CN111926393A - 一种测序文库的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测序文库的构建方法及其应用，所述方法包括以下步骤：(1)将M个待测序样本分别转入感受态细菌，划线过夜培养；(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，进行单独培养；(3)将包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；(4)对N份混合菌液分别提取质粒，线性化酶切；(5)向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后得到测序文库；其中，M和N为正整数。本发明采用混合抽提酶切步骤，在提高样本量的同时，省去了单克隆筛选过程，减少了99％的质粒抽提工作，有利于实现三代测序替代一代测序应用于基因合成中。

Description

一种测序文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

传统的工业化基因合成过程中，合成的片段需要导入载体进行测序验证，目前大多采用一代Sanger测序，使用的仪器是ABI公司的3730测序仪，一次可以进行96个反应，每个反应的测序读长约700bp，共计约76200bp。Sanger 测序的具体步骤为：将含有插入片段的载体转移到感受态细菌中，均匀涂抹于培养皿中过夜培养；挑选单克隆菌株在200μL培养基中培养2小时；用特异引物进行PCR扩增，将得到的条带进行Sanger测序验证，将测序结果与标准序列进行人工比对，选择100％正确的克隆进行下一步实验。然而，采用Sanger法进行测序验证，前期需要花费大量的人力进行样本扩增和筛选，成本高、耗时长。

CN 107760672 A公开了一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法，该方法包括如下步骤：将待合成的序列拆分成多段小片段，然后用首尾合成引物合成拆分的多段小片段；采用5’端含有20个随机碱基的扩增用上下游引物对合成的小片段进行扩增；将扩增后的所有小片段混合，然后采用二代测序技术进行测序，将测序结果进行对比分析，找到与预期完全一致的序列，从而确定该序列两端的随机序列为所需序列，然后根据所需序列设计调取引物；采用调取引物对扩增后的小片段进行第一轮调取扩增，然后首尾合成引物进行第二轮调取扩增，然后将第二轮调取扩增后的片段进行组装即得序列产物。但是，该方法需要对样本进行拆分，设计多组引物进行PCR扩增，过程繁琐、耗时较长，且对高GC、高重复序列或含有poly结构的特殊样本测序效果差、测序准确度低。

三代Pacbio测序基于单分子实时测序和零模波导孔技术，可以对每个文库进行独立的单分子测序，测序过程由于不进行PCR扩增，无GC偏好性，测序深度达20×，测序准确度达99.99％，测序读长可达100kb以上。Pacbio测序芯片上有1百万个零模波导孔，读长达数千碱基，不需要额外设计测序引物，可以同时进行上万个样本的测序，在规定的样本数量内，测序成本不会随样本量的增加而升高。但是，三代测序在基因合成中的应用受限于样本数量大，建库成本高等条件，无法真正运用起来。

如何将三代测序替代一代或二代测序应用于基因合成，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种混合抽提酶切方法及其应用，所述方法将菌液混合后抽提质粒，将质粒酶切后得到的线性化片段加标签序列进行三代测序，最后使用自动化拆分分析程序对结果进行处理，实现了大规模低成本对大量克隆进行三代测序，并成功应用于基因合成中。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种测序文库的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待测序样本分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，进行单独培养；

(3)将包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，线性化酶切；

(5)向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后得到测序文库；

其中，M和N为正整数。

本发明中，文库构建过程中采用混合抽提酶切步骤，在提高样本量的同时，省去了单克隆筛选过程，减少了99％的质粒抽提工作，缩短了菌液培养时间，有利于实现三代测序替代一代测序应用于基因合成中。

优选地，步骤(1)所述待测序样本包括合成的基因片段。

优选地，所述基因片段的长度为500-10000bp，例如可以是500bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp或 10000bp，优选为4000-6000bp。

本发明中，文库构建过程和测序过程不涉及PCR，无需对待测序样本进行拆分，测序结果无需拼接组装，直接通过分析程序进行处理，实现了长片段的完整测序，显著降低了测序成本。

优选地，步骤(2)所述培养在96孔板中进行。

优选地，步骤(4)所述酶切采用限制性内切酶进行。

本发明中，根据质粒信息选取合适的酶切位点和限制性内切酶，对质粒进行线性化，所述限制性内切酶包括但不限于EcoR I、BamH I、Hind II、Hind III、 Alu I、BsuR I、Bal I、Hal III、HPa I或Sma I中的任意一种。

优选地，在步骤(5)之前还包括对线性化酶切质粒进行修复的步骤。

优选地，所述修复包括损伤修复和/或末端修复。

本发明中，通过对线性化酶切质粒进行修复，使产物呈完整的双链DNA，有利于后续三代测序的进行。

优选地，步骤(5)所述标签序列通过DNA连接酶连接在线性化质粒的两端。

优选地，在步骤(5)之后还包括对文库进行回收纯化的步骤。

优选地，所述回收纯化包括采用磁珠回收后，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA。

作为优选技术方案，本发明提供了一种测序文库的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待验证的长度为500-10000bp合成的基因片段分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，单独培养在 96孔板的同一列中；

(3)将96孔板中同一行的包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，采用限制性内切酶进行线性化酶切，修复后得到完整双链的质粒DNA；

(5)采用DNA连接酶向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后用磁珠回收一次，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA，得到测序文库；

其中，M和N为正整数。

第二方面，本发明提供了一种基于三代测序的测序验证方法，所述方法包括以下步骤：

(1’)采用如第一方面所述的方法进行文库构建；

(2’)对构建的文库进行浓度和分布范围的检测；

(3’)三代测序；

(4’)结果分析。

优选地，步骤(3’)所述三代测序包括Pacbio单分子荧光测序和/或纳米孔测序，优选为Pacbio单分子荧光测序。

优选地，步骤(4’)所述结果分析包括：

根据标签序列和待测序样本的保守序列拆分测序结果；

去除低丰度CCS序列；

将测序结果与参考序列进行比对。

本发明中，标签序列用于确定混合菌液的编号，待测样本的保守序列用于确定混合菌液中样本的种类，通过自动化拆分分析程序，根据标签序列和待测序样本的保守序列拆分测序结果，实现了测序结果与样本的自动化对应。

本发明中，术语“低丰度CCS序列”指丰度小于3的CCS序列。

第三方面，本发明提供了一种基因合成方法，所述方法包括将合成的基因片段采用如第二方面所述的方法进行测序验证的步骤。

作为优选技术方案，本发明提供了一种基因合成方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待验证的长度为500-10000bp合成的基因片段分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，单独培养在 96孔板的同一列中；

(3)将96孔板中同一行的包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，采用限制性内切酶进行线性化酶切，修复后得到完整双链的质粒DNA；

(5)采用DNA连接酶向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后用磁珠回收一次，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA，得到测序文库；

(6)对构建的文库进行浓度和分布范围的检测；

(7)Pacbio单分子荧光测序；

(8)根据标签序列和待验证基因片段的保守序列拆分测序结果，去除小于 3的低丰度CCS序列，将测序结果与参考序列进行比对。

第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的测序文库的构建方法和/或如第二方面所述的基于三代测序的测序验证方法在基因合成中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明将菌液混合后抽提质粒，将质粒酶切后得到的线性化片段加标签序列进行三代测序，最后使用自动化拆分分析程序对结果进行处理，在提高样本量的同时，省去了单克隆筛选过程，减少了99％的质粒抽提工作，缩短了菌液培养时间，并成功应用于基因合成中；

(2)本发明采用三代测序进行合成基因的测序验证，一次测序可以至少完成5000个单克隆的测序，按照每个单克隆长度为5000bp，共计约2.5×10⁷bp，单个碱基的测序成本仅为Sanger测序的4.7％，实现了大规模低成本对大量克隆进行三代测序；

(3)本发明采用混合抽提酶切步骤，不涉及扩增，对基因序列没有限制，不需要对序列进行拆分，测序结果无需组装，可以通过分析程序进行处理，实现了基因的全长测序。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1文库构建

本实施例通过基因合成的方法合成了600条基因，编号为1、2、3……600，示例性地，本实施例列举6条基因的参考序列SEQ ID NO:1～6，序列信息详见序列表。

(1)将600条待验证的基因分别转入感受态细菌，涂平板后进行过夜培养；

(2)整理过夜培养后的平板，每条基因挑取8个圆润、独立、饱满的菌落，以表1-1和表1-2所示的对应方式放入50块96孔板中进行培养，共得到4800 个单克隆：

表1-1

表1-2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

13A

14A

15A

16A

17A

18A

19A

20A

21A

22A

23A

24A

B

13B

14B

15B

16B

17B

18B

19B

20B

21B

22B

23B

24B

C

13C

14C

15C

16C

17C

18C

19C

20C

21C

22C

23C

24C

D

13D

14D

15D

16D

17D

18D

19D

20D

21D

22D

23D

24D

E

13E

14E

15E

16E

17E

18E

19E

20E

21E

22E

23E

24E

F

13F

14F

15F

16F

17F

18F

19F

20F

21F

22F

23F

24F

G

13G

14G

15G

16G

17G

18G

19G

20G

21G

22G

23G

24G

H

13H

14H

15H

16H

17H

18H

19H

20H

21H

22H

23H

24H

……

(3)待培养一定时长后，将50块96孔板中字母相同的菌液混合，得到8 份混合菌液AB…H；

(4)采用AXYGEN质粒抽提试剂盒对8份混合菌液进行抽提，得到8份混合质粒AB…H，采用Hind III限制性内切酶对混合质粒进行线性化酶切，得到8份混合的线性化质粒AB…H；

(5)使用Qubit 3.0进行定量，每份样品取150-200ng DNA进行SMRTbell 文库构建：对线性化质粒进行DNA修复后，采用T4DNA连接酶将如表2所示的标签序列连接到双链DNA上，连接反应结束后，将加有不同标签序列的8 份样品混合，用1.0×AMPure beads回收一次，再用核酸酶III和VII消化未连接上标签的双链DNA，得到纯化的文库。

表2

编号	序列
		SEQ ID NO:7	CGTCTGACTACTCACG
SEQ ID NO:8	CAACTGACTACTCACG
		SEQ ID NO:9	CCCCTGACTACTCACG
SEQ ID NO:10	CGGCTGACTACTCACG
		SEQ ID NO:11	CTTCTGACTACTCACG
SEQ ID NO:12	CATCTGACTACTCACG
		SEQ ID NO:13	CCTCTGACTACTCACG
SEQ ID NO:14	CTCCTGACTACTCACG

实施例2 Pacbio Sequel测序和结果分析

(1)将实施例1纯化的文库进行QC，采用Qubit定量检测文库浓度和 Aglient 2100检测文库的分布与大小；

(2)根据经验选择上机浓度为3pM，加入测序引物Pacbio Sequencing Primer v3和酶Sequel DNA Polymerase 2.1，进行Pacbio Sequel测序，耗时约13 小时；

(3)测序完成后，自动化分析流程检测到完成信号，开始进行生物信息学分析，并生成分析结果，具体步骤为：

a)分析流程定时检查测序结果目录，判断测序是否已经完成，并且数据是否已经上传完毕；

b)测序数据上传完成，启动Pacbio data质量矫正程序，依据设置的 passnumber大于10，生产高质量的测序片段；

c)利用提供的index信息和每个克隆的标签序列信息，进行数据拆分，在拆分的同时，去除低丰度(小于3)的CCS序列，将测序结果对应到每个测序样本，并统计不能进行拆分的数据信息；

d)根据合成序列两端的质粒保守序列，从测序序列中提取目标合成序列信息，并与参考序列进行比对，比对软件采用Minimap2；

e)统计比对结果中与参考序列一致的测序序列数目，突变序列数目，统计结果提供该样本测序序列中最优序列的结果和最高丰度序列比对结果；

f)对于有突变的序列，提供测序序列与参考序列的BLAST比对结果，展示突变信息，辅助进行序列修复；

g)将所有分析结果整理到GS上机信息表中。

在编号为0227-Amp-1的96孔板中，F1孔对应的参考序列编号为LB3214-1，克隆编号为L008133，参考序列长662bp，具体的序列信息如SEQ ID NO:1所示。

根据提供的index信息(TTTATTATTAGCATATAAAA)、单克隆的标签序列信息(CGTCTGACTACTCACG，CGTCTGACTACTCACG)、载体标签序列 gaattgacgcgtattgggat和atcccaatggcgcgccgagc后，比对上最优的PacBio测序序列与参考序列100％精确匹配，无突变位点，丰度为108，最优序列的丰度占该标签序列下总丰度的95.575％。

该标签序列下最高丰度的测序序列与参考序列100％精确匹配，无突变位点，丰度为108，最优序列的丰度占该标签序列下总丰度的95.575％，该标签序列下总丰度占总reads数为113。

对比例1

与实施例2相比，将实施例1纯化的文库采用一代测序进行测序验证。

对比例2

与实施例2相比，将实施例1纯化的文库采用二代测序进行测序验证。

实施例2、对比例1和对比例2的测序验证方法的时长和单个碱基成本见表3。

表3

编号	测序方法	耗时(h)	100个碱基成本(元)
				实施例2	Pacbio Sequel测序	13	0.139
对比例1	一代测序	2040	1.667
				对比例2	二代测序	40	8.403

由此可见，在基因合成的应用中，采用三代测序进行测序验证，相较于一代和二代测序，不仅缩短了测序时长，而且显著降低了测序成本。

综上所述，本发明采用混合抽提酶切步骤，将质粒酶切后得到的线性化片段加标签序列进行三代测序，最后使用自动化拆分分析程序对结果进行处理，在提高样本量的同时，省去了单克隆筛选过程，减少了99％的质粒抽提工作，缩短了菌液培养时间，降低了测序成本，将测序结果与样本自动化对应，实现了三代测序替代一代测序应用于基因合成中。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 苏州金唯智生物科技有限公司

<120> 一种测序文库的构建方法及其应用

<130> 20190508

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 662

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

gaattcgtga ttatgtggat agaggaaaac aaagtttaga aaccatttgt ttattattag 60

catataaaat aaaatatcct gaaaattttt ttttattaag aggtaaccac gaatgcgctt 120

caataaatag aatatacgga ttctatgacg aatgtaaaag aagatatagt gtgaaattat 180

ggaaaacatt tattgattgc tttaattgct tacctgtggc agctattatt gacgaaaaaa 240

ttttttgtat gcatggtggt ttatcacctg aattaaataa tatggaacaa ataaggaaaa 300

taactaggcc tactgatgtt cctgataatg gtttattatg tgatttattg tggtctgatc 360

cagaaaaaga aattaatggg tggggagaaa acgaccgcgg agtttctttc acattcggtc 420

aagatgttgt tcataacttt ttaagaaaag acgaattaga tttaatatgc agggcacatc 480

aggtcgtgga ggatggatat gaattttttg caaagcgcca attagttaca ttattttctg 540

ctcctaatta ttgtggagag tttgataatg ccggtgcaat gatgagtgtt gacgagacat 600

taatgtgttc gtttcaaatt ttaaaaccag tggaaaaaaa gaaagcagca aattaagacg 660

tc 662

<210> 2

<211> 5021

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctaa gtaagcttgg 60

cattccggta ctgttggtaa agccaccatg gccgatgcta agaacattaa gaagggccct 120

gctcccttct accctctgga ggatggcacc gctggcgagc agctgcacaa ggccatgaag 180

aggtatgccc tggtgcctgg caccattgcc ttcaccgatg cccacattga ggtggacatc 240

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attgccctga tcatgaacag ctctgggtct accggcctgc ctaagggcgt ggccctgcct 720

catcgcaccg cctgtgtgcg cttctctcac gcccgcgacc ctattttcgg caaccagatc 780

atccccgaca ccgctattct gagcgtggtg ccattccacc acggcttcgg catgttcacc 840

accctgggct acctgatttg cggctttcgg gtggtgctga tgtaccgctt cgaggaggag 900

ctgttcctgc gcagcctgca agactacaaa attcagtctg ccctgctggt gccaaccctg 960

ttcagcttct tcgctaagag caccctgatc gacaagtacg acctgtctaa cctgcacgag 1020

attgcctctg gcggcgcccc actgtctaag gaggtgggcg aagccgtggc caagcgcttt 1080

catctgccag gcatccgcca gggctacggc ctgaccgaga caaccagcgc cattctgatt 1140

accccagagg gcgacgacaa gcctggcgcc gtgggcaagg tggtgccatt cttcgaggcc 1200

aaggtggtgg acctggacac cggcaagacc ctgggagtga accagcgcgg cgagctgtgt 1260

gtgcgcggcc ctatgattat gtccggctac gtgaataacc ctgaggccac aaacgccctg 1320

atcgacaagg acggctggct gcactctggc gacattgcct actgggacga ggacgagcac 1380

ttcttcatcg tggaccgcct gaagtctctg atcaagtaca agggctacca ggtggcccca 1440

gccgagctgg agtctatcct gctgcagcac cctaacattt tcgacgccgg agtggccggc 1500

ctgcccgacg acgatgccgg cgagctgcct gccgccgtcg tcgtgctgga acacggcaag 1560

accatgaccg agaaggagat cgtggactat gtggccagcc aggtgacaac cgccaagaag 1620

ctgcgcggcg gagtggtgtt cgtggacgag gtgcccaagg gcctgaccgg caagctggac 1680

gcccgcaaga tccgcgagat cctgatcaag gctaagaaag gcggcaagat cgccgtgaat 1740

tctgcttgca agaactggtt cagtagctta agccactttg tgatccacct taacagccac 1800

ggcttccctc ccgaggtgga ggagcaggcc gccggcaccc tgcccatgag ctgcgcccag 1860

gagagcggca tggatagaca ccctgctgct tgcgccagcg ccaggatcaa cgtctagggc 1920

gcggacttta tttatttatt tctttctaga gtcggggcgg ccggccgctt cgagcagaca 1980

tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 2040

ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 2100

aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg 2160

ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cgataaggat ccgtcgaccg 2220

atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc 2280

gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg 2340

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 2400

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 2460

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 2520

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 2580

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 2640

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 2700

aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 2760

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 2820

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 2880

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 2940

gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 3000

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 3060

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 3120

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 3180

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 3240

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 3300

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 3360

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 3420

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 3480

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 3540

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 3600

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 3660

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 3720

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 3780

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 3840

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 3900

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 3960

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catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 4200

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<211> 4200

<212> DNA

<213> 人工合成()

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aagcttatga aggctctgtg ggccctgctg ttggtcccat tgctgacagg atgcctggcc 60

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acacgggcca ggctggctaa agaggtgcag gcgacacagg cccgtctggg agctgacatg 360

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aaagccggtg atcgcatagt atcgaatatg ttgtagcacg ttgtcgtgtg ttattacact 120

gtaagtaaag tgcattagtc atcggtcgta taaccgtatg cggactggaa tcattggtgt 180

cggttatcgg tcagttatcg atcaagccct ccgccctgca cctctcattg aaaggacacc 240

gctgtggatt gtttgggtct acagatgttt agtccattat aatgcaagat gcatgctgat 300

gctcactgaa aatagccgta aacagctgaa aatcgttgat attttggggt gaagaatgac 360

cgaatataag cttgtggtcg tgggagctgg aggcgtaggc aaaagcgctc tcaccatcca 420

actcatccag aaccactttg tggacgaata tgacccaact atagaggact cgtacaggaa 480

gcaggtggtg attgacggag agacgtgtct actggacatc ctggacactg caggtcagga 540

ggagtacagt gccatgaggg accagtacat gaggacagga gagggcttcc tctgtgtctt 600

tgccatcaat aacaccaagt ccttcgagga cattcaccac tacagggagc agataaagcg 660

agtaaaggac tccgaggacg tccccatggt tctggtgggg aataagtgtg atcttcagtc 720

ccacaatgtg gactccaagc aggctcagga tttagcacgc agctacggca tcccatttat 780

agagacctca gcaaagacaa gacagagagt ggaagatgcc ttttatactc tggtacggga 840

gatcagggaa taccggctga gaaaactcag taaagaagaa agacgacaca atgcatcaag 900

cttttggtcc gttgacgcct tgttttatgg cttatgttag cagacgggct gtcagaactg 960

ggtatatttt gcagttggtt tgagtagttt tagcagattt ctaaagagaa gtgtggattt 1020

aaaatggtgt gcagagatta gctgttagac tgcatgcgag tcacttgatt tttgatggaa 1080

ttgaaacttt gaggaactat gattgttatt ttgtttttaa tggaccaaca cttcttttgg 1140

ggagatgatt tgatacatta tcactgtgta tgaccctgcc tttggttgtc ccagacttcc 1200

aaaaacgaca tgcatgtgaa cttccattgt agtcggatta acatgccctc tctataaagc 1260

catggtagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tatatatggt gaaatcttaa ccacgttaac 1320

attatttccc cgtttgcatg ctttatgttc tttaaacttc cagggaacgg tcatgtcttg 1380

aatactgttt aatagccact gttgtgtcgt tggtccagac aggcggtatt gtttaaacat 1440

ggcttttttt tcttttgatt taaatttatg aaggttgttt ggaagctcat ttccaccact 1500

gtattattcc tacttataaa aacaaattac aattctgaat attttgcaat tgcgaggacg 1560

agtctcatgt taatatttgt aatggagttg caaagtctgt taaccttctc cctcaactgc 1620

gtccgtgcat cacaattacg agtcacaact ctgtagttaa aaggttagga ttgcaagaag 1680

taaactactg tgagttgcat caaagtcctt ttaatgggat ggttcacccg aaaaatgaac 1740

atgcattcat tacttaggct gcatttacac tgcactgttc aagtgactca attcctgaat 1800

tttaatttat tttttctccc atgtggcaca gatcggatat ggctcatgta catagaagca 1860

ggaacaaatc acatggattc caatttactc aattcagatt caggccttgt tcatatgtgg 1920

aaatttatcc gatataaatc ggatcggtgt tcttgtgtct gcattgtaag caggtagatc 1980

agattttcac ctgtcaatgc caaagcgaat gacgtcaagt ctgacactta aatttcataa 2040

cagacttcag cagagtccca aaccttaaat gtcatacaca aggactcaaa cagcttttat 2100

actgtcatat agcacaggta tttaagcatg ttaacgagag caaaatgtct ggcacgtaac 2160

caatataaac taatataaaa ctagtgcata gctacatcac gtgcataaat caccgcatgg 2220

acattaggta gcctaaaggt ttaaaaaagc caatataatc aaaagaagat agacaaataa 2280

aaacctttgt cataaaacag cttgtcaaaa gctgcgaaca gattaaatac aggaatagag 2340

aaaagagcgc tctattatta tcagctgtta gtcagcgccc actcttattt tttttcctgg 2400

tcattgtgcc tttgacgtgc actgtgtaaa ttcaaacgat cggatacgag tcacttttat 2460

aagatgcaag caggtcatca aaaaacgatc ctacgatcag atacagtcac aaaatcggaa 2520

ttgaccatca agatctgcag tgtaaatgca gccttacact cactcaagtg ctttcaagcc 2580

attatggggt tctttctttc gttgaacact aagttacttt gaaaaaagtt agagacctgt 2640

aaccattgac ttccacagta cttgtttaac aggaaagaaa ctcaaacagg tttataacag 2700

acaagtaaat gattttcatt tttggggtaa ccatctcttg aaggcaagtc ctttcactct 2760

gtggccatct ttgaaactcc tttaatgctg tgttcacacc agatgctgaa cattaagttt 2820

acttttcatt tgcacatcaa attcgcttca ttcgagcatc aaattcattt cacgataaac 2880

gatttgcttc tgtctgcctg gtgactttag tttcattgct aacatggatt ttattgaggg 2940

agtagctgtg tttgtgcttt aggaaggctg aaaacagcgt gtattcattt ggcactattt 3000

ggagatgcac ttagctttca taaactcctc cagaaactat acctggatgg aggctttcag 3060

cagtgcttcc cactgtgccc agcccagttt aatgaactgt tgtccggtgt caccggtatt 3120

tcctctcggg acaccaacaa gaagcactac ttctgattgg ttaatgcaaa tgtgaatgtc 3180

agctgaagtt cagagtttcc aactctagtg atttacatga tatgcaaata aatatcctgc 3240

agcgcaaaat gatctactca tgccgcttca ttcctgcaaa tttcatcatt cgtgctgcct 3300

cgttctcgtg tattgcgtcg taggatgtct attcgcttat ttgcattgac ttaatgtaaa 3360

tcactcatgg tagacgcttc atctgtgtct ggtgtgaacg cagcattagt catgcaagta 3420

ttttatccca ctgaatgggg aaacatcaga ttctctggaa cagtttgcca agctccgatt 3480

taaatttcat atttggaatc atcaatgaca tttaacacaa actctcttgt aattttagct 3540

tgtaaacatt gtaaaacaaa aagtgttttt tcctcattcc ttcgctaatg cgcaatgcca 3600

attcgtaact atgatttagt ggctaattca tatgaatttg tatgacctta ttcatacatt 3660

ttagtactat ttactcatcc tccaatgatg ggtggggttt ggtgtcatgc ctctttaaat 3720

atcatacatt tttcgtaaaa ctgcactatt catacgaatt agccactaaa ctgacaaaac 3780

ataaaatagt tatgtctcct catgcaatca ggctggcatg cgcaaccgaa cggaacaaat 3840

tcacaacacc accctccttt tatggccatt tctgaaggac gtaatcagac gtaatccttt 3900

caatcaaacc atgttacttc cattagagtc aacatcttgc atcttacact ccatcctcta 3960

aatcatgccg tgtctgtttg cgctggtctt ctgaagtcat ttccaactta tttctgactg 4020

caaatctccc aaaatcatgg caatctcttt gtttacaaat tttgtgagcg ttcaagtggt 4080

tgctgtcatg tgattttgca tttgaatggt tgaggcagga aagatgactg tttataaggc 4140

aagattctag tgttcgctga ctccagtgga ttcaaaatga agctgcagaa actgtcgtga 4200

aaacatgtct ggactgtcta tagcatgggt ctcaaactca attcctaggg ggccacagct 4260

cttaatggct gcgtccaaag tcgcatactt ccatactata tagtaagctt aaaacagtac 4320

gtgagcataa tagtaaattc ggattcaaaa atcagtatgt gagaagtgat aacctactac 4380

caggtgatga cccaccactt ccggcgagat tttgaagtga gcgtcgaatg cacgctacgc 4440

tattccatga tgcactgaga agtggaagtg aagcgacgca actgaagctg cggtcacact 4500

gcacttttct ccacacgcac acgaacgcgt cagaccacaa acgcacgctc tagcaacaag 4560

tttcgcaatt cgctgcgttg gaaagttcaa gtttggcgaa atcgcatcac atgattgcgt 4620

gatacactga aaaaaagtgt tggatgcaga actgttgcaa acaatttgtt tgttgaattt 4680

aaacaaacaa attaagttta gtaatgttca acttaatttg tttgtttaaa atcagcccaa 4740

ataaattgtt taccacctct taacataaag aaattaagta aatccaagga atcatctttg 4800

aataattttt ttcagtgtag caattaaaga tcaaaacatg accactggac aggattttaa 4860

accagaccaa tcgcttgctt ttttaatgtc taataattta atcccgcccc ttctcgcagt 4920

gacgtatgac agaatttcgc aagttcaaac tctagtgtga ccgcagcttc acgcaggtag 4980

atcatgccaa aatggcggat gtagtacatc tgaattccat tcatgctact cttattcata 5040

ctgtatagaa tgtacttttc taacggccga gtagtacatt ttaatttcaa atgcagtacc 5100

tactgagcag taggcgtttt cggacgcagc cttggtgttc gaaagagtct cgaacacctt 5160

cattagttgg atcaaaactg tgcagagctg cggccctcca ggaattgagt ttgagaccca 5220

tactctatag cagtggtgtc caagttcagt cctgggaggc cggtgtcctg gagagtttag 5280

ttccaacccc aatcaaacac acccgaacca gctaattagg ctcttactgg atgttctaga 5340

aacttcctgg caggtgtgtt gaagcaagct ggagctaaac ttagcaggac accggccctc 5400

caggactaag tttagacacc cctgctctat agtgtttcat tggctctttt actagaaggc 5460

ggggcttcct tcactggagt gtccatgttg actgttgcat ttttttctta ttttaaacta 5520

tacaactgac acgtcttttg gttgcatctt gcatttctga gagggggaaa aactatttat 5580

gaatgtaaac ctggaataga cgcaaagaag acaattgaga cttccgagga atgcgtaaaa 5640

tctgaatcgt gagaatttgt agtttattta ttttttgttg ctattctgta ttggaatagc 5700

agctatgttt catttctttc cttttgtaat gagattttca cctcttggtt ggttaagaga 5760

gcatttgaca taacacctct ggctaaaaac aacagtaatt ttaacgttga gatactgtac 5820

aaaaaaagtg attaggatcg aagcacaaaa acacatttgt attcagagaa aagtcatact 5880

aaaagataaa gctgctgttg atcagtcaga atcaagtatt taggaaagcg ttaaatatga 5940

ttccattttg gaaggatcta cactagttaa agcctcactt ctgctttcag aggtgtgaat 6000

ttttaccctc ttgtgctcag ccaaacagcg ccttagaagt ctgaataaac actttgattt 6060

attttttttg ctaaattttg attcacgagt atagcctacc attgtgattt taaaatgtat 6120

gttaatggaa taaaacaaat gccttgttcc tgctgccatc acctatcaag tcattactcc 6180

accagtttga tgtccaacag agctttcctt ttgaacattt gaattcccaa gaggctgtcg 6240

gagtctagta tactatggta aaacggggca agaactagct ttcagttctg gagggcaaat 6300

tttcagccat cactcaaacc aaagagagtg atgtaaagat ttttattttg cgtggcaata 6360

cttgtgatgt catgagatga tgtcatgtgt gcaacaagca gtacgttgct ttaaaactcc 6420

ttcggtgagt ggttttacca tggtagtttt gttttctgat aattacttgc atgcaatttg 6480

actaatactg aggatctaca tgcaaaataa atcaggatgt ccgctcttat gcaaagtatt 6540

tgttgtgtga tttctgttcc ctttaaatca agcagtctgt aatggaagta gcaaagtcac 6600

taggtttttt ttttttactt gtttctgaaa tgttttctgt ttgtgtgcca aatgcaaatg 6660

ttgataaaac ggttcacgtg tatatggacc ttggtttaac aacctttgca tggatgtgat 6720

gataaagatg aatattttgt aaattgtgct tttggtttaa tgaactgatc gacgcttaat 6780

tgaaattaag ggtcacatgt taacgtctat gagaaattgc tgatctgagg tcatctttcg 6840

cctttcatgt gttggtaaat gtgattttat tagaattgaa aaataaagct gttctcagat 6900

ctgcacggtt ttataaatgc aacccagtct tgtttttccc cattaatctc accagtctta 6960

tttaatgtgt aattaaaaga agaacttaaa acccaatttc cttttgtaat gagattttca 7020

cctcttggtt ggttaagaga gcatttgaca taacacctct ggctaaaaac aacagtaatt 7080

ttaacgttga gatactgtac aaaaaaagtg attaggatcg aagcacaaaa acacatttgt 7140

attcagagaa aagtcatact aaaagataaa gctgctgttg atcagtcaga atcaagtatt 7200

taggaaagcg ttaaatatga ttccattttg gaaggatcta cactagttaa agcctcactt 7260

ctgctttcag aggtgtgaat ttttaccctc ttgtgctcag ccaaacagcg ccttagaagt 7320

ctgaataaac actttgattt attttttttg ctaaattttg attcacgagt atagcctacc 7380

attgtgattt taaaatgtat gttaatggaa taaaacaaat gccttgttcc tgctgccatc 7440

acctatcaag tcattactcc accagtttga tgtccaacag agctttcctt ttgaacattt 7500

gaattcccaa gaggctgtcg gagtctagta tactatggta aaacggggca agaactagct 7560

ttcagttctg gagggcaaat tttcagccat cactcaaacc aaagagagtg atgtaaagat 7620

ttttattttg cgtggcaata cttgtgatgt catgagatga tgtcatgtgt gcaacaagca 7680

gtacgttgct ttaaaactcc ttcggtgagt ggttttacca tggtagtttt gttttctgat 7740

aattacttgc atgcaatttg actaatactg aggatctaca tgcaaaataa atcaggatgt 7800

ccgctcttat gcaaaaccgt atgcggactg gaatcattgg tgtcggttat cggtcagtta 7860

tcgatcaagc cctccgccct gcacctctca ttgaaaggac accgctgtgg attgtttggg 7920

tctacagatg tttagtccat tataatgcaa gatgcatgct gatgctcgga agaagctgct 7980

cgactgcgtg ttattcgtca ctttaatcgc ctccacctac tgaaaatagc cgtaaacagc 8040

tgaaaatcgt tgatattttg gggtgaagaa tgaccgaata taagcttgtg gtcgtgggag 8100

ctggaggcgt aggcaaaagc gctctcacca tccaactcat ccagaaccac tttgtggacg 8160

aatatgaccc aactatagag gactcgtaca ggaagcaggt ggtgattgac ggagagacgt 8220

gtctactgga catcctggac actgcaggtc aggaggagta cagtgccatg agggaccagt 8280

acatgaggac aggagagggc ttcctctgtg tctttgccat caataacacc aagtccttcg 8340

aggacattca ccactacagg gagcagataa agcgagtaaa ggactccgag gacgtcccca 8400

tggttctggt ggggaataag tgtgatcttc agtcccacaa tgtggactcc aagcaggctc 8460

aggatttagc acgcagctac ggcatcccat ttatagagac ctcagcaaag acaagacaga 8520

gagtggaaga tgccttttat actctggtac gggagatcag ggaataccgg ctgagaaaac 8580

tcagtaaaga agaaagacga cacaatgcat caagcttaaa aaatgtgttt tgatgtgagc 8640

gggtgtggac gacgcgtttt atactttagt ccgagaaatc cggaaacaca aggagaagat 8700

gagcaaggag ggcaaaaaga aaaagaagaa atccaaaaca aaatgtgcat taatgtgaac 8760

aagtctttcc tgtcattacg gactcaaaag taccacaact gcattttgta catttacact 8820

aaattattcg cctcttcaga atacagaatg gatccctgtt ctacttgctt tcttaaaaga 8880

aaataagctt tactcgttcg gtgccagttg ccccaaagtg ttggtccgtt gacgccttgt 8940

tttatggctt atgttagcag acgggctgtc agaactgggt atattttgca gttggtttga 9000

gtagttttag cagatttcta aagagaagtg tggatttaaa atggtgtgca gagattagct 9060

gttagactgc atgcgagtca cttgattttt gatggaattg aaactttgag gaactatgat 9120

tgttattttg tttttaatgg accaacactt cttttgggga gatgatttga tacattatca 9180

ctgtgtatga ccctgccttt ggttgtccca gacttccaaa aacgacatgc atgtgaactt 9240

ccattgtagt cggattaaca tgccctctct ataaagccat ggtagtgtgt gtgtgtgtgt 9300

gtgtgtgtat atatggtgaa atcttaacca cgttaacatt atttccccgt ttgcatgctt 9360

tatgttcttt aaacttccag ggaacggtca tgtcttgaat actgtttaat agccactgtt 9420

gtgtcgttgg tccagacagg cggtattgtt taaacatggc ttttttttct tttgatttaa 9480

atttatgaag gttgtttgga agctcatttc caccactgta ttattcctac ttataaaaac 9540

aaattacaat tctgaatatt ttgcaattgc gaggacgagt ctcatgttaa tatttgtaat 9600

ggagttgcaa agtctgttaa ccttctccct caactgcgtc cgtgcatcac aattacgagt 9660

cacaactctg tagttaaaag gttaggattg caagaagtaa actactgtga gttgcatcaa 9720

agtcctttta atgggatggt tcacccgaaa aatgaacatg cattcattac ttaggctgca 9780

tttacactgc actgttcaag tgactcaatt cctgaatttt aatttatttt ttctcccatg 9840

tggcacagat cggatatggc tcatgtacat agaagcagga acaaatcaca tggattccaa 9900

tttactcaat tcagattcag gccttgttca tatgtggaaa tttatccgat ataaatcgga 9960

tcggtgttct tgtgtctgca ttgta 9985

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

cgtctgacta ctcacg 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

caactgacta ctcacg 16

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

cccctgacta ctcacg 16

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 10

cggctgacta ctcacg 16

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 11

cttctgacta ctcacg 16

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 12

catctgacta ctcacg 16

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 13

cctctgacta ctcacg 16

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 14

ctcctgacta ctcacg 16

Claims (10)

1.一种测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待测序样本分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，进行单独培养；

(3)将包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，线性化酶切；

(5)向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后得到测序文库；

其中，M和N为正整数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测序样本包括合成的基因片段；

优选地，所述基因片段的长度为500-10000bp，优选为4000-6000bp；

优选地，步骤(2)所述培养在96孔板中进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述酶切采用限制性内切酶进行。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(5)之前还包括对线性化酶切质粒进行修复的步骤；

优选地，所述修复包括损伤修复和/或末端修复；

优选地，步骤(5)所述标签序列通过DNA连接酶连接在线性化质粒的两端；

优选地，在步骤(5)之后还包括对文库进行回收纯化的步骤；

优选地，所述回收纯化包括采用磁珠回收后，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待验证的长度为500-10000bp合成的基因片段分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，单独培养在96孔板的同一列中；

(3)将96孔板中同一行的包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，采用限制性内切酶进行线性化酶切，修复后得到完整双链的质粒DNA；

(5)采用DNA连接酶向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后用磁珠回收一次，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA，得到测序文库；

其中，M和N为正整数。

6.一种基于三代测序的测序验证方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1’)采用如权利要求1-5任一项所述的方法进行文库构建；

(2’)对构建的文库进行浓度和分布范围的检测；

(3’)三代测序；

(4’)结果分析。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3’)所述三代测序包括Pacbio单分子荧光测序和/或纳米孔测序，优选为Pacbio单分子荧光测序；

优选地，步骤(4’)所述结果分析包括：

根据标签序列和待测序样本的保守序列拆分测序结果；

去除低丰度CCS序列；

将测序结果与参考序列进行比对。

8.一种基因合成方法，其特征在于，所述方法包括将合成的基因片段采用如权利要求6或7所述的方法进行测序验证的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待验证的长度为500-10000bp合成的基因片段分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，单独培养在96孔板的同一列中；

(3)将96孔板中同一行的包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，采用限制性内切酶进行线性化酶切，修复后得到完整双链的质粒DNA；

(5)采用DNA连接酶向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后用磁珠回收一次，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA，得到测序文库；

(6)对构建的文库进行浓度和分布范围的检测；

(7)Pacbio单分子荧光测序；

(8)根据标签序列和待验证基因片段的保守序列拆分测序结果，去除小于3的低丰度CCS序列，将测序结果与参考序列进行比对。

10.一种如权利要求1-5任一项所述的测序文库的构建方法和/或如权利要求6或7所述的基于三代测序的测序验证方法在基因合成中的应用。