CN104073507A - 一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents
一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用。斑鸠霉素的生物合成基因簇,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3411-15678位所示,包含3个基因:杂合的聚酮/非核糖体聚肽合成酶基因ikaA、FAD依赖的氧化还原酶基因ikaB及类Michael环化反应酶基因ikaC。本发明所提供的斑鸠霉素的生物合成相关的所有基因和蛋白信息,有助于阐释多环tetramate大环内酰胺家族天然产物的生物合成机制,为进一步遗传改造提供理论基础和材料。本发明所提供的基因及蛋白可以用于自然界中挖掘或创制可用于医药卫生及工农业的化合物或基因和蛋白。
Description
技术领域:
本发明属于微生物基因工程领域,具体涉及一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用。
背景技术:
斑鸠霉素(Ikarugamycin)属于多环tetramate大环内酰胺类化合物,其结构式如图1的式1所示,其具有独特5-6-5三环系统以及抗菌及抗肿瘤细胞等多种生物活性。目前斑鸠霉素已作为抗肿瘤先导化合物引起关注,相应的具体药理机制正在深入研究中。
近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术,为改造斑鸠霉素的生产菌Streptomyces sp.ZJ306带来了新的机遇。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上,人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作,不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物,而且还可以提高天然产物的产量,或定向积累所需要的天然产物,为天然产物的发现和药物开发提供化合物结构和生物活性多样化。
迄今为止,有关珠江口源微生物中斑鸠霉素生物合成基因簇、类Michael环化反应酶等生物催化制备斑鸠霉素及基因敲除获得斑鸠霉素类似物等,国内外尚未见报道。
发明内容:
本发明的目的是提供一种斑鸠霉素的生物合成基因簇。
本发明是以珠江口沉积物源放线菌Streptomyces sp.ZJ306中斑鸠霉素为目标分子,在筛选到生物合成基因簇基础上,综合运用分子生物学、微生物学、合成生物学、生物化学及有机化学相结合的技术,阐明了斑鸠霉素的生物合成机制,为利用组合生物合成方法修饰改造斑鸠霉素类似物提供依据,为药物筛选提供化合物实体。
本发明的斑鸠霉素生物合成基因簇来源于珠江口沉积物放线菌Streptomyces sp.ZJ306,其特征在于,该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3411-15678位的碱基序列所示,包括3个基因,具体为:
(1)负责斑鸠霉素的聚酮-鸟氨酸-聚酮骨架合成的基因,即ikaA,位于核苷酸序列(SEQID NO.1,下同)第3411-12785个碱基处,长度为9375个碱基对,编码杂合的聚酮/非核糖体聚肽合成酶,3124个氨基酸;
(2)负责斑鸠霉素骨架合成修饰的另一个基因,即ikaB,位于核苷酸序列第12782-14614个碱基处,长度为1833个碱基对,编码FAD依赖的氧化还原酶,610个氨基酸;
(3)负责斑鸠霉素的还原型环化反应的基因,即ikaC,位于核苷酸序列第14614-15678个碱基处,长度1065个碱基对,编码乙醇脱氢酶,354个氨基酸。
SEQ ID NO.1(序列表)所示序列的第3411-15678位碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到,且第3411-15678位碱基序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应DNA或DNA重组技术获得。
本发明提供了构建至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段的重组DNA载体途径。
本发明还提供了创制斑鸠霉素生物合成基因被阻断或异源表达等其他基因改造的途径,至少其中之一的基因包含SEQ ID NO.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可使用PCR探针法或Southern杂交等技术,从其他生物体重筛选获得斑鸠霉素的生物合成基因簇同源基因。
本发明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可用于Streptomyces sp.ZJ306基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包括本发明中的部分序列,也包含Streptomyces sp.ZJ306基因组中邻近区域未克隆DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段,可以被体内外突变等修饰,包括插入、置换、缺失、易错聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列重组、定向进化等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆,可以通过合适表达系统在外源宿主中表达生产相应酶或者提高生物活性化合物产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母及动植物等。
本发明提供的氨基酸序列可以用于分离所需蛋白并可用于抗体制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或者部分序列的多肽,可能在去除或者替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性,或提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达及揭示它们在宿主代谢中的功能。
包含本发明所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过DNA重组技术构建重组载体,以获得新型生物合成途径,也可以通过插入、置换、缺失或失活,进而获得其他基于生物合成途径的新结构化合物。
本发明提供了斑鸠霉素的生物合成基因簇在制备斑鸠霉素及其类似物中的应用。
本发明提供了一种类Michael环化反应酶基因ikaC,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ IDNO.1第14614-15678位碱基所示。
上述类Michael环化反应酶基因ikaC编码的类Michael反应环化酶IkaC。
类Michael反应环化酶IkaC在制备斑鸠霉素中的应用,如催化化合物3形成斑鸠霉素化合物1。
本发明提供了类Michael环化反应酶基因缺失突变株中斑鸠霉素类似物的创制应用。
总之本发明所提供的包括斑鸠霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息,帮助人们理解多环tetramate大环内酰胺家族天然产物的还原型环化等关键机制,为进一步遗传改造提供材料和理论基础。本发明所提供的基因和蛋白质可以用来寻找和发现可用于医药、卫生或农业的多环tetramate大环内酰胺家族、基因或蛋白。
本发明的放线菌Streptomyces sp.ZJ306于2014年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉武汉大学,其保藏编号为:CCTCC NO.M2014081。
附图说明:
图1是斑鸠霉素(化合物1)及生物合成中间体化合物3、以及化合物2的化学结构式。
图2是Streptomyces sp.ZJ306中斑鸠霉素的生物合成基因簇结构示意图和限制性内切酶谱(S,SacI;E,EcoRI;B,BglII;P,PvuI.)。
图3A是遗传改造Streptomyces sp.ZJ306中斑鸠霉素生物合成基因簇获得的突变株,在发酵培养基中的丁酮粗提物的HPLC分析图:I:野生型Streptomyces sp.ZJ306;II:突变株ΔikaA;III:突变株ΔikaB;IV:突变株ΔikaC;图中阿拉伯数字表示斑鸠霉素及其中间体,其中1、2和3分别代表图1中的式1、式2和式3表示的化合物。
图3B是ikaA、ikaAB和ikaABC在S.lividans TK64中表达的工程菌株发酵产物HPLC分析图。如图:V:TK64/pCSG3611(ika cluster);VI:TK64/pCSG3615(ikaA);VII:TK64/pCSG3614(ikaAB);VIII:TK64/pCSG3613(ikaABC);IX:TK64/pSET152。图中阿拉伯数字表示斑鸠霉素及其中间体,其中1、2和3分别代表图1中的式1、式2和式3表示的化合物。
图4是orf1、orf2、orf3、orf4和orf5的双交换突变株,在发酵培养基中的丁酮粗提取的HPLC图。(i)野生型Streptomyces sp.ZJ306;(ii)Δorf1突变株;(iii)Δorf2突变株;(iv)Δorf3突变株;(v)Δorf4突变株;(vi)Δorf5突变株,其中1、2和3分别代表图1中的式1、式2和式3表示的化合物。
图5是化合物1的1H核磁共振谱结果。
图6是化合物1的13C和EDPT核磁共振谱结果。
图7A和7B分别是化合物2的HRESIMS和MS/MS结果。
图8-14分别是化合物3的HR-ESI-MS、1H、13C、EDPT、HSQC、1H-1H COSY、HMBC和NOESY的核磁共振谱结果。
图15A是纯化的重组IkaC的SDS-PAGE结果。
图15B是图1中式3表示的化合物作为底物在IkaC催化作用下生成斑鸠霉素的HPLC分析图。(i)斑鸠霉素标准品1;(ii)标准反应体系:3,IkaC和NADPH;(iii)3,heat-denatured IkaC和NADPH;(iv)3和IkaC。
图16提出的斑鸠霉素生物合成途径。
具体实施方式:
以下是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
1.克隆分析斑鸠霉素的生物合成基因簇
斑鸠霉素(图1的式1所示)属于多环tetramate大环内酰胺家族(PTM)天然产物,由杂合的聚酮/非核糖体聚肽合成酶催化产生,因此针对聚酮/非核糖体聚肽合成酶基因的保守结构域,设计兼并引物C5F/C7R。通过PCR扩增获得一个约0.8kb的PCR片段,连接到T载体中,测序后,进行序列比对,结果表明与PTM的杂合聚酮/非核糖体聚肽合成酶基因具有高度同源性。根据测序结果,设计特异引物306-CF/306-CR,对Streptomyces sp.ZJ306基因组文库约2000个克隆进行筛选,获得10个不同的阳性克隆。通过限制性内切酶酶切分析,确定了10个不同的阳性克隆相对位置。经过末端测序分析,选取阳性克隆pCSG3500使用鸟枪法全测序,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.斑鸠霉素的生物合成基因簇中各基因体内功能分析。
本发明对斑鸠霉素的生物合成机制进行了研究。对pCSG3500测序结果,运用生物信息学分析,显示包含25个ORF,预测ikaA、ikaB和ikaC负责斑鸠霉素的生物合成(表1和图2)。
构建了Streptomyces sp.ZJ306的遗传操作系统,在斑鸠霉素生产菌株进行体内基因敲除,构建双交换突变株(检测引物和基因敲除引物见表2)。
对突变株进行发酵及代谢产物HPLC分析,进一步证实ikaA、ikaB和ikaC负责斑鸠霉素的生物合成(图3A),orf1-5不参与斑鸠霉素的生物合成(图4)。采用PCR-targeting技术,敲除了杂合的聚酮/非核糖体肽合成酶基因ikaA的突变株ΔikaA丧失了生产斑鸠霉素及相关化合物的能力;敲除了FAD依赖的氧化还原酶基因ikaB的突变株ΔikaB不再生产斑鸠霉素,而产生了新化合物2。敲除了类Michael环化反应酶基因ikaC的突变株,也不再生产斑鸠霉素,产生了新化合物3。
表1斑鸠霉素的生物合成基因簇的基因及其功能
a氨基酸数目;b括号内包含同源蛋白GenBank登录号;c一致性/相似性(identity/similarity)
表2:本发明中使用的引物
3.斑鸠霉素的生物合成基因簇在模式菌株链霉菌S.lividans TK64的异源组合表达。
本发明使用分子生物学技术,构建了4个基于质粒pSET152的载体pCSG3611,pCSG3613–3615(图2)。pCSG3611的插入片段包含ikaA-orf13,位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第2866-32536个碱基处。pCSG3613的插入片段包含ikaA-ikaC,位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第2866-17556个碱基处。pCSG3614的插入片段包括ikaAB,位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第2866-14792个碱基处。pCSG3615的插入片段包含ikaA表达盒,位于核苷酸序列SEQ IDNO.1第2866-13065个碱基处。将上述片段分别插入质粒pSET152中,分别获得载体pCSG3611,pCSG3613–3615。然后再将载体pCSG3611,pCSG3613–3615分别转化进入S.lividans TK64菌中,分别得到TK64/pCSG3611、TK64/pCSG3613、TK64/pCSG3614、TK64/pCSG3615的链霉菌TK64转化子,以转入空载体pSET152作为对照(TK64/pSET152)。
pCSG3611的链霉菌TK64转化子(TK64/pCSG3611),成功异源表达了化合物1(斑鸠霉素)及中间体化合物3。该结果表明ikaA上游的orf(-1)-orf(-4)不是合成斑鸠霉素的必要基因。携带完整的杂合聚酮/非核糖体肽合成酶基因的ikaA的pCSG3615链霉菌TK64转化子(TK64/pCSG3615),表达了少量的化合物2。携带完整ikaAB的pCSG3614的链霉菌TK64转化子(TK64/pCSG3614)成功合成了化合物3和少量化合物2。携带完整ikaABC的pCSG3613的链霉菌TK64转化子(TK64/pCSG3613)成功合成了化合物1(斑鸠霉素)和3。
由此充分证实ikaABC三个基因组合是合成斑鸠霉素的最小基因簇,并成功实现了ikaABC三个基因组合,在异源细胞工厂TK64中生产斑鸠霉素及其结构类似物,提供了创制斑鸠霉素及其中间体化合物的新策略(图3B)。
4.斑鸠霉素及其中间体的分离鉴定:
将培养皿上活化的Streptomyces sp.ZJ306等量分别每瓶含有50mL AM6培养基的250mL的锥形培养瓶中,28℃,200r·min-1,培养48h,制得种子液。将种子液以10%的接种量转接至AM6发酵培养基(置于1000mL的锥形培养瓶,每瓶含有200ml培养基)中,28℃,200r·min-1,振荡培养96h。发酵产物使用等体积丁酮萃取,静置分层。将丁酮萃取液与水相分离,用旋转蒸发仪将丁酮蒸干,获得发酵粗提物。采用正相硅胶柱层析、反相中压液相色谱及凝胶层析等技术纯化获得1和3,并采用核磁共振谱法鉴定结构(图5-6和8-14)。将化合物1的氢谱碳谱与文献[Ito S&Hirata Y(1977)The structure of ikarugamycin,an acyltetramicacid antibiotic possessing a unique as-hydrindacene skeleton.Bull Chem Soc Jpn50(7):1813-1820.]比较,发现化合物1为已知化合物斑鸠霉素。分析化合物3的氢谱碳谱发现它与斑鸠霉素(化合物1)相似,不同之处在于化合物1中C-4,C-5,C-15,和C-16的亚甲基或次甲基在化合物3中由这些烯键的碳所取代[δH6.35(H-4);δc132.3(CH,C-4)],[δH5.76(H-5);δc141.3(CH,C-5)],[δH5.88(H-15);δc141.1(CH,C-15)],[δH6.34(H-16);δc133.7(CH,C-16)],这说明化合物3与化合物1的区别是化合物3失去了五元环。化合物1和化合物3的具体结构如图1中的式1和式2所示。
5.类Michael环化反应酶IkaC体外酶催化体系的构建。
使用PCR技术、酶切连接等分子生物学方法,将ikaC基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a。将IkaC的表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达后,收集细胞,超声破碎获取粗酶液;镍柱亲和层析纯化、SDS-PAGE和Bradford法蛋白浓度测定等,最终获得高纯度IkaC重组酶(图15A)。每100ul IkaC酶催化体系反应体系包含200um的化合物3、2mMNADPH、10ug纯化的IkaC重组酶。该反应于pH8.0的磷酸盐缓冲液中28度温育10小时完成。利用该体系成功将前体化合物3催化成斑鸠霉素(化合物1)(图15B)。
以下进一步提供实施实例,这些实施实例有助于理解本发明,仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
实施例1
斑鸠霉素生产菌Streptomyces sp.ZJ306的基因组DNA的提取:
将新鲜Streptomyces sp.ZJ306的菌丝体按照5%的接种量接种于50mL的TSB培养基(胰蛋白胨17g,植物蛋白胨3g,氯化钠5g,磷酸氢二钾2.5g,葡萄糖2.5g,加水至1L,pH7.2-7.4)中,28-30℃,振荡培养约3-4天,4000rpm离心10分钟收集菌丝体。菌丝体用STE溶液(NaCl75mM,EDTA25mM,Tris-Cl20mM)洗涤两次,向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液和终浓度3mg/mL的溶菌酶,涡旋均匀,37℃温浴3小时,加入至终浓度0.1-0.2mg/mL的蛋白酶K,混匀,37℃温浴10分钟,加入至终浓度1-2%的SDS,混匀,放入55℃水浴约1小时,期间颠倒数次。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(V/V/V=25:24:1),混合均匀,置于冰上冷却30分钟。12000rpm,4℃离心10分钟,然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离心管中,用同样的方法反复处理3次,然后用等体积的氯仿洗涤两次,12000rpm,4℃离心10分钟。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管,加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2),混匀后再加入等体积的异丙醇,混匀后冰上放置,沉淀DNA。小心地用玻璃棒将DNA纤维团转移至新的离心管中,用70%乙醇洗涤两次,将液体倾出,在37℃下略微烘干,加5mL TE溶解,并加入3-5U的RNA酶,由此得到Streptomyces sp.ZJ306的基因组DNA。
实施例2
斑鸠霉素生产菌Streptomyces sp.ZJ306全基因组文库的建立:
首先通过一系列的稀释实验来确定限制性核酸内切酶Sau3A I的用量,在20μL体系中,含有17μL的基因组DNA,2μL的10×反应缓冲液和1μL不同稀释度的Sau3A I,其终止反应为4μL0.5mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了0.025-0.05U的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于40kb的基因组DNA片段,用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。
用于构建文库的载体SuperCos l质粒先用限制性核酸内切酶Xba I从两个cos序列中间切开,然后进行去磷酸化处理,再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶Bam HI切开,获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的约40kb的基因组DNA片段连接过夜,连接体系为10μL,含有1.25μg制备的基因组DNA和0.5μg处理后的SuperCos1质粒,1μL的10×Buffer,0.3U的连接酶。连接产物与65℃处理15分钟,使连接酶失活。从-80℃冰箱中取出一管包装混合物(50μL)置于冰上,将包装混合物在指间迅速融化,小心吸取一半包装混合物(25μL)至一个新的离心管中,加入10μL热处理后的连接产物,其余包装混合物于-80℃保存。小心混匀,30℃温浴90分钟,加入另外一半包装混合物(25μL),30℃温浴继续90分钟。加入500μL噬菌体稀释缓冲液(100mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl2,10mmol/L pH8.3Tris-HCl),再加入25μL氯仿,轻轻混匀,于4℃保存,由此得到包装液。
将冻存于-80℃的菌株E.coli LM392MP涂布在LB培养基上复苏。包装反应前一天,挑取单克隆接种于LB培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mM MgSO4),37℃振荡培养过夜,包装反应当天,取5mL过夜培养的菌液加入到50mL新鲜的LB培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mM MgSO4),37℃,200rpm振荡至培养物OD600达到0.8-1时,4℃保存备用。取100μL如上处理的宿主菌液和100μL适度稀释的包装液轻轻混匀,于37℃温浴15分钟,然后涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上,37℃培养过夜。将长出来的单个克隆子,用无菌牙签点种于25块含合适抗生素的LB的96孔板上,37℃培养过夜,加入终浓度为20%的甘油,混合均匀,置于-80℃保存,得到Streptomyces sp.ZJ306全基因组文库。根据测序结果,设计特异引物306-CF/306-CR,对Streptomyces sp.ZJ306基因组文库约2000个克隆进行筛选,获得10个不同的阳性克隆。通过限制性内切酶酶切分析,确定了10个不同的阳性克隆相对位置。经过末端测序分析,选取阳性克隆pCSG3500使用鸟枪法全测序。阳性克隆pCSG3500的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例3
斑鸠霉素生产菌Streptomyces sp.ZJ306遗传转移系统的建立及基因中断突变菌株的获得,以敲除类Michael环化反应酶基因ikaC为例:
利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的斑鸠霉素生物合成基因簇序列,参照文献报道的PCR-targeting系统,设计一对ikaC基因的敲除引物,引物序列见于表2中的ikaC敲除引物ikaCKF/ikaCKR。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到接合转移的供体菌中。具体步骤如下:(1)将cosmid质粒pCSG3500转入大肠杆菌E.coliBW25113/pIJ790中获得E.coli BW25113/pIJ790/pCSG3500,用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达,并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773,回收其中约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段,以此作为PCR模板,用引物ikaCKF/ikaCKR通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物,50μL的PCR反应体系:高保真DNA聚合酶3U,10×Buffer5μL,dNTPs0.5mmol/L,DMSO2.5μL,引物各0.5μmol/L,DNA模板约1ng,加水补至50μL。PCR反应条件为:预变性94℃5min;扩增循环为94℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸90s,30个循环;最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组,涂布于LB筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素,50μg/mL阿泊拉霉素)上,37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆,抽提质粒,重组质粒命名为pCSG3553,该质粒中的ikaC基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pCSG3553转化到E.coli ET12567/pUZ8002中,构建成E.coliET12567/pUZ8002/pCSG3553,作为接合转移的供体菌。
放线菌ZJ306在38#培养基平板中划线培养3-5天,长出的孢子用无菌棉签收集于含3%海盐的TSB培养基中,涡旋振荡,使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子,孢子悬浮于5mL含3%海盐的TSB培养基中,50℃热激10min,然后于28℃萌发2小时,作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG3553在50mL含50μg/mL卡那霉素,25μg/mL氯霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.8时,离心收集菌体(4000rpm,10min),用LB清洗菌体3遍,悬浮于300μL LB培养基中,作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀,涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上,吹干后,于28℃培养18-20h。然后将平板取出,用含有抗生素的水覆盖平板,其终浓度为35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶,吹干后,置于28℃培养箱中,培养5-7天后观察。
当接合转移平板上长出菌落后,用无菌牙签将其转接到含有35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的ISP4平板上,28℃培养3天后,抽取各个突变株的基因组DNA,利用检测引物ikaCF/R(引物序列见于表2)通过PCR检测获得阳性克隆,即获得ikaC敲除双交换突变菌株△ikaC。
其他各个基因的敲除引物和突变株检测引物参见表2,参照上述方法,利用PCR-targeting技术获得各个基因敲除的突变菌株。
具体如下:
敲除了ikaA–杂合聚酮/非核糖体肽合成酶基因,获得突变株△ikaA;敲除了ikaB-FAD依赖的氧化还原酶基因,获得突变株△ikaB;此外分别敲除了orf1基因、orf2基因、orf3基因、orf4基因和orf5基因,分别获得突变株△orf1、△orf2、△orf3、△orf4、△orf5。
实施例4
斑鸠霉素及其中间体的生物发酵与检测:
将放线菌ZJ306野生菌或突变株(△ikaA、△ikaB、△ikaC等)活化后,按1%的接种量分别加入到250ml摇瓶的50ml AM6液体培养基(可溶性淀粉20g/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉5g/L,碳酸钙5g/L,3g/L海盐)中,于28℃,200r.p.m,培养5d后,加入等体积丁酮,超声破碎细胞10min,然后静置分层。将上层丁酮萃取液与水相分离,使用旋转蒸发仪蒸干。粗提物使用二甲基亚砜溶解,进行HPLC检测,分析条件为:菲罗门Luna C18(5μm,150×4.6mm)反相柱,流动相A相为10%乙腈,含0.1%三氟乙酸(TFA),流动相B相为90%乙腈;流速为1ml/min。检测波长为360nm和245nm。HPLC程序:0-15min,5%Bto100%B(线性梯度),15-22min100%B,22-24min,100%B to5%B,24-30min5%B。
Claims (6)
1.一种斑鸠霉素的生物合成基因簇,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3411-15678位的碱基序列所示。
2.权利要求1所述的斑鸠霉素的生物合成基因簇在制备斑鸠霉素及其类似物中的应用。
3.一种类Michael环化反应酶基因ikaC,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1第14614-15678位碱基所示。
4.一种权利要求3所述的类Michael环化反应酶基因ikaC编码的类Michael反应环化酶IkaC。
5.权利要求4所述的类Michael反应环化酶IkaC在催化式3所述的化合物3形成斑鸠霉素中的应用;
6.放线菌Streptomyces sp.ZJ306,其保藏编号为:CCTCC NO.M2014081。
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