CN102286398B - 一种生产高活性和高纯度利福霉素sv的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产高活性和高纯度利福霉素SV(rifamyicn SV，Rf_SV)的方法。本发明具体涉及细胞色素P450基因或转酮酶基因或它们所编码的蛋白在用于调控利福霉素SV转化为利福霉素B中的用途。本发明的方法通过失活利福霉素B(rifamyicn B，Rf_B)生产菌株内参与利福霉素合成途径中Rf_SV转化为Rf_B所需的两个(Rif15和Rif16)或者其中一个关键酶，得到高活性和高纯度的利福霉素SV。

Description

一种生产高活性和高纯度利福霉素SV的方法
技术领域
本发明涉及生物工程和制药领域。更具体而言，本发明涉及细胞色素P450基因或转酮酶基因或它们所编码的蛋白在调控利福霉素SV转化为利福霉素B中的用途，通过生物工程方法获得的生产高活性、高纯度利福霉素SV的菌株及制备该菌株的方法，以及利用该菌株生产高活性、高纯度利福霉素SV的方法。
背景技术
地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)是1957年从法国圣拉斐尔(St.Raphael)附近的土样中分离出来的一种菌种，它是一种可以生成重要抗生素利福霉素的放线菌。
利福霉素属于安莎类抗生素(ansamycins)，主要用于治疗由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)引起的结核病和麻风，对肺炎球菌(Pneumococcus)及其它革兰氏阳性菌引起的各种感染也十分有效(Lal，Khanna等，1995)。利福霉素可以结合到原核生物中依赖于DNA的RNA聚合酶上，从而特异性地抑制依赖于DNA的RNA的合成而起到抑菌的作用(Floss和Yu 2005)。
最初分离的地中海拟无枝菌酸菌能够合成一组结构相关的利福霉素混合物。后来，经过一系列物理、化学方法诱变，使得地中海拟无枝菌酸菌在工业上所合成的主要组分为利福霉素B(Floss和Yu 2005)。利福霉素B的产量比较高，但其抑菌活性比较低。在发酵得到Rf_B后，再经过化学或酶学方法转化得到高活性的利福霉素SV，最后进一步得到临床用的利福平(rifampicin)或其它药用衍生物(Floss和Yu 2005)。
但是，随着对利福平有抗性的细菌的快速出现，其它化学半合成衍生物如利福布汀(rifabutin)和利福喷汀(rifapentine)相继进入临床(Floss和Yu 2005)。由于这些化学半合成药物的直接前体都是利福霉素SV，所以，得到高产量高纯度的利福霉素生物合成中间产物Rf_SV，是工业生产的重要步骤。
很多实验室和利福霉素生产公司利用物理或化学方法对工业生产菌株进行诱变，得到了一些可以直接生产利福霉素SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株。但是，这些菌株往往产量较低，容易发生回复突变，或者还夹杂着许多其它不需要的利福霉素衍生物，给下游的分离纯化带来诸多不便。
为了筛选得到能够在遗传上稳定生产高纯度Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株，通过解析利福霉素生物合成途径，从而利用分子生物学及基因工程方法改造获得目的生产菌株，一直是科学家们努力的目标。1998年，Floss等人以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合酶基因rifK为探针克隆了地中海拟无枝菌酸菌染色体上含有利福霉素合成基因簇的一段约100kb DNA片段。随后，其中的大部分基因的功能被实验鉴定(Floss和Yu 2005；Xu，Wan等，2005)。
利福霉素的合成是以AHBA为起始单元，丙二酰辅酶A(2分子)和甲基丙二酰辅酶A(8分子)为延伸单元合成了第一个中间体前安莎霉素X(proansamycinX)，然后，前安莎霉素X经过氧化还原、乙酰化、甲基化等多种修饰经Rf_SV并最终得到Rf_B。利福霉素合成途径如图9所示，其中利福霉素S是利福霉素SV的氧化形式，二者之间可以相互转化。
但是，对于利福霉素合成途径中的最后一步(也可能是几步)反应，即从Rf_SV到Rf_B转化所利用的基因以及酶催化反应机理，至今不是很明了。
因此，本领域仍然迫切需要对利福霉素的合成途径和所涉及的生物过程进行深入的研究，以开发出通过对菌株中特定基因的筛选或改造实现对利福霉素SV到利福霉素B的转化的控制从而有利于可控的利福霉素生产的方法，尤其需要开发出可高效生产高纯度Rf_SV的菌株和利用该菌株生产Rf_SV的方法。
发明内容
本发明的主要目的之一是提供参与利福霉素SV转化为利福霉素B的基因及其用途。本发明的另一主要目的正是提供一种可生产高活性、高纯度利福霉素SV的菌株，以及制备(尤其是通过基因工程方法)和筛选该菌株的方法。本发明的另一主要目的是提供一种利用该菌株生产高活性、高纯度利福霉素SV的方法。
在本发明的第一方面，提供了细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白的用途，其用于调控利福霉素SV向利福霉素B的转化。
在一个实施方式中，所述的细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白来源于产利福霉素B的菌株。在另一个实施方式中，所述细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白来源于地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsismediterranei)。在一个优选例中，所述菌株选自：ATCC 13685和ATCC 21789或S699。
在另一个实施方式中，所述的细胞色素P450或转酮酶基因或它们所编码的蛋白是单独应用或组合应用的。
在另一个实施方式中，所述的细胞色素P450或转酮酶基因选自下组：
(i)具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：23和/或SEQ ID NO：24所示序列的核苷酸序列；
(ii)与(i)中序列同源的序列；
(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列；和/或
(iv)核苷酸序列与(i)或(ii)有85％以上(优选90％以上)序列相同性、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列。
在本发明的一个优选例中，所述与(i)中序列同源的序列编码细胞色素P450或转酮酶。
在本发明的一个优选例中，所述基因分别为rif15(编码转酮酶)和rif16(编码细胞色素P450)，这两个基因的编码产物参与了Rf_SV到Rf_B的转化。这两个基因中的任何一个基因失活或同时失活，均能使地中海拟无枝菌酸菌菌体内的Rf_SV(以及其氧化型Rf_S)发生累积，而不能生成Rf_B。而回补这两个基因后，能够使利福霉素SV转化到B的表型恢复。
在本发明的一个优选例中，所述同源的序列来自产利福霉素B的菌株，优选地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)。在一个优选例中，所述菌株选自：ATCC 13685和ATCC 21789或S699。
在另一个实施方式中，在本发明的用途中，通过分别或同时抑制细胞色素P450或转酮酶基因或其同源基因表达或抑制它们所编码的蛋白，阻断利福霉素SV转化为利福霉素B。
在一个优选实施例中，产生Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌中，rif15和/或rif16基因的失活能引起利福霉素SV到利福霉素B合成途径的阻断。
在一个优选例中，所述抑制是通过基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰或点突变实现的。在另一优选例中，所述抑制是使得产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌中rif16基因所编码的蛋白质中第84位的R突变为W，例如使得ATCC13685和ATCC 21789或S699中rif16基因所编码的蛋白质中第84位的R突变为W。
在另一个实施方式中，分别或同时增强细胞色素P450或转酮酶基因或它们的同源基因的表达或增强它们所编码的蛋白的功能，使利福霉素SV转化为利福霉素B。在一个优选例中，所述增强是通过选自下组的方法实现的：插入或过表达。
在一个优选实施例中，在产生Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌中，通过rif15和/或rif16的基因回补能够使利福霉素SV转化到B的表型恢复。
在本发明的第二方面中，提供了一种生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株，其特征在于，所述菌株中的细胞色素P450基因和/或转酮酶基因失活或其所编码的酶失活，条件是所述菌株不是保藏号为CGMCC 4.5720的地中海拟无枝菌酸菌。
在一个优选例中，所述菌株所产生的利福霉素B的量至多为利福霉素SV产量的50％、40％、30％、20％、10％，或甚至为0。
在另一个优选例中，所述菌株所产生的利福霉素SV可用于合成以利福霉素SV为前体的抗生素，所述抗生素可为选自下组中的一种或多种：利福布汀、利福喷汀、利福平或利福霉素B。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞色素P450基因和/或转酮酶基因选自下组：(i)具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：23和/或SEQ ID NO：24所示序列的核苷酸序列；(ii)与(i)中序列同源的序列；(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列；和/或(iv)核苷酸序列与(i)或(ii)有85％以上(优选90％以上)序列相同性、且编码细胞色素P450或转酮酶的序列。
在本发明的另一个实施方式中，所述菌株是天然的菌株或是经遗传工程改造的菌株。在一个优选例中，所述遗传工程改造通过选自下组的方法进行：基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰或点突变。
在本发明的另一个实施方式中，所述菌株是产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)或由产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)经遗传工程改造而得。
在一个优选例中，所述产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌选自：ATCC 21789、ATCC 13685或S699，更优选ATCC 21789。
在本发明的第三方面中，提供了一种获得生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株的方法，所述方法包括步骤：(a)提供生产利福霉素的菌株；(b)使得所述菌株中的细胞色素P450基因和/或转酮酶基因失活或其所编码的酶失活。
在本发明的一个实施方式中，所述失活是通过选自下组的遗传工程改造实现的：基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰、点突变。
在一个优选例中，所述生产利福霉素的菌株是生产利福霉素B的菌株，优选产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)，更优选ATCC21789、ATCC 13685或S699。
在本发明的第四方面中，提供了一种筛选生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株的方法，所述方法包括：(a′)提供生产利福霉素的菌株；(b′)对所述菌株的细胞色素P450基因和/或转酮酶基因进行检测，或对其所编码的酶的活性进行测定，如果所述菌株中没有细胞色素P450基因和/或转酮酶基因或其所编码的酶的活性，或该活性显著低于生产利福霉素B的阳性对照菌株，则表明该菌株可用于生产利福霉素SV。
在本发明的一个实施方式中，所述基因的检测是通过选自下组的方法测定的：PCR测序或Southern杂交。
在一个优选例中，所述生产利福霉素B的阳性对照菌株选自：ATCC 21789、ATCC 13685或S699。
在本发明的第四方面中，提供了一种生产利福霉素SV、利福霉素S或以它们的衍生物的方法，所述方法包括：A)提供本发明的菌株、用本发明的方法产生的菌株、或用本发明方法筛选得到的菌株；B)用所述菌株生产利福霉素SV或利福霉素S；以及C)任选地，用步骤B)所得的利福霉素SV或利福霉素S进一步生产选自下组的利福霉素衍生物。
在一个优选例中，所述利福霉素SV或利福霉素S的衍生物选自：利福布汀、利福喷汀、利福平或利福霉素B。在另一个优选例中，所述生产包括接种、发酵、萃取、浓缩等步骤。在另一个优选例中，所述方法还包括根据菌株的稳定性和产量进行菌株的进一步选择。
本发明的其它方面中涉及一种制备高活性利福霉素SV的方法，该方法包括：对产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌菌株中rif15和/或rif16基因，或与其高度同源且具有相同或相似功能的同源基因(相同性至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)进行操作，使所述rif15和/或rif16基因或所述同源基因失活，得到突变的菌株，该突变菌株即为生产利福霉素Rf_SV的菌株。
在一个优选实施例中，所述菌株选自生产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌。在一个优选实施例中，将所述rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因失活，得到突变的菌株。
在一个优选实施例中，所述方法还包括步骤：培养所述突变菌株，鉴定其产生利福霉素SV的能力，筛选出进一步高产量，高纯度利福霉素SV的菌株。
本发明又一方面涉及一种采用本发明所述的方法制得的菌株，它选自地中海拟无枝菌酸菌，其中，该菌株包含rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因，rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因已失活。
本发明的另一方面涉及一种制备利福霉素B的方法，该方法包括：在产利福霉素SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株中，回补产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌菌株中的rif15和/或rif16基因，或与其高度同源的基因(相同性至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)，使所述rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因产生功能，得到突变的菌株，该突变菌株即为生产利福霉素Rf_B的菌株。
在一个优选实施例中，所述菌株选自生产利福霉素SV的地中海拟无枝菌酸菌。在一个优选实施例中，将所述rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因回补，得到突变的菌株。
在一个优选实施例中，所述方法还包括步骤：培养所述突变菌株，鉴定其产生利福霉素B的能力，筛选出进一步高产量，高纯度利福霉素B的菌株。
本发明又一方面涉及一种采用本发明所述的方法制得的菌株，它选自地中海拟无枝菌酸菌，其中，该菌株包含rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789染色体上rif15突变体初筛PCR鉴定图。
泳道1为1kb分子量标记，泳道2-8为挑取的rif15突变体克隆1-7，泳道9为阴性对照(未加DNA模板)，泳道10为阳性对照。
图2：rif15基因失活和失活后回补对利福霉素Rf_B和Rf_SV生产的影响。
图2A为ATCC 21789发酵液的BPC图谱分析，2B为ATCC 21789 rif15突变体(图1中的克隆1)发酵液的BPC图谱分析，2C为rif15突变体克隆1转入空质粒pDXM4的菌株发酵液的BPC图谱分析，而2D为rif15突变体克隆1回补菌株发酵液的BPC图谱分析。
图3：地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789染色体上rif16突变体初筛PCR鉴定图。
泳道1为1kb分子量标记，泳道2-16为挑取的rif16突变体克隆1，1，2，2，3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，泳道17为阴性对照(未加DNA模板)，泳道18为阳性对照(基因组DNA)。
图4：rif16基因的失活和失活后回补对利福霉素Rf_B和Rf_SV生产的影响。
图4A为ATCC 21789发酵液的BPC图谱分析，图4B为rif16基因失活后(图3中的克隆2)的地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789发酵液乙酸乙酯萃取液的BPC图谱分析。图4C为rif16突变体转入空质粒pDXM4的菌株发酵液的BPC图谱分析，而图4D为rif16突变体克隆2回补了rif16的菌株发酵液的BPC图谱分析。
图5：5a为rif基因簇的缩略图，5b是ATCC 13685，ATCC 21789，S699和U32中P450的蛋白序列比对图(右上)，以及各个菌株的产利福霉素表型：ATCC13685野生型，ATCC 21789野生型；U32野生型；U32(pDXM4-P450)；U32(转空质粒pDXM4)。
图6：图6a为在培养基加安普霉素抗生素(6a中虚线)或者不加安普霉素抗生素(6a中实线)的产利福霉素表型。图6b为pDXM4-P450质粒在不同培养基中的丢失情况。直条形柱代表U32(pDXM4-P450)培养基中未添加安普霉素抗生素，波浪形柱代表U32(pDXM4-P450)培养基中添加安普霉素。
图7：用Swiss-PdbViewer模拟的U32中P450的三维结构。球棒模式表示的氨基酸为Rif16 R84位氨基酸(Arg或Trp)，该SNP位点恰好在一个β折叠的末尾，推测为结合底物的口袋口部。
图8：S699、U32、ATCC13685和ATCC 21789氨基酸序列比对图。将地中海拟无枝菌酸菌菌株S699、U32、ATCC 13685、ATCC 21789的细胞色素P450蛋白的氨基酸序列用CLUST软件相互做比对(Alignment)。可以看到U32与其它三者在84位氨基酸不同(R84W)；但在295位处，U32只与S699不同(G295E)，而与其它两者ATCC 13685、ATCC 21789一致。故我们可以推测R84W的变化影响了U32菌株中利福霉素SV向利福霉素B的转化。注意：U32的起始密码子预测比S699等提前了31个氨基酸，这并不影响其蛋白的真实表达情况。
图9：利福霉素的合成途径。
发明内容
本发明人通过长期而深入的研究发现：细胞色素P450基因(如rif16)和/或转酮酶基因(如rif15)的活性对由利福霉素SV向利福霉素B的转化有决定性的作用，利用这些关键基因的失活可获得用于高效制备高纯度利福霉素SV的菌株，或利用对这些关键基因活性的测定可筛选可用于高效制备高纯度利福霉素SV的菌株，也可利用这些关键基因的回补使产利福霉素SV的菌株转化为产利福霉素B的菌株。在此基础上，本发明人提供了细胞色素P450基因(如rif16)和/或转酮酶基因(如rif15)及其编码蛋白的用途，包括这两个基因分别或同时失活，阻断利福霉素SV转化为利福霉素B，以及这两个基因的回补使利福霉素SV进一步转化为利福霉素B。另外，发明人还提供了生产高活性和高纯度利福霉素SV的菌株、其制备和筛选方法，以及利用该菌株制备高活性和高纯度利福霉素SV的方法，从而完成了本发明。
具体而言，本发明人通过失活参与利福霉素SV到利福霉素B的转化过程的两个关键酶的基因(尤其是基因rif15和/或rif16)，使Rf_SV到Rf_B合成途径发生阻断，从而实现高活性利福霉素Rf_SV的产量得到提高，并使得发酵产物的组分得到纯化。
rif16基因是本发明人在对一株产利福霉素Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株U32的全基因组测序后，与三株野生型产利福霉素B的菌株进行序列比对分析的过程中发现的。将地中海拟无枝菌酸菌菌株S699、U32、ATCC 13685、ATCC 21789的细胞色素P450蛋白的氨基酸序列用CLUST软件相互做比对。研究表明：编码细胞色素P450的rif16基因中的1个位点在U32里是W(84位氨基酸，其编码序列为tgg)，而在ATCC 13685和ATCC 21789及S699里均为R(其编码序列为cgg表1)。但在295位处，U32只与S699不同(G295E)，而与其它两者ATCC 13685、ATCC 21789一致。(注意：U32的起始密码子预测比S699等提前了31个氨基酸，这并不影响其蛋白的真实表达情况)
由此发明人认为rif16基因在U32里的突变极有可能是引起Rf_SV到Rf_B阻断的关键原因。故发明人在U32中回补含野生型ATCC 21789 rif16基因的质粒(pDXM4-P450)，同时用空质粒作对照，发现：在rif16回补株可大量产生利福霉素B，而空质粒株的发酵液中仍然只有利福霉素SV以及其氧化型Rf_S，没有Rf_B的产生(图5)。这证明了rif16在Rf_SV到Rf_B的转化中起到关键作用。
发明人进一步通过回补质粒pDXM4-P450的稳定性对不同利福霉素衍生物产量的影响进行了研究。结果发现，随着回补质粒pDXM4-P450的丢失，发酵液中的Rf_SV和Rf_S迅速累积(图6)。从而，从另一角度验证了rif16在Rf_SV到Rf_B的转化中起作用。
同时，发明人还对产利福霉素B的野生型ATCC 21789中rif16基因进行中断突变，发现利福霉素B不再合成，进一步回补试验发现，回补菌株恢复了利福霉素Rf_B的生产，而检测不到任何Rf_SV的产生(图4)，这表明rif16基因确实在利福霉素SV到B的转化中不仅非常重要，而且起到了必要作用。
经研究发现：rif16编码的P450蛋白为胞质蛋白，没有过膜区，而U32中的SNP位点恰好在一个β折叠的末尾且位于P450的活性口袋周围，这就提示了它重要的位阻作用(图7)。
发明人进一步对ATCC 21789中编码转酮酶的rif15基因进行敲除。结果发现，此转酮酶的失活和回补能产生和P450失活和回补相同的表型(图2)。证明rif15的功能对于从Rf_SV到Rf_B的转化也是必需的。
由此，本发明人确定了由利福霉素SV向利福霉素B的转化中的关键基因，即细胞色素P450基因(如rif16)和/或转酮酶基因(如rif15)，并通过对这些基因的活性的调控和筛选成功获得了高产高纯度利福霉素SV的菌株，从而可用于工业生产。
细胞色素P450基因和转酮酶基因
如本文所用，术语“细胞色素P450基因”或“rif16基因”可互换使用，均是指产利福霉素菌中编码细胞色素P450的基因，其优选具有SEQ ID NO：2(例如ATCC 21789或ATCC 13685中所具有的相同的rif16基因)或SEQ ID NO：24所示(例如S699中的rif16基因)的ORF序列、或可与该序列高度同源(例如同源性至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％)、或可为在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高度同源的家族基因分子，该基因的表达受到抑制可阻碍利福霉素SV向利福霉素B的转化，从而可用于高效生产高纯度的利福霉素SV，而该基因的回补可促使产利福霉素SV的菌株产生利福霉素B。
如本文所用，术语“转酮酶基因”或“rif15基因”可互换使用，均是指产利福霉素菌中编码转酮酶的基因，其优选具有SEQ ID NO：1所示(例如ATCC21789或ATCC 13685中所具有的相同的rif15基因)或SEQ ID NO：23所示(例如S699中的rif15基因)的ORF序列、或可与该序列高度同源(例如同源性至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％，或这些数值之间的任何区间)、或可为在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高度同源的家族基因分子，该基因的表达受到抑制可阻碍利福霉素SV向利福霉素B的转化，从而可用于高效生产高纯度的利福霉素SV，而该基因的回补可促使产利福霉素SV的菌株产生利福霉素B。
如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，在严格条件下与某特定序列杂交的序列可为所述特定序列的互补序列。
本发明的基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成等常规方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
应理解，本发明的细胞色素P450基因和转酮酶基因优选是产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)的基因，获自其它产利福霉素B菌类的与地中海拟无枝菌酸菌高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。
基于本发明所揭示的rif15和rif16基因对利福霉素SV转化为利福霉素B的调控作用，本领域普通技术人员很容易理解与本方面中所揭示的具体rif15基因(即编码转酮酶的基因)和rif16基因(即编码细胞色素P450的基因)同源的序列，尤其是产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌中的同源序列也具有同样的功能，即具有调控利福霉素SV转化为利福霉素B的作用，只要这些同源序列在所述地中海拟无枝菌酸菌中负责编码转酮酶或细胞色素P450。
基因的失活及其失活菌株的鉴定
如本文所用，术语“失活”是指细胞色素P450基因和/或转酮酶基因不能正常表达出其所对应的酶或表达的酶量或酶活性显著降低。术语“失活菌株”是指不能正常表达细胞色素P450基因和/或转酮酶或所表达的相应酶量或酶活性显著降低的菌株。
例如，在采用遗传工程改造菌株时，经遗传工程改造的菌株中细胞色素P450基因和/或转酮酶基因表达量或所表达的酶的活性与未经改造的菌株相比降低了70％、80％、90％、95％、98％、99％，甚至100％。
可采用本领域现有技术已知的方法使相关基因失活，例如可采用相关基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰、或使其发生突变(优选基因敲除、点突变)等方法。例如，可利用DNA同源重组的方法，构建相关基因中断载体，将目的基因敲除(丁晓明等，利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统，生物工程学报，2002，18(4)：431-437)。
可采用本领域现有技术已知的方法来判断基因是否已失活，例如用Southern杂交或用PCR扩增的方法来检验目的基因是否突变；利用HPLC-MS检测突变株的表型变化(如，利福霉素的组分变化)的方法或通过相关生理生化实验来判断突变的基因是否失活。
本发明提供了一种可以生产高活性利福霉素SV的菌株，该菌株中rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因已失活。该菌株是可以产Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)或由其经遗传工程改造获得。
本发明还提供了一种可以生产利福霉素B的菌株，该菌株是由产利福霉素SV的菌株中插入rif15和/或rif16基因或与其高度同源的基因，而且该基因及其编码的细胞色素P450基因和/或转酮酶具有正常功能。优选地，该菌株是由可以产Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)经遗传工程改造获得。
本领域技术人员可采用现有技术公开的知识筛选失活菌株。例如在构建中断载体的时候引入抗性基因，用中断载体中断相关基因。利用含有抗性的培养基来筛选基因失活菌株，并用上述验证基因失活的方法对所筛选的菌株进行验证。测定菌株生产抗生素的能力的方法可用HPLC-MS分析。
失活菌株的培养和利用
在制备或筛选得到细胞色素P450基因和/或转酮酶基因失活菌株后，可在本领域常规使用的条件下培养和扩增所得的菌株，例如，地中海拟无枝菌酸菌可在26℃-30℃用本氏固体或液体培养基培养(Wang W等，2002)。
本发明还提供了利用失活菌株高效制备高纯度利福霉素SV或以其为前体的非利福霉素B抗生素的方法。术语“以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素”或“利福霉素SV的衍生物”是指在工业生产上需首先制得利福霉素SV，然后以利福霉素SV为前体进行进一步合成的抗生素，例如利福布汀、利福喷汀或利福平。
可在工业条件下，利用制得或筛选得到的失活菌株进行利福霉素SV的生产，例如通过发酵等工艺。可进一步利用所制得的利福霉素SV生产以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素，例如利福布汀、利福喷汀或利福平。
本领域普通技术人员可根据常识对培养和生产条件进行选择和优化。
回补菌株或活性增强菌株的培养和利用
如本文所用，术语“活性增强”是指过细胞色素P450基因和/或转酮酶基因的表达活性提高或表达的酶量或酶活性显著增强。术语“活性增强菌株”是指过细胞色素P450基因和/或转酮酶基因表达活性提高或所表达的相应酶量或酶活性显著提高的菌株。
例如，在采用遗传工程改造菌株时，经遗传工程改造的菌株中细胞色素P450基因和/或转酮酶基因表达量或所表达的酶的活性与未经改造的菌株相比提高了50％、60％、70％、80％、85％、90％或以上。可采用本领域现有技术已知的方法使相关基因活性增强，例如可采用插入或过表达等方式。可采用本领域现有技术已知的方法来判断基因或酶活性是否增强，例如利用HPLC-MS检测菌株的表型变化。
在制备得到细胞色素P450基因和/或转酮酶基因回补菌株或活性增强菌株后，可在本领域常规使用的条件下培养和扩增所得的菌株，例如，地中海拟无枝菌酸菌可在26℃-30℃用本氏固体或液体培养基培养(Wang W等，2002)。
本发明还提供了利用回补菌株或活性增强菌株制备利福霉素B或将利福霉素B转化为利福霉素SV及以其为前体的非利福霉素B抗生素的方法。术语“以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素”是指在工业生产上需首先制得利福霉素SV，然后以利福霉素SV为前体进行进一步合成的抗生素。
可在工业条件下，利用制得的回补菌株或活性增强菌株进行利福霉素B的生产，例如通过发酵等工艺。可进一步利用所制得的利福霉素B转化为利福霉素SV并生产以利福霉素SV为前体的非利福霉素B抗生素，例如利福布汀、利福喷汀和利福平。本领域普通技术人员可根据常识对培养和生产条件进行选择和优化。
本发明的优点
本发明具有如下的主要优点：
(1)明确了产利福霉素菌中细胞色素P450基因和转酮酶基因及其编码的酶与利福霉素SV到利福霉素B的转化之间的关系，从而为高效生产高活力、高纯度利福霉素SV或利福霉素B提供了一种新的方法；
(2)提供了可高效生产高活力、高纯度利福霉素SV的菌株及其制备或筛选方法，为利福霉素SV及其下游产品(如利福布汀、利福喷汀或利福平)的生产和加工提供了有力保障；
(3)为利福霉素合成途径的进一步研究提供了新的思路。
应理解，本发明的优点并不限于上述所列举的主要优点，本领域普通技术人员基于说明书的描述可理解和知晓本发明的其它优点。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，涉及DNA的操作参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)；涉及染色体总DNA的提取参考文献(D.A.Hopwood，M.J.Bibb，K.F.Chater等，Genetic Manipulation of Srteptomyces.ALaboratory Manual.England：John Innes Foundation Press，1985.)，或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
方法与材料
菌株及其培养：
在实验中使用到的地中海拟无枝菌酸菌U32[保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京，CGMCC)，保藏号CGMCC 4.5720，保藏日期2010年2月10日]；ATCC13685和ATCC 21789购自ATCC。
地中海拟无枝菌酸菌的培养采用本氏培养基(Bennet Medium，Wang W等，2002)；大肠杆菌培养用LB培养基。培养基中所添加抗生素的终浓度为：氨苄青霉素100μg/ml，安普霉素apramycin 30μg/ml，红霉素200μg/ml。
发酵萃取：
地中海拟无枝菌酸菌发酵液萃取方法参照(Xu，Wan等，2005)。
工具酶及分子量标记：
实验中使用到的限制性内切酶、T4 DNA连接酶、RNase A、Klenow酶、1kb DNA分子量标记物为MBI公司产品，高保真DNA聚合酶KOD-plus为ToYoBo公司产品。
实施例1：产利福霉素Rf_SV菌株U32的全基因组测序及其与产利福霉素B菌株的序列比对
rif16基因是本发明人在对一株产利福霉素Rf_SV的地中海拟无枝菌酸菌菌株U32的全基因组测序后，与三株野生型产利福霉素B的菌株进行序列比对分析的过程中发现的。具体而言：
利用第二代454测序仪，结合SOLID，Sanger测序方法，以及6-8k质粒文库、fosmid文库构建，最终得到error值小于0.5/100,000的10,236,715bp的地中海拟无枝菌酸菌U32的全基因序列。BLASTP注释得到利福霉素合成基因簇rif后，与Floss研究的产Rf_B菌株S699的rif合成基因簇进行比对。发明人发现了41个SNP，8个INDEL位点，它们一共影响了13个编码蛋白和2个基因的启动子区域(表1)。通过文献查询和功能分析，初步确定可能与Rf_SV到Rf_B的转化有关的候选基因。
表1.地中海拟无枝菌酸菌U32与S699、ATCC13685和ATCC 21789的比较
Figure GDA0000090029940000151
表中，NA表示该基因的变异不会影响翻译密码子、该基因的产物涉及利福霉素B生物合成途径中利福霉素SV形成前的步骤、或据报道其突变不影响利福霉素B的生产。
表中，ORF15B即为Rif 15，ORF16即为Rif 16
接下来，设计检测引物(如SEQ ID Nos：21-22所示)，在两株产利福霉素B的野生型地中海拟无枝菌酸菌菌株ATCC 13685和ATCC 21789中进行PCR。回收片段测序分析发现，编码细胞色素P450的rif16基因中的1个位点在U32里是W(84位氨基酸)，而在ATCC 13685和ATCC 21789及S699里均为R(参见图5和图8)。
通过HMMTOP软件分析，rif16编码的P450蛋白为胞质蛋白，没有过膜区，而U32中的SNP位点恰好在一个β折叠的末尾。用Swiss-PdbViewer模拟三维结构可以看到，该SNP在P450的活性口袋周围，提示了他重要的位阻作用(图7)。
因此发明人推测rif16基因在U32里的突变导致P450蛋白功能失活，极有可能是引起Rf_SV到Rf_B阻断的关键原因。
实施例2：将ATCC 21789的rif16转入U32
利用常规分子生物学方法，将ATCC 21789中含有自己启动子区域的rif16基因的PCR产物(所用引物如SEQ ID Nos：19和20所示)克隆到地中海拟无枝菌酸菌游离型多拷贝质粒pDXM4(参照丁晓明2001)的EcoRV位点上，获得含野生型ATCC 21789 rif16基因的质粒pDXM4-P450。以空质粒作为对照，利用电转化的方法将含有rif16的pDXM4-P450转到U32中(参照丁晓明2001)。结果如图5所示。
实施例3：U32回补质粒pDXM4-P450的稳定性对Rf_SV转化为Rf_B的影响
如果在培养基中添加安普霉素抗生素，质粒pDXM4-P450则能稳定在U32菌株中，反之质粒则会在细菌的增殖过程中丢失。以培养基中添加安普霉素抗生素作为对照，我们分别在没有添加安普霉素抗生素的U32发酵液中按照2天，3天，5天时间点取样，与添加了抗生素的发酵液一起做HPLC-MS检测。结果发现，随着回补质粒pDXM4-P450的丢失，发酵液中的Rf_SV和Rf_S迅速累积。从侧面验证了rif16在Rf_SV到Rf_B的转化中起作用(图6)。
实施例4：ATCC 21789 rif15和rif16突变体的构建
利用分子生物学方法依次将失活rif15或rif16的PCR产物上游和下游同源片段分别克隆到pBluescript KS(-)(购自Stratagene)对应酶切位点(rif15上游片段为Hind III和EcoR V，下游片段为EcoR V和EcoR I；rif16上游片段为Hind III和EcoR V，下游片段为EcoR V和EcoR I)上，最后将安普霉素抗性基因插入到上、下游同源片段中间设计的酶切位点EcoR V上，利用电转化的方法将同源重组敲除质粒转到ATCC 21789中(参照丁晓明2001)，若同源重组敲除质粒只有其中一侧同源片段与染色体发生重组，则得到的带有安普霉素抗性的转化子为单交换；而若质粒上的两个同源片段都发生重组则会得到染上提上对应基因失活的突变体。其中，rif15的失活引物Rif15KO11、Rif15KO12、Rif15KO21和Rif15KO22的序列分别如SEQ ID NOs：3-6所示和rif16失活引物Rif16KO11、Rif16KO12、Rif16KO21和Rif16KO22的序列分别如SEQ ID NOs：7-10所示。
用抗性筛选标记同源重组敲除ATCC 21789染色体上的rif15或rif16基因后，分别采用SEQ ID NOs：11-12所示的引物和SEQ ID NOs：13-14所示的引物对rif15突变体或rif16突变体进行PCR验证。
对rif15突变体而言，若为单交换，则可以扩出原先rif15上的约750bp DNA片段；若为双交换，则只会扩出含有安普霉素(apramycin)抗性基因的约1700bpDNA片段。所以，由图1所示的结果可知，克隆1，2，4，6，7(分别对应于泳道2、3、5、7和8)为rif15突变成功的候选克隆。
对rif16突变体而言，若为单交换，则可以扩出原先rif16上的约800bp DNA片段；若为双交换，则只会扩出含有安普霉素抗性基因的约1700bp DNA片段。所以，由图3所示的结果可知，克隆2(泳道3和4)、4(泳道8和9)、5(泳道10和11)、6(泳道12和13)、7(泳道14-15)、8(泳道16)为rif16突变成功的候选克隆。
实施例5：ATCC 21789 rif15和rif16突变体的回补
利用分子生物学方法将红霉素启动子以及rif15 ORF(其序列如SEQ ID NO：1所示)或rif16 ORF(其序列如SEQ ID NO：2所示)依次先连到pBluescript KS(-)上，再转到pDXM4的EcoRV位点上，以空质粒作为对照，利用电转化的方法将含有rif15和rif16的pDXM4转到对应的ATCC 21789 rif15或rif16突变体中(丁晓明2001)。
用于rif15和rif16回补的引物序列ermEP1、ermEP2、Ep-15pcr1、Ep-15pcr2、P450-F和P450-R分别如SEQ ID NOs：15-20所示。
实施例6：地中海拟无枝菌酸菌发酵液中利福霉素的提取
将培养合适时间的发酵液上清调pH至2-3，等体积乙酸乙酯萃取，经0.22μm滤膜过滤后直接用HPLC-MS分析利福霉素组分。HPLC参数为：Zorbax EclipseXDB-C18柱(50×4.6mm 1.8μm；梯度甲醇∶0.5％甲酸水溶液t0＝70∶30(v/v)，t15min＝90∶10，t18min＝70∶30，并维持这个比例一直至t23min；0.2ml/min流速)，检测波长为256和425nm。MS参数为：质谱范围：550-1100m/z(MS扫描速率1.03和分辨率±0.5amu)，喷雾器40psi，气体(N2)温度350℃，气体流速9l/min，VCap 3500V，碎片器(fragmentor)160V，分离器(Skimmer)65V，Octopole RF 750V，Ext Dyn标准2GHz(3200).
实验结果及讨论
发明人通过U32基因组测序并与3株产利福霉素B的菌株序列比对和分析后(如实施例1所述)发现编码细胞色素P450的rif16基因中的1个位点在U32里是W(84位氨基酸)，而在ATCC13685和ATCC 21789及S699里均为R。通过HMMTOP软件分析，rif16编码的P450蛋白为胞质蛋白，没有过膜区，而U32中的SNP位点恰好在一个β折叠的末尾。用Swiss-PdbViewer模拟三维结构可以看到，该SNP在P450的活性口袋周围(图7中球棒模式表示的氨基酸为Rif16 R84)，提示了它重要的位阻作用。根据上述分析，发明人推测rif16基因在U32里的突变导致P450蛋白功能失活，极有可能是引起Rf_SV到Rf_B阻断的关键原因。
因此发明人在U32中回补含野生型ATCC 21789 rif16基因的质粒(pDXM4-P450)(如实施例2所述)，同时用空质粒作对照，对所得菌株的发酵液中的利福霉素进行检测(如实施例6所述)。结果发现：在rif16回补株的发酵液中检测到了大量的利福霉素B的产生，而空质粒株的发酵液中仍然只有利福霉素SV以及其氧化型Rf_S，没有Rf_B的产生(图5)。这证明了rif16在Rf_SV到Rf_B的转化中起到关键作用。
同时，发明人还进行了回补质粒pDXM4-P450的稳定性对不同利福霉素衍生物产量的影响的实验(如实施例3所述)。如果在培养基中添加安普霉素抗生素，质粒pDXM4-P450能稳定在U32菌株中，反之质粒则会在细菌的增殖过程中丢失。结果发现，随着回补质粒pDXM4-P450在未添加安普霉素抗生素情况下逐渐丢失，发酵液中的Rf_SV和Rf_S迅速累积。这从另一角度验证了rif16在Rf_SV到Rf_B的转化中起作用(图6)。
同时，对产利福霉素B的野生型ATCC 21789中rif16基因进行中断突变(如实施例4所述)，结果如图4所示。在正常情况下，ATCC 21789产生大量的Rf_B(滞留时间约为9min，如图4A)。而rif16被失活以后，产Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789的突变体(图3中一个突变成功的候选克隆)发酵液中积累利福霉素Rf_SV(滞留时间约为9.5min)以及其氧化型Rf_S(滞留时间约为15.5min)，而不再合成利福霉素Rf_B(图4B)。导入正常的rif16基因(如实施例5所述)恢复了突变体的表型，即恢复了Rf_B的合成(图4D)，转入空质粒的表型同rif16突变体(图4C)。这表明rif16基因确实在利福霉素SV到B的转化中不仅非常重要，而且起到了必要作用。
经过pfam分析，P450为单加氧酶，主要功能是使底物羟基化(Lamb，Skaug等，2002)。通过对其催化机理分析，发明人认为从Rf_SV至Rf_B的生化转化过程中，还有可能涉及其它的酶及其相关基因，如rif15等。
因此，本发明人对ATCC 21789中也可能起作用的rif15(编码转酮酶)进行敲除(如实施例4所述)。结果发现，此转酮酶的失活和回补能产生和P450(rif16)失活相同的表型(图2)。
具体而言，在正常情况下，ATCC 21789产生大量的Rf_B(滞留时间约为9min，如图2A)。由图2B可知，rif15被失活以后，产Rf_B的地中海拟无枝菌酸菌ATCC 21789的突变体(图1中一个突变成功的候选克隆)发酵液中积累利福霉素Rf_SV(滞留时间约为10.5min)以及其氧化型Rf_S(滞留时间约为15min)，而不再合成到利福霉素Rf_B。而导入正常的rif15基因则恢复了突变体的表型(图2D)，即恢复了Rf_B的合成(滞留时间约为9min)，转入空质粒的不能回复(图2C)。
该实验结果证明了rif15的功能对于从Rf_SV到Rf_B的转化也是必需的。
综上所述，通过生物工程学手段定向调控地中海拟无枝菌酸菌中rif15和/或rif16的表达与活性可对利福霉素生产中的主要产物进行调控，从而为利福霉素SV和利福霉素B的工业生产提供了有效的控制方法和有力的工具。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (17)

1.一种生产利福霉素SV或利福霉素S的菌株，其特征在于，所述的菌株是经遗传工程改造的菌株且不产生利福霉素B，所述菌株中的细胞色素P450基因rif16和/或转酮酶基因rif15失活或其所编码的酶失活，条件是所述菌株不是保藏号为CGMCC4.5720的地中海拟无枝菌酸菌。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述细胞色素P450基因rif16选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:24所示序列的核苷酸序列；和
所述转酮酶基因rif15选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:23所示序列的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株是产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)或由产利福霉素的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)经遗传工程改造而得。
4.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述遗传工程改造通过选自下组的方法进行：基因敲除、基因置换或基因沉默。
5.一种获得生产利福霉素SV或利福霉素S而不产生利福霉素B的菌株的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供生产利福霉素的菌株；
(b)使得所述菌株中的细胞色素P450基因rif16和/或转酮酶基因rif15失活或其所编码的酶失活。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述失活是通过选自下组的遗传工程改造实现的：基因敲除、基因置换或基因沉默。
7.一种筛选生产利福霉素SV或利福霉素S而不产生利福霉素B的菌株的方法，所述方法包括：
(a')提供生产利福霉素的菌株；
(b')对所述菌株的细胞色素P450基因rif16和/或转酮酶基因rif15进行检测，或对其所编码的酶的活性进行测定，
如果所述菌株中没有细胞色素P450基因rif16和/或转酮酶基因rif15或其所编码的酶的活性，则表明该菌株可用于生产利福霉素SV。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基因的检测是通过选自下组的方法测定的：PCR测序或Southern杂交。
9.一种生产利福霉素SV或利福霉素S的方法，所述方法包括：
A)提供权利要求1-4中任一项所述的菌株、用权利要求5-6中任一项所述的方法产生的菌株、或用权利要求7-8中任一项所述的方法筛选得到的菌株；
B)用所述菌株生产利福霉素SV或利福霉素S；以及
C)任选地，用步骤B)所得的利福霉素SV或利福霉素S进一步生产选自下组的利福霉素衍生物：利福布汀、利福喷汀或利福平。
10.细胞色素P450基因rif16或转酮酶基因rif15或它们所编码的蛋白的用途，其用于阻断利福霉素SV转化为利福霉素B。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450基因rif16或转酮酶基因rif15或它们所编码的蛋白来源于地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)。
12.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450基因rif16或转酮酶基因rif15或它们所编码的蛋白来自产利福霉素B的菌株。
13.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450基因rif16或转酮酶基因rif15或它们所编码的蛋白是单独应用或组合应用的。
14.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450基因rif16选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:24所示序列的核苷酸序列；和
所述转酮酶基因rif15选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:23所示序列的核苷酸序列。
15.如权利要求10所述的用途，其特征在于，在所述用途中，通过分别或同时阻断细胞色素P450基因rif16或转酮酶基因rif15表达，阻断利福霉素SV转化为利福霉素B。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述阻断是通过基因敲除、基因置换、基因沉默或蛋白抑制剂实现的。
17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述阻断是使得产利福霉素B的地中海拟无枝菌酸菌中rif16基因所编码的蛋白质中第84位的R突变为W。
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