CN103243062A

CN103243062A - 产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途

Info

Publication number: CN103243062A
Application number: CN2013101706582A
Authority: CN
Inventors: 马正; 俞晓平; 刘金秀; 申屠旭萍; 边亚琳; 郝培应; 许益鹏
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2013-08-14

Abstract

本发明公开了一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途。它的染色体上整合有来源于透明颤菌的血红蛋白基因vgb，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628更高的丰加霉素表达能力。构建过程如下：1）构建表达载体pIB139-vgb；2）利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。利用pIB139载体上的启动子permE*启动vgb基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-vgb特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。与原始菌株相比，重组菌丰加霉素产量至少提高21.2%，菌浓提高了11.6%。

Description

产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途

技术领域

本发明涉及利用透明颤菌血红蛋白基因在淀粉酶产色链霉菌中表达提高丰加霉素产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

　　丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。

　　丰加霉素属于次级代谢产物，在发酵过程中菌丝结构稠密，发酵液粘稠导致溶氧水平受到限制，导致丰加霉素合成水平较低，生产能耗较大，难以规模化生产。解决该问题的现有方法一般都局限于通过通入纯氧、通气/搅拌优化配置等方式来提高细胞生长环境中的氧气传递性质，增加了生产成本。

透明颤菌血红蛋白（VHb）是目前为止研究最为透彻的原核生物血红蛋白，许多研究均表明它在细胞中处于限氧条件下促进细胞生长、提高细胞培养密度和蛋白质合成能力。抗生素的生产是一个好氧的过程，由于VHb在微氧条件下可以提高细胞的溶氧水平，促进细胞的生长以及提高次级代谢产物的产量，因此VHb在抗生素生产中受到广泛的研究和应用。安德荣等SOE-PCR (Splicing by overlap extension PCR)技术构建含红霉素抗性基因启动子PermE 和 vgb 结构基因融合片段的整合型表达载体 pJD100，利用接合转移法将vgb基因整合到瑞拉菌素产生菌委内瑞拉链霉菌秦岭变种中，使工程菌株的效价提高，但其中获得基因融合片段的过程操作复杂，易产生移码突变。陈文青等基于质粒pWQ2005中的硫链丝菌素诱导启动子PtipA启动vgb的表达，利用接合转移法将vgb基因整合到泰乐菌素的生产菌株弗氏链霉菌中，但由于PtipA启动子受到硫链丝菌素诱导，发酵过程中添加对菌体生长不利。载体pIB139是在链霉菌整合型质粒pSET152的多克隆位点加入启动子PermE*构建而成的链霉菌穿梭质粒，便于基因在链霉菌中的高效表达，同时由于其中具有用于接合转移的oriT功能区域，链霉菌筛选标记-安普抗性基因（apr），整合酶基因，链霉菌温和噬菌体ΦC31的attP位点。因此，pIB139可利用简便高效的属间接合转移法导入链霉菌，并可通过特异性重组整合在链霉菌染色体的attB位点上，随着宿主染色体的复制而复制并赋予安普抗性。赵广荣等将vgb基因置于pIB139中的PermE*下游，通过原生质体转化将其转入链霉菌中。但是其中原生质体转化操作复杂，需要原生质体的制备，原生质体转化还存在宿主的限制性修饰系统而导致转化效率较低，同时赵广荣等并未考察重组菌中vgb表达对菌株合成目的代谢产物的影响。

发明内容

　　为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途。

　　淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628是一株拮抗放线菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分为丰加霉素，尚未见淀粉酶产色链霉菌的遗传表达体系的研究报道。本发明以绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因，成功构建了含有permE^*启动子的淀粉酶产色链霉菌重组表达载体pIB139-gfp，对其在淀粉酶产色链霉菌中启动子活性进行研究后发现，在淀粉酶产色链霉菌中permE^*启动子可有效启动外源基因的表达。在此基础上，成功构建了携带有来源于透明颤菌血红蛋白基因vgb的表达质粒pIB139-vgb，并通过接合转移法将其整合在淀粉酶产色链霉菌1628染色体上。

　　一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌，它的染色体上整合有来源于透明颤菌的血红蛋白基因vgb，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628更高的丰加霉素合成能力。

　　所述的产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌的构建方法，过程如下：

1）构建表达载体pIB139-vgb；

2）利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。

　　所述的方法，利用pIB139载体上的启动子permE*启动vgb基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-vgb特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。

　　所述的淀粉酶产色链霉菌工程菌生产丰加霉素的用途，将重组菌1628-VHB进行发酵，与原始菌株相比，重组菌丰加霉素产量至少提高了21.2%，菌浓提高了11.6%。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途，得到了整合血红蛋白基因vgb的淀粉酶产色链霉菌后使其合成丰加霉素的能力比原始菌提高了21.2%，菌浓提高了11.6%。为进一步改善发酵法生产丰加霉素过程中溶氧的问题奠定了基础。

附图说明

图1 重组质粒pIB139-gfp的构建示意图。

图2 质粒pET28-gfp的酶切电泳验证图。

其中，M₁：λDNA/Hind III Marker, M₂：DL2000 Marker, 1: pET28a-gfp/EcoR I+Hind III双酶切; 2: pMD18- T-gfp/EcoR I+Hind III双酶切; 3: gfp的PCR产物

图3质粒pIB139-gfp的酶切电泳验证图。

其中，M: DL2000 Marker; 1: pIB139-gfp/Xba I+NotI双酶切; 2: pIB139/Xba I+NotI双酶切;

图4重组菌1628-GFP的PCR电泳验证图。

其中，1-4: 以重组菌1628-GFP为模板PCR扩增gfp基因; 5: 以1628为模板PCR扩增gfp; M: DL2000 Marker

图5启动子转录活性测定图。

其中，出发菌株1628和重组菌1628-GFP的绿色荧光检测: A. 出发菌株1628; B. 重组菌株 1628- GFP

图6 重组质粒pIB139-vgb的构建示意图。

图7 重组质粒pET28a-vgb的酶切电泳验证图。

其中，1: pET28a-vgb/EcoR I+Hind III双酶切; 2: pET28a/EcoR I+Hind III双酶切; M: DL2000.

图8 重组质粒pIB139-vgb的酶切电泳验证图。

M: DL2000; 1: pIB139/ Nde I+Not I双酶切; 2: pIB139-vgb/ Nde I+Not I双酶切.

图9重组菌1628-VHB的PCR电泳验证图。

　　其中，1-4：以重组菌1628-VHB为模版PCR扩增apr基因；5：以原始菌1628为模板PCR扩增apr基因；6-9：以重组菌1628-VHB为模版PCR扩增vgb基因；10：以原始菌1628为模板PCR扩增vgb基因；M：DL2000 Marker。

图10重组淀粉酶产色链霉菌1628-VHB的CO差光谱图。

具体实施方式

实施例1：以绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因的淀粉酶产色链霉菌遗传表达体系的构建：

以质粒pCAMBIA1302为模板，以PgfpF EcoR I和PgfpR HindIII为引物PCR获得含有EcoR I与HindIII两个酶切位点的gfp片段，与pMD18-T Vector连接，构建克隆载体pMD18-T-gfp (EcoR I+HindIII)。将克隆载体pMD18-T-gfp(EcoR I+ HindIII)转化至E. coli JM109受体菌，涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB琼脂平板上，37 ℃培养过夜后，平板上长出许多白色菌落。随机挑取白色克隆酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序用EcoR I与HindIII双酶切得到含有EcoR I与Hind III两个酶切位点的gfp片段，与同样酶切的pET28a连接，转化大肠杆菌JM109后在Kan抗性LB平板筛选得到转化子，获到质粒pET28a-gfp。然后用Xba I与Not I双酶切pET28a-gfp，与同样酶切的pIB139连接转化，涂布阿泊拉霉素抗性平板，挑取转化子，酶切验证，即获得重组质粒pIB139-gfp（图1）。

根据GenBank公布的绿色荧光蛋白基因gfp序列，设计引物，通过PCR技术从质粒pCAMBIA1302中扩增出gfp序列。引物设计如下：

PgfpF EcoR I：5’-ACG TCTAGA ATGGTAGATCTGACTAG

PgfpR HindIII：5’-ACG GCGGCCGC CCCGATCTAGTAAC

如图2和3所示，分别为重组质粒pET28a-gfp和pIB139-gfp酶切验证结果。重组质粒pET28a-gfp经EcoR I与HindIII双酶切后获得约1.1kb和5.3kb的DNA片段，分别与gfp基因片段和质粒pET28a的大小一致（图2）。重组质粒pIB139-gfp经Xba I与Not I双酶切后获得约1.1kb和5.9kb的DNA片段，分别与gfp基因片段和质粒pIB139的大小一致（图3）。以上结果证明重组质粒pIB139-gfp构建正确。

提取质粒pIB139-gfp，用接合转移法转入淀粉酶产色链霉菌。在阿泊拉霉素抗性平板上随机挑取若干菌落于CP培养基中培养后，提取染色体。PCR实验均能扩增出gfp基因（图4），证明重组淀粉酶产色链霉菌1628-GFP构建成功。

实施例2：以绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因的淀粉酶产色链霉菌遗传表达体系的初步评价：

挑取在含50μg/mL阿泊拉霉素的平板生长的淀粉酶产色链霉菌菌落接种CP培养基，28 ℃,180 r/min 振荡过夜,然后再以1:50 的接种量分别接种于装有50 mL新鲜CP培养基中,培养至对数生长中期，细胞干重 (DCW)约为0.3 g/L, 6000 r/min 离心收集菌丝体，用PBS 缓冲液洗涤菌丝体2次后，重悬于30 mL PBS 中。取5 -10 μL菌液涂片，在Olympus BX50 荧光显微镜下观察，同时用SONY 3CCD 的Color Video Camera 拍照。以野生菌作为对照，选择激发滤光片为485 nm，发射滤光片为520 nm，确定启动子的转录活性。

结果显示重组菌1628-GFP菌丝能发出稳定的明亮的绿色荧光（图5），而对照无荧光，说明在淀粉酶产色链霉菌1628中启动子PermE ^*能有效启动外源基因gfp的表达。

实施例3：透明颤菌血红蛋白基因vgb在淀粉酶产色链霉菌中的表达:

重组质粒pIB139-vgb的构建如图6所示，步骤与重组质粒pIB139-vgb的构建方法类似。

如图7和图8所示，分别为重组质粒pET28a-vgb和pIB139-vgb酶切验证结果。重组质质粒pET28a-vgb经EcoR I与HindIII双酶切后获得约0.5kb和5.3kb的DNA片段，分别与vgb基因片段和质粒pET28a的大小一致。重组质粒pIB139-vgb经NdeI与Not I双酶切后获得约0.6kb的DNA片段，与vgb基因片段的大小一致。以上结果证明重组质粒pIB139-vgb构建正确。

提取质粒pIB139-vgb，用接合转移法转入淀粉酶产色链霉菌1628。在阿泊拉霉素抗性平板上随机挑取若干菌落于CP培养基中多次培养后，提取染色体。PCR实验均能扩增出vgb基因和阿泊拉霉素抗性基因apr（图9），证明质粒pIB139-vgb成功的整合在淀粉酶产色链霉菌的染色体上，且遗传稳定，重组淀粉酶产色链霉菌1628-VHB构建成功。

成功获得重组淀粉酶产色链霉菌1628-VHB后，对其进行VHb的表达研究，并通过CO差光谱法测定了VHb的表达量。

如图10所示，以原始淀粉酶产色链霉菌1628做对照，重组淀粉酶产色链霉菌1628-VHB，与CO结合后在419nm处均出现吸收峰，证明vgb基因以淀粉酶产色链霉菌为宿主细胞，在启动子PermE ^*作用下，能表达出具有活性的血红蛋白。

将重组淀粉酶产色链霉菌1628-VHB接种于发酵培养基中，于28℃，180 r/min发酵96h。对照组为淀粉酶产色链霉菌出发株。发酵结束后，分别测定了菌浓，丰加霉素产量。如下表1所示，重组菌株的产素水平较出发菌株提高了21.2%，菌浓提高了11.6%，且重复性良好。说明VHb的表达有利于淀粉酶产色链霉菌菌体的生长和丰加霉素的合成。

表1 VHb 表达对1628菌体生长和丰加霉素生物合成的影响

菌体	丰加霉素产量 (mg/L)	细胞干重 (g/L)
			1628	134.97	0.43
1628-VHB	163.52	0.49

Claims

1.一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌，其特征在于，它的染色体上整合有来源于透明颤菌的血红蛋白基因vgb，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628更高的丰加霉素表达能力。

2.一种如权利要求1所述的产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌的构建方法，其特征在于，过程如下：

1）构建表达载体pIB139-vgb；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用pIB139载体上的启动子permE*启动vgb基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-vgb特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。

4.一种利用如权利要求1所述的淀粉酶产色链霉菌工程菌生产丰加霉素的用途，其特征在于，将重组菌1628-VHB进行发酵，与原始菌株相比，重组菌丰加霉素产量至少提高了21.2%，菌浓提高了11.6%。