.8的菌液侵染香蕉果实薄片达5天时，淀粉含量高于其他侵染天数。

表6不同温度处理条下的香蕉果实薄片中总淀粉含量(平均值)

温度(℃)	17℃	20	23	26	29	CK
							淀粉含量(mg/g)	194.06	218.05	334.66	189.29	175.13	167.48

表7不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中总淀粉含量(平均值)

OD600	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	CK
							淀粉含量(mg/g)	260.67	264.00	316.02	223.10	211.40	220.94

表8不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中总淀粉含量(平均值)

表9不同侵染时间的香蕉果实薄片中总淀粉含量(平均值)

时间(d)	1	3	5	7
					淀粉含量(mg/g)	176.24	198.35	315.68	301.42

(2)直链淀粉含量的测定

a、试剂的组成和配制：

试剂一：液体50mL×1瓶；4℃保存；

试剂二：乙醚50mL×1瓶；(自备)

试剂三：液体50mL×1瓶；4℃保存；

试剂四：液体4mL×1瓶；4℃保存；

试剂五：液体1mL×1瓶；4℃保存；

b、淀粉提取：

称取0.01g烘干样本于研钵中研碎，加入1mL试剂一，充分匀浆后转移到EP管中，80℃水浴提取30min，3000g，25℃离心5min，弃上清，留沉淀，加入1mL试剂二(乙醚)振荡5min，3000g，25℃离心5min，弃上清，留沉淀，加入1mL试剂三充分溶解，90℃水浴10min，冷却后待测。

c、测定步骤：

分光光度计30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。

测定管：在EP管中依次加入100uL样本，70uL试剂四，600uL蒸馏水，10uL试剂五，220uL蒸馏水，混匀，测定620nm处吸光值，记为A测定。

空白管：在EP管中依次加入100uL试剂三，70uL试剂四，600uL蒸馏水，10uL试剂五，220uL蒸馏水，混匀，测定620nm处吸光值，记为A空白。计算直链淀粉含量，结果如表10-13和图10-12所示：

结果表明，温度处理中，23℃处理下的香蕉果实测得较高的直链淀粉含量，CK对照相较于沉默处理的果实，直链淀粉含量较低；菌液浓度处理中，OD600为1.0的测得直链淀粉含量最高，与沉默处理后的相比，CK对照测得直链淀粉含量具有显著性差异，且显著低于处理果实。不同菌液比例中，PTRV1菌液与PTRV2-MaBAM9b菌液配比1:1、1:2、1:3无较明显差异，但可以看出1:2测得较高的直链淀粉含量，与其他处理相同，CK对照测得含量低于沉默处理的香蕉果实。菌液侵染果实薄片达5-7天时直链淀粉含量明显高于其他天数，但5天效果最佳。

表10不同温度处理条下的香蕉果实薄片中直链淀粉含量(平均值)

温度(℃)	17	20	23	26	29	CK
							淀粉含量(mg/g)	23.27	28.38	41.00	27.60	21.79	14.92

表11不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中直链淀粉含量(平均值)

OD600	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	CK
							淀粉含量(mg/g)	30.54	36.41	34.07	41.37	29.28	22.47

表12不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中直链淀粉含量(平均值)

表13不同侵染时间的香蕉果实薄片中直链淀粉含量(平均值)

时间(d)	1	3	5	7
					淀粉含量(mg/g)	15.54	20.25	35.58	31.94

(3)葡萄糖含量测定

a、需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵和蒸馏水

b、试剂的组成和配制：

试剂一：0.5μmol/mL葡萄糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体25ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体25ml×1瓶，4℃保存；

c、葡萄糖提取：

称取约0.1g组织，加入1mL蒸馏水，研磨成匀浆，95℃水浴10分钟(盖紧，防止水分散失)，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清液备用。

d、测定步骤：

分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。

混合试剂的配制：使用前将试剂二和试剂三1:1等体积混合，用多少配多少。

加样表(在EP管中加入下列试剂)：空白管加入100ul蒸馏水和900ul混合试剂，标准管加入100ul试剂一和900ul混合试剂，测定管加入100ul样本试剂一900ul混合试剂，混匀后，置25℃水浴中，保温15min，于505nm波长处读取吸光度。空白管、标准管和测定管吸光值分别记为A1、A2和A3。空白管和标准管只要做一管。

计算葡萄糖含量，结果如表14-17和图13-15所示：

结果表明，CK对照具有较高的葡萄糖含量，这是因为将淀粉降解关键酶基因沉默后，淀粉降解变慢，从而淀粉含量高，糖含量较低；20℃、23℃处理含量最低，并且无明显差异，说明低温能够进行有效地沉默。菌液浓度处理中，OD600浓度为0.8及OD600浓度1.0无明显差异且含量最低，CK对照葡萄糖含量最高；不同菌液比例处理中1:1和1:3测得含量相对较低，CK对照显著高于其他。菌液侵染果实薄片达5-7天时，葡萄糖含量明显降低，但5天时效果最佳。

表14不同温度处理条下的香蕉果实薄片中葡萄糖含量(平均值)

温度(℃)	17	20	23	26	29	CK
							葡萄糖含量(mg/g)	7.58	5.19	5.26	10.33	16.57	58.98

表15不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中葡萄糖含量(平均值)

OD600	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	CK
							葡萄糖含量(mg/g)	13.46	11.63	7.59	7.31	10.79	33.11

表16不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中葡萄糖含量(平均值)

表17不同侵染时间的香蕉果实薄片中葡萄糖含量(平均值)

时间(d)	1	3	5	7
					葡萄糖含量(mg/g)	12.68	10.46	6.69	7.35

(4)蔗糖含量的测定

a、试剂的组成和配制：

提取液：液体100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体3ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体40ml×1瓶，4℃保存；

试剂四：液体15ml×1瓶，4℃保存；试剂五：粉剂0.5g×1瓶，常温保存。

b、蔗糖提取：称取0.1样本，常温研碎，加入1mL提取液，适当研磨后快速转移到离心管中，置于80℃水浴锅中10min，振荡3到5次，冷却后，4000g，25℃离心10min，取上清，加入2mg试剂五，80℃脱色30min，再加入1mL提取液，4000g，25℃离心10min，取上清液测定。向空白管中加入100ul和50ul的试剂二，向标准管中加入100ul的试剂一和50ul的试剂二，向测定管中加入100ul样本50ul试剂二。混匀，沸水浴煮沸5min左右(盖紧，防止水分散失)依次加入700ul的试剂三和200ul的试剂四，混匀，沸水浴30min，冷却后480nm处蒸馏水调零，空白管、标准管和测定管分别记为A1、A2和A3。计算蔗糖含量，结果如表18-21和图16-18所示：

结果表明，温度处理中17℃、20℃、23℃处理含量较低，其中23℃含量最低，具有显著性差异，26℃、29℃处理蔗糖含量显著高于其他处理；菌液浓度处理中，OD600浓度0.6、0.8及OD600浓度1.0含量较低，OD600浓度0.8具有显著性差异，OD600浓度0.4、1.2蔗糖含量较高，可能是因为浓度过低影响沉默效果，而浓度过高可能对植物造成损伤而影响沉默效果；不同菌液比例处理中1:3测得蔗糖含量较低，1:1和1:2表现出无明显差异；从测得蔗糖含量结果看，CK对照均表现出较高的含量，这可能是没有沉默掉淀粉降解的关键酶基因而表现出的自然成熟的过程。菌液侵染果实薄片达5-7天时，蔗糖含量明显降低，但5天时效果最佳。

表18不同温度处理条下的香蕉果实薄片中蔗糖含量(平均值)

温度(℃)	17	20	23	26	29	CK
							蔗糖含量(mg/g)	9.16	8.14	5.87	16.74	28.57	38.52

表19不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中蔗糖含量(平均值)

OD600	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	CK
							蔗糖含量(mg/g)	16.93	10.00	5.82	9.63	22.71	34.08

表20不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中蔗糖含量(平均值)

表21不同侵染时间的香蕉果实薄片中蔗糖含量(平均值)

时间(d)	1	3	5	7
					蔗糖含量(mg/g)	14.56	13.38	7.75	8.21

(5)果糖含量测定

a、试剂的组成和配制：提取液：液体100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：1mg/mL标准液10mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体40ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体15ml×1瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂0.5g×1瓶，常温保存。

b、果糖提取：称取0.1g样本，常温研碎；加入1mL提取液，适当研磨后快速转移到有盖离心管中；置于80℃水浴锅中10min(盖紧，以防止水分散失)，振荡3到5次，冷却后，4000g，25℃离心10min，取上清；加入少量(约2mg)试剂四，80℃脱色30min(盖紧，以防止水分散失)；再加入1mL提取液，4000g，25℃离心10min，取上清液测定。

c、测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零。2、样本测定(在1.5mLEP管中依次加入下列试剂)：空白管中加入100ul蒸馏水，700ul试剂二，200ul试剂三；标准管中加入100ul试剂一，700ul试剂二，200ul试剂三；测定管中加入100ul样本，700ul试剂二，200ul试剂三；

混匀，95℃水浴反应30min(盖紧，以防止水分散失)，冷却后测定480nm处光吸收值，空白管、标准管和测定管分别记为A1、A2和A3。

计算果糖含量，结果如表22-25和图19-21所示：

结果表明，20℃、23℃、26℃三个处理无明显差异且显著低于CK处理，29℃测得果糖含量明显高于其他四个处理，与之前测得29℃总淀粉含量最低，这一结果也说明淀粉降解速度快而导致果糖含量的增加，因此高温影响沉默效率；菌液浓度处理中，OD600浓度0.4及OD600浓度1.2显著高于其他处理，说明浓度过低或者过高都不适宜病毒诱导的基因沉默，OD600浓度0.8及OD600浓度1.0测得果糖含量无明显差异且显著低于其他处理；不同菌液比例处理中1:3略低于其他两个处理，但三个处理中无较明显差异，可能是因为沉默后的香蕉果实降低了淀粉降解效率，测得果糖含量较少。菌液侵染果实薄片达5-7天时，果糖含量明显降低，但5天时效果最佳。

表22不同温度处理条下的香蕉果实薄片中果糖含量(平均值)

温度(℃)	17	20	23	26	29	CK
							果糖含量(mg/g)	6.77	4.18	3.89	4.63	9.95	27.80

表23不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中果糖含量(平均值)

OD600	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	CK
							果糖含量(mg/g)	10.89	5.75	3.66	4.33	6.94	19.92

表24不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中果糖含量(平均值)

表25不同侵染时间的香蕉果实薄片中果糖含量(平均值)

时间(d)	1	3	5	7
					果糖含量(mg/g)	4.42	4.15	3.64	3.98

(6)β-淀粉酶含量测定

淀粉酶活性测定。酶原液提取后稀释10倍，取1.0mL稀释液40℃恒温水浴10min；加1.0mL 1％淀粉溶液，40℃恒温水浴中准确保温5min；加入2.0mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)混匀，水浴中煮沸5min，取出后流水冷却终止反应，加蒸馏水定容至20mL，摇匀，采用紫外分光光度计(型号：T6新世纪；北京普析通用仪器有限责任公司)测定540nm处吸光值，并做麦芽糖标准曲线，计算淀粉酶总活力[mg/(g·min)]。

α-淀粉酶活性测定。酶原液提取后取1mL，置70℃水浴中15min钝化β-淀粉酶，取出后在流水中冷却，加1.0mL 1％淀粉溶液，其后操作步骤同上，计算α-淀粉酶活力[mg/(g·min)]。

β-淀粉酶活性测定。根据β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH 3.6以下则发生钝化的特性，首先将提取的酶原液用pH 3.6的醋酸(17.5moL/L)在0℃处理，钝化α-淀粉酶，其后操作步骤同上，计算β-淀粉酶活性[mg/(g·min)]，结果如表26-29，图22-24：

结果表明，不同温度处理中17℃和23℃处理β-淀粉酶活性较低，而26℃和29℃处理β-淀粉酶活性较高，可能是因为放置沉默果实温度过高而造成的沉默效果不明显从而导致的成熟速度加快，此外CK对照与23℃处理的β-淀粉酶活性相比含量高于其1.3倍；菌液浓度处理中，OD600浓度0.4和OD600浓度处理无明显差异，OD600浓度0.8处理表现出较低的含量，且CK对照含量高于其他沉默果实的处理；不同菌液比例处理中1:1及1:2无较大差异，而1:3测得β-淀粉酶活性较低，CK对照测得含量是其1.5倍，由此得出菌液比例为1:3时能够获得较好的沉默效果。菌液侵染果实薄片达5-7天时，β-淀粉酶活性明显降低，但5天时效果最佳。

表26不同温度处理条下的香蕉果实薄片中β-淀粉酶活性

温度	17	20	23	26	29	CK
							β-淀粉酶活性(mg/g·min)	0.68	0.78	0.69	0.80	0.84	0.90

表27不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中β-淀粉酶活性

OD600	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	CK
							β-淀粉酶活性(mg/g·min)	0.75	0.83	0.71	0.76	0.89	0.98

表28不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中β-淀粉酶含量

表29不同侵染时间的香蕉果实薄片中β-淀粉酶活性(平均值)

时间(d)	1	3	5	7
					β-淀粉酶活性(mg/g·min)	0.84	0.75	0.59	0.61

7、基因表达分析

将沉默处理后的香蕉果实用液氮速冻后，放于-80℃超低温冰箱中用于总RNA的提取。提取方法参照RNA提取试剂盒进行。利用Primer Premier 5.exe软件设计MaBAM9b基因特异表达引物，具体引物序列如下：

MaBAM9bF:GCCCGCAGTCACTACTATCT

MaBAM9bR:GAAGAACTCAGCACCCATCC

以香蕉ACTIN基因为参照，以所得cDNA为模板进行实时荧光定量分析。反应体系如下：

PCR扩增条件如下：步骤95℃预变性3min，步骤：95℃变性20s，步骤：56℃退火20s，步骤：72℃延伸30s，步骤2-4扩增40个循环，并做溶解曲线。实验设3次重复。

基因表达分析的结果如表30-33和图25-27所示：

MaBAM9b基因在经过不同温度沉默处理后的香蕉果实中表达量呈现出不同的趋势，CK对照的表达量显著高于沉默果实，17℃及20℃处理条件下表达量无明显差异，23℃处理条件下表达量显著低于其他水平，且17℃处理表达量高于其表达2倍，29℃处理表达量高于其2.6倍，因此，23℃处理具有较好的沉默效果。

MaBAM9b基因在不同农杆菌菌液OD浓度沉默处理中表达量趋势不同，CK对照与沉默处理相比，表现出较高的表达量，OD600浓度为0.4及OD600浓度为1.2处理的沉默果实表达量其他三个处理，OD600浓度为0.8处理的表达量显著低于其他，沉默效果明显。

MaBAM9b基因在不同菌液比例沉默处理后表达量趋势不同，可以看出沉默处理后的基因表达量显著低于CK对照，在不同的菌液配比中，1:1和1:2沉默处理明显差异，1:3沉默处理的果实基因表达量略低于1:1和1:2，因此，1:3这一比例可以获得较明显的沉默效果。菌液侵染果实薄片达5-7天时，内源基因表达明显受到抑制，但5天时抑制效果最明显。

表30不同温度处理条下的香蕉果实薄片中基因表达量

温度	17	20	23	26	29	CK
							基因表达量	0.55	0.48	0.27	0.42	0.73	1.00

表31不同菌液浓度处理条下的香蕉果实薄片中基因表达含量

OD600	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	CK
							基因表达量	0.51	0.31	0.21	0.32	0.48	1.00

表32不同菌液比例处理条下的香蕉果实薄片中基因表达量

表33不同侵染时间的香蕉果实薄片中基因表达量(平均值)

时间(d)	1	3	5	7
					基因表达量	1.00	0.74	0.42	0.58

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法及VIGS沉默系统

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 586

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

tccggacttc ggcaactttt tcaaggacca tggcggctcc tgggagacac cctacgggca 60

attcttcctc tcctggtaca ccggcaagct cctgtctcac ggtgacggcc tgctctcggt 120

cgcgtcagaa gtatttggtg atttgcctgt cgcgctctcg gccaaggttc cacttctgca 180

ttgttggcac gacacccggt cgcgcccgtc tcagctgacg gccgggttct ataacactga 240

cggcagagac gggtacgatg atgtggctaa gatcttcgcg aagcattcct gcaccatgat 300

catcccgggc atggacctca cggacgggga gcagcctcag ggtgtccggt cctgcccgca 360

gtcactacta tctcaggtaa tggggacgtg caagaggcat ggggtgaagg tcgccggcga 420

gaactcttcc ctcgtccggg tcggcaccgc tggctttact aagatcaagg agaatgtttt 480

agctgagaaa tcgacgttgg attcgttcac ttatcatagg atgggtgctg agttcttctc 540

tccggatcac tggccgctgt ttaccgagtt catcaggagc atggcg 586

Claims (10)

1.一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法，其特征在于，采用VIGS沉默系统转染香蕉果实，其中，所述VIGS沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒pTRV1，所述表达病毒载体为含有目的基因DNA片段的烟草脆裂病毒pTRV2，所述目的基因DNA片段如序列表中SEQ ID NO.1所示序列。

2.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述VIGS沉默系统中，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:(1-3)，优选为1:(2-3)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将香蕉果实浸没在含有权利要求1或2所述VIGS沉默系统的菌液中，采用真空渗透的方式侵染香蕉果实；

将侵染的果实放置于黑暗条件且相对湿度控制在70％-80％的智能培养箱中，放置一周，期间注意湿度及果实情况，之后检测淀粉含量变化。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，含有权利要求1或2所述VIGS沉默系统的菌液OD600浓度为0.4-1.2，优选为0.4-1；侵染天数为5-7天，优选为5天；侵染后香蕉果实培育温度为17-29℃，优选为20-26℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为23℃，菌液OD600浓度为0.8，菌液中辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:3；或者

侵染天数为5天，侵染后香蕉果实培育温度为23℃，菌液OD600浓度为1，菌液中辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:2。

6.一种VIGS沉默系统，其特征在于，所述VIGS沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒pTRV1，所述表达病毒载体为含有目的基因DNA片段的烟草脆裂病毒pTRV2，所述目的基因DNA片段如序列表中SEQ ID NO.1所示序列。

7.根据权利要求2所述的VIGS沉默系统，其特征在于，辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:(1-3)，优选为1:(2-3)。

8.如权利要求6或7所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉果实总淀粉含量降低中的应用。

9.如权利要求6或7所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉果实直链淀粉含量降低中的应用。

10.如权利要求6或7所述的VIGS沉默系统在抑制香蕉果实中果糖和/或葡萄糖和/或蔗糖含量升高中的应用。

Images