CZ247998A3 - Varianty thymidin-kinasy, sekvence DNA, které ke kódují a jejich použití ke genové terapii - Google Patents

Varianty thymidin-kinasy, sekvence DNA, které ke kódují a jejich použití ke genové terapii Download PDF

Info

Publication number
CZ247998A3
CZ247998A3 CZ982479A CZ247998A CZ247998A3 CZ 247998 A3 CZ247998 A3 CZ 247998A3 CZ 982479 A CZ982479 A CZ 982479A CZ 247998 A CZ247998 A CZ 247998A CZ 247998 A3 CZ247998 A3 CZ 247998A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mutation
sequence
wild
variant
thymidine kinase
Prior art date
Application number
CZ982479A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ294497B6 (cs
Inventor
Joël Crouzet
Francis Blanche
Michel Couder
Béatrice Cameron
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9601603A external-priority patent/FR2744731B1/fr
Priority claimed from FR9609709A external-priority patent/FR2751988B1/fr
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Publication of CZ247998A3 publication Critical patent/CZ247998A3/cs
Publication of CZ294497B6 publication Critical patent/CZ294497B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Varianty thymidin-kinasy, sekvence ' jejich použiti ke genové terapii
Oblast techniky
Předložený vynález se týká sekvenci nukleových kyselin, j. které kóduji enzymy odvozené od divokého enzymu
I thymidin-kinasy (TK), a které mají zlepšené funkce z pohledu l
terapeutického použiti. Týká se zejména nových enzymů, které máji substrátovou specifitu nebo/a zlepšený účinek vzhledem k enzymu thymidin-kinasa divokého typu. Týká se zejména vektorů obsahujících tyto sekvence nukleových kyselin a jejich terapeutického použití, zejména ke genové terapii.
Dosavadní stav techniky
Předložený vynález se týká zejména oblasti genové terapie, která využívá sebevražedný gen z pohledu indukce buněčné smrti specifických buněk zejména takových, jako jsou virem infikované buňky, například virem typu HIV (human immunodeficiecy virus), CMV (cytomegalovirus) nebo RCV (respiratorní syncytiální virus). Tento typ terapeutického léčení,které spočívá v exprimování sebevražedného genu ve středu buňky je zejména aplikován pro léčení rakovin a určitých kardiovaskulárních onemocněních.
tí . Jako sebevražedný -gen se používají zejména ke genové terapii geny, jejichž produkt exprese uděluje buňce citlivost na terapeutický činitel. Všeobecněji se jedná o geny kódující nesavčí a netoxické enzymy, které když jsou exprimovány v savčích buňkách exprimují proformu účinné látky na počátku málo toxickou nebo netoxickou v látku vysoce toxickou. Takovýto mechanizmus účinku proformy účinné látky je výhodný z několika důvodů: umožňuje optimalizovat terapii upravou koncentrace této proformy účinné látky nebo expresí enzymu, • ·
ti jí umožňuje zrušit toxicitu, když se tato proforma účinné látky již nepodává a umožňuje odhadnout stupeň smrtelnosti.
V literatuře byly popsány počty sebevražedných genů jako například geny kódující cytosin-deaminasu, purin-nukleosid-fosforylasu nebo thymidin-kinasu, například . thymidin-kinasy viru planých neštovic nebo viru herpes simplex typu 1. Mezi těmito geny je především zajímavý gen kódující thymidin-kinasu viru herpes simplex typu. 1 v terapeutickém plánu, neboť na rozdíl od jiných sebevražedných genů vytvoří enzym thymidin-kinasu schopnou specificky eliminovat buňky v průběhu dělení. Tento enzym má · substrátovou specifitu odlišnou od buněčného enzymu a ukazuje se, že je cílem analogů guanosinu, jako je acyclovir nebo ganciclovir (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276) .
Ve zvláštním případě pro dvojici HSV1-TK / ganciclovir může být mechanizmus účinku naznačen následovně: savčí buňky modifikované pro exprimování enzymu HSV1-TK vykonávají první etapu fosforylace gancicloviru, aby se vytvořil ganciclovir monofosfát. Tato etapa je omezena. Později buněčné kinasy umožňují metabolizování monofosfátu gancicloviru postupně v difo.sfát a potom trifosfát. Trifosfát gancicloviru takto vytvořený způsobuje toxický účinek, když se začleňuje do DNA a inhibuje část buněčné α-DNA-polymerasy té, která vyvolává zastavení syntézy DNA, a tak vede k buněčné smrti (Moolten 1986 Cancer Res. 46p527 6, Mullen 1994 Pharmac. Ther. 6 3p19 9) .
k
........ Jinak šířený toxický účinek (účinek by stander) byl pozorován při použití TK. Tento účinek se projevuje destrukcí nejenom buněk majících začleněn gen TK, ale zejména blízkých buněk. Mechanizmus tohoto procesu se může vysvětlit třemi způsoby: i) tvorbou apoptických měchýřků, které obsahují fosforylovaný ganciclovir nebo thiamidin-kinasu pocházející z mrtvých buněk, potom fagocytosou těchto měchýřků příbuznými buňkami, ii) přechodem proformy účinné látky metabolizované thymidin-kinasou, procesem metaboiické spolupráce buněk, které obsahují sebevražedný gen skrz buňky, které ji neobsahují nebo/a iii) imunitní odpovědí spojenou s regresí tumoru (Marini et coll., 1995 Gene Therapy 2p655).
Pro odborníka použití sebevražedného genu, který kóduje thymidin-kinasu viru herpes je velmi široce popsáno. Zejména první studie in vivo na krysách, které mají gliom ukazují regresi tumoru, když je gen HSV1-TK exprimován, a když jsou injektovány dávky 150 mg/kg gancicloviru (K. Culver et coll. 1992 Science 256pl55Q). Tyto dávky jsou vysoce toxické u myší (T.Osaki et coll. 1994 Cancer Research 54p5258) a z toho důvodu úplně vyloučeny z genové terapie u lidí.
Určitý počet terapetických studií se také provádí právě u lidí, v těchto studiích je gen TK uvolněn z buněk prostřednictvím různých vektorů takových, jako jsou zejména .retrovirové nebo adenovirové vektory. V klinických zkouškách genové terapie u lidí jsou dávky, které musí být podávány podstatně slabší a to v rozmezí 5mg/kg a délka léčení musí být krátká (14 dní) (E. Oldfield et coll. 1995 Human Gene Therapy 6p55). U zvýšených dávek nebo u prodloužené léčebné doby lze pozorovat vedlejší nežádoucí účinek.
Bude tedy zejména výhodné upravit sebevražedný gen, aby byl podobný genu kódujícímu divokou thymidin-kinasu, a aby byl schopný tvořit variantu enzymu divokého TK specifičtější nebo/a účinnější pro fosforylaci gancicloviru. Výhodně může být taková varianta použita zejména ve významně snížené dávce srovnatelné k dávce sebevražedného genu a mimoto může umožnit snížit dávku substrátu, která je s ním klasicky spojená.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká sekvence nukleových kyselin, která kóduje enzym typu thimidin-kinasy, který je výkonnější
aktivátor vzhledem ke gancicloviru nebo analogu nukleosidu.
Sekvence genu, který kóduje enzym thymidin-kinasu viru herpes simplex typu 1 byla popsána v literatuře (viz zejména McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5949). Tam byly popsány přírodní varianty vedoucí k proteinům, které mají enzymovou aktivitu srovnatelnou s thymidinem nebo ganciclovirem (M.Michael et coll. 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun 209 p966). Stejně byly popsány deriváty získané mutagenezí řízenou na úrovni vazebného místa enzymu se substrátem. Tentokrát nebyla provedena žádná přesná biochemická charakterizace na čistém enzymu á žádný buněčný test, který používá tyto mutanty nebyl publikován (Black et coll., 1993 Biochemistry 32pll618) . Mimoto indukovatelná exprese genu HSV1-TK s delecí 45 prvních kodonů byla provedena v eukaryontních buňkách, ale použité dávky proformy látky zůstaly srovnatelné s dávkami· již dříve popsanými ve všech testech v literatuře (B. Salomon et coll. 1995 Mol. Cell. Biol. 15p5322) . Podle toho žádné popsané varianty až dosud nevykazují zvýšenou aktivitu vzhledem nebo vůči gancicloviru.
Předložený vynález popisuje konstrukci nových variant thymidin-kinasy, které mají zlepšené enzymové vlastnosti. Předložené přihláška vynálezu popisuje také konstrukci sekvencí nukleových kyselin, které kódují tyto varianty, stejně jako vektory obsahující výše uvedené sekvence, a které umožňují jejich podávání in vivo a umožňují produkci mutantů in vivo.. _.....,„ ... ,, -·. -« -..........- - ·
Neočekávaně předkladatel vskutku připravil, izoloval a charakterizoval sérii sekvencí nukleových kyselin kódujících zejména varianty thymidin-kinasy, která má požadované vlastnosti aktivátoru, totiž významně zlepšení v porovnání s vlastnostmi divoké thymidin-kinasy. Předkladatel zejména prokázal, že nové varianty thymidin-kinasy, které mají zlepšené enzymové vlastnosti mohou být získány zejména • ·
modifikací oblasti proteinu odpovědné za vazbu s DNA.
První předmět vynálezu spočívá v sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje thymidin-kinasu charakterizovanou tím, že má vzhledem k divoké sekvenci přinejmenším mutaci v oblasti odpovídající vazebnému místu DNA spojenou s mutací v oblasti N-konce nebo/a C-konce.
Předložený vynález se přesněji týká sekvence nukleových kyselin charakterizovanou tím, že odvozuje sekvenci nukleových kyselin, které kódují divoký enzym thymidin-kinasu, výše uvedenou sekvenci nukleových kyselin, která má. alespoň mutaci v oblasti odpovídající vazebnému místu DNA a alespoň mutaci v oblasti N-konce nebo/a C-konce.
Ve smyslu předloženého vynálezu termín mutace pokrývá všechny substituce, delece, adice nebo/a modifikace jednoho nebo více reziduí požadované sekvence nukleových kyselin. Očekává se, že nárokovaná sekvence nukleové kyseliny může zahrnovat jiné mutace umístěné nebo neumístěné v oblastech, které byly již definovány.
Podle upřednostněného způsobu vynálezu sekvence nukleových kyselin pochází ze sekvence, která kóduje TK viru herpes simplex typu I. Mutace v oblasti odpovídající vazebnému místu DNA je výhodně vyjádřena substitucí guaninu v poloze 180 adeninem (G180A).
Co se týče mutace přítomné v části N-konce enzymu TK, . může se jednat o substituci guaninu v poloze 16 adeninem (G16A) nebo o dvojnásobnou substituci guaninu v polohách 28 a adeniny (G28A a G30A).
Podle upřednostněného způsobu vynálezu nárokované nukleové sekvence nesou mimo mutaci v oblasti odpovídající DNA vazebnému místu alespoň jednu mutaci v oblasti C-konce, zejména umístěné mezi polohami 990 a 1030. Podle jiného způsobu vynálezu tato mutace přítomná v oblasti C-konce je • ··· • · · • · · mimoto spojena s mutací umístěnou v oblasti N-konce enzymu TK tak, jak je již definováno.
Jako reprezentativní příklad takovéto sekvence se může uvést sekvence nukleových kyselin obsahující alespoň substituci guaninu v poloze 180 -adeninem (G180A), alespoň dvojnásobnou substituci guaninu v poloze 28 a 30 adeniny (C28A a G30A), dvojnásobnou substituci cytosinů v poloze 591 a 892 thyminem (C591T a C892T) a dvojnásobnou substituci guaninu v poloze 1010 a 1011 adeniny (G1010A a G1011A).
Sekvence nukleových kyselin, která kóduje variantu thymidin-kinasy je výhodně vybrána mezi následujícími sekvencemi:
(a) sekvence SEQ ID n°3 nebo část této sekvence nesoucí, mutaci (G180A) nebo jedno z jejích komplementárních vláken (b) sekvence SEQ ID n’6 a SEQ ID n°7 nebo část těchto sekvencí nesoucích mutaci (G180A) a případně mutaci G16A a dvojnásobnou mutaci (G28A, G30A) nebo jedno z jejich komplementárních vláken (c) sekvence SEQ ID n°8 nebo část těchto sekvence nesoucí mutaci (G180A), dvojnásobnou mutaci (G28A, G30A) ačtyřnásobnou mutaci (C591T, C892T, G1010A, G1011A) nebo jedno z jejích komplementárních,vláken (d) každá sekvence, která hybriduje se sekvencemi (a), (b) nebo/a (c) kódující variantu thymidin-kinasy a je v souhlase s předloženým vynálezem (e) varianty (a), (b) , (c) a (d) vyplývající z degenerace genetického kódu
Sekvence nukleových kyselin podle vynálezu může být bakteriálního, eukaryontního, virového, syntetického nebo semisyntetického původu.
Všeobecně sekvence nukleových kyselin vynálezu mohou • ··· • · · • ··
Ί být připraveny podle všech odborníky známých technik. Jako ilustrativní příklady těchto technik se mohou zejména zmínit:
- chemická syntéza, která využívá sekvence přítomné v přihlášce vynálezu, a která využívá například syntetizér nukleových kyselin
-třídění bank prostřednictvím specifických sond zejména takových, jaké jsou popsány v přihlášce vynálezu, nebo také smíšené techniky zahrnující chemické modifikace (elongace, delece, substituce atd.) sekvencí vytříděných z bank.
Sekvence nukleových kyselin podle vynálezu mohou také být získány řízenou (řízenými) nebo neřízenou mutací (mutacemi)' přírodní nebo již mutované sekvence nukleových kyselin kódující případně divokou thymidin-kinasu nebo jednu z jejích variant. Počet metod umožňující provést mutaci řízenou nebo neřízenou je známý odborníky, mohou se uvést mutace řízené PCR nebo nukleosidy, neřízené mutace in vit.ro chemickými činidly, jako jsou například mutace hydroxylaminu nebo in vivo v kmenech E. coli (Miller A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992).
Předložený vynález se nukleových kyselin, která thymidin-kinasy získatelné od takových, jaké jsou nárokované, dříve uvedenými, zejména mutací také týká každé sekvence kóduje variantu divoké sekvence nukleových kyselin modifikovanými technikami již řízenou nebo neřízenou.
Produkty nárokovaných sekvencí podle předloženého vynálezu se výhodně jeví jako výkonnější než přírodní enzym, který derivují strukturní modifikací či modifikacemi. Exprimovány v cílové buňce představují zvýšenou enzymovou aktivitu vzhledem k přírodnímu enzymu oproti gancicloviru nebo analogu nukleosidu. Chování variant podle vynálezu s>
444
44 ·
4· nazvané vyšší aktivátor nebo zlepšená enzymová aktivita se posuzuje ve srovnání s chováním divokého enzymu, podle protokolu detailně popsaného v následujících příkladech.
Ve, smyslu předloženého vynálezu se rozumí analogy nukleosidu sloučeniny typu acyc-lovir, trif luorothymidin, l-(2-deoxy, 2-fluoro, beta-D-arabino-furanosyl)-5-jodouracil, ara-A, araT, 1-beta-D-arabinofuranosyl-thymidin, 5-ethyl-2'-deoxyuridin, jodouridin, AZT, AIU, didexycytidin a AraC. Například analog upřednostněný v rámci předloženého vynálezu se může zejména uvést BVDU, ganciclovir a penciclovir.
Předložený vynález se také týká thymidin-kinasy schopných být exprimovány sekvence nukleových kyselin.
variant divoké od nárokované
Vynález se zejména týká každé varianty thymidin-kinasy charakterizované tím, že obsahuje alespoň mutaci na úrovni svého DNA vazebného místa spojenou alespoň s mutací v oblasti N-konce nebo/a C-konce.
Umístění DNA vazebného místa ve smyslu peptidové sekvence thymidin-kinasy se mění podle virového původu tohoto enzymu. Tato oblast je umístěna v různých částech sekvence peptidů podle toho zda se zkoumá thymidin-kinasa viru varicelle nebo viru herpes simplex typu 1. Všeobecně tato oblast je znázorněná GXXXXGK(T/S (SEQ ID N°l), kde X vyjadřuje jekoukoliv aminokyselinu, v charakteristic_kém případě thymidin-kinasy Herpes simplex viru typu 1 specifickou sekvenci GPHGMGKT (SEQ ID N°2).
Podle toho předložený vynález se týká každé varianty divoké thymidin-kinasy ve shodě s vynálezem a každé varianty zahrnující na úrovni své peptidové oblasti GXXXXGK(T/S) mutaci.
Podle upřednostněného způsobu předloženého vynálezu ·’·· ··«· · ♦ · · • · 999 9 9 99 9 9 99 • · · ··· · 9 9 9 999 « · • · 9 · «··· · · * ·· 99 99 99 99 99 sekvence, která má alespoň jednu mutaci je vyjádřena GPHGMGKT (SEQ ID N°2) . V tomto specifickém případě mutace j,e zejména vyjádřena alespoň substitucí Methioninu v poloze 60 Isoleucinem.
Jako reprezentitativní příklad tohoto typu mutantu se může zejména uvést mutant 1537:E4 popsaný v následujících příkladech.
Co se týče zejména mutace v oblasti N-konce, tato mutace je umístěna především u aminokyselin od 1 do 20. Tato výše uvedená mutace je zejména umístěna u aminokyselin od 1 do 15. Výhodněji tato výše uvedená mutace je zejména umístěna u aminokyselin od 1 do 10. Podle způsobu provedení vynálezu upřednostněná výše uvedená mutace je umístěna u aminokyselin od 5 do 10.
Podle upřednostněného způsobu předložený vynález se týká varianty thymidin-kinasy viru herpes simplex typu 1, která obsahuje alespoň mutaci vyjádřenou substitucí Methioninu v poloze 60 Isoleucinem a substitucí Alaninu v poloze 10 Threoninem.
Jako reprezentativní příklad _tohoto typu. mutantu se může zejména uvést mutant 2-865:H12 popsaný v následujících příkladech.
Podle jiného způsobu předloženého vynálezu zejména upřednostněného se jedná o variantu thymidin-kinasy viru herpes simplex typu I obsahující alespoň mutaci vyjádřenou substitucí Methioninu v poloze 60 Isoleucinem a substitucí Glycinu v poloze 6 Serinem.
Jako reprezentitativní příklad tohoto typu mutantu se může zejména uvést mutant 2-3361:D3 popsaný v následujících příkladech.
Co se týče mutace v oblasti C-konce, tato mutace je umístěna přednostně u aminokyselin od 320 do 350. Zejména • · výše uvedená mutace je umístěna u aminokyselin od 325 do 345. Výhodněji výše uvedená mutace je zejména umístěna u aminokyselin od 330 do 343. Podle způsobu provedení vynálezu upřednostněná výše uvedená mutace je umístěna u aminokyselin od 335 do 340.
Podle upřednostněného způsobu předloženého vynálezu se jedná o variantu thymidin-kinasy viru herpes simplex typu 1 obsahující alespoň mutaci vyjádřenou substitucí Methioninu v poloze 60 Isoleucinem a substitucí v poloze 10 Alaninu Threoninem a substitucí Argininu v poloze 337 Glutaminem.
Jako reprezentitativní příklad tohoto typu mutantu se .* může zejména uvést mutant 3-4216:H2 popsaný v následujících příkladech.
Varianty, podle vynálezu výhodně vyjadřují zlepšené chování na úrovni jedné, nebo více následujících enzymových vlastností:
- inhibice substrátem: inhibice ganciclovirem k silné koncentraci je všeobecně pozorována u divokého enzymu, je snížena ba dokonce potlačena u variant podle vynálezu,
- rychlost fosforylace gancicloviru nebo jednoho z analogů nukleosidu, varianty podle vynálezu mají výhodně vyšší rychlost fosforylace gancicloviru nebo jednoho z analogů rychlost fosforylace thymidinu: je přednostně nezměněná nebo snížena u těch variant vynálezu, což jim udělí vyšší selektivitu vůči gancicloviru nebo analogu nukleosidu. Tato rychlost fosforylace thymidinu bude definována specifickými konstantami Kcat/Km. Jedná se o zřejmou rychlostní konstantu druhého řádu dobře známou odborníky. Umožňuje popsat vlastnosti a reakce volného enzymu a volného substrátu. Pro kompetitivní substráty určuje specifitu enzymu vůči těmto substrátům. (A. Fersht, Enzyme Structure and • · ·· 11
Mechanism 1985, W.H. Freeman, London).
Varianty podle vynálezu, zejména varianta 1537:E4, výhodně vykazuji následující kinetické vlastnosti:
-podstatné snížení až k úplné inhibici fosforylační aktivity gancicloviru vzhledem k divokému enzymu, pro který inhibice je zřejmá od 15 μΜ,
-zvýšení faktoru z 2 na 2,5 počáteční rychlosti fosforylace GCV od 15-20 μΜ vzhledem k divokému enzymu,
-a poměr Kcat/Km thymidinu snížený alespoň faktor od 1 na 6 vzhledem k tomuto poměru divokého enzymu a přednostně alespoň 2
Přednostně varianty podle předloženého vanálezu, zejména varianty 2-865:H12 a 2-3361:D3, vyjadřují alespoň jeden z kinetických údajů:
-významné snížení inhibice fosforylace gancicloviru nebo nukleosidového analogu se zvýšenou koncentrací gancicloviru nebo nukleosidovém analogu,
-alespoň trojnásobná rychlost fosforylace gancicloviru nebo nukleosidového analogu nebo/a
-poměr Kcat/Km thymidinu buď nezměněn, jako pro mutant
2-865:H12, nebo přeměněný faktorem rovným 5 pro mutant 2-3361:D3 vzhledem k tomuto poměru divokého enzymu.
Varianta 3-4216:H2 podle vynálezu přednostně představuje alespoň jednu z následujících výhod:
-nepřítomnost inhibice fosforylace gancicloviru nebo nukleosidového analogu ke zvýšené koncentraci gancicloviru nebo nukleosidovém analogu,
-zvýšení faktoru iniciační rychlosti fosforylace GCV nad 3,5 od 15-20 μΜ vzhledem k divokému enzymu nebo/a
-poměr Kcat/Km thymidinu snížený faktorem 4 vzhledem k • ·
tomuto poměru divokého enzymu.
Z těchto údajů vyplývá, že varianta 3-4216:H2 projevuje zvláště výhodné chováni podle vynálezu.
Z těchto vlastnosti jsou zejména výhodné z terapeutického hlediska, vlastnosti, které umožňuji uvažovat o významném sníženi použité dávky enzymu nebo/a nukleosidového analogu při zachování stejné ba dokonce vyšší účinnosti. Neškodnost je přednostní i v tom případě, že by došlo ke snížení účinku.
Ve smyslu vynálezu variantou podle předloženého . vynálezu se rozumí každý enzym získaný modifikací sekvencí nukleových kyselin kódujících divokou thymidin-kinasu pomocí technik genového oboru, které mají dříve definované chování z pohledu gancicloviru nebo/a nukleosidového analogu. (Modifikací, se rozumí každá mutace, substituce, delece, adice nebo modifikace povahy genetické nebo/a chemické).
Tyto deriváty podle vynálezu schopné indukovat aktivací gancicloviru nebo jedním z jeho analogů destrukci uvedených buněk mohou být výhodně exprimovány in vivo přímo od nárokovaných sekvencí nukleových kyselin.
V tomto ohledu předložený vynález se týká také každé kazety . exprese obsahující sekvenci nukleových kyselin takových, jaké jsou již definovány, promotor umožňující její expresi a signál ukončení transkripce. Promotor je výhodně , vybrán mezi promotory— účinými v savčích buňkách, přednesené v -·· lidských. Výhodněji se jedná o promotor umožňující expresi sekvence nukleových kyselin v hyperproliferativní buňce (rakovina, restenosa, atd.). V tomto ohledu mohou být použity různé promotory. Může se jednat například o vlastní promotor genu TK herpes simplex typu I. Může se jednat také o sekvence různého původu (sekvence odpovědné za. expresi jiných genů nebo stejných syntetických) . Může se také jednat o každý promotor nebo odvozenou sekvenci stimulující nebo potlačující transkripci genu specifickým způsobem nebo nespecifickým indukovatelně nebo neindukovatelně, silně nebo slabě. Mohou se zejména uvést sekvence promotoru eukaryotních genů nebo genů virových. Například se může jednat o sekvence promotorů vzešlých z genomu cílové buňky. Mezi promotory eukaryontů se mohou použít zejména ubikvitinové promotory (promotor genů HPRT, PGK, a-aktinu, tubulinu, DHFR atd.) promotorů vláknitých zprostředkovatelů (promotor genů GFAP, desmin vimentin, neurovlákna, kergtin atd.) promotorů terapeutických genů (například promotory genů MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI' atd.) promotory specifických tkání (promotor genu pyruvát-kinasy, vilinu, vazebný střevní protein mastných kyselin, α-aktin hladkého svalstna atd.), promotory buněk specifického typu buněčného dělení jako jsou rakovinové buňky nebo také promotory odpovídající stimulům (receptor steroidních hormonů,, receptor kyseliny retinové, receptor glukokortikoidů atd.) nebo řečené indukovatelně. Stejně tak se může jednat o sekvence promotorů pocházející z genomu virů takových, jako jsou například promotory genů E1A a MLP adenovirů, raný promotor CMV nebo také promotor LTR RSA atd. Mimoto tyto oblasti promotorů mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních nebo sekvencí umožňujících expresi tkáňově specifickou nebo majoritní.
Předložený ' vynález předkládá nyní nové terapeutické činitele umožňující interferovat s počtem nefunkčních buněk. Za tímto účelem nukleové kyseliny nebo kazety podle vynálezu mohou být injektované takové, jaké jsou na úrovni místa ošetření nebo přímo inkubovány s buňkami určenými ke zničení nebo k léčení. Bylo popsáno, že sekvence nukleových kyselin mohou penetrovat do buněk bez zvláštního vektoru. Nicméně se upřednostňuje v rámci předloženého vynálezu použít podávající vektor umožňující zvýšit (i) účinnost buněčné penetrace (ii) cílení (iii) stabilitu extra- a intracelulární.
V upřednostňovaném způsobu provedení předloženého • ·· vynálezu sekvence nukleových kyselin nebo kazeta je začleněna do vektoru. Použitý vektor může být chemického původu, biochemického nebo virového.
Chemickým vektorem se rozumí ve smyslu vynálezu každý nevirový činitel schopný podporovat' přenos a expresi sekvence nukleových kyselin do eukaryontních buněk. Tyto chemické nebo biochemické vektory představují zajímavou alternativu přírodních virů zejména z důvodu pohodlnosti, bezpečnosti a absence teoretické limity, co se týče velikosti DNA k transfekci. Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce zkompaktnit nukleovou kyselinu ke transfekci a umožnit její > buněčnou fixaci stejně jako její přechod přes plazmidovou membránu, v případě potřeby dvě nukleové membrány. Pro potlačení polyanionické povahy nukleových kyselin nevirové vektory mají všechny náboje polykationické. Jako reprezentativní příklad tohoto typu technik transfekce nevirové aktuálně vyvinuté pro vložení genetické informace se mohou uvést ty techniky, které zahrnují komplexy DNA a DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1^ (1967) 891), DNA a nukleové proteiny (Kaneda et al., Science 234 (1989) 375),
DNA a lipidy (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), použití lipozomů (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atd.
Později se ukázalo jako slibná alternativa těmto fyzikálním technikám transfekce použití viru jako vektoru pro přenos,genů . V . tom t o ohledu by 1 y .. testovány. různé viry pro svou schopnost infikovat určitou buněčnou populaci. Zejména se jedná o retroviry (RSV, HMS, MMS atd.) virus HSV, AAV a adenovirus.
Sekvence nukleových kyselin nebo vektor použitý v předloženém vynálezu může být formulován z pohledu podávání, a to topikálně, orálně, parenterálně, intranasálně, intravenózně, intramuskulárně, podkožně, intraokulárně, transdermikálně atd. Sekvence nukleové kyseliny nebo vektor je zejména použit ve formě injektovatelné. Může to být tedy směs každého farmaceuticky akceptovatelného vehikula pro injektovatelnou formulaci, zejména pro přímou injekci na úrovni místa k ošetření. Může se jednat zejména o sterilní roztoky, izotonické roztoky nebo suché kompozice, zejména lyofilizované, které po přidání, podle případu, sterilované vody nebo fyziologického séra umožňují injektovatelnou formu. Přímá injekce sekvence nukleové kyseliny do tumoru pacienta je zajímavá, protože umožňuje soustředit terapeutucký účinek na úrovni postižené tkáně. Dávky nukleové sekvence mohou být přizpůsobeny funkci různých parametrů zejména funkci vektoru, způsobu použitého podávání, patologie nebo také doby hledaného léčení.
Předložený vynález se také týká každé farmaceutické kompozice obsahující alespoň sekvenci nukleové kyseliny takovou, jaká je již'definována.
Vynález se také týká každé farmaceutické kompozice obsahující alespoň vektor takový, jaký je již definován.
Vynález se také týká každé farmaceutické kompozice obsahující variantu thymidin-kinasy takovou, jaká je již definována.
Z důvodu jejich antiproliferativních vlastností farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou obzvláště přizpůsobeny pro léčení .· hyperproliferativních chorob jako například rakovin a restenosy. Předložený vynález ·. se týká také metody zejména účinné pro destrukci buněk zejména hyperproliferativních buněk. Je také aplikovatelný pro destrukci buněk tumorů nebo buněk hladkého svalstva vaskulární stěny (restenosa). Je také zejména vhodný pro léčení rakovin. Například se mohou citovat adenokarcinomy tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomy plic, leukémie myeloidní, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny vaječníků, rakoviny • · • 4 β
močového měchýře, glioblastomy, hepatokarcinomy, rakoviny kostí, rakoviny kůže, rakoviny pankreasu nebo také rakoviny ledvin a prostaty, rakoviny hrtanu, rakoviny hlavy a krku, rakoviny genitální HPV (human papilloma virus) pozitivní, rakoviny nosohltanu EBV (virus Epsteina-Barrové) pozitivní atd.
Farmaceutické kompozice mohou být použity in vitro nebo ex vivo. Ex vivo spočívá zejména v inkubaci buněk v přítomnosti sekvence nukleových kyselin (nebo vektoru nebo kazety nebo přímo derivátu. In vivo spočívá v podávání organizmu účinného množství vektoru (nebo kazety) podle · vynálezu zejména přímo na úrovni místa ošetření (zejména tumoru), předběžně současně nebo/a po injekci zkoumané proformy účinné látky čili gancicloviru nebo nukleosidového analogu. Po této stránce vynález se také týká metody destrukce hyperproliferativních buněk, která zahrnuje zkontaktování uvedených buněk nebo částí buněk navzájem se sekvencí nukleových kyselin nebo variantou thymidin-kinasy takovou, jaká byla již definována.
Předložený vynález podle toho navrhuje mutovaný . enzym TK takového, druhu, že fosforylace gancicloviru nebo použitého nukleosidového analogu tomu velmi významně zvýšená. Výhodně se mohou použít podle vynálezu v buněčných a klinických testech sekvence nukleových -kyselin mutovaného TK v dávkách proformy účinné látky i) významně slabších, ii)nebo schopných vyvolat „zyýšdnýí=účiriek;ssby-sranděr .ii.ih nebo také v dávkách ř nevedoucích k buněčné toxicitě, která by se mohla objevit v případě, když je divoká thymidin-kinasa silně exprimovaná.
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
Legenda k obrázkům:
Obrázek 1: Plazmid exprese pXL2645
Obrázek 2: Iniciační rychlost fosforylace (specifická aktivita v nmol/min/mg) jako funkce koncentrace thymidinu (v -μΜ) pro enzymy: divoký HSV1-TK a mutanty 1537:E4, 2-856:Hl, 2-3361:D3 a 3-4216:H2.
Obrázek 3: Křivka vyjadřuje rychlost fosforylace (specifická aktivita v nmol/min/mg) jako funkci koncentrace, gancicloviru (v μΜ) pro enzymy: divoký HSV1-TK a mutanty 1537:E4, 2-856:H12, 2-3361:03 a 3-4216:H2.
Obrázek 4: Schematické vyjádření plazmidu pcDNA3-TK, pXL 3022 a PXL3037. Tabulka 1 shrnuje kinetické konstanty těchto enzymů, tedy gancicloviru a thymidinu.
K Tabulce 1:
GCV nevyjadřuje klasické kinatické michaelisovy konstanty (mimo s mutantem 3-4216:H2), hodnoty jsou vyjádřeny pomocí S0.5 (tzn. substrátovou koncentraci odpovídající polovině pozorované maximální rychlosri).
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
• ·
Acyclovir Vmax obs 220 250 280 220 590 910128
s 3- O co 51 99 62 45 123 255+16
Ganciclovir Vmax obs nmol/min/mg 400 550 1080 730 2100 Vmax 2800+130
s 3. iD O ca co c—1 ϊ '9 LiO rH co r- .Γ- ·». LO co co 00 +1 sr «7 CN
c f Ό -H e >1 J3 b***. «—i 3540 1815 3055 637 870
» Vmax : nmol/min/mg i 1020 + 105 CN r-H -H LiO o co j 880177 i 718185 :1486137
£ 3. CN O K. o +1 CN i—1 s. o 0,07±0,01 o o +1 CN i—1 o CN t1 O +1 r- *» o 0,7110,05
Thymidin kinasa Divoký typ 1537:E4 CN τ—l X LiO CO co 1 CN 2-3361:D3 3-4216:H2
Materiál a metody
Zkratky
ACV: acyclovir
GCV: ganciclovir
HSV1-TK: thymidin-kinasa viru herpes simplex typu 1.
Všeobecné techniky molekulární biologie
Metody klasicky používané v molekulární biologii jako' je preparátivní extrakce plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA v gradientu cloridu cesnatého, elektroforéza na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, srážení DNA v prostředí šalinu ethanolem nebo isopropanolem, transformace v Escherichia coli atd. jsou odborníky dobře'známé metody a jsou obsáhle popsané v odborné literatuře (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N. Y., 1989, Ausubel F.M. et al. Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987).
Plazmidy typu pUC a fágy série M13 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratories), plazmidy pBSK nebo pBKS pocházejí z firmy Stratagen.
Enzymová amplifikace fragmentů DNA technikou nazvanou PCR (?o 1 ymersse-cata 1 yzed Chain Reactio) může ) být., provedena za použití DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podle doporučení výrobce.
Elektroporace plazmidové DNA do buněk Escherichia coli může být provedena pomocí elektroporatéru (Bio-Rad) podle doporučení výrobce.
Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sangerem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci.
·· • «
USA, 74 (1977} 5463-5467) za použití soupravy distribuované
Amérshamem nebo Applied Biosystems.
Příklad 1: Biochemické třídění mutantů HSVl-TK
1-1 Plazmid exprese prokaryontního genu HSVl-TK
V odborné literatuře bylo popsáno několik systémů exprese genu HSVl-TK u Escherichia coli (Colbere et al. 1979 Proč. Nati. Sci. USA 76 p3755, Kit et al. 1981 Gene 16 p287, . Wadman et al. 1983 J. Biol. Chem. 258 pll571, Fetzer et al. 1992 Pharm. Pharmacol. Lett. 2 pll2, Brown et al. 1995 Nátuře Structural Biology 2_ p87 6) . Systémy, které jsou popsány dále umožňují velmi přesnou a účinnou produkci proteinu HSVl-TK v jeho původní formě (jako nezměněný, nesloučený)
Expresní lazmid prokaryontu pXL2638 byl konstruován od plazmidu pHSV-106 (Gibco-BRL) a expresní vektor pETlla (pocházející . z Novagenu) byl konstruován následujícím způsobem. Potom co inzert BglII-NcoI 1,5 kb pocházející z pHSV-106 a obsahující gen HSVl-TK, jehož sekvence jsou publikovány McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5949 byl zbaven přesahujících konců, byl klonován .v místě Smál pBSK, aby se vytvořil plazmid pBTKl. Místo Ndel bylo vloženo řízenou mutací od polohy -3 sekvence kódující gen HSVl-TK. Z toho důvodu fragment 500bp obsahující část 5'genu byl amplifikován . PCR za použití pBTKl jako matrice a dvou oligonukleotidů: oligonukleotidu 5'(TTA TGA ATT CAT ATG GCT TCG TAC CCC GGC)3'SEQ ID N°4 a antimediátorového oligonukleotidu 5'(TTA TTT CTA GAG GTC GAA GAT GAG GGT)3'SEQ IN°5 jako nástrojů, byl tento fragment klonován v M13mpl9 a potom sekvenován. Tento fragment řízený EcoRI a Sstl tvoří inzert 460 pb, který byl klonován společně s inzertem Sstl-Xbal lkb pBTKl obsahující část 3'genu HSVl-TK v plazmidu pUCl9 řízeném EcoRI a Xbal; tento plazmid pUCTK obsahuje gen HSVl-TK ve formě kazety
Ndel-BamHI, která byla klonována mezi místy Nde.I a BamHI pETlla, aby se vytvořil plazmid pXL2638. Tento plazmid umožňuje exprimovat gen HSV1-TK pod řízením promotoru genu 10 bakteriofágu T7; tento promotor byl indukován, když RNA-polymerasa bakteriofágu T7 byla syntetizována například ve kmeni Escherichia coli BL21, lairibdaDE3 (Studier et al. 1990 Methods Enzymol. 185 p89).
1-2 Příprava nebuněčných extraktů
Neuněčný extrakt kmene Escherichia coli produkující · protein HSV1-TK může být připraven různým způsoby, mezi kterými se může uvést lýza lyzozymu v přítomnosti EDTA, použití přístroje pro drcení typu Menton-Golin, Erench .Press, X-Press, nebo účinek ultrazvuku. Nebuněčné extrakty kmene i Escherichia coli BL21, lambdaDE3 (Novagen lne) pXL2638.. byly připraveny následujícím způsobem:
Kmen Escherichia coli BL21, lambdaDE3 pXL2638 se kultivuje v kultivační půdě LB (Luria-Bertani) + ampicilin (50 mg/1) při teplotě 37°C až do absorbance 0,7 při 600 nm; produkce proteinu HSV1-TK se indukuje přídavkem lmM IPTG (isopropylthio-beta-D-galaktosiduj a probíhá při sledování růstu buněk během 3 hodin při teplotě 30°C. Získané buňky z 1 litru buněčného média po ostředění (5 000 x g, 20 min) se znovu rozředí v 10 ml pufru 50 mM Tris/HCl pH 7,8, který obsahuje 5 mM DTT, 4 mM MgCi2 a 10% glycerolu (cbj ./obj . ) a.....
podrobí ultrazvuku během 4 minut při teplotě 4°C. Po odstředění (50 000 x g, 1 hodinu) se supernatant injikuje na kolonu Source 15Q (50 ml gelu, Pharmacia), která se ekvilibruje v pufru popsaném dále. Proteiny se eluují v lineárním gradienru od 0 do 400 mM NaCl v pufru A. Frakce vykazující aktivitu TK se slijí dohromady, připraví ke konečné koncentraci 1,1 M síranu amonného a chromatografuji na koloně Phenyl-Superose HR 10/10 (Pharmacia) a eluují • · • ·· ·«· « · · ··· · · · · ··· · · ···· · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ·· ·· snižujícím se lineárním gradientem oč 1,1 do 0 M síranu amonného. Frakce vykazující aktivitu TK se slijí dohromady. Po této etapě frakce představuje jeden viditelný pruh v SDS-PAGE, po detekci v Coomassie Blue, tento pruh migruje s molekulovou hmotností zřejmou okolo 41 000.
1-3 Velikost aktivity TK
Může se detekovat aktivita ATP závisející na fosforylací nukleosidů, když se postupuje následujícím způsobem:
enzymatický extrakt obsahující okolo 0,1 jednotky TK se inkubuje po dobu 15 minut při teplotě 37°C v 100 μΐ pufru 50 mM Tris/HCl pH 7,8, který obsahuje 1 mg/ml BSA (hovězí sérový albumin), 5 mM ATP, 4 mM MgC12, 12 mM KC1, 2 mM DTT, 600 μΜ EDTA a 100 μΜ (8-3H)-GCV (40nCi/nmol). Reakce se zastaví přídavkem 10 μΐ pufru 50 mM Tris/HCl pH 7,8 obsahujícího 1 mM neradioaktivního thymidinu. Fosforylované vzorky se fixují na koloně DEAE-Sephadex (400 μΐ gelu), potom po promytí kolony jsou tyto vzorky eluovány 2 ml 1M HCI. Radioaktivita ve vzorku se počítá kapalnou scintilací.
Stanovení velikost aktivity TK za použití thymidinu jako substrátu se provede stejným způsobem za použití 0,002 jednotky TK a 1 μΜ (methyl-14C) thymidinu (56nCi/nmol).
Jednotka akt i v i ty. TK je definována jako množství . enzymu nezbytného pro fosforylací 1 nmol substrátu za jednu minutu za podmínek, které jsou dále popsány.
Pro výpočet kinetických konstant se množství TK vložené do enzymové reakce upravuje tak, aby se přeměnilo nejvýše 5% substrátu vloženého na začátku reakce a specifická aktivita tohoto substrátu byla podle toho zvýšena. Michaelisivy křivky jsou upraneny na základě experimentálních dat pomocí • ···
• ·
Enzfitter (Sigma).
Když GCV nevyjadřuje klasickou michaelisovu kinetickou konstantu (mimo s mutantem 3-4216:H2) hodnoty jsou vyjádřeny pomoci S0.5 (tj. koncentrace substrátu, při které se dosáhne poloviční pozorované maximální rychlosti).
1-4 Plazmid pXL2645 umožňující biochemické třídění
Systémy heterologní exprese u Escheřichia’ coii jsou početné a dobře známé odborníky. Exprese genu HSV1-TK se jeví jako nej lepší pro biochemické třídění, když je gen exprimován pomocí promotoru Tryptofanu (pTryp) a pro zvýšený počet kopií na plazmidu pXL2645. Inzert Ndel-Xbal 1,4 kb pUCTK se společně klonuje s inzerty Ndel-EcoRI 120 pb a EcoRI-Xbal 3,1 kb pXL694 (Jung et al. 1988 Ann. Inst. Pasteur / Microbiol. 139 pl29j, aby se vytvořil plazmid pXL2619. Následující inzerty pXL2619: EcoRI-Xbal 1,5 kb (obsahující gen HSV1-TK a pTryp: oblast promotor / operátor operonu tryptofanu Escheřichia coli následujíce RBS (místo vazby ribozomů) genu cil lambda) a Xbal-BamHI 530 bp obsahující oblast terminátoru TrrnB ribosomálního operonu Escheřichia coli byly společně klonovány ve vektoru pBSK+, aby se vytvořil plazmid pXL2645.
1-5 Mutageneze plazmidu
Počet meťoď umožňuj i cích realizovat mutaci řízenou nebo neřízenou na plazmidu je dobře známý odborníky, mohou se uvést mutace řízené PCR nebo oligonukleotidy při dodržení doporučení dodavatele Amersham, může se uvést neřízená mutace in vitro chemickými činitely nebo mutace in vivo v kmeni Escheřichia coli (Miller A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1992). Plazmid pXL2645 byl mutován mutagenezí hydroxylaminu podle návodu již popsaného, která vede neřízené ··· · · · · · · · · • ···· · · ι· · · · · · • 9 · 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 ·· ·· ·· ·· k přeměně GC na AT v plazmidu (Humphreys et al. 197 6 Mol.
Gen. Genet. 145 plOl). Pět μς plazmidové DNA rozpuštěné v 0,2 M fosfátovém pufru pH6, který obsahuje 0,4 M hydroxylaminu se inkubuje při teplotě 80°C nebo při teplotě 86°C po dobu 30 minut, potom se nechá ochladit při okolní teplotě po dobu 20 minut, roztok se pak podrobí dialýze a srazí. DNA se rozpustí v 50 μΐ vody. Jestliže plazmidová DNA je pCHHO (pocházející z Pharmacia) nesoucí gen lacZ), mutanti lacZ- jsou získáni při frekvenci 2,4% (příp. 7,6%), když se plazmid zahřeje na teplotu 80 °C (příp. 86°C) v přítomnosti hydroxylaminu.
1-6 Třídění mutantů vyjadřujících modifikovaný TK
Plazmid pXL2645 s mutovaným hydroxylaminem při teplotě 80 °C se vloží elektroporací do kmene Escherichia coli tk-ME802.5 (pocházející z National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka, Ken, Japon). Elektroporanti jsou vyseti individuelně do jamek mikrotitrační destičky obsahující 100 μΐ minimální kultivační půdy M9 doplněné 0,4% aminokyseliny a 50 mg / 1 ampicilinu. Kultura se inkubuje při teplotě 37°C za stálého míchání po dobu 17 hodin. Patnáct μΐ kultury rozpuštěné v 1/25 pufru 50 mM Tris/HCl pH 7,8 se inkubuje během 20 minut při teplotě 37°C v objemu 250 μΐ pufru 50 mM Tris / HCI. pH 7,8, který obsahuje 2 mg/ml lyzozymu vaječného bílku, 5 mM ATP, 4 mM MgC12, 12 mM KC1, 2mM DTT, 600 μΜ EDTA, μΜ (8-3H)-GCV (60 nCi/nmol) a 1 μΜ (methyl-14C)-thymidinu (56 nCi/nmol). Reakce se zastaví přídavkem 25 μΐ pufru 50 mM Tris/HCl pH 7,8, který obsahuje lmM neradioaktivního thymidinu. Fosforylované vzorky se fixují na koloně DEAE-Sepharex (400 μΐ gelu), potom po promytí kolony tyto vzorky se eluují 2 ml 1M HCL. Radioaktivita (3H a 14C) ve vzorku se potom vypočítá kapalinovou scintilací za použití programu dvojnásobného značení, poměr 3H/14C se vypočítá pro každý vzorek.
• '· 1
Pro každý mikrotitračni plak s 96 jamkami se vypočítají průměrem poměrů 3H/14C souboru klonů (M) a odchylkou typu (σ) rozložení poměrů 3H/14C. Větší množství proteinů přítomné v každé jamce plaku s 96 jamkami se měří pomocí reagentu Brandford (Coomassie Plus Protein Assay Reagent, Pierce) z frakce odpovídající 1/25 roztoku připraveného dále. Každý klon, který obsahuje méně než jednu čtvrtinu proteinů než je obsaženo průměrně v jednom klonu v krabici je definitivně vyloučen.
Poměr 3H/14C získaný pro každý klon v boxu s 96 jamkami se porovnává se středem M. Klony, které vyjadřují tento poměr . vyšší než součet Μ+3σ při vyjádření fosforylační aktivitu thymidinu vyšší než M'/2, kde M' je střední fosforylační aktivita thymidinu jsou ponechány pro potvrzení a pro studium.
Tabulka 2 shrnuje výsledky získané po třídění 4129 klonů pocházejících z mutací hydroxylaminu pXL2645 při teplotě 80°C. V tomto třídění pro divoký enzym aktivita TK se vztahuje k 100% a výtěžek GCV/Thy je 1.
Na konci této studie byl prokázán mutant nazvaný 1537:E4 představující zvýšenou aktivitu vůči gancicloviru.
9· ·· • · · • · · ·· • · · ft · · • ft ·· ftft «· ftft ftft • · · · · · · • ·· · · »· ftft ·· · * · • ftft · · ft ftft ·· ftft ··
Tabulka 2:
aktivita TK %<TK<% počet název mutantu frekvence o. o
zvýšená 233<TK<320 2 3841:D2 0,05
slabá 5<TK<10 17 3841:F3 : o,4
nulová TK<5 99 2,4
nulová na GCV, ale nezměněná na thymidin 1 2881:C8 0,02
zvýšená na GCV, ale nezměněná na thymidin GCV/Thy: 1,76 (σ:0,11) 1,70 (σ:0,19) 2 1537:E4 1921H:12 0, 05
Příklad 2: Primární struktura a biochemická charakteristika mutantu 1537:E4
2-1 Sekvence genu HSV1-TK mutantu 1537:E4
Gen HSV-TK exprimovaný od mutantu 1537:E4 byl sekvenován na dvou vláknech a byla pozorována mutace G1.80A. Tato mutace odpovídá substituci Met60Ile. Může se poznamenat, že toto reziduum je situováno v oblasti schodné s ATP vazebným místem. Srovnatelná práce byla provedena s mutantem 1921:H12 a byla pozorována stejná mutace (MetSOIle).
2-2 Klonování genu HSV1-TK mutantu 1537:E4 do prokaryontního vektoru exprese
Inzert Ndel-BamHI 1,4 kb kódující gen HSV1-TK mutantu 1537:E4 byl klonován ve vektoru exprese pETlla, aby se vytvořil pET:E4. Enzym HSV1-TK mutantu 1537:E4 byl produkován u Escherichia coli BL21, lambdaDE3 za podmínek popsaných v ·· ·· • · · • · ··· • · · • · · · • · · · · · · • ·· · · ·* • · · · ··· · · • · · * « · · kapitole 1-2.
2-3 Biochemické údaje
Kinetické konstanty pro mutovaný TK 1537:E4 a divoký TK přejaté z odkazů jsou získány za podmínek enzymatického dávkování popsaných v kapitole 1-3.
Dva TK (divoký a mutant 1537:E4) nevyjadřují Michaélinovo chování s Ganciclovirem a Acyclovirem (inhibice silnou koncentrací). To nedovoluje tedy výpočet hodnoty Km u těchto dvou substrátů. Může být daná koncentrace S0,5 odpovídající koncentraci substrátu při počáteční rychlosti rovné polovině pozorované maximální rychlosti. Vmax a Vmax obs jsou vyjádřeny v nmol/min/mg proteinu.
Křivka na obrázku 2 ukazuje počáteční rychlosti fosforylace jako funkci koncentrace GCV pro dva enzymy, 1537:E4 a divoký. Ukazuje zejména nepřítomnost úplné inhibice aktivity fosforylace GCV mutovaným TK 1537:E4, na rozdíl od divokého enzymu, pro který inhibice je velmi jasná od 15μΜ. Tato křivka ukazuje zvýšení faktorem 2 až 2,5 počáteční rychlosti fosforylace GCV od 15-20 μΜ s mutovaným enzymem 1537:E4 vzhledem k divokému enzymu. Mutovaný enzym 1537:E4 zde vyjadřuje poměr Kcat/Km thymidinu ‘ snížený faktorem 2 vzhledem k divokému enzymu.
Příklad 3: Získání, primární struktura a biochemická charakteristika mutantů 2-865:H12 a 2-3361:D3
3.1 Získání mutantů 2-865:H12 a 2-3361:D3
Plazmid pXL2838, vzešlý z mutantu 1537:E4 nese pod řízením promotoru pTryp gen HSV1-TK, jehož protein TK je odlišný od divokého proteinu mutací M60I. U tohoto plazmidu se mutuje hydroxylamin při teplotě 86°C, potom se vloží plazmid elektroporací do kmene Escherichia coli tk- ME8025. Souhrn 4992 elektroporantů se analyzuje pro schopnost fosforylovat ganciclovir a thymidin, jak je to popsáno v příkladu 1-6. Výsledky třídění jsou uvedeny v Tabulce 3, kde aktivita TK je vztažena k 100% a poměr GCV/Thy je 1 pro divoký enzym. Dva mutanty 2-865:H12 a 2-3361:D3 vyjadřují zlepšení vlastnosti aktivátoru vůči gancicloviru.
Tabulka 3:
aktivita TK %<TK<% počet název mutantu frekvence %
slabá 5<TK<10 55 1,1
nulová TK<5 227 4,5
zvýšená na GCV, ale nezměněná na thymidin GCV/Thy: 4,95+/-0,66 3,99+/-0,53 2 2-865:H12 2-3361:03 0,04
3-2 Sekvence genu HSV1-TK mutantů 2-865:H12 a 2-3361:D3
Gen HSV1-TK exprimovaný od mutantů 2-865:H12 a 2-3361:D3 byl sekvenován na obou vláknech a byla pozorována následující mutace. U mutantů 2-865:H12, jsou to mutace G28A, G30A. _ a G13QA., které , odpovídají substitucím .. AlalOThr , a Met60Ile. Zatímco u mutantu 2-3361:D3 to jsou mutace G16A, G180A, C306T a C308T, které odpovídají substitucím Gly6Ser, Met60lle a Thrl03lle.
3-3 Důležitost mutace umístěné, na N-konci TK
Enzymy mutantů 2-865:H12 a 2-3361:03 nesou obě dvě mutace v oblasti N-konce thymidin-kinasy v poloze 10 nebo 6.
• ·
Když enzym odpovídající mutantu 2-3361:D3 obsahuje také mutaci v poloze 103, plazmidy odpovídající mutacím v poloze 6 a 60 (pXL2964) nebo v poloze 60 a 103 (pXL2963) nebo v poloze 103 (pXL2965) nebo v poloze 6 (pXL2966) byly vytvořeny následujícím způsobem. Inzert SnaNI-BspEI 400 bp plazmidu pXL2840 (plazmid část mutantu 2-3361:D3) byl klonován bud’ v plazmidu pXL2645 řízeném SnaBI-BspEI, aby se vytvořil pXL2965 nebo byl klonován v plazmidu pXL2838 řízeném SnaBI-BspEI, aby se vytvořil pXL2963. Plazmid pXL2964 odpovídá ligaci inzertu MiuI-XmnI 2,9 kb plazmidu pXL2838 s fragmentem XmnI-MluI 2,1 kb plazmidu pXL2840. Plazmid pXL2966 odpovídá ligaci inzertu MluI-XmnI 2,9 kb plazmidu pXL2649 s fragmentem XmnI-MluI 2,1 kb plazmidu pXL2840. Tyto plazmidy byly transformovány ve kmeni Escherichia coli ME8025 a aktivita thymidin-kinasy na thymidin a ganciclovir byla určena jako v příkladu 1-6, poměry GCV/Thy jsou uvedeny v Tabulce 4.
Tabulka 4:
plazmid (mutant) mutace enzymu TK GCV/Thy
pXL2645 divoký TK. 1,00+/-0,08
pXL2838 (1537:E4) M60I 1,60+/-0,17
PXL2840 (2-3361:D3) G6S, M60I, TI031 3,10+/-0,26
pXL2963 M60I, T103I 1,60+/-0,18
pXL2964 C-6S, M60I_________ 2,80+/-0,40
PXL2965 T103I 1,00+/-0,18
pXL2966 G6S 1,40+/-0,20
Samotný poměr GCV/Thy získaný s plazmidem pXL2964 je srovnatelný s poměrem získaným s plazmidem pXL2840. Souhrn výsledků ukazuje, že to není mutace v poloze 103, ale mutace v poloze 6, která vede ke zvýšení aktivity TK na GCV mutantu
2-3361:03 vzhledem k mutantu 1537:E4. Jiná mutace v poloze 6 vede ke zvýšení aktivity TK. Účinek této mutace je tedy připočten k účinku mutace v poloze 60 pro zvýšení aktivity TK na GCV. Nejvyššího zvýšení získaného kombinací dvou mutací Gly6Ser a Met60lle se může také získat, když se kombinuje s mutací Met60lle jiná mutace umístěná v části N-konce thymidin-kinasy, například mutace AlalOThr.
3-4 Klonování genu HSV1—TK mutantu 2 —865:H12 a 2-3361:D3 do prokaryontního vektoru exprese
Inzert Ndel-BamHI kódující gen HSV1-TK pocházející z mutantu 2-865:H12 (příp. 2-3361:D3) byl klonován ve vektoru exprese pETlla, aby se vytvořil pXL2843 (příp. pXL2841). Tento plazmid byl transformován do Escherichia coli BL21met”lambdaDE3, aby se vytvořil enzym těchto dvou mutantů.
3-5 Biochemické údaje
Enzymy pocházející z kultury Escherichia coli BL21met-lambdaDE3, pXL2843 a Escherichia coli BL21met-lambdaDE3, pXL2841 byly purifikovány až do úplné homogenity. Kinetické konstanty pro mutovaný TK mutantů 2-865:H12 a 2-3361:D3 byly určeny a porovnány s kinetickými konstantami divoké TK a TK mutantu 1537:E4. Soubor těchto hodnot je naznačen na Obrázku 3. Křivka na obrázku 3 ukazuje rychlost fosforylace jako funkci koncentrace GCV pro čtyři enzymy. Ukazuje částečné ukončení inhibice GCV mutantů TK 1537:E4 2-865:H12 a 2-3361:D3 vůči divokému enzymu, pro který je inhibice jasná už od 30 μΜ. Tato křivka ukazuje také zvýšení rychlosti fosforylace GCV z faktoru 1,6 na 2,5 při 16 μΜ GCV a od 4,3 na 4,9 při 100 μΜ GCV vzhledem k divokému enzymu. Tabulka 1 k Obrázku 3 ukazuje, že enzym mutantu 2-865:H12 má poměr Kcat / Km thymidinu změněn vzhledem k • · • ·
tomuto poměru divokého enzymu, a že enzym mutantu 2-3361:D3 vyjadřuje poměr Kcat / Km snížený faktorem vyšším nebo rovným 5 vzhledem k faktoru divokého enzymu.
Přiklad 4: Získání, primární struktura a biochemická charakteristika mutantu 3-4216:H2
4.1 Získání mutantu 3-4216:H2
Plazmid pXL2842, vzešlý z mutantu 2-865:H12 nese, pod řízením promotoru pTryp, gen HSV1-TK, jehož protein TK je odlišný od divokého proteinu mutacemi AlalOThr a MetéOIle. U tohoto plazmidu se mutuje hydroxylamin při teplotě 86°C, a potom se plazmid vloží elektroporací do kmene Escherichia coli tk- ME8025. Souhrn 3900 elektroporantů se analyzuje pro >schopnost·-fosforylovat ganciclovir a thymidin tak, jak je popsáno v příkladu 1-6. Výsledky třídění jsou uvedeny v Tabulce 5, kde aktivita TK je vztažena k 100% a poměr GCV/Thy je roven 1 pro divoký enzym. Mutant 3-4216:H12 vyjadřuje vlastnost vyššího aktivátoru vůči gancicloviru.
t-c c© - -cg
Tabulka 5:
aktivita TK %<TK<% počet název mutantu frekvence 0, 0
slabá 5<TK<10 19 0,5
nulová TK<5 121 3,2
nulová na GCV, ale nezměněná na thymidin 1 3-2293:C4 0,03
zvýšená na GCV, ale nezměněná na thymidin GCV/Thy: 7,84+/-1,09 1 3-4216:H2 0,03
4.2 Sekvence genu HSV1-TK mutantu 3-4216:H2
Gen HSV1-TK exprimovaný od mutantu 3-4216:H2 byl sekvenován na obou vláknech a byly pozorovány následující mutace (G28A, G30A, G180A, C591T, C892T, G1010A a G1011A). Tyto mutace odpovídají substitucím AlalOThr, Met60Ile a Arg337Gln.
4-3 Klonování g.enu HSV1-TK mutantu . 3-4216:H2 do prokaryontního vektoru exprese
Inzert Ndel-BamHI kódující gen HSV1-TK pocházející z mutantu 3-4216:H2 byl klonován ve vektoru exprese pÉŤlía, aby se vytvořil pXL3129. Tento plazmid byl transformován do Escherichia coli BL21met~lambdaDE3, aby se vytvořil enzym tohoto mutantu.
4-4 Biochemické údaje
Enzym TK pocházející z kultury Escherichia coli e-e.
ββ
BL21metlambdaDE3, pXL3129 byl purifikován až do úplné homogenity. Kinetické konstanty pro mutovaný TK mutantu 3-4216:H2 byly charakterizovány a porovnány s kinetickými konstantami divoké TK a mutantu 1537:E4, 2-865:H12 a 2-3361:D3. Soubor těchto hodnot je naznačen na Obrázku 3 a uveden v Tabulce 1. Enzym mutantu 3-4216:H2 je význačný zvýšením úplné inhibice substrátem GCV a zvýšením rychlosti !
fosforylace. Počáteční rychlost fosforylace GCV s mutantem je násobena faktorem 7 vzhledem k divokému enzymu a faktorem 2,8 vzhledem k mutantu 2-865:H12. Mutant 3-4216:H2 má fosforylační katalytickou aktivitu thymidinu slabší než divoký enzym a než mutanty 1537:E4, 2-865:H12 a 2-3361:D3, jak naznačují hodnoty Kcat / Km v Tabulce 1.
Příklad 5- Konstrukce vektoru exprese variant TK
Tento příklad popisuje konstrukci vektorů použitelných pro přenos sekvencí nukleových kyselin předloženého vynálezu in vitro a in vivo.
5.1 Konstrukce plazmidových vektorů
Pro provedení konstrukce se mohou použít komerční vektory jako jsou vektory pZeoSV, pSV2pcDNA3...
- Vektor. pSV2 popsaný v DNA Cloning, A practical approarch Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je expresním vektorem eukaryontů. Nukleové kyseliny kódující varianty TK byly vloženy do tohoto vektoru v místech Hpal-EcoRV. Byly tak umístěny pod kontrolou promotoru leucinového zipu viru SV40.
- Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Jedná se o eukaryontní expresní vektor eukaryontní ·exprese. Sekvence nukleových kyselin kódující varianty TK předloženého vynálezu jsou
umístěny v tomto vektoru pod En, co se týče genů kódujících divoký HSV1-TK a pod řízením raného promotoru CMV. Všechny konstrukce popsané v tomto příkladu byly vloženy do tohoto vektoru mezi místy Hind III / Not I, aby byly testovány v různých systémech in vitro.
Co se týče genu kódujícího divoký HSV1-TK a genu mutantu 2-865:H12 konstrukce, které byly vytvořeny s plazmidem pXL2990. Tento vektor odvozený od pBSK (Stratagene) obsahuje promotor / leucinový zip amplifikovaného CMV metodou PCR od plazmidu pGCN (Tanaka et al. 1990 Cell 60 p375). Gen HSV1-TK byl amplifikován metodou PCR pomocí plazmidu pBTKl . (viz příklad 1-1) za vytváření míst Ncol a AvrlI kodonů ATG a TGA. Tento gen byl klonován po směru promotoru CMV pXL2990 a proti směru pozdní polyadenylové sekvence SV40 (amplifikované metodou PCR pomocí plazmidu pGL3basic (Promega)), aby se vytvořil . plazmid pXL3022. Srovnatelně byl amplifikován gen HSV1-TK vzešlý z mutantu 2-865:H12 metodou PCR pomocí plazmidu pXL2843 (viz. příklad 3.4) potom klonován po směru promotoru CMV plazmidu pXL2990 a proti směru pozdní polyadenylové sekvence SV40, aby se vytvořil plazmid pXL3037, viz Obrázek 4.
5.2 Konstrukce virových vektorů
Podle zvláštního způsobu předložený vynález spočívá v konstrukci a použití.virových vektorů, které umožňují přenos a expresi in vivo nukleových kyselin tak, jak je definováno.
Jedná se zejména o adenoviry, různé serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, a které byly charakterizovány. Mezi těmito serotypy se upřednostňuje použití v rámci předloženého vynálezu lidských adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirů zvířecího původu (viz přihláška vynálezu WO94/26914). Mezi adenoviry zvířecího původu, které jsou použitelné v rámci předloženého vynálezu ·€:·® β» )
·· se mohou uvést adenoviry psího, hovězího, myšího původu (například: Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího původu (například: SAV). Z adenovirů zvířecího původu jsou zejména upřednostňovány adenoviry psí zejména adenovirus CAV2 (například: kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800) ).. V rámci předloženého vynálezu se zejména používá adenovirus lidského nebo psího původu nebo jejich směs.
Defektní adenovirus podle předloženého vynálezu obsahuje ITR, sekvenci umožňující enkapsidaci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. V genomu adenovirů vynálezu alespoň oblast El není funkční. Uvažovaný virový gen může být zbaven funkčnosti všemi odborníky známými technikami zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více párů basí v uvažovaném nebo uvažovaných genech. Tyto ^modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA.) nebo in sítu například prostřednictvím technik genového oboru nebo také působením mutagenních činidel. Mohou být také modifikovány jiné oblasti genomu zejména oblast E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938) , E4 (WO94/28152, WO94/12649,
WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podle upřednostňovaného způsobu provedení adenovirus podle předloženého vynálezu obsahuje delecí v oblastech El a E4. Podle jiného způsobu realizace obsahuje deleci v oblasti El na úrovni, ve ' které jsou vloženy oblast E4 a sekvence nukleových kyselin vynálezu (viz FR94 13355) . Ve virech vynálezu deléce v oblasti El se rozprostírá především od nukleotidu 455 po 3329 v sekvenci adenovirů Ad5.
Rekombinantní defektní adenovirus podle vynálezu může být připraven všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EKBO J. 3 (1984) 2917). Mohou být připraveny zejména obecnou rekombinací mezi adenovirem a plazmidem, který nese mimo jiné nárokovanou sekvenci nukleových kyselin. Obecná rekombinace i* rT se provádí po společné transfekci výše uvedených adenovirů a plazmidem v přizpůsobené buněčné linii. Použitá buněčná linie musí přednostně (i) být transformovatelná uvedenými elementy a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenovirů přednostně v integrované formě proto, aby se zamezilo nebezpečí rekombinace. Jako příklad buněčných linií se může uvést lidská ledvinová embryonální linie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje zejména včleněnou ve svém genomu levou část genomu adenovirů Ad5 (12%) nebo se mohou uvést linie schopné doplnit funkce El a E4 takové jaké, jsou zejména popsány v přihláškách vynálezu n°WO 94/26914 a WO95/02697.
Adenoviry, které se rozmnožily byly získány a purifikovány podle klasických technik molekulární biologie, jak je naznačeno v příkladech.
Adenovirové konstrukce podle vynálezu jsou především získány v souhlase s následujícím protokolem:
Adenovirové konstrukce byly konstruovány podle technologie popsané v přihlášce vynálezu WO96/25506, která se vztahuje k detailnímu popisu dále citovaných plazmidů. Byl použit kyvadlový plazmid pACK3, který odvozuje ColEl a obsahuje i) gen, který uděluje rezistenci ke kanamycinu, ii) gen sacB B. subtillis, iii) sekvence ITR-Psi (poloha 1-386 adenovirů Ad5) odlišné od sekvencí obsahujících gen, který kóduje protein PIX (poloha 3447 - 4415 adenovirů Ad5) místy restrikce EcoRV a Šálí. Kazety exprese eukaryontních plazmidů pXL3022 a pXL3037 byly klonovány mezi místy EcoRV a Sáli kyvadlového plazmidů pACK3, aby se vytvořily plazmidy pXL3050 a 3051, viz Obrázek 4. Dvojitou obecnou rekombinací pomocí adenovirového plazmidů pXL2822 (J. Crouzet et al., 1997 Proč. Nati. Acad. Sci. 94 v tisku) byly vytvořeny adenovirové plazmidy pXL3075 a 3076, Tyto plazmidy byly digerovány PacI a transfektovány v lidské buněčné linii 293, aby se vytvořil virus ADV3075 a ADV3076. Tyto viry jsou deletovány v oblasti >« • ··· 9 * ·· • · 9 9 9 · · • 9 9 9 · 9
El a E3, které obsahují kazety exprese genů HSV1-TK divokého enzymu a mutantu 2-865:H12.
Co se týče adeno-associated viru (AAV) , jedná se o virus DNA velikosti relativně malé, který se začleňuje do genomu buněk, který infikují stabilně a stereospificky. Tyto viry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez toho, aby byl vyvolán účinek na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Nezdá se, že jsou zahrnuty do patologií u lidí. Genom viru AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 4700 basí a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) se 145 basemi, které jsou počátkem replikace . pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě oblasti zejména nesoucí funkce enkapsidace: levou část genomu, která obsahuje gen rep zahrnutý do virové replikace a exprese virových genů, pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující kapsidové proteiny viru.
Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18088, WO 93/09239, US 4,797,368, US5,139,941, EP 488
528). Tyto přihlášky vynálezů popisují různé konstrukce rep nebo/a cap jsou a jejich použití pro nebo in vivo (přímo v odvozené od AAV, ve kterých gen deletovány a nahrazeny genem zájmu přenos in vitro (na buněčné kultuře) organizmu) uvedeného genu zájmu. Defektní rekombinantní AAV podle vynálezu může být připraven společnou transfekci v buněčné linii infikované pomocným lidským virem (například adenovirem) plazmidu, který obsahuje sekvenci nukleových kyselin vynálezu zájmu lemovaným dvěma oblastmi obrácené repetice (ITR) AAV, a plazmidu, který nese gen enkapsidace (gen rep a cap) AAV. Použitelná buněčná linie je například linie 293. Rekombinantní produkty AAV jsou pak purifikovány klasickými technikami.
Co se týče viru herpes a retroviru, konstrukce rekombinantních vektorů byla široce popsána v literatuře: viz
9
> · · » · ···
Β · ·
Β · · zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atd. Retroviry jsou zejména integrativní viry, selektivně infikující buňky při buněčném dělení. Tvoří tak vektory zájmu, pro rakovinové aplikace. Genom retroviru zahrnuje zejména dvě LTR, sekvenci enkapsidace a tři kódované oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retroviru geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány úplně nebo částečně a nahrazeny sekvencí neterologní nukleové kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být realizovány od různých typů retrovirů takových jako zejména MoMuLV (murine moloney leukemia virus, také označovaný jako MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rouš sarcoma virus) nebo také Friendův virus.
Aby se vytvořily rekombinantní retroviry podle vynálezu obsahující sekvenci nukleových kyselin podle vynálezu, plazmid obsahující zejména LTR, byla vytvořena sekvence enkapsidace a výše uvedená sekvence nukleových kyselin a potom použita pro transfekci buněčné linie řečené enkapsidační, schopné nést v trans retrovirální funkce se sníženou schopností v plazmidu. Všeobecně, enkapsidační linie jsou schopny exprimovat geny gag, pol a env. Takovéto enkapsidační linie byly popsány ve vedlejších oborech, zejména linie PA317 (US4,861,719), linie PsiCRIP (W090/02806) a linie GP+ěnvAm-12 (W089/07150) . Rekombinantní retroviry mohou zahrnovat modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity, stejně jako studované enkapsidační sekvence obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639. Produkované rekombinantní retroviry jsou pak purifikovány klasickými technikami. Pro uvedení předloženého vynálezu je zejména výhodné použít rekombinantní defektní adenovirus nebo retrovirus. Tyto vektory mají vskutku zajímavé vlastnosti zejména pro přenos sebevražedných genů do
¢., ¢.
nádorových buněk.
5.3 - Chemické vektory
Mezi vyvinutými syntetickými vektory se přednostně používají v rámci předloženého vynálezu kationické polymery polylysinového typu, . (LKLK)n, (LKKL)n, polyethylenimin a DEAE-dextran nebo také kationické lipidy nebo lipofektanty. Tyto vektory mají schopnost kondenzace DNA a podporují její vázání s buněčnou membránou. Mezi těmito posledně jmenovanými vektory se mohou uvést lipopolyaminy (lipofectamin, · transfektam atd.), různé kationické lipidy nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atd.), stejně jako peptidy nukleárního původu. Mimoto pojem cílové transfekce byl vyvinut prostřednictvím receptoru, který využívá principu kondenzace DNA díky. kationickému polymeru s řízením fixace komplexu k membráně díky chemické vazbě mezi kationickým polymerem a ligandem membránového receptoru přítomného na povrchu buňky, která se chce štěpovat. Byly popsány cílové receptory k transferinu, k inzulínu a receptor asialoglykoproteinů hepatocytů. Příprava farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu používající chemický vektor je provedena podle všech odborníky známých technik, všeobecně jednoduchým zkontaktováním různých látek.
<« 0 0 » 0 0 « » 0 00 • 0 0 0« 0 0 0 0
Seznam sekvencí (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (D) konfigurace: lineární: ~ (ii) typ molekuly: peptid (ix) charakteristika (D) další informace: čtyři první Xaa vyjadřují libovolnou aminokyselinu a třetí Xaa threonin nebo serin (xi) popis sekvence SEQ ID NO:1:
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys Xaa 5 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: peptid (xi) popis sekvence SEQ ID NO:2:
Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr ··
4·
• • • • *·
42
(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1131 párů basí
(B) typ: nukleotid
(C) počet vláken: jedno
(D) konfigurace: lineární
(ii) typ •molekuly: cDNA
(xi) popis sekvence SEQ ID NO:3:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC GCG TCT GCG TTC GAC 42
Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gin His Ala Ser Ala Phe Asp
5 10
CAG GCT GCG CGT -TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG 8 4
Gin Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala
.15 20 25
T.TG CGC CCT CGC CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG 126
Leu Arg Pro Arg Arg Gin Gin Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro
30 35 40
GAG CAG AAA ATG CCC ACG CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT 168
Glu Gin Lys Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly
45 50 .55
CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC ACC ACG CAA CTG CTG GTG 210
Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr Thr Thr Gin Leu Leu Val
60 65 70
GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC GTA CCC GAG CCG 252
Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro
75 80
ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA ATC GCG 294
Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr Ile Ala
85 90 95
4 ·· • 4 4
4 444
4 4 4
4 4 Φ
4 4 4
AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
Asn Ile Tyr Thr Thr Gin His Arg Leu Asp Gin Gly Glu Ile
100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA 378
Ser ALA Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gin Ile
115 120 125
ACA ATG GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT 420
Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala
130 135 140
CCT CAT ATC GGG GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC 4 62
Pro His Ile Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro
145 150
CCG GCC CTC ACC CTC ATC TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC 504
Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile AT 3 Ala
155 160 165
CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG TAC CTT ATG GGC AGC ATG 546
Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr leu Met Cly Ser Met
170 175 180
ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC CTC ATC CCG CCG 588
Thr Pro Gin Ala Val Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro
185 190 195
ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT CCG GAG 630
Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu
200 2.05 210
GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC . 672
Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gin Arg Pro Gly
--·· ,215- = 220, -
GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT 714
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val
225 230 235
TAC GGG CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC 756
Tyr Gly Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gin Cys Gly
240 245 250
: ·:-. . . .. . ♦ ·.·. * ···· · ® e β ββ *
.. ·♦ ·· ·· *· ··
GGG TCG TGG CGG GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC 798
Gly Ser Trp Arg Glu Asp Trp Gly Gin Leu Ser Gly Thr Ala
255 260 265
GTG CCG CCC CAG GGT GCC GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA 840
Val Pi?o Pro Gin rsi v Ala Glu D 4. 4- C-ln Ser Asn Ala Gly Pro
270 275 280
CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA TTT ACC CTG TTT CGG GCC 882
Arg Pro His Ile Glu Asp Thr Leu Phe Thr Leu Phe Arg Ala
285 290
CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG TAT AAC GTG TTT 924
Pro Glu Leu Leu Ada Pro Asn Gly Asp Leu Tyr • Asn Val Phe
295 300 305
GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT TCC ATG 966
Ala T m 4. 4-^ Ada Lou Δ cn xxuy V a 1 V Ui Leu Ala Tvo 4_i_y O Σ\ υ'γτ T on jjCo Arg Ser Mo Ή t V.
310 315 320
CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
His V a 1 V l-A 4- ΡΤΙΘ Ile T.pn 4—i “ VA Son XX Tyr Son 4 Gin Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC 1050
Arg Δ on Ada Leu τ,θη Gin τ,θη Thl? Ser Gly Met Val Gin Thr
340 345 350
CAC GTC ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG' 1092
His Val Thi? Thi? Px?o pí W Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu
355 360
GCG CGC ACG TTT GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131
AjT-Gf· v* Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
365 37 0 .... , ™ 375 -
(1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 30 párů basí (B) typ: nukleotid • to ·· • toto • · to·· • to · ·· ·· • to · • · «·
(C) počet vláken: jedno
(D) konfigurace: lineární
(ii) 1 typ molekuly: cDNA
(Xi) i popis sekvence SEQ ID NO:4:
TTATGAATTC ATATGGCTTC GTACCCCGGC
(1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 27 párů basí
(B) typ: nukleotid
(C) počet vláken: jedno
(D) konfigurace: lineární
(ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence SEQ ID NO:5:
TTATTTCTAG AGGTCGAAGA TGAGGGT 27 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1131 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence SEQ ID NO:6:
,.
• · · s e e • · ·· • 4 4 9 • 4 4 4
44 4 9 · • « 4
CCG GCC CTC ACC CTC ATC TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC 504
Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp 7\ Ltt r 11X0 Pro Ile Ala Ala
155 160 165
CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG TAC CTT ATG GGC AGC ATG 54 6
Leu ΧχΘ U Cys Pro Ala Ala Arg Tt r v· X γ X leu Met fhr uxy Se r Met
170 175 180
ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC CTC ATC CCG CCG 588.
Tb >~ Ό v>o X X Cln 7\ Ί nu ci Val T o1 UČ Cl Ala Phe Ί </ Ο X 7\ Ί -λ rix α Leu Ile Pro Pro
185 190 195 .
ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT CCG GAG 630
Tin X 11X Leu Pro Π τ r Ό x γ Thr Asn Ile 1 V Cí X Leu ΓΊ tz ox y 7\ Ί n A“iXd T nu XJ CZ X Pro r 1 n \JXU
200 205 210
GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
Asp Ar g V 4 O 11X0 Ile Asp Arg Leu 7\ 1 -Λ nx o T T rn χΐγ o Arg Π V X 11 Arg Pro ri .7 oxy
215 220
GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT 714
Clu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala 7\ 1 -n ηχ ci Ile Arg Arg Val
225 230 235
TAC GGG CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC 756
ΤΤΓΛ- xyx Cly T ^,1 χττζ ui Leu Ala As π Tin X iiX Val 7\ X“X.X Tt Ty~ Le u Cln Cys ri tt wx y
240 245 250
GCG TCG TGG CGG GAG GAC TGG CGA CAG 'CTT TCG GGG ACG GCC 798
Cly Ser τ 7\ v-rr Clu 7\ o *n noy τ v-χλ xxy Cly ΓΊ n Ό X 11 Le u Ser r’ 1 τ r ό x y Tb X 1 i X Ala
255 260 265
GTG CCG CCC CAG GGT GCC GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA 840
Val Pro Pro Π τη ΌΧ11 T 1 τ r x y Ala Π u ΌΧ Ci Pro ΓΊ n OXil Ser Asn Ala Cly Pro
27 0' 275 280 -
CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA TTT ACC CTG TTT CGG GCC 882
Arg Pro His Ile Clu Asp Tb X 11 X Leu Phe Tin vX i t X Leu Phe Arg 7\ Ί -n cx
285 290
CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG TAT AAC GTG TTT 924
Pro Clu Leu Leu Ala Pro Asn Π XT \u x y Asp Leu Tt rr xyx Asn Val Phe
295 300 305
• ft ··· · · · · · · ft · • ···· · · ftft ftft ·· e e β eee · · ·· ···· · ···· ···· ···
48
GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT TCC .ATG 966
Ala T Κ'ΚΛ i J-^z Ala Le u Asp Val Leu Ala T 1 T o xjy o Arg Leu Arg Ser Met
310 315 320
CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gin Sg x Pro Ala Π Tr Cys
325 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC 1050
Arg Asp Ala Leu Leu Gin Leu Tb X ilX Sex1 Gly Met Val Gin Tin vX i i X
340 345 350
CAC GTC ACC ACC ccc GGC TCC ATA /'Ί/Κ' oCo ACG ATA TGC GAC CTG 1092
His Val TV> y> X ΠΧ Thr Pro <z jl y Ser Ile Pro Tk vX 11X Ile Xz_y xj Asp xiGU.
355 360
GCG CGC ACG TTT GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131
Ala Arg Tk v~ X ll X. Phe 7\ Ί Λ.Χ CX Arg rii, \j±u Met m ,, χχγ Π 1-, 7\ Ί ΛΧ CX Aj n ·£
365 370 375
(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: ' 7 :
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1131 párů basí (B) typ: nukleotid
(C) počet vláken: jedno
(D) konfigurace: lineární
(ii) typ molekuly: cDNA
(xi) popis sekvence SEQ ID NO: 7 : - ... - .....™--- =-z
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC GCG TCT GCG TTC GAC 42
Met Ala C/n v OCX Tyr Pro Gly. His Gin His Ala Ser Ala Phe Asp
5 10
CAG GCT GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG 84
Gin Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg 7\ nx xj T vX 11X Ala
20 • · • ·· • · · ·
TTG CGC CCT CGC CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG 126
ϋιΘ U Ax?cj Pro Ary A **»/▼ nr Gin Gin Clu Ala Thr Clu Val 7\ ν'/T Hi yj Pro
30 35 40
GAG CAG AAA ATG CCC ACG CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT 168
Clu η π \J i. 11 T t τ <r> xiy oj Met Pro Thr Lsti LjSvJ Arg Val Tyr Ile Asp Cly
45 50 55
CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC ACC ACG CAA CTG CTG GTG 210
Pro u-í n± J Γ1! ury Ile Cly Lys Thr Thr Thr Tks v i iii Gin Σίθ u LGU Val
60 65 70
GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC GTA CCC GAG CCG 252
Ala Leu Cly Ser Al? cj Asp Asp Ile Val Tyr Val Pro Clu Pro
75 80
ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA ATC GCG 294
<T>, rr Τ’ LiS ti Π TF 7\ 1 -> Co ν' r Ή-. Τ Ί p Ala
líc i_ i Iii x y A ‘•y Λ1 V O i. <jj_ y jTl-LCi i
85 90 95
AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
A. 3 R Ile Tyr Tin v i i ti Thr Gin His Arg Ι_ιθ ii Asp Gin Cly Clu Ile
100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA 378
Ser 7\T Λ riiiTi ΓΊ τ r i. y Asp Ala Ala Val Val Met v i Iii. Ser Ala Gin Ile
115 120 125
ACA ATG GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT 420
ΤΊη v* X iii Met Cly Met Pro Ala Val var Thr Asp Ala Val Leu Ala
130 135 140
CCT CAT ATC GGG GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC 462
Pro His Ile Cly Cly Clu Ala Cly Ss i? Ser His Ala D v*·,—\ 1 rv Pro
......... „ 145 -a. .. . .= ... , 5 0
CCG GCC CTC ACC CTC ATC TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC 504
Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala
155 160 165
CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG TAC CTT ATG GGC AGC ATG 546
Lsu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala 7\.i Cj Tyr leu Met Cly SSr Met
170 175 180
• · · · • · ·
ACC ccc CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC CTC ATC CCG CCG 588
mk 111X Pro Gin 185 Ala Val Leu Ala Phe 190 Val Ala Leu Ile Pro 195 Pro
ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT CCG GAG 630
Th v Leu Pro Cly 200 Tb r- Asn Ile Val Leu. 205 n,, <jxy Ala Leu Pro Clu 210
GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
7\ ¢- «> 7\ His Ile Asp 215 Ti rrr Leu Ala T.vc XJ J Arg 220 Cln Arg Pro Cly
GAG CGC CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC CTT 714
Clu 225 Arg Leu Asp Leu Ala 230 Met Leu Ala Ala Ile 235 Arg Arg Val
TAC GGG CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC 756
TN 7T- n„ Τ.απ T z^n Ala Ti o rj Thr Vsi L r<r T o11 Cln 250 C* \ r Q d V
-* U - -_r 240 XJ S— bA xu d L* x x<> x 1 245 xJCÍ Lx o/ Ú Oxjy
GGG TCG TGG CGG GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC 798
Π v -UJ, Ser Trp Arg 255 Clu Asp T> r-r> X j-P Cly Cln 260 Leu Ser Cly Thr Ala 265
GTG CCG CCC CAC GGT GCC GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA 8-4 0
Val i_ x O D X. J_ r Ί n 270 π v Ala Cl” Pro Cln 275 Ser Asn Ala m w Pro 280
CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA TTT ACC CTG TTT CGG GCC 882
Ti Ύ'ΓΤ χχ-*-^ Pro His Tle Clu 285 Asp Thr Leu Phe Thr 290 Leu Phe Arg Ala
ccc GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG TAT AAC GTG TTT 924
Pro r i π KJ X. U* Leu Leu Ala D j- x. O Asn Cly Asp Leu Tyr Asn Val Phe
295 - ·· 300 — 30’5
GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT TCC ATG 966
Ala Trn 1 -‘-ť 310 Ala Leu Asp Val Τ,ΩΗ xJC w 315 Ala Lys Arg Leu Arg 320 Ser Met
CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
His Val Phe 325 Ile T.pn Jj” u 7\ o v\ X Xk_» £_/ Tvr X J X. Asp 330 Cln Ser Pro Ala Cly 335 Cys
335 • · • ·
9 99 e 4
51
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC 1050
Arg Asp -η 1 _ au a Leu T > XJ x Li Gin Leu Tbr' Co ν' Π tr xij_y ucu Ví 1 v x x Gin Th r- X λ X X.
340 345 350
CAC GTC ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG 1092
Π Ί C Val Tb ν' Tb ν' D v'^ x x. x Cly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu
355 360
GCG CGC ACG TTT GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131
7\ 1 X χ-i- X A-x Cj Tk yi iiX Phe Ala Arg Clu Mo X Cl v ri m λ i -i X X Li x Λ.Χ x Asn *
365 37 0 375
(2 /Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1131 párů basí
(B ) typ: nukleotid
(C ) počet vláken: j edno
(D ) konfigurace: lineární
(ii) typ molekuly: cDNA
(xi) popis sekvence SEQ ID NO:8:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC GCG TCT GCG TTC GAC 42
Met Aula Co r* P v/-\ i- X. X T' 1 τ τ U -T «Γ» x -i- y i i X O Π n J-li Hx 3 TxX x S x X Ala Phe Asp
5 10
CAG GCT GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG 84
ΓΊ p. Ala Ala -v π Ser 7\ ν' z-v ť'' 1 Λ 7 LT 4 o Ser Asn Arg Arg Tb X 111. Ala
15 .....20 ~ 25
TTG CGG CCT CGC CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG 126
Leu Arg. Pro Arg Arg Cín Γ1 n 'XXI X xi x x i m n X X. u Ala Thr Clu Val Arg Pro
30 35 40
GAG CAG AAA ATG CCC ACG CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT 168
Clu C' 1 Ό X i-i Lys· Met -Pro- Thr Leu Leu Ά cf Val Tyr Ile Asp Cly
45 50 55
CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC ACC ACG CAA CTG CTG GTG 210
9··
Pro GCC Ala His CTG Leu Gly GGT Gly Ile 60 TCG Ser Gly Lys Thr Thr Thr 65 GTC Val Thr Gin Leu CCC Pro Leu GAG Glu Val 7-0
GAT Asp ATC Ile
CGC Arg Ί z. GAC Asp TAC Tyr ρ n GTA Val CCG Pro 252
ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA ATC GCG 294
Met fl R Thr Tyr Trp Arg Val Qfi Leu Gly Ala Ser Glu o £ Thr Ile Ala
AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
Asn Ile' Tyr Thr Thr Gin His Arg Leu Asp Gin Gly Glu Ile
1 ,nn 10· 110·
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA 378
Ser ALA Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gin Ile
1 1 R X x 12-0· 1 O £
ACA ATG GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT 420
Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala
130 i 313 -L. 1 λ r\ X -f-V
CCT CAT ATC GGG GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC 4 62
Pro His Ile Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro
1 /1 c XMro· 150
CCG GCC CTC ACC CTC ATC TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC 504
Pro i £ c; Ala Leu Thr Leu Ile i <ςη Phe Asp Arg His Pro 1 £ ς Ile Ala Ala
_L CTC CTG TGC TAC CCG x \j-o- GCC GCG •CGG TAC CTT ATG GGC AGC ATG 54 6
Leu Leu i ί n Cys Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr leu Met Gly 1 on Ser Met
ACC CCC CAG GCC GTG CCG X i- ^>· GCG TTC GTG GCC CTC ATC- CCG CCG - ’5-88
Thr Pro Gin Ala Val Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro
185 190 195
ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT CCG GAG 630
Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu
20-0 205 210
GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gin Arg Pro Gly
215 220
· 4 4
4 4
GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT 714
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Le u Ala Ala Ile Arg Arg Val
225 230 235
TAC GGG CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC 756
Tyr Gly LeU Leu Ala 7\ Ο ΤΛ rrjii Thr Val Arg Τιτν i y x Leu Gin Cys Cly
240 245 250
GGG TCG TGG CGG GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC 798
Gly Ser Trp Arg Clu Asp m t r W-x. γ Leu Ser Gly mb XHi Ala
255 260 265
GTG CCG CCC CAG GGT GCC GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA 8 4 0-
Val Pro P ro Gin Gly Ala Glu Pro Gin Ser 7\ f> T-l 7\1 Aid Gly O V'/i X
270 275 280
CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA TTT ACC CTG TTT CGG GCC 882
Arcj Pro His Ile Glu Asp ΦΪΊ ν' iiiL Leu Phe m>> lili Leu Phe Arg Ala
285 290
ccc GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG TAT AAC GTG TTT 924
Pro Glu Leu LrGtl Ala Pro 7\ r*\ ZttO 11 Gly Asp Leu Asn Val Phe
295 300 305
GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT TCG ATG 966
Ala Trp Ala LeU Asp Val Leu Ala T T r<-« xj y 7\ vrr ZtLX'<J Leu -A.ríj Ser Met
310 315 320
CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC, CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
His Val Phe Ile L-θ U Asp Tvv' x γχ Asp Gin Ser Pro Ala Π o \j x y Cys
325 330 3.35
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC 1050
Arg Asp Ala ΣτθΙΙ Leu VX tt Leu i iii Ser Πτζ οχγ Met Val Gin mb ν' X XXX
.nzun 34 5: CCG 350 CTG
CAC GTC ACC ACC CCC GGC TCC ATA ACG ATA TGC GAC 1092
His Val Thr Thr Pro Cly Ser Ile Pro Thr Ile Cys 7\ c* v> rioy Le u
355 ' 360
GCG CGC ACG TTT GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA
Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Mot UC X Gly Glu' Ala 7\ <r»-r-s ★ ΑΟΠ
365 370 375
1131

Claims (46)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sekvence nukleových kyselin kódující thymidin-kinasu vyznačena t i m, ze ma vhledem k divoké sekvenci alespoň jednu mutaci v oblasti odpovídající vazebnému místu ATP spojenou s mutací v oblasti N-konce nebo/a C-konce.
  2. 2. Sekvence t i m, ze je thymidin-kinasu, mutaci v oblasti
    W\ η i 4— ι -Ί T T z-\ T —\ ť—« +- Π UtULGOi V WICIOUJ.
    nukleových kyselin vyznačená od sskvsncs
    KOdUj ICi
    GlVOKCu výše uvedená sekvence má alespoň jednu odpovídající vazebnému místu ATP a alespoň
    XT _ 1z- z*\ v» z-^ z—> Vs z-\ / Y'' _ 1/· Z~\ r\ z—i
    Kvut-C ci v-/ Λ.</ϋ\»ζτΞ
  3. 3. Sekvence nukleových kyselin podle nároku značena tím, ze odvozuje sekvenci thymidin-kinasu viru herpes simplex typu 1.
    2 vyKOGUjICi
  4. 4. Sekvence nukleových z n a · c e n a t x m? ze alespoň substituci guaninu v kyselin podle nároku vy se uvedena sekvence obsahu poloze 180 adeninem (G180A).
    yjs
  5. 5. Sekvence nukleových kyselin podle nároku 3 nebo 4 ii ca v_z e n a t i m, ze vyse uvedena sekvence obsahuje alespoň substituci guaninu v poloze 180 adeninem (G180A) a alespoň substituci guaninu v poloze 16 adeninem (G16A).
  6. 6.
    v y z n alespoň alespoň
    Sekvence nukleových kyselin podle nároku 3 nebo 4 a c e n á t i m, ze výše uvedena sekvence obsahuje substituci guaninu v poloze 180 adeninem (G180A) a dvojnásobnou substituci guaninu v poloze 28 a 30 • ··· adeninem (G28A a G30A).
  7. 7. Sekvence nukleových kyselin podle nároku 4 až 6 vyznačena t i m, ze vyse uvedena sekvence obsahuje mimoto alespoň mutaci oblasti C-konce. .
  8. 8. Sekvence nukleových kyselin podle jednoho z nároků *4 r ' υ cx t v y χ ϋ α λξ ϋ α υ χ IR, χ*ξ ΙΓια axtzropoii ouvolxuuvi· guaninu v poloze 180 adeninem (G180A) a alespoň dvojnásobnou substituci guaninu v poloze 28 a 30 adeninem (G28A a G30A), rÍTT/N Π ΤΛ A Γ λΧγι Λ1 1 Í-Ί lX r + Ί uí T ř O+ /O O ΐ Λ11 TT V\ /*\ Ί zS rr r\ ί Ω 1 O QO 4“ Xi ττη i’ y\ t* v vj :ιαο wíivu oavoc±cuL-± v yv-Lvzd α v_7x >_ x i y itíx ucítí (C591T a C892T) a dvojnásobnou substituci guaninu v poloze 1010 a 1011 adeninem (G1010A a G1011A) .
  9. 9. Sekvence nukleových kyselin kódující variantu tiiyxuxcixn kipiasy v y Z Π a C θ Ω 3 +- η m o TT1 rr, V* —> τ-· «Ί t_ x in, zť . j VyXZXdilCi množiny sekvencí:
    (a) sekvence SEQ ID n°3 nebo část této sekvence nesoucí mutaci (G180A) nebo jedno z. jejich kompleutentárnich vláken, (o) sekvence SEQ ID n°o a SEQ ID n°7 nebo část těchto sekvencí nesoucí mutaci (G180A) a případně mutaci G16A a dvojnásobnou mutaci (G28A, G30A) nebo jedno z jejich
    1/· ^ntvirc Ί τλ -i η U, tt 1 A Ιλ λ o
    AuuíMXCiuťn t αι ní Oii v xan.cn, (c) sekvence SEQ ID n°8 nebo část této sekvence nesoucí mutaci (G180A) , dvojnásobnou mutaci (G28A, G30A) a čtyřnásobnou mutaci (C591T, C892T, G1010A, G1011A) nebo jedno z jejich komplementárních vláken, (d) každá sekvence hybridující se sekvencí (a), (b) nebo/a (c) a kódující variantu thymidin-kinasy a taková, jaká je definovaná v nárocích 1 nebo 2, )e) varianty sekvencí (a), (b) , (c) a (d) vyplývající z
    Z---Ť /=> z···» V' «· /—· <T /“·. T“. X· 1 <—* b“ «Ά X. .
    ucycuctaoc y cuc t áCacííu jyL/mxu .
  10. 10. Sekvence nukleových kyselin kódující variantu divoké thymidin kmasy ziskateína řízenou nebo nerx^.enou mutací sekvence, podle jednoho z nároků 1 až 9.
  11. 11. Sekvence nukleových kyselin podle, jednoho z předchozích nároku v y značena ti m, bjc původu eukaryontního, bakteriálního, virového, syntetického nebo semi-syntetického.
  12. 12. Varianta divoké ‘-íiuJcIgo ve·· <- lvy* Sciiny thymidin-kinasy odie jakéhokoliv vyjádřitelná od nároku 1 az 11.
  13. 13. Varianta thymidin-kinasy obsahující alespoň mutaci _ _ I— T _ —, 4— -i λ x-J λ τ τ Z /-4 ·—> X £ z—1 £ τ τ T z-\ »> m i i ▼*> τ <*> 4- λ 7\ 1 I 1 T} o τ“\ Z\ “i /-x rx z-x i l -X 1 zX O v“X z\ tX v wxciotx ouj/v v ±ua j v cx lcviiciuu ittxouu nu j o aico^cu mutací v oblasti N-konce nebo/a C-konce.
  14. 14. Varianta podle nároku 13 vyznačená t i m, ze implikovaná oblast obsazena v oblasti odpovídajíce vazebnému místu ATP je vyjádřena GXXXXGK(T/S).
  15. 15. Varianta podle nároku 14 vy značená tím, se jedna přednostně o motiv GPHGMGKT.
  16. 16. Varianta podle nároku 15 vyznačená tím, ze obsahuje alespoň substituci v poloze 60 methioninu « ··· • · · · · · • · · · · · • · · · · ·· · isoleucinem.
  17. 17. Varianta divoké thymidin-kinasy vyznačená
    4 m *5 o f> o -i /4 n A /> m 1 C ”3 T · ζ1
    X itl< XC: ÚC JCUHCX W ítLUCClHL XW/ . £j
  18. 18. Varianta podle jednoho z nároků 13 až 16 v y z n aO 11 Cl u i ni, ze mutace v oblasti N—konce je obsazena v aminokyselinách 1 až 20 výše uvedené oblasti.
  19. 19. Varianta podle nároku 18 vyznačená tím.
    xo lcuv IuU u d C o jc UvdoátiHá v dittJ_íi\J Ky co j
    N-konce.
    > Vt rri \ 1 4 n -A /—, 4i T —ί -? 1 C /-i4-i 3 ί i-i 4-
    XlidOli X CIL X wxco C X.
  20. 20. Varianta podle nároku 19 vyznačená tím, «τ',O Ί +“ z-\ ΤΎ1 —ΐ Z“1 z—\ 4-ι f-t -i η —\ T v —\ rvi 4 r-ι z-\ l/Tfc/ij-ir^A/iVl T —i 4v 1 Γ\ s~> 4-\ Ί —> <—i 4— 4
    ΧΌ VdVW itttx V CGC JC WOCLCliC v dittx HV λ. y o o X X ii d Ol i X dX X \J 'VX/XddV-L
    N-konce.
  21. 21. Varianta podle nároku 20 vyznačená tím, —I S“\ 4—1 r-1 —1 -V \ ΤΊ —1 V f —k m 1 v-» γ—1 l/im /1 j 4 n A /l4l C -1 -V ΤΓΊ «—1 4—1 Ί —1 <—1 4
    J O WCCLCHC V dittX il<7 OO X X iidk-zli dX XV XZíV-LdOt
    N-konce,
  22. 22. Varianta thymidin-kinasy viru herpes simplex typu 1 obsahující alespoň substituci methioninu v poloze 60 isoleucinem a substituci, alaninu v poloze 10 threoninem.
  23. 23. Varianta thymidin-kinasy viru herpes simplex typu 1 obsahující alespoň substituci methioninu v. poloze 60 isoleucinem a substituci glycinu v poloze 6 serinem.
    • · · · · · · • ·· · · ·· • · ·· ·· · · · · · · · · · ► ·· ·· ··
  24. 24. Varianta divoké thymidin-kinasy vyznačená
    4— 4 rv> 24 z->> i z-\ -í /-> r-\ A o i i +· -i r-ι -t- O __ O C. · LT 1 O u j_ ÍTl f o<z: jcvuici itttu ucxix u. z. υυο.Πχό
  25. 25. Varianta divoké thymidin-kinasy vyznačená
    G 3G j G kU.il CL k> UtULGi
  26. 26. Varianta podle nároků 14 až 23 obsahující mimoto alespoň mutaci v oblasti C-Konce.
  27. 27. Varianta podle nároku 26 vyznačená tím, ze tato mutace je obsazena v aminokyselinách 32v oblasti C-konce.
  28. 28. Varianta podle nároku 27 vy značená tím, ze tato mutace jt oosazena v aminokyselinách 325 az 34 5 oblasti C-konce.
  29. 29. Varianta podle nároku 28 vyznačená tím, ze tato mutace jt obsazena v aminokyselinách 330 az 343 oblasti C-konce.
  30. 30. Varianta podle nároku 29 v y z n a č e n á tím, ze tato mutace je obsazena v aminokyselinách 335 gí. 3^v oblasti C-konce.
  31. 31. Varianta thymidin-kinasy viru herpes simplex typu 1 obsahující alespoň substituci methioninu v poloze 60 isoleucinem, substituci alaninu v poloze 10 threoninem • · ·· • ·· substituci argininu v poloze 337 glutaminem.
  32. 32. Varianta divoké thymidin-kinasy vyznačená t i m, ze se jedna o mutant 3—4216:H2.
  33. 33. Varianta divoké thymidin-kinasy vyznačená nt t ς Θ vy jad rujc Π3 3 ledu. j IC.
    podstatné snižování ba dokonce úplná inhibice aktivity fosforylace gancicloviru v rozporu s divokým · enzymem, pro který je inhibice velmi zřetelná od 15 μΜ,
    - zvýšení iniciační rychlosti fosforylace GCV faktorem 2 az 2,5 od 15—20 μΜ vzhledem k divokému enzymu poměr Kcat/Km thymidinu snížený faktorem 1 až 6 vzhledem k tomuto poměru divokého enzymu.
  34. 34. Varianta thymidin-kinasy podle.nároků 13 až 25 v yL&f ΣΘ piSdSt aVu j Θ ctleSpOH jGuna následujících kinetických vlastností:
    - významné snížení inhibice fosforylace gancicloviru nebo analogu nukleosidu ve zvýšených koncentracích gancicloviru nebo nukleosidového analogu, , - rychlost fosforylace gancicloviru nebo nukleosidového analogu alespoň trojnásobná nebo/'a
    - poměr Kcat/Km thymidinu je buď nezměněný nebo snížený faktorem vyšším nebo rovným 5 vzhledem k poměru divokého enzymu
  35. 35. Varianta thymidin-kinasy podle nároků 13 až 25 v ym, ze představuje alespoň je^nu • · · • · ··· následujících kinetických vlastností:
    - nepřítomnost inhibice fosforylace gancicloviru nebo nukleosidového analogu ve sní zených
    1λ y“\ /“· v» /*·» λ 1*
    Nuiiccii t lacici gancicloviru nebo nukleosidového analogu, zvýšení faktoru na 3,5 iniciační rychlosti fosforylace GCV od 15 — 20 fiM vzhledem k divokému enzymu.
    •m
  36. 36. Kazeta exprese obsahující nukleovou kyselinu podle ednoho z nároku 1 az 11, promotor umožňující její expresi a signál ukončení transkripce.
  37. 37. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle jednoho laroku 1 az 11 a nebo kazetu podle nároku 36.
  38. 38. Vektor podle nároku 37 vyznačený tím, že se jedna o virový vektor.
  39. 39. Vektor podle nároku 38 v y z n a č e n ý t i m, že se jedna o defektm rekombinantní adenovirus.
  40. 40. Vektor podle nároku 38 vyznačený tím, že se jedná o defektní rekombinantní retrovirus
  41. 41. Vektor podle nároku 38 vyznačený t i m, že se jedna o defektní rekombinantní AAV.
  42. 42. Vektor podle nároku 38 v y z n a č e n ý tím, že • ·· • ···· · · ·<
    • to · • · 4 ·· »· se jedná o defektní rekombinantní HSV.
  43. 43.Vektor podle nároku 37 vyznačený tím, že se jedna o chemicky nebo biochemicky* vektor.
  44. 44. Farmaceutická kompozice obsahující nukleovou kyselinu podle jakéhokoliv nároku 1 az ii nebo/a veKtOx. pou-c jednoho z nároků 37 až 43.
  45. 45. Farmaceutická kompozice obsahující variantu podle
    4 <—> ^4 v\ s~\ «τ τ·ί A v~ z*\ 1 r \y TO —s <-4 Q C( jcuiiviiv ϊ i cx i_ \-t Lt qa .
  46. 46'. Farmaceutická' kompozice podle jednoho z nároků 45 iebo 46 pro lečem hyperproliferativmch chorob.
CZ19982479A 1996-02-09 1997-01-31 Sekvence nukleové kyseliny kódující nové varianty enzymu thymidinkinázy a farmaceutické kompozice obsahující takovou nukleovou kyselinu nebo variantu thymidinkinázy CZ294497B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9601603A FR2744731B1 (fr) 1996-02-09 1996-02-09 Nouveaux variants de la thymidine kinase, sequences d'acides nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapie genique
FR9609709A FR2751988B1 (fr) 1996-08-01 1996-08-01 Nouveaux variants de la thymidine kinase, sequences d'acides nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapie genique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ247998A3 true CZ247998A3 (cs) 1998-11-11
CZ294497B6 CZ294497B6 (cs) 2005-01-12

Family

ID=26232518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19982479A CZ294497B6 (cs) 1996-02-09 1997-01-31 Sekvence nukleové kyseliny kódující nové varianty enzymu thymidinkinázy a farmaceutické kompozice obsahující takovou nukleovou kyselinu nebo variantu thymidinkinázy

Country Status (12)

Country Link
US (2) US6207150B1 (cs)
EP (1) EP0879288A1 (cs)
JP (1) JP2000505288A (cs)
KR (1) KR19990082124A (cs)
AU (1) AU720936B2 (cs)
BR (1) BR9707483A (cs)
CZ (1) CZ294497B6 (cs)
HU (1) HUP9902571A3 (cs)
IL (1) IL125597A0 (cs)
NO (1) NO983449L (cs)
SK (1) SK107998A3 (cs)
WO (1) WO1997029196A1 (cs)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6451571B1 (en) 1994-05-02 2002-09-17 University Of Washington Thymidine kinase mutants
EP1914304A1 (en) * 1998-10-14 2008-04-23 Darwin Molecular Corporation Thymidine kinase mutants and fusion proteins having thymidine kinase and guanylate kinase activities
CA2306443A1 (en) * 1997-10-14 1999-04-22 Darwin Molecular Corporation Thymidine kinase mutants and fusion proteins having thymidine kinase and guanylate kinase activities
CN1301821A (zh) * 1999-12-27 2001-07-04 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——胸腺嘧啶核苷酸激酶11和编码这种多肽的多核苷酸
GB0008966D0 (en) * 2000-04-13 2000-05-31 Imp College Innovations Ltd Vectors for gene therapy
EP1283874A2 (en) * 2000-05-12 2003-02-19 Wolfgang Knecht Novel deoxynucleoside kinase enzyme variants
FR2823219B1 (fr) * 2001-04-10 2003-07-04 Pasteur Institut Mutants de la desoxycytidine kinase possedant une activite enzymatique elargie
US20040053836A1 (en) * 2002-04-22 2004-03-18 Philipp Mayer-Kuckuk Method for modulating the production of a selected protein in vivo
US20070167353A1 (en) * 2003-10-24 2007-07-19 John Hilfinger Prodrug composition
US20050137141A1 (en) * 2003-10-24 2005-06-23 John Hilfinger Prodrug composition
GB0413702D0 (en) 2004-06-18 2004-07-21 Molmed Spa Thymidine kinase
KR101726390B1 (ko) 2008-08-15 2017-04-12 더 유에이비 리서치 파운데이션 뉴클레오시드 프로드럭의 효소 활성자로서의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소
US20110023144A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease
US20110016543A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in inflammation
US20110023156A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Feline genome editing with zinc finger nucleases
US20110023141A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved with parkinson's disease
US20110023150A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with schizophrenia in animals
US20110016540A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
US20110016546A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Porcine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023143A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of neurodevelopmental genes in animals
US20110023140A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Rabbit genome editing with zinc finger nucleases
US20110023152A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of cognition related genes in animals
US20110023146A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in secretase-associated disorders
US20110030072A1 (en) * 2008-12-04 2011-02-03 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of immunodeficiency genes in animals
US20110023147A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of prion disorder-related genes in animals
US20110023158A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Bovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023145A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in autism spectrum disorders
US20110023148A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of addiction-related genes in animals
US20110023153A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in alzheimer's disease
US20110023149A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in tumor suppression in animals
US20110023154A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Silkworm genome editing with zinc finger nucleases
US20110016539A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of neurotransmission-related genes in animals
US20110023139A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in cardiovascular disease
US20110016541A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of sensory-related genes in animals
US20110023151A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of abc transporters
AU2020306544A1 (en) * 2019-06-27 2021-12-02 Bionoxx Inc. Oncolytic virus with improved safety and anticancer effects

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10503641A (ja) * 1994-05-02 1998-04-07 ユニバーシティ オブ ワシントン チミジンキナーゼ変異体

Also Published As

Publication number Publication date
US6207150B1 (en) 2001-03-27
NO983449D0 (no) 1998-07-27
HUP9902571A2 (hu) 1999-11-29
KR19990082124A (ko) 1999-11-15
EP0879288A1 (fr) 1998-11-25
JP2000505288A (ja) 2000-05-09
BR9707483A (pt) 1999-04-06
NO983449L (no) 1998-07-27
WO1997029196A1 (fr) 1997-08-14
IL125597A0 (en) 1999-03-12
AU1606897A (en) 1997-08-28
AU720936B2 (en) 2000-06-15
CZ294497B6 (cs) 2005-01-12
SK107998A3 (en) 1999-01-11
US20020102247A1 (en) 2002-08-01
HUP9902571A3 (en) 2002-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ247998A3 (cs) Varianty thymidin-kinasy, sekvence DNA, které ke kódují a jejich použití ke genové terapii
CA2336743C (en) Antigenic peptides derived from telomerase
US8163528B2 (en) Nucleic acid molecules encoding thymidine kinase fusion proteins
US20040072168A1 (en) Novel deoxynucleoside kinase enzyme variants
US6518062B1 (en) Enzyme combinations for destroying proliferative cells
US7018834B2 (en) Mutated herpes simplex virus type 1 thymidine kinases and uses thereof
AU778376B2 (en) New medical use of gene and vector encoding a multisubstrate deoxyribonucleosidase
US7928206B2 (en) Pharmaceutical composition comprising a thymidine kinase polynucleotide
MXPA98007181A (en) Combinations of enzymes for the destruction of proliferati cells

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19970131