JPH05507067A - 細胞増殖性疾患に対する遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 且ユｍ笠　細胞増殖性疾患に対する遺伝子療法且玉二皇亙 本発明は抑制的に作用する成長調節（ＮＣＲ）要素を増殖中の細胞に挿入するこ とよりなる、細胞増殖性疾患の措置のための療法に関するものである。

の共通の原因である。良性のヒトの疾患は、基本的には身体のある部分から別の 部分に広がることができないこと、および一般的にその成長速度が遅い点が、悪 性のプロセス（ガン）とは異なっている。両方とも患者を殺したり、視覚を奪っ たり、あるいは不興にしたりする場合がある。開腹手術後の望ましくない内部的 癒着および傷跡は腸絞窄などにつながる可能性がある。糖原病からの視覚喪失は 眼球内の新しい首管の不適切な成長から発生する。良性の神経繊維腫症は見た目 の醜さの原因となる。乾癖などの皮膚疾患は、そうした原因がなければ正常な細 胞の不適切な過剰成長からもたらされる。

多数のいろいろな疾患をこうしたカテゴリーに属するものとみなすことができる 。

細胞の不適切な局所増殖がもたらす疾患は全体としては良性増殖性疾患（ＢＰＤ ）と呼ばれる。過剰成長群で優勢な細胞が線繊芽細胞の場合、それに属する疾患 は「腺維芽増殖性」不全として知られている。優勢な細胞が血管内皮（血管の内 部表面に存在しているタイプの細胞）の場合、その疾患は「血管増殖性」不全と して知られている。内皮の不適切な過剰成長は重大な皮膚疾患につながる。現在 、こうした良性の増殖性疾患の措置は往々にして、以下のような一つあるいは複 数の措置による組織切除を必要とすることが多い：外科、放射能照射、および／ または化学療法。こうした措置はすべて一般的に正常な組織と病理組織の両方に 損傷をもたらす。

レーザーや寒冷療法など、他の局所措置法が成功を収めることはめったにない。

鳳忽ヱ呈五１里 細胞増殖のコントロールは近年ようやく理解され始めたばかりの複雑なプロセス である。細胞が成長するかどうかは抑制的な働きをする成長要素と促進的な働き をする要素とのバランスに依存している。抑制的な働きをする成長調節（ＮＣＲ ）要素は、細胞内で表現されたり細胞に与えられたりすると、細胞成長の抑制に 導くようなものである。促進的に働く成長調節（ＰＧＲ）は一般的には、その生 成物が細胞内で表現されたり、細胞に与えられたりすると、その増殖を刺激する ような生成物、あるいは遺伝子やその生成物を意味している。

ＮＣＲ） 抑制的な働きをする成長遺伝子の表現は、細胞増殖の調節およびコントロールに は重要である。

ＮＣＲ要素の例としては、その表現が休止あるいは休息状態の細胞内で誘発され ることが確認されているいくつかの遺伝子である。これらの遺伝子は抑制的成長 調節（ＮＣＲ）遺伝子と命名することができる。こうした抑制的な働きをする成 長調節遺伝子のダウン調節は細胞増殖の抑止の中止をもたらす。

こうした遺伝子あるいはこれら遺伝子の生成物の非活性化をもたらす生物学的あ るいは生理学的現象に加えて、こうした抑制的な働きをする成長調節遺伝子が非 活性であるか、あるいは存在しないある種の病理的な状態も確認されている。こ れらの遺伝子は消失、変異、あるいはダウン調節のために不活性であるし、ある いはそうした遺伝子生成物を結合させたり、不活性化させ、したがって、その遺 伝子の表現やその生成物の機能を部分的、あるいは全体的に阻止してしまい、そ して、細胞増殖を阻止したり抑止する能力をなくしてしまう因子が豊富すぎるこ となどによる。

最近、腫瘍抑制遺伝子と呼ばれる、腫瘍細胞の増殖に抑制的な効果を持ついくつ かのＮＣＲ遺伝子が確認された。これらの遺伝子には、ヒト網膜芽腫遺伝子Ｒｂ −１、ｐ５３遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＮＦＩ遺伝子、ウィルムス腫瘍遺伝子、甲 状腺ホルモン受容体遺伝子、およびレチノ酸受容体などを含んでいる。

これら抑制的成長調節遺伝子とある種のガンとの関連性も認められている。

ヒト網膜芽腫Ｒｂｌは、細胞内におけるそれらの遺伝子の両方の対立遺伝子の不 在、あるいはその遺伝子やその生成物の表現の抑制が腫瘍性あるいは異常な細胞 増殖をもたらす、この種の腫瘍抑制遺伝子、ここでは抑制的成長調節（ＮＣＲ） 遺−伝子のプロトタイプである。分子レベルで、ＲＢＩ遺伝子の両方の対立遺伝 子の喪失あるいは不活性化は網膜芽腫あるいは骨肉腫、線繊肉腫、軟組織肉屋お よび黒色腫などの臨床的に関係の深い腫瘍の発現に関与していることが明らかに されている。

さらに、Ｒｂ−１遺伝子の機能の喪失も、−次小細胞肺腫瘍（ＳＣＬＣ）　、軟 組織肉腫、乳房腫瘍、頚部腫瘍、および前立腺腫瘍など他のタイプの腫瘍と関連 していることが分かつている。

Ｒｂ−１遺伝子を喪失した腫瘍細胞へのＲｂ−１遺伝子の導入はその腫瘍の成長 の抑制をもたらした。例えば、Ｒｂ−１のｃＤＮＡが、その内生Ｒｂ遺伝子を失 った腫瘍細胞である骨肉腫細胞株５ＡＯ３２および前立腺ガン細胞株ＤＵ１４５ に導入されると、これらの腫瘍細胞の成長はイン・ビボで具体的に抑制された（ Ｈｕａｎｇ等、（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２　：　１５６３　；　Ｂ ｏｏｋｓｔｅｉｎ等、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７　：　７１２）。こ れらの著者は、網膜芽腫が特に腫瘍原性表現型を抑制するが、正常の細胞には何 の影響も与えないと結論づけた。

゛　に　＜　ＰＧＲ！ 促進的に働く成長調節（ＰＧＲ）要素は、その表現がある形態のガンおよび正常 の細胞やある種の病理的細胞増殖性疾患において活性化されることが知られてい る原腫瘍遺伝子を含んでいる。原腫瘍遺伝子の表現の活性化は細胞増殖には不可 欠である。この種類の特殊な遺伝子の多くは成長因子あるいはその受容体をコー ド表現することが認められている。

ある種の原腫瘍遺伝子は、ひとつの細胞が成長因子に露出された場合、その増殖 状態と密接に関連していることも分かっている。成長因子から取り出された血小 板、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、インシュリン、およびトランスフェリンなどの 多くの成長因子が細胞増殖には必要である。成長因子に関する特殊な受容体分子 を表現しない細胞は、その細胞に成長因子が与えられても増殖しない。一方、そ の受容体の表現の通常に抑制的調節が妨害されて、その受容体のコントロールさ れない表現が発現してしまうような細胞はコントロールされない形態で増殖する 。休止細胞が成長因子から誘導された血小板（ＰＤＧＦ）に露出された場合、ｃ −ｆｏｓおよびＣ−１１１ｙＣを含むいくつかの原腫瘍遺伝子の新しいｍＲＮＡ の合成が誘発される。

同様に、休息肝臓細胞が刺激されて、イン・ビボで部分的肝臓ガンの症状にまで 成長する場合がある。この成長刺激はｃ−ｍｙｃを含むいくつかの原腫瘍遺伝子 の高度の表現と関係している。これらのＰＧＲ遺伝子の活性化は、通常の、およ び異常な、そして病理的な細胞増殖にとっても必要である。

病理的な細胞増殖不全あるいは疾患は原腫瘍遺伝子の不適切な活性化に関連して いることが多い。例えば、ｃ　１ｙｃ表現のレベルは非リンパ球白血病細胞株Ｈ Ｌ−６０内で高度に増幅される。レチン酸およびジメチル・スルホキシドなどの 化学的誘発因子によって増殖を止めるためにＨＬ−６０細胞が導入されると、ｃ −ｍｙｃのレベルがダウン規制される。一方、ＨＬ−６０細胞を、ｃ−ｍｙｃあ るいはＣ１ｙＣの５′末端に相補型のＤＮＡ構造に露出すると、これらｍＲＮＡ およびｃ−ｍｙｃの翻訳の抑止を引き起こすか、あるいはｃ−ｍｙｂ蛋白質表現 がダウン規制され、細胞増殖および処理された細胞の分化の抑止につながる（Ｗ ｉｃｋｓｔ、ｏｒｍ等、（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃ、　 Ｓｃｉ、８５　：　１０２８　；Ａｎｆｏｓｓｉ等、（１９８９）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａリ　Ａｃｄ、　Ｓｃｉ、　８６　：　３３７９）。

且ユ立ｌ笠 一つの側面において、本発明はガン、悪性細胞増殖、良性増殖性疾患およびその 他の病理的細胞増殖性疾患などにおいて存在しているように、不適切あるいは病 理的な細胞成長への一般的取り扱い方法を提供する。

別の側面で、本発明は、抑制的に働く調節遺伝子（ＮＣＲ）要素の一つあるいは 複数の活性ある遺伝子コピーを異常に増殖している細胞に投与することでより成 る細胞増殖性疾患の方法を提供する。

別の具体例において、本発明は、ＰＧＲ要素の表現を不活性化する本発明による 合成りＮＡあるいはＲＮＡを異常に増殖している細胞に入れることにより、異常 な細胞増殖を抑止する方法を提供する。

本発明の一つの実施例は、抑制的な働きをする調節（ＮＣＲ）遺伝子の、一つあ るいは複数の活性のある遺伝子コピーを投与することで構成される、個々の人の ガンあるいは細胞増殖性疾患を措置する方法を提供する。

一つの側面において、本発明はヒト網腹芽種遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ８５遺伝 子、ｐ１０７遺伝子、ｐ１３９遺伝子、レチノ酸受容体遺伝子、甲状腺ホルモン 受容体遺伝子、ｌ！１０　Ｄ遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、およびＮト２３遺伝子で 構成されるグループから選択される抑制的な働きをする調節（ＮＣＲ）遺伝子の 一つ、あるいは複数のコピーを投入することにより、病理的、あるいは異常な細 胞の成長、あるいは増殖を抑止するための方法を提供する。

別の具体例において、本発明は、本発明によるリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ　 ）構成を、コード表現されたりボザイムが目標ＰＧＲ遺伝子あるいは要素の前ｍ ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡを破壊する腫瘍遺伝子あるいは原腫瘍遺伝子など のＰＧＲ要素を含んでる細胞に投与することより成る、病理性細胞増殖性疾患を 措置する方法を提供する。

別の具体例において、本発明は、一つあるいは複数のＮＣＲ要素を、その内部で 該ＮＧＲ要素が（１）抑制的す働キヲスル調節遺伝子および、（２）特にＰＧＲ 遺伝子あるいは要素の＃ｍＲ，ＮＡあるいはｍＲＮＡに対して向けられたりボザ イムをコード表現するＤＮＡから成るグループから選ばれる、異常に増殖する細 胞に対して投与することより成る、病理性細胞増殖性疾患の措置方法を提供する 。

さらに別の具体例において、本発明は、ＮＣＲ要素を、内部で該ＮＧＲ要素がＰ ＲＧ要素の正常な機能的表現に干渉する、あるいは抑制する、ＰＧＲ遺伝子を含 んだ細胞に投与することから成る、病理的細胞増殖性疾患の措置方法を提供する 。

本発明のさらに別の目的は、ＮＣＲ要素で構成されるＤＮＡ構成を、内部で該Ｄ ＮＡ構成が腫瘍遺伝子、原腫瘍遺伝子、あるいは他のＰＧＲ要素の活性化を抑制 したり、内部で該ＤＮＡ構成が形質転換宿主細胞と共存できる第二のコントロー ルＤＮＡ配列と結合しているリボザイムをコード表現するＤＮＡ配列を有効に表 現する遺伝子組換え表現ベクターより成る腫瘍遺伝子、原腫瘍遺伝子あるいは他 のＰＧＲ要素の活性化を抑制したり、あるいは該腫瘍遺伝子、原腫瘍遺伝子、あ るいは他のＰＧＲ要素を不活性化する腫瘍遺伝子、あるいは原腫瘍遺伝子を含ん でいる細胞に投与することより成る、病理性細胞増殖性疾患の措置方法を提供す ることである。好ましい具体例においては、ＤＮＡ構成は、内部で該リボザイム が形質トランスフォーマント宿主細胞内に存在している腫瘍遺伝子、原腫瘍遺伝 子、あるいは他のＰＧＲ要素の核酸やメツセンジャーＲＮＡ　、または遺伝子生 成物に対して相補型の配列を含んでいる、該リボザイムをコード表現するＤＮＡ 配列で構成される。本発明による方法はいかなるＰＧＲ要素の前ｍＲＮＡあるい はｍＲＮＡを活性化するために用いることができ、好ましくは、ｃ−ｍｙｃ、　 ｃイｏｓ、　ｃｍｙｂ。

ｅｒａｓ、　ＫｃとＪＥトランスフェリン受容体、インシュリン受容体、ＰＤＧ Ｒ受容体、およびＥＧＦ受容体で構成されるＰＧＲ要素を不活性化する。本発明 の最も好ましい具体例において、本発明によるＤＮＡ構成は誘発可能プロモータ ーに操作可能に結合される。

別の具体例において、本発明は、内部で該ＮＧＲ遺伝子が網膜芽種遺伝子、９５ ３遺伝子、ｐ８５遺伝子、ｐ１０７遺伝子、ｐ　１３０遺伝子、レチノ酸受容体 、甲状腺ホルモン受容体、ｍｙｏ　Ｄ遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、 およびＮＭ−２３遺伝子から成るグループから選択される細胞に、ＮＣＲ遺伝子 の一つあるいは複数の活性のある遺伝子コピーを投与することより成る、細胞増 殖性疾患の措置法を提供する。好ましい具体例において、抑制的成長調節遺伝子 は該抑制的成長調節遺伝子をコード表現するＤＮＡ配列の表現において有効な遺 伝子組換え表現ベクターより成るＤＮＡ構成である。好ましくは該ＤＮＡ構成は トラ、ンスフオーマント宿主細胞と共存できる第二のコントロールＤＮＡ配列に 操作可能に結合されている。

別の側面で、本発明は反腫瘍遺伝子、抑制的成長調節遺伝子、および促進的な働 きをする成長調節遺伝子あるいは要素を異常に増殖しつつある細胞に挿入するこ とにより、異常な細胞増殖を抑止する方法を提供する。

一つの具体例において、ＮＣＲ要素は網膜芽種遺伝子Ｒｂ−１である。

本発明の別の側面は、ＮＣＲ遺伝子の唯一つの活性のある対立遺伝子だけを有し ており、したがって、腫瘍形成にかかりやすい個人を確認し、少なくとも、ヒト 網膜芽種遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ８５遺伝子、ｐ　１０７遺伝子、ｐ１３０遺 伝子、レチノ酸受容体遺伝子、甲状腺ホルモン遺伝子、ｍｙｏＤ遺伝子、ＤＣＣ 遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＭ−２３遺伝子より成るグループから選択される抑 制的成長遺伝子の少なくとも一つの追加コピーを、該抑制的成長遺伝子の十分な 量の正常コピーを欠いており、受精あるいは萌芽的発達の継続を可能にしてしま うと確認された該病気にかかりやすい個人の卵子、精子、あるいは受精卵に挿入 するステップより成る、全体的に病気にかかりやすい個人におけるガンなどの異 常な細胞増殖性疾患を抑止し、防ぐ予防的措置の方法を提供する。

本発明の好ましい具体例において、ＮＣＲ要素はレトロウィルス・ベクターを用 いて増殖中の細胞に挿入される。最も好ましい具体例において、レトロウィルス ・ベクターは欠陥を持っており、非増殖性細胞を形質転換しない。

本発明のさらに別の側面は、増殖性眼球内不全、乾癖、魚鱗癖、苔癖、乳頭腫、 基底細胞悪性腫瘍、鱗状細胞悪性腫瘍などの増殖性皮膚疾患、すべての器官の血 管増殖性疾患、およびその他の同様の身体全体での増殖性細胞疾患など、病理性 細胞増殖性疾患の措置のための方法を提供する。

本発明の他の、そしてさらなる側面、特徴、および利点は開示のために以下に記 述する本発明の現在の段階で好ましい具体例の説明からも明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図はヒトβアクチン・プロモーターによるコントロール下でのすべてのＲｂ −１ｃＤＮＡの主要部を含んでいるプラスミドＨｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒ ｂの構成と構造を示している。

第２図はトランスフェクトされたプラスミドのヒト腺維芽細胞株ＷＳＩの増殖に 対する影響を示している。

第３図はトランスフェクトされたプラスミドのヒト水痘性腫瘍細胞株ＴＣＣ５Ｕ Ｐの増殖に対する影響を示している。

第４図はトランスフェクトされたプラスミドのイン・ビトロおよびイン・ビボで の骨肉腫５ａｎｓ”細胞の増殖に対する影響を示している。

第５図はりギザイムＤＮＡ構成の系統的な表現を示している。

パネル５ＡはりギザイムＤＮＡ構成の一般的系統を示し、パネル５ＢはＲｂ　Ｄ ＮＡに向けられたりボザイムをコード表現するＤＮＡ構成を示しており、パネル ５ＣはＲｂ−リボザイムの触媒作用をテストするための二つのＲＮＡ血小板を作 成するために用いられるプラズミドＰＴ−Ｒｂ−ＦＬを含んでいるＲｂ−１を示 しており、パネル５Ｄはｃ−ｍｙｃｍ　ＲＮＡに向けられたりボザイムをコード 表現するＤＮＡ構成を示している。

第６図は一つ、あるいは複数のりボザイム（パネル６Ａ）、アンチセンス（パネ ル６Ｂ）、およびＮＣＲ遺伝子（Ｒｂ−１遺伝子）（パネル６Ｃ）を含んでいる レトロウィルス性ベクターの系統的表現を示している。

第７図は目標とされたりボザイムでの処理の前と後とでの二つの合成ＲＮＡ血小 板を電気泳動パターンを示している。

第８図はＲｂ抗体で沈殿させた種々の蛋白質の電気泳動パターンを示している。

ましい　■の　な ヱーー盈 「抑制的な働きをする成長調節要素、ｆｉ　（ＮＣＲ要素）という用語は、増殖 中の細胞に投与され、該細胞のゲノムに組み込まれた時、細胞の成長を減らし、 あるいは細胞の増殖を抑止する作用因子を含む意味で使われている。本発明の一 つの具体的な実施例は、強力なプロモーターの促進作用の影響下で伝播体あるい はベクターに組み込まれたＮＣＲ遺伝子、Ｒ，ｂ−１遺伝子である。好ましくは 、本発明によるＤＮＡ構成はＭｕＬＶに基づくレトロウィルス・ベクターを用い て目標細胞に提供される。

ＮＣＲ要素という用語は、一つの細胞内に存在している場合、あるいは一つの細 胞に提供された時に細胞成長、あるいは増殖に貢献するすべての遺伝子、遺伝子 をコード表現する領域あるいは遺伝子生成物、いずれかの天然、あるいは合成り ＮＡあるいはＲＮＡ、ペプタイド、ステロイド、あるいは他の生物学的素材を含 む意味で使われている。

例えば、一つのタイプのＮＣＲ要素は、網膜芽種遺伝子Ｒ，ｂ−１。

ｐ５３遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ウィルス性腫瘍遺伝子、ＮＭ２ ３遺伝子、甲状腺ホルモン受容体遺伝子、レチノ酸受容体遺伝子、およびｐ１３ ０．　ｐ１０７．およびｐ８５をコード表現する遺伝子などで構成されるグルー プから選択される劣勢ヒト・ガン遺伝子（腫瘍サプレッサー遺伝子、あるいは抗 腫瘍遺伝子）である。

第二のタイプのＮＣＲ要素はりボザイムをコード表現するＤＮＡ構成である。該 ＤＮＡ構成は、（１）　ｃ−ｍｙｃ、　ｃ−ｆｏｓ、　ｃ−ｊｕｎ。

ｃ−ｍｙｂ、　ｃ−ｒａｓ、　ＫｃおよびＪＥなどから成るグループから選択さ れる腫瘍遺伝子あるいは原腫瘍遺伝子、（２）血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ） 　、表皮成長因子（ＥＧＥ）、トランスフェリンおよびインシュリンから成るグ ループから選択される成長因子受容体遺伝子などの、選択された促進的に働く成 長調節（ＰＧＲ）遺伝子のＲＮＡに結合し、それを破壊するＲＮＡ酵素をつくる ためにデザインされている。

「抑制的に働く成長調節（ＮＣＲ）遺伝子」は、網膜芽種遺伝子ＲＢ−１、ｐ５ ３遺伝子、ｐ８５遺伝子、ｐ１０７遺伝子、ｐ１３０遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、Ｎ Ｆ−１遺伝子、ウィルス性瘍遺伝子、ＮＭ２３遺伝子、甲状腺ホルモン受容体遺 伝子およびレチノ酸受容体遺伝子などから成るグループから選択される遺伝子あ るいは遺伝子コード表現領域で構成されるＮＣＲ要素のサブグループを含んで意 味するように使われている。

「促進的に働く成長調節要素」という用語は、細胞内に存在している場合、ある いは細胞に提供された場合、細胞成長あるいは増殖の誘発に寄与するいずれかの 遺伝子あるいは遺伝子生成物、天然あるいは合成りＮＡあるいはＲＮＡ　、ベプ タイド、ステロイド、あるいは他の生物学的素材を含んで意味するように使われ ている。　ＰＧＲ要素はウィルス性腫瘍遺伝子ｖｓｒｃなとの腫瘍遺伝子、ｃ− ｍｙｃなどの原腫瘍遺伝子、成長因子遺伝子ｃ−ｓｉｓ、　ＰＧＲ受容体遺伝子 などの成長因子受容体遺伝子、インシュリンなどの成長因子、インシュリン受容 体あるいはトランスフェリン受容体などの成長因子受容体などから成るグループ から選択される。

「遺伝子の機能的表現」という用語は、遺伝子の転写の抑制、遺伝子転写（前メ ツセージＲＮＡ　）の劣化、スプライシングの抑止、メツセージＲＮＡの破壊、 メツセージＲＮＡの翻訳の阻止、蛋白質の翻訳後修正の阻止、あるいは蛋白質の 通常の機能の抑止を含んで意味するように使われている。

「リボザイム」という用語で、目標遺伝子のｍＲＮＡあるいは前ｍＲＮＡを認識 し、それらと結合して、モして該前ｍＲＮＡ、あるいはｍＲＮＡを破壊するよう に構成されたＲＮＡが意味される。リボザイムは、その遺伝子のＤＮＡ配列が知 られていれば、いずれかの遺伝子の前ｍＲ，ＮＡあるいはｍＲＮＡに向けられる ように構成することが可能である。

「トランスフェクトされたプラスミド」という用語は、（１）　ＮＣＲ遺伝子あ るいはその遺伝子の一部、（２）　ＰＧＲ要素の前＠ＲＮＡおよび／またはｍＲ ＮＡを破壊し、その細胞に移入（トランスフェクト）されるように構成されたり ボザイム、で構成されるグループから選択されるＮＣＲ要素を含むバクテリア性 プラスミドを意味するように使われている。

子遺伝子療法」という用語は、遺伝子表現、および／またはその遺伝子生成物の 機能を調整する目的で、遺伝子、ＤＮＡ構成、ＲＮＡ　、あるいは遺伝子生成物 の一部分、あるいはすべてを細胞、細胞のグループ、組織、病理的病変、器官あ るいは有機組織体に挿入することを含めて意味するように使われている。

ｒ予防的遺伝子療法」という用語は、疾患あるいは疾患の広がりを部分的、ある いは全体的に抑止、または阻止するために使用することができる遺伝子を含めて 意味するように使用されており、また、細胞、組織、あるいは細菌株において不 在の、あるいは欠陥のある抑制的成長を補ったり、代替するために用いることが できる遺伝子を含めて意味するように使われている。

「細胞増殖性疾患Ｊという用語は、良性あるいは悪性を間わす、細胞、細胞のグ ループ、あるいは組織の、一つあるいは複数の局所的な異常増殖によって特徴づ けられる、一つの器官あるいは複数の器官の組み合わせ、腔、あるいは身体の部 分に影響を及ぼすいずれかのヒトまたは動物の疾患あるいは不全を含んで意味す るように使われている。

「原核生物」という用語は、本発明の遺伝子組換分子の表現に関して、そのＤＮ Ａで形質転換できるすべてのバクテリアを含んで意味するように使われている。

「真核生物Ｊという用語は、本発明の遺伝子組換分子の表現に関して形質転換さ れ得るすべてのイースト菌、菌類、動物および植物性細胞を含んで意味するよう に使われている。

本発明のＤＮＡ構成のためのＤＮＡは合成したり、あるいはいずれかの１乳動物 種から取り出すことができる。必要なのはそのＮＣＲ要素のための遺伝子配列が その原核生物あるいは真核生物組織内において機能的に表現されていることであ る。好ましいのは合成りＮＡである。

本発明のＤＮＡ構成をコード表現する遺伝子組換ＤＮＡ分子は当業者に普通に知 られている技術のいずれかを用いて宿主を形質転換するために用いることができ る。

融合された、操作可能に結合された遺伝子を調製し、それらをバクテリア内で表 現するための方法は、例えば、引例として本仕様書に組み込まれている米国特許 １１ｈ４．３６６、２４６で知られている。そこで述べられている遺伝子構成お よび方法は、本発明によるＤＮＡ構成の構成と原核生物、あるいは真核生物宿主 内へのトランスフェクションのために利用することができる。

原核生物宿主は、太１１、Ｓ、ｔ　ｍ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ、　Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｅｓｃｅｎｓ　、およびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓなどのグラ ム陰性菌およびダラム陽性菌を含んでいる。

真核生物がＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓあるいは哺乳動物の細胞などのイー スト菌を含んでいる。

一般的に、挿入されたＤＮＡフラグメントの効率的な転写を促進するプロモータ ー配列を含んでいる表現ベクターは宿主との組み合わせで用いられる。表現ベク ターは通常、複製、プロモーター、ターミネータ−１および形質転換された細胞 で表現型選択を行うことができる特殊な遺伝子の発生源を含んでいる。形質転換 された宿主は、最善の細胞成長を達成するために、公知の手段で発酵、あるいは 培養することができる。

本発明で用いることができるプロモーターの例は、ヒトβアゲチン・プロモータ ー、メタロチオニン・プロモーター、複製（７）ＳＶ４０オｌＪジン、オヨびＭ ＭＴＶ　ＬＴＲプ０　モー　タートＭｕＬＶ−ＬＴＲプロモーターなどを含んで いる。本発明で使用することができるプラスミド、あるいはバクテリオファージ の一部の例はＭａｎｉａｔｉｓｉ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ａｎｉｎ　、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　１９８２に リストされており、その他は当業者に知られており、容易に確認することができ る。

遺伝子はその鋳型あるいはメツセンジャーＲＮＡを通じて、特定のペプチドの特 性を有するアミノ酸の配列をコード表現するＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡという 用語は、邪魔な配列が取り除かれた遺伝子を含んでいる。「遺伝子組換えＤＮＡ 、ｊ　（ｒＤＮＡ）という用語では、ｃＤＮＡあるいはゲノム性Ｉ）ＮＡ配列を Ａ２・ｅｈｏで切断することにより組み換えた分子が意味される。

クローニング伝播体は、その場所で該ＤＮＡ配列がそのＤＮＡの基本的な生物学 的機能を失わずに判定可能な方法で切断することができる一つ、あるいは少数の エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられ、形質転換された細胞の確認 において使用するのに適している標識を含んでいる宿主細胞において複製できる プラスミド、あるいはファージＤＮＡ、またはその他のＤＮＡ配列である。例え ば、標識はテトラサイクリン抵抗、あるいはアンピシリン抵抗である。「ベクタ ー」という用語は時々、クリーニング伝播体のために使われる場合もある。

表現伝播体はクローニング伝播体に類似しているが、通常、一定のコントロール ・シーケンスのコントロールの下で、宿主内で与えられた構造遺伝子を表現する ことができる伝播体−である。

「個体」という用語は、動物および人間を含めて意味するように使われている。

増殖中の細胞を「生物学的に抑止する」あるいは「抑止」という用語は、部分的 、あるいは全体的成長抑止を含めて意味するように使われており、また、その細 胞の増殖、または成長の速度を減らすことを含めて意味するように使われている 。本発明によるＮＣＲ要素または遺伝子の生物学的に抑制効果を持つ投与量は、 組織培養（例３−４、および図２−４参照）、動物における腫瘍成長、および細 胞培養、あるいは当業者に知られている他の方法で、目標の悪性、あるいは異常 に増殖している細胞成長に対するテストＮＣＲ要素の影響を評価することによっ て決めることができる。

本発明による方法で有益なＮＣＲ要素あるいは遺伝子の投与は、局所的、眼球内 、腸外、経口、鼻腔内、静脈、あるいはその他の適切な手段によって行うことが できる。眼球疾患の措置のための好ましい方法は眼球内あるいは眼球周辺注射で ある。皮膚細胞増殖性疾患の措置のための好ましい投与方法は、局所投与、ある いは皮下注射である。

別の具体例で、本発明によるＤＮＡ構成は焦点増殖性疾患に直接与えることもで きるであろう。眼球内増殖性疾患の場合、本発明のＤＮＡ構成は直接眼球に注入 することができる。

本発明のＤＮＡ構成は内部器官、体腔などの焦点疾患部位に、注射針を疾患部位 に直接誘導するために用いられる画像装置を使用することで、直接あたえること ができる。本発明によるＤＮＡ構成はまた、外科処置の際に疾患部位に与えるこ ともできる。

投与されるＤＮＡの投与量は年齢、疾患の治療段階あるいは個体の傾向的な病気 にかかりやすさ、並列的に措置が行われている場合その位置、重量および種類、 そして病理的、あるいは悪性状況などに応じて決められる。本発明の方法におい て有用な効果的投与システムは、カプセル、タブレット、溶液、懸濁液、あるい はエリキシル剤、経口投与、あるいは溶液や懸濁液、または乳剤などの無菌液体 形態などの形を用いることができる。食塩水、あるいは燐酸塩バッファ食塩水な どの基質、あるいはその内部で本発明による方法において用いられる化合物が適 切な可溶性を持つ他のいずれかの基質を用いるのが望ましい。

ＮＣＲ要素あるいは遺伝子の細胞への局所投与のために、本発明によるＤＮＡは 、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のミクロ注入などの当 業者に知られているいずれかの方法で、あるいは、リボゾーム、リポフェクチン などの伝播体において、あるいはむき出しのＤＮＡあるいはＲＮＡとして投与す ることができる。本発明によるＤＮＡはレトロウィルス性ベクター（Ｇｉｌｂｏ ａ　（１９８２）ム」オ旦国鉦旦、　８４５　。

Ｈｏｃｋｅ（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２０　：　２７５　；　Ｗｉｌｓｏ ｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　ＵＳＡ　８５　：　３０１４）　 、ワクチニア・ウィルス・システム（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ等、　（１９８５ ）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５　：　３４０３）、あるいは当業者に知ら れている他の効率的なりＮＡ投与システム（Ｙａｔｅｓ等、（１９８５）　Ｎａ ｔｕｒｅ　３１３　：　８１２）　、これらの引例は説明のためだけのものであ って、参照のために本明細書に取り入れられている。異常に増殖しており細胞を 与える、あるいはトランスフェクト（形質移入）して非分裂細胞を節約するため には、当業者に知られているレトロウィルス投与システムを用いるのが好ましい 。レトロウィルス性ＤＮＡが融合するためには宿主ＤＮＡの複製が必要であり、 レトロウィルスはそのライフ・サイクルのために必要レトロウィルス遺伝子を欠 いているので、自己複製することができない。本発明によるＮＣＲ要素のための レトロウィルス投与システムを用いれば、該抗増殖性ＮＧＲ要素を異常に増殖し ている細胞に向け、非分裂細胞を干渉から守る。

本発明によるＤＮＡは生物学的に有効な基質に入れて投与することもできる。こ の生物学的に有効な基質は、レトロウィルス、リポゾームおよびいずれかの他の 外部ＤＮＡを細胞のゲノムに導入することができるトランスフェクション・メカ ニズムなどを含む。こうしたトランスフェクション・メカニズムは当業者に公知 である。基質は、それと本発明による構成が共存でき、その投与量で措置を受け る固体や細胞に毒性を示さないいずれかの試薬あるいは溶剤なども含むことがで きる。

本発明による方法が治療上の利点をもたらす病理学的な細胞増殖状態は広範にわ たっている。これらの病理学的状態は異常な細胞増殖を起こし得るほとんどすべ てのタイプの細胞で起こり得る。病理学的、あるいは異常な成長を示す細胞のタ イプには（１）その疾患が線繊増殖性不全としてしらている腺維芽細胞；（２） その疾患が眼球増殖性不全として知られている眼球内皮細胞、および（３）その 疾患が皮膚増殖性疾患として知られている上皮細胞などがある。上に述べたこと から、本発明による方法が固体のすべての、あるいはほとんどすべての器官およ び組織システムにおける局所的、あるいは広がった病理状態の措置において有効 であることがわかるであろう。

例えば、眼だけでも、本発明による方法は、未熟児網膜障害、増殖性糖尿性網膜 障害、増殖性糖尿性網膜障害、毛細管種、コロイド性断絶管束網、網膜下断絶管 束網、網膜下の断絶管束形成や角膜における断絶管束網形成による老齢性斑点性 変性、網膜上の膜増殖による斑点性しわ、該硬化による成人性白内障、外傷性や 手術後の腺維芽の内側への成長、光神経膠腫、網膜及大脳血管腫症、断絶管束性 緑内障、体腔譚、風疹性虹採影、鎌状細胞増殖性網膜障害、眼球手術、あるいは 負傷後の上皮の下方成長、白内障後の膜、乳頭腫、サラセミアにおける網膜の断 絶管束形成、弾力線繊性偽黄色腫による網膜下新維管束形成、および神経腺維芽 腫タイプエおよび■、網膜芽細胞腫、葡萄膜黒色腫、および眼縁部偽腫瘍、など を含む正常、喪失、あるいは悪性の細胞や組織の異常な増殖による様々な疾病を 措置するために用いることができる。

本発明が有効な他の喪失増殖性疾患には、乾鮮、魚鱗癖、乳頭腫、基底細胞腫、 鱗状細胞腫、そしてスティンフ・ジョンソン症候群などがある。

本発明による方法によれば、広範な細胞増殖性疾患における異常な増殖を阻止、 あるいは抑止するために−っのＮＧＲ要素あるいは複数のＮＣＲ要素を導入する ことによって、細胞の増殖プロセスを操作することができる。増殖プロセスの操 作は目標の増殖中の細胞にＮＣＲ要素をコード表現するＤＮＡ構成を導入するこ とによって達成することができる。このＮＣＲ要素はＮＣＲ遺伝子で構成されて おり、ＰＧＲ要素の機能的表現を不活性化、あるいは抑止する。

本発明による方法で非悪性、あるいは非ガン細胞における異常な細胞の増殖を抑 止するためのＮＣＲ要素の使い方を示すために、ヒト網膜芽細胞腫遺伝子、Ｒｂ −１が正常なヒト網膜芽細胞株に導入された。例２においてより詳しく述べるよ うに、ヒトＲ，ｂ　ｃＤＮＡを正常なヒト網膜芽細胞ＷＳＩを導入したところ、 細胞成長が停止した。同様に、このヒト網膜芽細胞腫遺伝子をいくつかの異なっ た腫瘍細胞タイプに導入したところ、例３および例４でさらに詳しく述べられて いるように。

イン・ビトロおよびイン・ビボで、これらの細胞における成長の抑制につながっ た。

我々、および他の人々が、ヒト網膜芽細胞腫遺伝子生成物は、細胞がＧｌ／Ｓ境 界と細胞サイクルのＳフェーズで増殖している時、高度に燐酸化される（Ｂｕｃ ｋｏｖｉｃｈ等、（１９８９）Ｃｓｌｌ　５８　：　１０９７　；阿１ｈａｒａ 等、（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　１３００　；Ｄｅｃａｐｒｉ ｏ　（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　５８およびＣｈｅｎ等、（１９８９）　Ｃｅ１ｌ 　５８゜１１９３）、しかし、細胞がＧ１フェーズで増殖していない時は、脱燐 酸化あるいは低燐酸化されることを明らかにした。休息細胞をミトゲンに露出さ せるとＲｂ蛋白質を燐酸化するキターゼ複合体の活性化がもたらされる。その結 果、その細胞はＤＮＡ複製および有糸分裂がもたらされる。したがって、一つの 細胞がＤＮＡ複製を開始するためには、燐酸化によるヒト網膜芽遺伝子生成物の 活性化が必要である。

本発明の一つの具体例において、Ｒｂ−１蛋白質の正常な細胞燐酸化は、ＲＢ− １遺伝子の追加コピーを導入してＲｂ−１蛋白質を過剰に生産させるか、あるい は燐酸化されないようにＲｂ−１遺伝子を変異原化するかのいずれかによって、 抑止するか、あるいは邪魔することができる。

高度に表現された網膜芽細胞腫遺伝子が正常な非腫瘍性細胞に導入されると、豊 富な量の網膜芽細胞腫蛋白質が表現される。したがって、処理された細胞は過剰 な量のＲｂ蛋白質を含んでおり、増殖は停止される６通常、多重燐酸化形態で存 在する網膜芽細胞腫は増殖中の細胞が血清枯渇で成長を止められると、脱燐酸化 される。この過剰の量のＲｂ蛋白質は細胞キナーゼがＲｂ遺伝子生成物を燐酸化 し、不活性化する能力を上回ってしまう。したがって、一つの具体例において、 細胞増殖はＲｂ−１遺伝子などのＮＣＲ遺伝子を細胞に導入することにより、休 止、あるいは抑止できる。同様に、他のＮＣＲ遺伝子も本発明を実施するために 使用することができる。成長休止プロセスを確実なものとするために、導入され る遺伝子は強力なプロモーターのコントロール下に置かれる。ヒトβアクチンは そうした強力なプロモーターの一つである。ヒトβアクチン遺伝子のような強力 なプロモーターのコントロール下でＲｂ遺伝子で構成されるＤＮＡ構成の作成を 例１に示す。しかしながら、他のＮＣＲ要素をＲＢ−１遺伝子の代わりに使うこ とができること、および他の強力なプロモーターも本発明に実施において利用で きることは当業者にとっては明らかである。

他の具体例においては、Ｒｂ−１遺伝子の燐酸化部位が細胞への導入前に突然変 異される。Ｒｂ蛋白質には７−１２の潜在的燐酸化部位が存在する。アラニンま たはバリンまたは他のものを含むＲｂ−１ｃＤＮＡ内のセリンあるいはスレオニ ン・コーディング配列の変異は、したがって、燐酸化では非活性化されない恒常 的に活性のあるＲｂ蛋白質の生産に導くであろう。したがって、その宿主細胞は 燐酸化によってＲｂ蛋白質を不活性化することはできないであろう。そうした変 異Ｒｂ−１遺伝子の細胞への導入は、成長抑止につながるであろう。また、ｐ５ ３゜ｐ８５．　ｐ１０７、およびｐ１３０など他のＮＣＲ遺伝子の燐酸化部位も 、その遺伝子生成物の燐酸化を防ぐために変異させて、異常に増殖中の細胞に導 入し、これらの細胞の増殖を抑止することが可能である。

ＮＣＲ遺伝子の細胞外コピーを導入することにより、細胞成長を抑止する別の方 法は、促進的な働きをする表現を破壊することである。ＲＮＡの新陳代謝におい て酵素として作用する天然のＲＮＡ分子が確認されている。集合的にリボザイム を呼ばれるこの種の分子は植物および動物ウィルスで見い出されている。こうし たりボザイムの一つが衛星タバコ・リングスポット・ウィルス（ＳＴｏｂＲＶ） において認められており、自己切断ＲＮＡのいわゆるハンマー・ヘッド構造がＳ ｙｍｏｎｓとその共同研究者たちにより提案されている（Ｈｏｓｔｅｒおよび５ ｙｍｏｎｓ（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５０　：　９）　、　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ はハンマーヘッド構造を模倣する短い長さのＲＮＡで構成されるＲＮＡのフラグ メントが生理学的条件下での合成ＲＮＡフラグメントの切断において酵素として 作用することを示した。グロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ ＣＡＴ）　ＲＮＡに固有のりホゾラムはイン・ビトロでのＣＡＴ　ＲＮＡの切断 において有効であることが示され（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、　 （１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３４　：　５８５）、同じ構成が、表現性ベク ターに入れられると、インビボで、意図された部位でＣＡＴ　ＲＮＡを切断した （ＣａｍｅｒｏｎおよびＪｅｎｎｉｎｇｓ（１９８９）　Ｐｒ立ｈコ組」工１仰 よ」劇よ：競：　９１３９）。さらに、そのＣＡＴ表現はトランスフェクトされ た細胞内では抑制された。

５ＴｏｂＲＶの触媒性領域でできているリボザイムの切断特性は非常に広い範囲 で発揮される。それは、ＸがＡかＣかＵである三つ組５　’　ＧＵＳ　３　’の 末端でも切断することができる。処理されたりボザイムは触媒性領域に隣接して いる配列内に存在している。これらの配列は切断されるＲＮＡ上のその部位を取 り囲んでいる配列に対して相補型になるように選ばれる。

別の具体例において、本発明はＰＧＲ要素の破壊に関する特性を有する細胞にお けるリボザイムの生産に関するコード表現を行う一つ、あるいは複数のＤＮＡプ ラスミドを導入することによって、細胞増殖を止める方法を提供する。この具体 例を例５に示す。このリボザイムをコード表現し、さらに、いずれのＰＧＲ要素 にそのリボザイムを向ける配列で構成されいるＤＮＡ構成の構造は例５に示され ており、そうしたりボザイム構成を第５Ａ図に一般化した形態で系統的に示しで ある。

ＲＢ−１遺伝子を切断するりボザイムの構造も例５に示しである。本発明の一つ の実施例により、リボザイム構成を細胞に導入して、目標のＲＮＡ要素の核ある いはメツセンジャーＲＮＡを破壊することができる。この側面は例５に述べたｃ −ｍｙｃリボザイムで具体的に示されている。ここでの知見がすべてのＰＧＲ要 素に適用でき、いずれかのＰＧＲ要素あるいは遺伝子生成物を切断するために、 本発明による知見によってリボザイム構成を調製することができるのは当業者に は明らかであろう。

細胞における一つの遺伝子の表現を抑制するための別の手段はアンチセンスＲＮ Ａによる方法である。アンチセンスＲＮＡとは意図された遺伝子のメツセンジャ ーＲＮＡの一部あるいは全部に対して相補的なＲＮＡである。アンチセンスＲＮ Ａの過剰生産は翻訳のための目標ＲＮＡの使用を阻止し、そのことによってその 遺伝子生成物の表現を妨げることが示されている。

細胞の増殖を止めるために、ＤＮＡ構成を特にその細胞内の種々の促進的に働く 調節要素に向けられたアンチセンスおよび／またはりボザイムを表現する増殖中 の細胞に導入することができる。

同じ部位に本発明による複数のＤＮＡ構成を同時に投与することもできる。例え ば、いくつかのＰＧＲ遺伝子に向かう異なったりボザイム構成を同時に、同じ局 所疾患部位に投与することも可能である。さらに、一つ、あるいは複数のりボザ イムと一つ、あるい複数のＮＣＲ遺伝子またはＮＣＲ要素などいくつかの異なっ たＤＮＡ構成も同時に投与することもできる。

上に本発明を一般的に説明したが、以下の特定の実施例を参照することにより、 より具体的な理解を得ることができるであろう。これらの例は説明の目的のため だけに記載されるのであって、特に注記されない限り、限定的な意味を持つもの ではない。

例ｌ Ｒｂ−１ｃＤＮＡ表現プラスミドの作成プラスミド作成およびＤＮＡ調製の一般 的な手順はＭａｎｉｔｉａｓ等が述べた通りである（Ｍａｎｉｔｉａｓ、　Ｔ、 、　Ｆｕｉｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、および５ｅｎｂｒｏｏｋ、　Ｊ、（１９８２ ）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕ ａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ）　、すべて のプラスミドはＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａ、ｂｏｒａｔｏｒｙ　 （ＢＲＬ）から購入したエッシヒリア・コリイ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ）宿主ＤＨ５−ａで育てられた。ヒトβアクチン表現ベクター・システム 、ｐＨＢＡＰｒ−１−ｎｅｏの構造と物理的特性とはすでに述べられている。（ Ｇｕｎｎｉｎｇ等、（１９８７）ヒエニ上虹ム」１虹」虱工亙巳旦、　４８３１ −４８３５）。Ｒｂ−１ｃＤＮＡ配列もすでにこれまでに述べられている（Ｆｕ ｎｇ等、（＋９８９）　効−■」、第１３章で。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅＨｕｍａｎ　Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　Ｇｅｎｅ、 　ＢｅｎｚおよびＬｉｎ１（ｅｄｓ）　ＫｌｕｗｅｎＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｅｒｓ）。

ＨｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｂ−８３４２の作成を第１図、パネルＡ−Ｂで 系統的に示す。ＨｕＢＡａｐｒ−］、−］ｎｅｏ−Ｒｂ−８３４を作成するため に、第一のｅｘｏｎの一部を含んでいるＢａｍ、ＨＩ　ＤＮＡフラグメントがλ ファージ・クローン４−１４−５　（Ｔ’Ａｎｇ等、（１９８９）　並匹■皿４ 、　４０＋、−４０７）から取り除いて、ＢａｍＨ１−Ｅａｇ　１部位で、Ｒｂ −１ｃＤＮＡプラスミドＰＧＨ２の５′末端に結さっされた。（第１図、パネル Ａ参照）その結果得られるプラスミドが成長され、Ｒｂ−１プロモータ領域およ びＲｂ−１ｃＤＮＡの５′部分を含んでいるＨｊｎｄＩＩＩ　ＥｃｏＲ１フラグ メントがＨｉｎｄ　ｍ　１およびＥｃｏＲ１部位（第１図、パネルＡ参照）でプ ラスミドに移入され、プラスミドｐＢＲＢ２．９が作成された。Ｒｂ　ｃＤＮＡ の３．８Ｋｂ３’半分がＥｃｏＲｌと共にＰＧＲ３，８から取り出され（Ｆｕｎ ｇ等、（＋９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ２３６　：　１６５７−１６６１）　、　 ｐＢＲ８２，９のＥｃｏＲ１部位にサブクローンされ、ＰＴ　７　ＢＲＢＦＬが 作成された（第１図、パネルＣ参照）。最後に、Ｒｂ−１ｃＤＮＡおよびそのプ ロメータを含んでいるＢａｍＨ１フラグメントがＨＢＡｐｒ−１−ｎｅｏにＢａ ｍＨ１にサブクローンされ、）１ｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｂ−８３４２に サブクローンされた。

ＨｕＢＡａｐｒ−１−ｎｅｏ−ＲＢ−ＰＱの作成のためには、二重標準合成リン カ−（ここではその内の一本だけが図示されている）コ　５　’ＡＣＧＧＡＴＣ ＣＧＣＧＴＣＡＴＧ　Ｃ：ＣＧ　ＣＣＣＡＡＡ　ＡＣＣＣＣＣＣＧＡ　ＡＡＡＡ ＣＧ　ＧＣＣＧ　３’がＢａｍＨｌおよびＥａｇ　１で消化され、プラスミドＰ Ｔ７ＢＲＢＦＬ　（第１図、パネルＣ参照）のＢａｍＨ１／Ｅａｇ　１にサブク ローンされ、Ｒｂプロモーターと置換された。次に、このプラスミドはヌクレオ チド＃　２７９７−２７９９で直線化するために、酵素ｐｐｕｍ　１で部分的に 消化された。ポリーＡシグナル（ＡＡＴＡＡ、Ａ）およびｐｐｕｍ　１部位に隣 接したＢａｍ８１部位を含んだ合成リンカ−が、直線化ＰＴ７ＢＲＢＦＬのｐｐ ｕｍ　１部位に挿入された。結果として得られるプラスミドが成長され、Ｒｂ　 １　ｃＤＮＡコーディング領域を含んでいるＢａｍＨｌフラグメントが取り出さ れ、プラスミドＨＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏのＢａｍ８１部位に挿入されて、プラ スミドＨｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｂ−ＰＱが作成された。

第１Ｄ図はヒトβアクチン・プロモーターの存在下でＲｂ−１ｃＤＮＡの一部、 あるいは全部を含んでいるプラスミドＨｕＢＡａｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｂの一般 的な構造を示している。

二つの異なったＨｕＢＡａｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｂ表現プラスミドが作成された 。ＨｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｂ−８３４２の場合、Ｘは一番長いオープン ・リーディング・フレームの第一のＡＴＧの前にあるＢａ、ｍＨ１２ｋｂフラグ メントであり　（Ｔ″Ａｎｇ等、（１９８９）更巴邦甜狙工：４０１）　、また 、ＹはＲｂ　ｃＤＮＡの３′未翻訳領域全体である。

）１ｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｂ−ＰＱの場合、Ｘは第一のＡ、ＴＧの前に 配置されている合成リンカ−（５−ＧＡＴＣＣＧＣＧＴＣ−３）であり、Ｙはヌ クレオチド１８０１の後にポリＡテール・シグナルＡＡＴＡＡＡを含んでいる合 成リンカ−である。

例２ ヒト　株ＷＳＩの　に・する ランスフェクトされたプ５７．１Ｆ（７）ｌＩ正常な角膜細胞を、多くのタイプ の細胞の成長を抑止する腫瘍成長因子β　（ＴＧＦβ）に露出すると、角膜細胞 内の網膜芽細胞腫蛋白質は急速に燐酸化され、角膜細胞が成長を停止する。網膜 芽細胞腫に結合してその遺伝子生成物を不活性化すると考えられるＳＶ４０大型 Ｔ抗原は網膜芽細胞腫蛋白質の低燐酸化（活性）形態に対してだけ結合すること ができる。したがって、細胞が成長抑止状態に導かれると、それに伴って起きる 変化は網膜芽細胞腫蛋白質の脱燐酸化である。ミトゲンに露出して抑止された細 胞が成長するように再刺激すると、ＤＮＡ合成の前に網膜芽細胞腫蛋白質の重度 の燐酸化が発生する。こうした現象が正常な細胞と腫瘍細胞で観察されるという 事実は、細胞増殖が起きるためには燐酸化による網膜芽細胞腫蛋白質の不活性化 が必要であることを示唆している。したがって、この網膜芽細胞腫蛋白質は正常 および腫瘍細胞の成長遅延あるいは抑止に関与している可能性がある。

細胞成長に対するＲＢｃＤＮＡの影響を調べるために、）ＩｕＢＡｃ−１−ｎｅ ｏ−Ｒｂ−ＰＱが正常なヒト線維等細胞株ＷＳＩにトランスフェクトされた。コ ントロールとして、Ｒ５Ｌ　ＬＴＲのコントロール下でネオマイシン抵抗性遺伝 子を含んでいるＤＮＡフラグメントがプラスミドＰＡＴＶ−６Ｄ３Ａから取り出 され、合成ｓａｌ　Ｉリンカ−がそのフラグメントに結さつされ、ｓａｌ　１で 消化された後、ＰＰＶＵＯ（ＫａｌｄｅｒｏｎおよびＳｍ１ｔｈ、　（１９８４ ）　ｎ匹旦■１３９　：　１０９−４３７）に結さつされて、　ＰＰＶＵＯ−Ｎ ｅｏが作成された。このＳＶ４０大型Ｔ抗原の遺伝子を含んでいるプラスミド、 ＰＰＶＵＯ−Ｎｅｏがトランスフェクションの効率をモニターするためにトラン スフェクトされた。トランスフェクションのために、エレクトロポレーション・ チェンバー装置セル−オペレータ”（ＢＲＬ）内で、各プラスミドでの１１００ ｕが１０′に指数関数的に成長したーＳ１細胞と混合され、最終的な体積を０． ８ｍｌのＲ，ＰＭｌ　１６４０（Ｇｉｂｃｏ）　＋　１０％ＦＣＳに調整した。

エレクトロポレーションは２００ボルト、１１８０ｕＦの条件下で行われた。エ レクトロポレートされた細胞は室温で１０分間回復され、次に、ＲＰＭＩ　１６ ４０＋胎仔性仔ウシ血清（Ｆｅ２）で希釈され、２ｘｌＯ’細胞／Ｃｍ″の細胞 密度で６０ｍｍディツシュにプレート・アウトされた。この細胞は同じ媒体中で 、二日間、成長させられた。その後、媒体はＲＰＭ　１　１６４０＋１０％ＦＣ ３＋１５ｕｇ／ｍｌ　Ｇ４１８　（ＧＩＢＣＯ）に変えられる。三日関与に、各 ディツシュに対して、ウサギ・ポリクローナル抗Ｒｂ蛋白質抗体ＲＢ　１−ＡＢ Ａ　１あるいはＲＢ　１−ＡＢ１８（Ｍｉｈａｒａ　Ｋ、等、　（１９８９）　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　１３００）　（第２Ａ図）を使うか、あるいはマ ウス・モノクローナル抗ＳＶ４０大型Ｔ抗原抗体ＰＡＢＩＯＩ　（第２Ｂ図）を 使って、組織免疫化学染色が行われた。例８に述べた染色手順が用いられた。第 ２Ａ図に見られるように、トランスフェクションと０４１８媒体での選択後１３ 日目に、トランスフェクトされたＲｂ　ｃＤＮＡプラスミドＨｕＢＡｃｐｒ−１ −ｎｅｏ−Ｒｂ−ＰＱを表現していたＷＳＩ細胞は抗Ｒｂ蛋白質抗体で強く染色 された。しかしながら、Ｒｂ蛋白質を表現した細胞は単一の細胞として残り、分 裂しなかった。対照的に、トランスフェクトされたＳＶ４０大Ｔ抗原（ＳＶＬＴ ）を表現した細胞は、第２Ｂ図でマウス抗５ＬＶＴ抗体で陽性に染色された細胞 のグループ別に示されているコロニーに分裂し続けた。

この様に、細胞内でのＲｂ　ｃＤＮＡの過剰表現は細胞成長の極端な遅れ、また は抑止に導いた。

例３ ヒト水痘腫瘍細胞株ＴＣＣＳＵＰの増殖に対するトランスフェクトされたプラス ミドの影響Ｒｂ−１遺伝子が例２に述べられたのと同じ手順を用いて、内発性Ｒ ，ｂ蛋白質を持っていないヒト水痘腫瘍細胞株ＴＣＣ３ＵＰにトランスフェクト された。用いられたプラスミド、トランスフェクションおよび免疫染色の方法は 第２図に述べられたものと同じである。

第３Ａ図に見られる様に、トランスフェクトされたＲｂ−１ｃＤＮＡを表現して いる細胞は分裂することができなかった。対照的に、トランスフェクトされた５ ＶＬＴを表現している細胞は分裂して、コロニーを形成した（第３Ｂ図）。Ｒｂ 　ｃＤＮＡの過剰表現は、イン・ビトロでの腫瘍細胞の成長のかなりの遅れをも たらした。

例４ 骨髄腫Ｓ　ａ　ＯＳ　＊細胞株の増殖に対するトランスフェクトされたプラスミ ドの影響媒体で１１００ｕ／ｍＱＧ４１８Ｓが使われたことを除くと、５ａＯ５ ｔ細胞のトランスフェクションのためのプラスミドおよび条件は例２に述べられ ているものとまったく同じである。

すべての腫瘍細胞が単一細胞レベルで成長抑止できるわけではない。骨髄腫細胞 株Ｓａｎ乳は良い例である。Ｒｂ　ｃＤＮＡプラスミドＨｕＢＡｃｐｒ−１−ｎ ｅｏ−Ｒｂ−ＰＱをこの細胞株にトランスフェクションすると、三つの異なった 細胞反応が現れた。５ａｎｓｔ細胞株は複数の群で構成されているように思われ る。第４Ａ図およびＢに示されているように、ＨｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒ ｂ−ＰＱでトランスフェクトされた５ａｎｓ、細胞の２／３がＲｂ蛋白質を表現 し、分裂しなかったが、１／３は分裂した６Ｒｂ蛋白質を表現した、トランスフ ェクトされた５ａｎｓ、細胞の約１７３は分裂することができ、コロニーを形成 することができる。Ｒｂ蛋白質を表現した細胞の残りの２７３は二つの異なった 形態を示した。一つは小さく、他方の細胞の体積は５−１０倍程度大きかった。

これら２つの細胞群は同じ割合で存在している。

ヱ之・ビトロで分裂できた５ａｎｓ、細胞が工λχζ弘で成長できるかどうかを 調べるために、当業者に公知の方法で単一細胞クローンされた。簡単にいうと、 単一細胞クローニングのために、トランスフェクトされたＧ４１８抵抗性５ＡＯ Ｓ、細胞がクローニング・シリンダーを用いて分離された。クローニング・シリ ンダー内部の細胞はトリプシン化され、６０ａａプッシュ１枚あたり細胞２００ 個程度の割合で、プレートされた。プッシュ上で一つの細胞として定着した細胞 は２００細胞コロニ一程度に成長され、これらのコロニーはクローニング・シリ ンダーで回収され、トリプシン化された。次に、これらの細胞は完全に成長され た後、組織免疫染色のためにサンプルを採取し、すべての細胞が抗Ｒｈ抗体Ｒｂ 　１−Ａ、ＢＡ　ｌおよびＲＢ　１−ＡＢ１８で陽性に染色された。次に約ｉｏ ”個の細胞が１０匹のヌード・マウスのそれぞれの眼の前室に注入された。コン トロールとして、親糸の５ａｎｓ、細胞が、比較のため、同じヌード・マウスの 反対側の眼球に注入された。第４ｃ図に示されているように、Ｒｂ構成でトラン スフェクトされたＳａ　Ｏ５ｓは眼球内で成長することはできなかったが、親糸 ５ａｎｓ、細胞は増殖し、腫瘍を形成した。

例５ 成長抑止リボザイムの作成 リボザイムをコード表現し、さらにそのリボザイムをいずれかの特定なＰＧＲ要 素に向ける配列で構成されているＤＮＡ構成が第５Ａ図に一般化された形態で系 統的に示されている。ＲＢ−１遺伝子を切断するりボザイムの系統的表示が第５ Ｂ図にも示されている。本発明の一つの実施例において、リボザイム構成をリボ ザイムがいずれかのＰＧＲ要素の核あるいはメツセンジャーＲＮＡを破壊する細 胞内に導入することができる。

この側面は第５Ｄｌｉ！Ｉ上に系統的に示されているｃ−ｍｙｃリボザイムによ って具体的に示されている。ｃ−ｍｙｃ遺伝子のｍＲＮＡ配列とデザイナ−遺伝 子の一部が第５Ｄ図に示されている。

いくつかのりボザイムは与えられたｍＲＮＡに関して異なった位置で、同様のや り方でつくることができる。唯一の必要条件は、この例で用いられる特定のりボ ザイムを用いる場合、その配列内にＧＵＸ三つ組の存在である。ＲＮＡ分子上で 異なった切断部位を有する酵素を切断する他のＲ，ＮＡも用いることができる。

これらは合成的に調製することもできるし、天然自乗のＲＮＡ切断分子であって もよい。

したがって、このリボザイムはその５′および３′側で、切断されるべき、Ｘを Ａ、ＣあるいはＵとするＧＵＸにすぐ隣接したｍＲＮＡの３′および５′に相補 型のヌクレオチド配列によって隣接されている ５　’−ＣＵＧ　ＡＵＧ　ＡＧＵ　ＣＣＧ　ＵＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＡ　ＡＡＣ− ３’の触媒性領域で構成されている。

第５Ａ図に描かれている一般化すボザイムにおいて、ＮおよびＮ’　＝Ｇ、Ａ、 ＵＣでＮ′はＮ、　Ｂ、に対して相補型である。

Ｒｂ　ＲＮＡに固有のりボザイムの作成Ｒｂ　ｍＲＮＡをヌクレオチド１７７１ と１７７２の間のＲｂ遺伝子の切断箇所で不活性化する抗−Ｒｂリボザイムが以 下に述べるように作成され、第５Ｂ図に示されている。

Ｒｂ　ｍＲＮＡを切断するためには、そのＲｂ　ｍＲＮＡ配列に相補型のりボザ イム ５　’−ＣＵＵ　ＧＡＡ　ＵＣＵ　ＧＣＵ　ＣＧＵ　ＣＣＵ　ＣＵＵ　ＡＡＵ　 ＣＵＵ　ＣＣ［Ｊ−３’が合成された。

リボ−Ｒｂ　ＤＮＡをつくるために、以下の二つのプライマーが合成された。

珈工上 ａ）　５’−ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＡ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　ＧＡ Ｔ　ＧＡＧ　ＴＣＣＧｒＧ　ＡＧＧ　ＡＣＧ−３’−ｂ）　５’−ＣＴＧ　ＧＡ Ｔ　ＣＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＡＡＴ　ＣＴＧＣＴ　ＴＧｒ　ＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡ ＣＧ　ＧＡＣＴＣＡ丁−３′二つのプライマーのそれぞれのｊｕｇが１０ｍＭ　 ＴＲｌ５　’ＨＣＬ　ｐＨ７，５，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　４０ｕｌ内で、１分 間、９０℃に加熱された。

加熱されたプライマーに対して、最終的な溶液が５０ｍＭ　ＴＲｌ５ＨＣＬ　ｐ Ｈ７，２，ｌｏｍＭ　ＭｇＳＯ４，Ｏ，１ｍＭジチオトレイトール、５０ｕｇ／ ｍＱ仔ウシ血清アルブミン、各０．１ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ およびｄＴＴＰを含むように、１０ｕｌの１０ｘプライマ一表現バッファーを加 えた。この混合物に対して、４ユニツトのＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥ　Ｂｉｏｌ ａｂ）のＫｌｅｎｏｗフラグメントが加えられ、室温下で、１時間培養された。

０．５ＭＥＤＴＡをｌｕｌ追加してこの反応を止めた後、例えばＭａｎｉａｔｉ ｓ等が述べたような当業者に公知の標準的なプロトコルでＤＮＡが精製された。

（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｉｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、、および５ｅｎｂ ｒｏｏｋ、　Ｊ、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　１ ａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ＋Ｙ、、 　Ｕ、Ｓ＋Ａ、）精製されたＤＮＡはＳａｌ　ｌおよびＢａｍＨ１で切断され、 Ｔ７ポリメラーゼでのイン・ビトロ表現と触媒作用に関するテストのために、ｐ ＧＥＭ　４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）にサブクローンされた 。

リボザイムの触媒をテストするために、必要な望ましい長さのＲＮＡを得るため に適切な場所でプラスミドが直線化された後、ＰＧＥＭ−ｒｉｂｏ−Ｒｂ−３（ リボザイムＲＮＡのため）およびＰＴ７ＢＲＢＦＬ　（基質ＲＮＡのため）から のイン・ビトロでの転写でＲＮＡが作成された。イン・ビトロでの転写のため、 ２ｕＭの直線化プラスミドＤＮＡ力、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、１ｍＭＡＴＰ、 　ＧＴＰオよびＧＴＰ、　５０．：ｌニットのＲＮａｓｉｎ、　０．１ｍＭＵＴ Ｐおよび［ｑ−”Ｐ］ＵＴＰの１０ｕＣｉ、　４０ｍＭ　ＨＱ　ＴＲｌ５　ｐＨ ７，９，２０ｍｍ　ＭｇＣｌ３．１０ｍＭ　ＮａＣ１および１０ｍＭ　ＤＴＴを 含んでいる５０℃１反応混合物内で、４０’Ｃの温度下で、１時間培養された。

反応後、このリボザイムＲＮＡは６％７Ｍ尿素ポリアクリルアミド・ゲル上で電 気泳動によって精製された。このゲルを室温で１０分間Ｘ線フィルムに露出して 、この合成リボザイムが確認された。

このリボザイムを含んでいるゲル切片が取り出され、０．１％ＳＤＳ、　０．５ Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ６，９，１ｍＭ　ＥＤＴＡ内でそのゲル片を渦巻き回転 させて、ＲＮＡが回収された。溶出液をろ過して、０．１容積の５Ｍ酢酸ナトリ ウムｐＨ５，３および２体積の１００％エタノールで沈降反応させた。

反応完了後、このＲＮＡサンプルが等しい体積のフェノール内で渦流させ、さら にそれら二つのフェーズを分離するために遠心分離をかけて精製された。このＲ ＮＡを含んでいる水相がエチル・エーテルで抽出された。次に、この水相に０． ２容積の５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，３と、２体積の１００％エタノールが加え られた。

第５Ｃ図に示されている二つの鋳型はＰＴＢＲＢＦＬをＢａｍ１（１部位（鋳型 Ａ）かＭｌｕ　１部位（鋳型Ｂ）で直線化して作成されたものである。鋳型Ａは ４．７ｋｂであるのに対して、鋳型Ｂは１．８ｋｂである。このリボザイムが設 計通りヌクレオチド＃１７００で切断すれば、鋳型Ａのサイズはがなり小さくな り、−方、鋳型Ｂの方はほんの少し小さくなるだけである。

このリボザイムの触媒作用をテストするために、Ｒｂ−リボザイムの１ｐｍｏｌ ｅが鋳型Ａ（第７図、レーン１．２）あるいは鋳型Ｂ（第７図、レーン３，４） のそれぞれ１　ｐｍｏｌｅと、７５　ｍＭ　ＴＲｌ５−ＨＣＬおよび２　ｍＭ　 ＥＤＴＡ　１０ｕｌ内で混合された。この混合物は９５℃まで２時間かけて加熱 され、それから氷上で冷やされた。この反応は最終的な濃度が２０！ＩＩＭとな るようにＭｇＣ１、を加えることにより開始された。１２時間後、４℃または４ ２℃で、２ｕｌの２００ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＦ（７，９を追加することにより、 この反応が止められた。反応生成物は前にも述べたような（Ｆｕｇ等、（１９８ ７）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　：　１６５７）ホルムアルデヒド・アガロース ・ゲル電気泳動で分析された。第７図、レーン２に示しであるように、鋳型ＡＲ ＮＡ生成物（レーン１）は予想された通り元の長さの半分程度に縮小された。し かしながら、鋳型ＢＲＮＡの生成物サイズは、これも予想通り、目につく程には 縮ノ」１されなかった。

したがって、Ｒｂ−リボザイム構成がデザインされた部位でＲｂ　ＲＮＡを切断 し、そのことでＲｂ　ＲＮＡを不活性化したことは明らかである。ＲＮＡの配列 が分かれば、上に述べた方法で、特定のＲＮＡに向けられたりボザイムを構成で きる。また、より明確に目標のＲＮＡを破壊、あるいは不活性化するために、同 じ目標ＲＮＡ内の複数の部位に向けられた複数のりボザイムを構成するのが有利 であろう。

Ｃ，ｃ−ｍｙｃ配列に相補型のりボザイムであるｃ−ｍｙｃｍ　ＲＮＡを切断す るためのｃ−ｍｙｃｍ　ＲＮＡに対して特に作用を発揮するりボザイムの構成 ５　’−Ｕ　ＣＣＵ　ＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＯＧ　ＧＵＣＣＵＣＡＡＧ　Ａ、Ｇ Ｇ−３’が合成された。これにより、望ましい位置で目標のｃ　−ｍｙｃｍＲＮ Ａを切断する第５Ｄ図に示されているような構造がもたらされた。

ヌクレオチド８８８と８８９との間の切断部位のためのｃ　−ｍｙｃｍＲＮＡの リボザイムが第５Ｄ図に示されている。

細胞内のｃ　−ｍｙｃ　ＲＩ’Ｊ＆を破壊するためには、そのリボザイムをコー ド表現するＤＮＡプラスミドが必要である。このリボザイム・プラスミドの作成 は以下のステップで構成される＝１、　リボザイム領域の合成 ２、　リボザイムの哺乳動物表現ベクターへのサブクローニング １、　リボザイム領域の合成 第５ＤＩｆｆｌに示されているｃ　−＋ａｙｃ　ｍＲＮＡに対するリボザイムは 以下のようにつくられる。二つのオリゴヌクレオチドが合成される。

珈上上 （ａ、）　５’−ＴＣＧＴＣＧＡＩ：　ＣＣＴＣ１７ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　 ＡＧｒ　ＣＣＧ　ＴＧＡ　ＧＧＡ　Ｇ：ＧＡ−３’ＢａｍＨＩ　ＨｉｎｄｌｌＩ ｒ （ｂ）　５’　ＣＴ　Ｇｒ、Ａ、　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＣＣＣＣＣＴＧＧ 　ＴＴｒ　Ｃ釘ＣＣｒ　ＣＡＣＣＧＡ　Ｃ−ＡＴ−３’（ａ）で下線を付したヌ クレオチドはその切断部位に対してｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡ　３’に対して相補型 である。

（ｂ）で下線を付したヌクレオチドはその切断部位に対するｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮ Ａ　５’における配列であるところのものである。

二つのプライマーのそれぞれのＪｕｇが４０ｕｌの１０ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ０７ ，ｓ、　０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ内で、１分間、９０℃に加熱された。この加熱さ れたプライマーに、最終的な溶液が５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ７，２， １０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０，１ｍＭジチオスレイトール、５０ｕｇ／ｍＱ仔ウシ 血清アルブミン、０．１ｍＭのｄａＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰおよびｄＴＴ Ｐとなるように、１０ｕ１の１０ｘプライマーが加えられた。この混合物にＤＮ Ａポリメラーゼ（ＮＥ　Ｂｉｏｌａｂ）のＫｌｅｎｏｗフラグメント４ユニット が加えられ、室温で一時間反応が行われた。

この反応がｌｕｌの０．５　Ｍ　ＭＥＤＡを加えて止められ、ＤＮＡは標準的な 手順で精製された。精製されたＤＮＡはＳａｌ　１とＢａｍＨ１を使って切断さ れ、Ｔ７ポリメラーゼでイン・ビトロで表現し、その触媒活性（以下参照）でテ ストするためにＰＧＥＭＡベクター　（Ｐｒｏｍｅｇａ　ｄｉａｔｅｃｈ）にサ ブクローンされるか、あるいは以下のものを作成するために、ＨＢＡｐｒ−１− ｎｅｏのＳａｌ　１７Ｂａｍ８１部位にサブクローンされた： ＨｕＢＡｃｐｒ−１−ｎｅｏ−Ｒｉｂｏ−ｃ　−ｍｙｃ−１例６ 遺伝子組換構成からのレトロウィルスの作成リボザイム構成ＨｕＢＡｃｐｒ−１ −ｎｅｏ−ｒｉｂｏ−ｃ　−ｍｙｃ−１をレトロウィルス性ベクターと共に細胞 に入れるためには、ＥｃｏＲ１／Ｈｉｎｃｌ　ＩＩｔフラグメントが取り出され 、レトロウィルス・ベクターＰＭＶ　７に基づいて、マウス・リューケミア・ウ ィルスのＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩにサブクローンされた。結果として作成さ れるレトロウィルス性構成ＰＮＶ　７−ＨＢＡｐ−ｒｉｂｏ−ｃ　−ｍｙｃ−１ の構造を第６Ａ図に示す。

第６Ａ図はｃ　−ｍｙｃ　ｍＲＮＡに対するＭｕＬＶ内のりボザイムを系統的に 示しており、ここで２は（＋）そのリボザイムのＭｕＬＶへのサブクローニング のための短い長さの合成リンカ−１あるいは（２）ヒトβアクチン・プロモータ ーのいずれかである。

このりボザイム構造は第５Ｄ図に図示されている通りである。

リボザイムあるいはアンチセンスのために得られたレトロウィルス性プラスミド ＤＮＡ、あるいは抑制的に働く成長調節遺伝子をもったものをエレクトロポレー ションによってφｍあるいはＰＡ１２にトランスフェクトされ、例２に示される ように０４１８抵抗性コロニーが分離された。組織培養上澄み液は毎日取り出さ れ、ソーパル（ｓｏｒｖａｌ）　ＨＢ−４０−ターで４℃。

１０．０００ｒｐｍの条件下で遠心分離を行って精製される。このウィルスの力 価はＮＩＨ３Ｔ３細胞をその上澄み液を系列希釈で判定される。この細胞はＲＰ ＭＩ　１６４０媒体＋ｌＯ％Ｆｃｓおよび１１００ｕ／ｎＱＧ４１８内で培養さ れる。このウィルスの力価は獲得されるＧ４１８抵抗性コロニーの数から判定さ れる。低い力価だけが得られるのであれば、このウィルスはφ２細胞を感染する ために使われ、Ｇ４１８抵抗性φ２細胞を分析して、ウィルス力価を上に述べた ように判定される。そのウィルス力価がそれでも低い場合は、ψ２からの上澄み 液がψｍ細胞を感染するために用いられ、その上澄み液をテストして力価がめら れる。

こうした感染手順を月いることにより、通常、ｔｏ’−’／ｍＱの高い力価を示 す細胞コロニーが、ウィルス生産のために育てられる。そしてこのウィルスを治 療目的のために用いるのである。

このリボザイムのための別のベクターも発表されている（Ｃｏｔｔｏｎ　Ｍ、お よびＢｉｒｎｓｔｉｅｌ　Ｍ、Ｌ、　（１，９８９）　ＥＭＢＯＪ　８　：３８ ６１）。このリボザイムはｔＲＮＡ　という構造遺伝子にサブクローンされた。

その結果得られたハイブリッド分子ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡｌｌｌｅｔはその意図さ れたＲＮＡ基質に対して触媒活性を持っていることが認められている。これ、お よび他のりボザイム系も用いることが可能である。（Ｋｕｏ等、　（１９８８） 　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　６２　：４４３８　；　ＨｅｒｓｃｈｌａｇおよびＣｅｃ ｈ　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４４７　：　４０５　；Ｒｏｂｅｒｔｓｏ ｎおよびＪｏｙｃｅ　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４４　：　４６７）。

例フ イン・ビトロおよびイン・ビボでの リボザイム触媒活性の分析 イ・ビトロでリボザイムを作成するため、２ｕＭのリボザイム・プラスミドｐＧ ＥＭ−ｒｉｂｏ−ｃ　−ｍｙｃ−１が、０．５ユニツト／ｕｌＴ７　ＲＮＡポリ メラーゼ、４０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，９，２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　 ；１０ｍＭ　ＮａＣ１；　１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭ　ＵＴＰ、［ｑ”　Ｐ コＵＴＰの１０ｕＣｉ。

ＡＴＰ、　ＣＴＰおよびＧＴＰをそれぞれ１ｍＭおよび、ヒト胎盤ＲＮａｓｅの １ユニット／ｕＱ含んでいる５０ｕｌ反応溶液内で、４０℃で１時間、培養され た。

反応終了後、９５％ホルムアルデヒド、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％（Ｗ／ Ｖ）キシレン・シアツール・ブルー、０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール・ブ ルーがこの反応混合物に加えられた。

この溶液が６５℃で５分間加熱され、６％　７Ｍ尿素−ポリアクリルアミド・ゲ ルに加えられた。１ｘＴＢＥバター（５０ｍＭトリス−ボラートｐＨ８，４およ び１．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ）内で電気泳動が行われた。この合成リボザイムの位 置が、そのゲルに室温で十分間Ｘ線フィルムに露出することによって確認された 。そのリボザイムを含んでいるゲル・スライスが取り出され、０゜１％ＳＤＳ、 　０．５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ６，９内で渦流することによって、ＲＮＡが溶 出された。この溶出液がろ過され、Ｏ０１体積の５Ｍ酢酸アセテートｐｌ（５， ３および２体積の１００％エタノールで沈降反応された。

このリボザイムの触媒活性をテストするために、上に分離されたりボザイムの１ 　ｐｍｏｌが、７５＋ａＭ　トリス−ＨＣｌおよび２鱈ＥＤＴＡ内で、ｌｐｍｏ ｌのｃ　−ｍｙｃ　ｍＲＮＡと混合された。この混合物が二分間、９５℃に加熱 され、そして、氷上で急速に冷やされた。この反応は、パラフィン・オイルの層 の下で、最終溶液１０ｕｌが５０ＩＩＩＭトリスー）（ＣＩ　ｐＨ７，５，１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡおよび１０−２０ｍＭＭｇＣ１，を含んでいるように調整すること によって開始された。

この反応は、２００ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，９を追加して停止された。反応生 成物はノーザン・プロットで分析された。

例８ 内のＲｂ　白　の　化８　化 細胞が１０％ＦＣＳおよび０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲ ＰＭＩ　１６４０媒体中で培養された。この細胞が冷たいＰＢＳ　（燐酸で緩衝 された食塩）で二環すすがれた。これらの細胞が、４℃の温度下で１２時間、５ ％酢酸および９５％エタノールを含んだ溶液を用いて固定された。

固定後、これらの細胞が冷たいＰＢＳ内で二環すすがれた。

１％正常ウマ血清、３％仔ウシ血清アルブミン、および０．２％トリトンＸ−１ ００を含んだＰＢＳ溶液内で、４℃の温度下で一時間培養することによって、非 特定結合が阻止された。次に、この細胞がＰＢＳで２度すすがれた。そしてこれ らの細胞が、ＲＢ　１−ＡＢｌ、８の１：１６００希釈液かＲＢ　１−ＡＢＡ　 ｌのｌ：１００希釈液を含んでいる４℃溶液を用いて、ＰＢＳ内で１時間、３７ ℃の温度下で培養された。これらの細胞が次に、冷たいＰＢＳと、１％トリトン Ｘ−１００およびＰＢＳを含んだＰＢＳによって連続的に洗浄された。ビオチニ ル化されたヤギ抗つサギＩｇＧ抗体（ＰＢＳ内で１：２００に希釈）を使って、 １時間、３７℃の温度下で培養することによって、これらの細胞に対する特定の 結合が明らかにされた。これらの細胞を冷たいＰＢＳで五目洗浄した後、ＡＢＣ 試薬（アビジン：ビオチン複合体）を用いて、３７℃の温度下で、３０分間培養 され、冷たいＰＢＳで洗浄され、その後、作成されたばかりのＤＡＢ（３，３’ −シアミクソベンジジ−テトラヒドロクロライド）溶液（１０ｍの０．０５Ｍ　 ＴＲｌ５−ＨＣＩ、　ｐＨ７，６，０，３％ナトリウム・アザイドおよび１０ｕ ｌの過酸化水素内に６ｍｇのＤＡＢ（３，３’−シアミクソベンジジ−テトラヒ ドロクロライド）溶液（１０ｍｌの０．０５Ｍ　ＴＲｌ５−ＨＣＩ、ｐ）１７， ６．０．３％ナトリウム・アザイドおよび１０ｕｌの過酸化水素内に６ｍｇのＤ ＡＢを溶かしたもの）で、４分間、室温下で培養された。そして次に、これらの 細胞が希釈水で洗浄され、光学顕微鏡で調べられた。

例９ ｃｍｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂのためのアンチセンスＲＮＡ構成非リンパ球・リュ ーケミア細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の成長を抑止するための、ｃ−ｍｙ ｃおよびｃ−ｍｙｂに対するアンチセンスＲＮＡ構成の使用については、これま でにも発表されている（讐ａｃｋｓｔｏｒｍ等、（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

８５　：　１０２８　；　Ａｎｆｏｓｓｉ等、（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　８６　：３３７９）。これらの実験はイン・ビトロで オリゴリボヌクレオチドで細胞を培養することによって、行われた。イン・ビボ で使用するために、アンチセンスＲＮＡのためのオリゴヌクレオチドのベアが以 下のように作成される。ｃ　１ｙｃに対しては、オープン・リーディング・フレ ーム（ｃ　−＋ａｙｃ　１ＲＮＡのヌクレオチド＃　５５９−５７３　）の最初 の１５の塩基に対して相補型の配列が５′末端ではＥｃｏＲ１部位で、また３′ 末端ではＨｉｎｄｍ部位で隣接されている。

５’　ＡＡＴＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＡ　３’３’　ＧＴＴＧＣＡ ＡＣＴＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＧＡ　５’ＥｃＯＲＩ　Ｈｉｎｄ　ｍ このオリゴヌクレオチドの対は９０℃の温度下で１分間加熱され、そして、２Ｘ リゲーシヨン・バッファ（２０ｍＭ　トリスＨＣｌｐＨ７，５，１０ｍＭ阿ｇｃ １．．　ｌ０ＭＭジチオスレイトール（ＤＴＴ”）および０．２＋ａＭ　ＡＴＰ ）内で７ニールされ、そして、レトロウィルス性−ベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ １／Ｈｉｎｄ　ｍ部位に結さつされる。

促進的な働きをする成長調節遺伝子（例えば、ｃ−ｆｏｓ。

ＰＤＧＦ受容体など）に対するアンチセンスＲＮＡコードｃＤＮＡも同様のやり 方で構成される。

例１０ Ｒｂ蛋白質と同様あるいは同じ構造領域を有する新規蛋白質の免疫学的検査 本発明者はＲｈ蛋白質と同様、あるいは同じ構造領域を有する蛋白質のグループ を見出した。これらの蛋白質は新しい抑制的成長調節遺伝子の生成物であるかも しれない。これらの蛋白質はＲＢ遺伝子生成物に対してつくられた抗体で免疫沈 降反応させることによって検出された。この免疫沈降反応は抗Ｒｂ抗体ＲＢＩＡ Ｂ２０およびＲＢＩＡＢｌ、８とＲＢＩＡＢ　Ａｌを使って行われた。

これら三つの抗体の調製と使用法はこれまでに発表されている（Ｍｉｈａｒａ等 、（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　１３００）　、さらに、ペプチ ドＰ３（Ｒｈ蛋白質、およびＮ−末端にシスティン残基を持ったアミノ酸４２５ ０−２７０で構成されたペプチドで、ＣＦｌ、ＴＰＲＲＧＱＮＲ５ＡＲＩＡＫＱ ＬＥＮＤ）に対して、ウサギ・ポリクローナル抗体ＲＢＩＡＢ　Ｃが作成された 。

免疫沈降反応のために、融合ヒト腫瘍細胞Ｓ同１３（４ｘ１０６細胞）のランダ ム・ポピユレーションがダルベツコのミニマム基本媒体（ＤＭＥＭ）および５％ 透析仔ウシ血清（ＦＢＳ）内で、（ラベルとして［“Ｓ］が使われていれば）メ チオニンが存在しない条件下で、または、（８゛Ｐ燐酸塩が用いられていれば） その存在下で、培養された。、３７℃の温度下で１時間培養ン（Ｉ０００ｃイ／ ｍｍｏ１）か３００ｕＣｉの［”Ｐ］正燐酸塩（９１２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含 んでいるＤＭＥＭ　２７２と、２時間、３７℃の温度下で、取り替えられた。次 に、この細胞は燐酸塩で緩衝した食塩（ＰＢＳ）で二環洗浄され、０．５ｍｌの ＥＢＳ　（４０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ　ｐＨ８，０，１２０ｍＭＮａＣ１，０， ５％ＮＰ−４０、アプロチニン（２ｕｇ／ｍＱ）　、ペスタチン（２ｕｇ／ｙＱ ）　、リューベプチン（２ｕｇ／ｍＱ）およびふつ化フェニルメチルスルホニル （１００ｕｇ／ａｄ）を使って、０℃の温度下で、１時間抽出された。この細胞 溶解物が４℃の温度下で、１５．０００ｒｐｍの回転数で、１０分間遠心分離を 行うことにより、処理された。この上澄み液が５−１０ｕｌの抗Ｒｈ抗体か、あ るいは４℃の温度下で２時間以上、免疫性ペプチド１１００ｕを使って培養され た抗体を用いて、４℃の温度下で、２時間培養された。この免疫複合体が蛋白質 Ａ−アガロース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）上で集められ、　ＥＢＣを用いて、５ 回洗浄された。この免疫沈降された蛋白質が、サンプル・バッファー［６２，５ ｍＭ　トリスＨＣＩ　ｐＨ６，８，５％β−メルカプトエタノール、２．３％Ｓ ＤＳ、　１．０％グリセロール、および０．００１％ブロモフェノール・ブルー ］内で、８７℃の温度下で１０分間加熱することによって溶出され、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥによって分離された。このゲルが固定され、Ｘ線フィルムに露出された。

図８で見られるように、抗Ｒｂ抗体で沈降される少なくとも４つの蛋白質のグル ープが存在する。これらの蛋白質は類似した構造的領域を保有している必要があ り、したがって、Ｒｂ蛋白質に対する抗体で認識される。他の蛋白質をＲｂ蛋白 質と組み合わせて、共析させることもできる。これらの蛋白質の特性を以下に示 す。

（１）　ｐ　１１０−　ｐ　１３０は＋１０から１３０に、ｄの範囲の分子量を 有する蛋白質種の異種グループである。これらの分子量は使用されたゲル電気泳 動標識の遊走から、最もよく推定できる。これらの蛋白質は１０７から１０５Ｋ ｄの範囲の分子量を持っている可能性がある。

これらの蛋白質は最初、Ｒｂ蛋白質を有するヒト腫瘍細胞株内で検出された。第 ８図、レーン１，９および１３に見られるように、ＲＢＩＡＢ２０は分子量が１ ０５−１３０キロドルトン（ｋｄ）の範囲の蛋白質のグループを析出した。これ らの蛋白質が抗Ｒ，ｂ抗体によって特に認識されることは、その免疫化ペプチド ｐ５を予め吸収しておくと、これらの蛋白質の免疫沈降が不可能になる事実によ って示される（第８図、レーン２，１０および１４）。複合体としてＲｂ蛋白質 とむすびつく代わりに、これらの蛋白質ループはＲｂ蛋白質と構造的モチーフを 共有しているように思われる。このことは、それらが、いずれも内発性Ｒｂ蛋白 質を有していない乳房腫瘍細胞株ＢＴ−５４９および網膜芽細胞腫瘍細胞株Ｙ７ ９（図８、レーン１１）などのような細胞内でＲＢＩＡＢ２０によって検出され るという事実によって示されている。さらに、このことは、これらの蛋白質がＲ ｂｌ遺伝子によってはコード表現されないことを示している。

このグループの蛋白質の一つ、または複数のメンバーは最近報告されたｐ１０７ ／ｐ１２０蛋白質（ＥｗｅｎＭ、Ｅ、等、（１，９８９）　Ｃｅ旦５８　：　２ ５７　；　Ｄｙ５ｏｎ　Ｎ等、（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　５８　：　２４９）に 関連している可能性がある。ｐ１０７／ｐ１２０はＳＶ４０およびＪＣウィルス などの大きなＴ抗原、およびアデノウィルスのＥＩＡ蛋白質に結合する蛋白質種 である。同じウィルス抗原領域がこれらとＲｂ蛋白質を結合させるために用いら れたので、これらの蛋白質がこれらのウィルス蛋白質によって認識され得る可能 性を持つ構造的モチーフを共有している。Ｒｈ遺伝子での消却マツピングによっ て、これらのウィルス抗原に対して結合する上で重要なアミノ酸＃　３９３−５ ７２および＃　６４６−７７２の結合位置が確認された。実際、Ｒｂ蛋白質のこ れらの領域に対してつくられた抗体はｐ１０７／ｐ１２０種を認識することがで きる。しかしながら、それに対してＲＢＩＡＢ２０がつくられたアミノ酸のスト レッチであるｐ５は、ＥＩＡあるいはＳＶ４０Ｌａｒｇｅ　Ｔに結合するのに必 要な領域の外にある。　ｐ５はこれらの蛋白質の間で保持されている領域の一部 であるのかもしれない。これもそれらの抗体により認識されるｐ１０７−１１． ０ｋｄを、第８図、レーン３および４に示す。歯頚部腫瘍細胞株ＭＥ１８０から の細胞溶解物の免疫沈降を行ったところ、第８図、レーン３の１０５Ｋｄおよび １１０Ｋｄ蛋白質の存在が示された。ペプチドｐ５でこれらの抗体を予め吸収し てしまうと、両方の横縞が消失してしまった。しかしながら、重度に燐酸塩化さ れたＲｂ１０５Ｋｄ蛋白質は１０７−１１０に、ｄ程度の分子量を有しているの で、その領域の蛋白質が不明確になってしまう、これらの蛋白質がＲｂ蛋白質の 燐酸塩化された形態によって不明確になっているのかどうかをテストするために 、同じ実験が、その内部でＲｈ蛋白質が変異されていて燐酸塩化されない菌類部 腫瘍細胞株Ｃ３３Ａ　（第８図、レーン５および６）と水庖細胞株Ｊ８２（第８ 図、レーン７および８）を用いて行われた。これら両方の細胞株からの細胞溶解 物の免疫沈降の結果、１０５ＫｄのＲｂ蛋白質の未燐酸塩化された形態、および １０７Ｋｄの蛋白質の存在が示された。したがって、ＲＢＩＡＢ−２０は分子量 が１０７−１３０Ｋｄ程度の蛋白質のグループを発生させることができる。これ らの蛋白質はＲｂ蛋白質と共通の構造領域を有しており、抗Ｒｈ蛋白質によって 認識される。

（１）　約８５Ｋｄ程度の分子量を有する蛋白質ｐ８５がヒト腫瘍細胞株ＳＷ６ １３で検出された。ｐ８５は抗体ＲＢ］ＡＢ２０およびＲＢＩＡＢ　Ｃを用いて 検出することができる。第８図、レーンｌおよび２に示されているように、ｐ８ ５は容易に検出できるが（第８図、レーンｌ）、しかしこれらの抗体が免疫化ペ プチド（ｐ５）（第８図、レーン２）によってブロックされていれば、検出でき ない。増殖中の正常ヒト角膜細胞がＴＧＦ−βで処理されると、ｐ８５蛋白質の 表現のアップレギュレーションに伴って成。

長抑止が起きる。より重要なことは、ｐ８５の表現の強化でＴＧＦ−βの投与量 とそれによる処置の継続時間に依存している。

ＴＧＦ−β措置が多くの細胞タイプの成長抑止をもたらすことはよく知られてい る。細胞内のｐ８５表現がＴＧＦ−β処理によって強化されるという事実は、ｐ ８５がＲｂ蛋白質と共通の構造的モチニフを有しているもうひとつの抑制的な働 きをする成長調製遺伝子生成物であるという可能性と合致している。

（３）分子量が５３ｋｄ程度であるもうひとつの蛋白質ｐ５３がＲｂ抗体によっ て析出された。恐らく、Ｒ，ｂ蛋白質と共通の構造的モチーフを有している蛋白 質がすべて抑制的な働きをする成長調節遺伝子生成物であるという最も強力な証 拠は、腫瘍サプレッサー遺伝子生成物ｐ５３がＲＢＩＡＢ　２０　（第８図、レ ーン１３および１４）およびＲＢＩＡＢ　１８　（第８図、レーン１５−１８） 抗体によって析出されるという事実である６ｐ５３がＲｂとの結びつき、あるい は結合との故に共析されないといことを示すために、その内部でＲｂ遺伝子が消 去されるが、Ｒｂ遺伝子を含んでいるヒト乳房腫瘍細胞株ＭＤＡＭ８４６８がテ ストされた。ｐ５３もこれらの抗体の両方で、ヒト乳房腫瘍細胞株ＭＤＡＭ８４ ６８から析出された。

以上に述べたように、これらの蛋白質グループは抑制的に働く成長調節遺伝子に よりコード表現される可能性を有している。これらの遺伝子はしたがって、それ らを異常に増殖している標的細胞に導入することにより、細胞成長を抑制するた めに用いることもできる。

以上に本発明を十分に述べたので、ここに記載した本発明の精神を損なわず、ま た範囲を逸脱しないで、多くの変更や修正が可能であることは、当業者には明ら かであろう。

ＦＩＧ、　ＩＡ ＧＨ−５ ＦＩＧ、　ＩＤ ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、　３Ａ ＦＩＧ、　３Ｂ ＦＩＧ、　４Ａ ＦＩＧ、　４Ｂ ＦＩＧ、　５Ａ リボヂイム　３’−Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’ＣＡ　Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ“Ｎ” Ｎ’Ｎ”Ｎ“　−５゛ＦＩＧ、　５Ｄ ＦＩＧ、　５Ｇ ＰＴ７Ｂ−Ｒｂ−Ｆヒ ＦＩＧ、　６Ａ ＦＩＧ、　６８ ＦＩＧ、　６Ｃ ＋　２　３　４５６７　８　９　ｔｏｌｌ　１２１３１４１５１６１７１８ＦＩ Ｇ、　８ 増殖性疾患に関する遺伝子療法 発明の要約 本発明はガン、悪性細胞増殖、良性増殖性疾患および他の病理的細胞増殖性疾患 などの不適切な、あるいは病理的な細胞成長に対する措置の方法を提供する。

本発明はまた、異常に増殖している細胞に対して抑制的に働く成長調節遺伝子（ ＮＣＲ）の一つ、あるいは複数の遺伝子コピーを投与することより成る個体にお ける細胞増殖性疾患の処理方法を提供する。

別の実施例において、本発明は異常に増殖している細胞にＰＧＲ要素の機能的表 現を不活性化する本発明による合成りＮＡあるいはＲＮＡ構成を挿入することに より、異常な細胞増殖を抑止する方法を提供する。

国１ｌｉ１１１１査報告 ”””””””””’ｒ／１ｌｓＱＩ／ｌ’１２１！＋７１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．促進的な働きをする成長調節遺伝子あるいは該抑制的成長調節遺伝子により コード表現される核またはメッセンジャーＲＮＡを抑制することにより、細胞増 殖を抑止するＤＮＡ構成を増殖中の細胞に投与することを特徴とする病理的細胞 増殖性疾患を措置する方法。 ２．該ＤＮＡ構成が、リボザイム、あるいは抑制的成長遺伝子をコード表現する ＤＮＡ配列を有している遺伝子組換え表現ベクターより成る、特許請求請求の範 囲第１項の方法。 ３．該ＤＮＡ構成がリボザイムをコード表現するＤＮＡ配列を含む遺伝子組換え 表現ベクターより成る、特許請求の範囲第１項の方法。 ４．該ＤＮＡ構成が抑制的成長調節要素をコード表現するＤＮＡ配列を含んでい る遺伝子組換え表現ベクターより成る、特許請求の範囲第１項の方法。 ５．該ＤＮＡ構成が該リボザイム配列の３′および５′末端で、少なくとも、標 的宿主細胞内に存在する促進的に成長調節する遺伝子によってコード表現される 核ＲＮＡあるいはメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドをコード 表現するＤＮＡ配列より成る、特許請求特許請求の範囲第２項の方法。 ６．該促進的な成長調節が、ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｆｏｓ，ＪＵＮ，ｍｙｂ，Ｋｃ， ＪＥトランスフェリン受容体遺伝子、インシュリン受容体遺伝子、ＰＤＧＦ受容 体遺伝子、およびＥＧＦ受容体遺伝子で構成されるグループから選択される、特 許請求特許請求の範囲第５項の方法。 ７．抑制的成長調節遺伝子の少なくとも一つの活性のある遺伝子コピーで構成さ れるＤＮＡ構成を異常に増殖している細胞に投与することより成る、個体の良性 細胞増殖性疾患を処置する方法。 ８．ＮＧＲＧが網膜芽細胞腫、ｐ５３遺伝子、ｐ８５遺伝子、ｐ１０５遺伝子、 ｐ１３０遺伝子、レチノ酸受容体、甲状腺ホルモン受容体、ｍｙｏＤ遺伝子、Ｄ ＣＣ遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、およびＮＭ−２３遺伝子によって構成されるグル ープから選択される特許請求の範囲第５項の方法。 ９．ｐ５３遺伝子、ｐ８５遺伝子、ｐ１０７遺伝子、ｐ１３０遺伝子、レチノ酸 受容体、甲状腺ホルモン受容体、ｍｙｏＤ遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＮＦ−１遺伝 子、およびＮＭ−２３遺伝子から成るグループから選択される遺伝子の少なくと も一つの活性遺伝子コピーより成るＤＮＡ構成を、増殖中のガン細胞に投与する ことより成る悪性腫瘍性細胞疾患を措置する方法。 １０．抑制的調節遺伝子より成るＤＮＡ構成の少なくとも一つのコピーを該不適 切に増殖している細胞に投与することにより、抑制的成長調節遺伝子の少なくと もひとつの活性を有する対立遺伝子を含んでいる増殖中の細胞の成長を抑止する ための方法。 １１．増殖中の細胞が、乾癬、良性の増殖性皮膚疾患、魚鱗癬、乳頭腫、基底細 胞腫瘍、鱗状細胞腫瘍、腺維芽増殖性疾患、血管増殖性疾患、および皮膚増殖性 疾患より成るグループから選択される疾病の原因である特許請求の範囲第１０項 の方法。 １２．ＤＮＡ構成を異常に増殖している細胞に投与することで構成され、該ＤＮ Ａ構成が、以下のものより成るグループから選択されるところの、細胞増殖性疾 患を措置する方法。 （１）抑制的成長調節遺伝子、および （２）ＰＧＲ遺伝子によりコード表現される核あるいはメッセンジャーＲＮＡに 相補的なヌクレオチド配列で構成されるリボザイムをコード表現するＤＮＡ １３．ＤＮＡ構成をＰＧＲ遺伝子を含む細胞に投与することより成り、該ＤＮＡ 構成が該ＰＧＲ遺伝子の構造的表現を抑止する、病理的細胞増殖性疾患を措置す る方法。 １４．ＤＮＡ構成が、形質転換宿主細胞と共存できる第二のコントロールＤＮＡ 配列と操作可能に結合したリボザイムをコード表現する上で有効な遺伝子組換え 表現ベクターより成る、特許請求の範囲第１０項の方法。 １５．該リボザイムをコード表現する該ＤＮＡ配列がその形質転換宿主細胞内に 存在するＰＧＲ遺伝子によりコード表現される核あるいはメッセンジャーＲＮＡ に対して相補型のＤＭ配列より成る、特許請求の範囲第１１項の方法。 １６．抗腫瘍遺伝子、抑制的成長調節遺伝子、および促進的な働きをするプロモ ーター遺伝子に相補型の配列で隣接されているリボザイムより成るグループから 選択されるＤＮＡ構成を異常に増殖している細胞に挿入することにより、異常な 細胞増殖を抑制する方法。 １７．増殖中の細胞の、抑制的成長調節遺伝子の少なくともひとつの対立遺伝子 で構成されるＤＮＡ構成によるトランスフェクションで構成される、抑制的成長 調節遺伝子の少なくともひとつの対立遺伝子を欠いている、あるいはそれが不完 全な増殖中の細胞の成長を抑止する方法。 １８．抑制的成長調節遺伝子の活性を有する対立遺伝子を一つしか有しておらず 、したがって病気にかかりやすいと判断される個体を確認し、ヒト網膜芽細胞腫 遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ８５遺伝子、ｐ１０７遺伝子、レチノ酸受容体、甲状 腺ホルモン受容体、ｍｙｏＤ遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、およびＮ Ｍ−２３遺伝子から成るグループから選択される抑制的成長調節の少なくとも一 つのコピーを、卵子、精子、あるいは、該抑制的成長調節遺伝子の正常なコピー を十分に有しておらず、受精あるいは萌芽的発達の継続を許してしまうと認めら れる個体に挿入するステップより成る、一般的に病気にかかりやすいと診断され る個体におけるガンを抑止し、あるいは防ぐための予防的措置法。 １９．リボザイムの３′および５′末端で、標的宿主細胞内に存在する促進的な 働きをする成長調節要素によりコード表現される核ＲＮＡあるいはメッセンジャ ーＲＮＡをコード表現する配列より成るリボザイムをコード表現するＤＮＡ配列 。 ２０．抑制的成長調節遺伝子をコード表現するＤＮＡ配列を含む遺伝子組換え表 現ベクターより成るＤＮＡ構成。 ２１．ＮＧＲ要素がＮＧＲ遺伝子である特許請求の範囲第２０項のＤＮＡ構成。 ２２．ＮＧＲ遺伝子がヒト網膜芽細胞腫遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ８５遺伝子、 ｐ１０７遺伝子、レチノ酸受容体、甲状腺ホルモン受容体、ｍｙｏＤ遺伝子、Ｄ ＣＣ遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、およびＮＭ−２３遺伝子から成るグループから選 択される特許請求の範囲第２２項のＤＮＡ構成。 ２３．特許請求の範囲第１９項記載のＤＮＡ構成を増殖中の細胞に投与すること より成る局所細胞増殖性疾患を措置する方法。 ２４．増殖中の細胞が、眼球における線維芽細胞増殖性、血管増殖性、および新 維管束疾患より成るグループから選択される疾患の原因である、特許請求特許請 求の範囲第１０項の方法。