JPH02503265A - トランスカリオチック移植 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランス力リオチック移植 発明の分野 本発明は、遺伝子学的に操作した細胞を受容個体に導入することに関連する遺伝 子発現レベルを変化させるための方法に関する。さらに、本発明はこのような細 胞から産生された化合物、特に抗体、およびそのような化合物の用途に関する。

従来技術 個体の両親から遺伝する疾患は遺伝子疾患として知られている。

区別し得るヒトの疾患のうち少なくとも１，５００は遺伝子学的に決定付けられ ている［マツクシツク（ＭｃＫｕｓ　ｉｃｋ、　Ｖ、　Ａ、　）、　Ｍｅｎｄｅ ｌ　ｆａｎ　Ｉ　ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋ ｉｎｓ　Ｐｒｅｓｓ、　３編、ボルチモア、　１９７１）コ。

これら疾患の殆どは、その詳細な分子主体が未だに理解されていないが、多くの 場合、疾患の基礎は特定の酵素欠損であると決定付けられている［ＭｃＫｕｓｉ ｃｋ、　Ｖ、　Ａ、　、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　４：１（１９７０ ）コ。

現在、全面的に許容された遺伝子治療法は知られていない。ヒトの遺伝子疾患は 、食事療法（たとえば、フェニルケトン尿症に罹患した患者からフェニルアラニ ンを回避させるなど）、薬物療法（たとえば、痛風およびリーシニーナイハン症 候群などに伴う尿酸の蓄積を減少させるために、牛サンチンオキシダーゼ酵素の 阻害物質（アロプリノール）を使用することなど）、または遺伝子産物置換療法 （たとえば、血友病の患者に第■因子を投与するなど）のいずれかによって通常 は治療される。

しかし、多くの遺伝子疾患は上記の治療のいずれに対しても依然として反応しな い。たとえば、一般に、アミノ酸代謝の遺伝子障害は食事療法によって十分にコ ントロールすることはできない。さらには、ライソソーム酵素欠損に伴う蓄積症 は酵素療法に反応しないことが見いだされている。さらに、疾患を上記いずれか の方法でコントロールしたとしても、疾患の管理は殆どの場合、完全ではない。

上記の方法の欠点に対応し、多（の研究者が組換えＤＮＡ技術を遺伝子疾患の治 療に応用している。このような遺伝子療法は、患者のゲノムを意図的に変化させ て病態生理状態を改善させるという内科的／外科的な介入手段として広（定義付 けられており、このような用語はさらに生殖細胞ラインおよび体細胞遺伝子療法 に分けることができる。倫理的および実地上の両見地から、ヒトを対象としては 生殖細胞ライン遺伝子療法を実行することはできない。倫理的観点から、生殖ラ インを改変することは、若干であってもヒトの次世代に変化を及ぼしかねず、そ の長期間作用は全く予期できない。これとは対照的に、体細胞遺伝子療法は適用 した個体に作用するのみであり、新しい遺伝子は遺伝子プールには入らないであ ろう。実地的観点から、生殖ライン遺伝子導入は比較的非能率的であり、注入し た遺伝子の運命は予想することができず、おそらくは最重要事項として、殆ど例 外なく、単一細胞または胚の未来の表現型（特定の疾患に関して）を決定するこ とはできないであろう。

しかし、体細胞遺伝子療法は、人類の特定疾患に対処し、治療するための妥当な 方法であるように思われる。体細胞遺伝子供給システムでは、患者由来の細胞を 取り出し、インビトロ培養し、トランスフェクトし、再移植する。この基礎的な 方式の変法としては、細胞タイプおよび細胞ドナー（患者である必要はない）、 トランスフェクションプロトコール、および再移植の部位の選択が挙げられるが 、これらに限定されない。

このように、ＤＮＡを個体に供給するための手段として有望視された幾つかの方 法が開発されている。広く開示されている方法は、レトロウィルスベクター［パ ルマス（Ｖａｒｍｕｓ、　Ｈ，）らのＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕ　Ｓ　ｅ　 Ｓ　＋ワイス（ｉａｉｓｕ）ら編、（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボい る。この方法では、個々の遺伝子をレトロウィルスに挿入し、次いでそれを個体 に導入する。レトロウィルスはＲＮＡの遺伝子情報を蓄えており、細胞に入ると 、この情報はＤＮＡへと逆転写され（したがって、「レトロ」と命名されている ）、次いで宿主細胞のゲノムに組み込まれ、発現することができるようになる。

実際には、遺伝子操作法によって、目的とする遺伝子およびレトロウィルスのゲ ノム（幾つかのレトロウィルス遺伝子はウィルスが複製できないように除去する ）を含有する組換えレトロウィルスを構築する。この人工ウィルスを利用してイ ンビトロで骨髄細胞を感染し、得られた細胞を致死的に照射した受容マウスに静 注すると、これらは最終的には、骨髄および牌臓に達する。この方法を使用し、 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ［ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　 Ｄ、　Ａ、　）らのネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１０：４７６−４８１（１ ９８４）］　、アデノシンデアミナーゼ［Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、　Ａ、らの プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ　Ｓ　 Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ 、　）＋８３＋２５６６−２５７０（１９８６）］　、およびヒボキサンチンホ スホリボシルトランスフェラーゼ［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ａ、　Ｄ、　）ら の２２５：６３０−６３２（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ］をコードしている遺伝 子がマウスにおいて発現された。

過去数年来で、遺伝子供給システムを基礎とするレトロウィルスの移植は、主と してレトロウィルス自身の性質に関連した大きな障害に直面することが明らかに なってきた［ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ。

Ｍ、）、Ｎａｔｕｒｅ　３２０：２１３−２１４（１９８６）、マークス（Ｍａ ｒｘ、　Ｊ、　Ｌ、　）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２　：８２４−８２５（１９ ８６）］。まず第１に、ヒト細胞を感染するのに使用したレトロウィルスベクタ ーでは、一般に哺乳動物遺伝子を発現させることができず、この問題が解決する までは、遺伝子発現を調節する問題に取り組むことができない。第２に、レトロ ウィルスを一群の骨髄細胞の感染に使用した場合、実質的にいずれの細胞も感染 され、レトロウィルスの宿主ゲノムへの組込み部位が細胞毎に異なる。

感染細胞は再導入前には特性化しないので、有害な組込み事象の起こる可能性を 排除することができない。第３に、感染に使用した複製障害性のレトロウィルス と哺乳動物のゲノムに存在する内生レトロウィルスとの間に組換えが起こること が知られており［ホック（Ｈｏｃｋ、　Ｒ，Ａ、　）らのＮａｔｕｒｅ　３２０ ：２７５−２７７（１９８６）］　、宿主動物の慢性的なレトロウィルス感染症 を開始させる可能性がある。第４に、骨髄は、治療的に移入する多くの（殆どで なければ）遺伝子の発現にとって最適の部位とはおそらくはいえない。

遺伝子療法の他の方法は、ＤＮＡをウィルスではなく化学的な方法によって細胞 に導入することである。この方法では、リン酸カルシウム−介在性トランスフェ クションによって受容細胞にＤＮＡを導入する。一般に、まず受容細胞を個体か ら取り出し、導入したい遺伝子を含有するＤＮＡ溶液の存在下にそれをインキュ ベートする。

その遺伝子が細胞に導入された後に、得られた細胞を個体に戻す。

現在、個体から取り出し、処理し、次いで再導入できる細胞は骨髄幹細胞および 皮膚線維芽細胞（フィブロブラスト）［アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｗ 、　Ｊ、　）らの５ｃｉｅｎｃｅ　２２６：４０１−４０９（１９８４）コのみ である。クライン（Ｃ１ｉｎｅ、Ｍ、Ｊ、）らは、機能的なジヒドロ葉酸レダク ターゼ遺伝子をマウスの骨髄に導入するのに成功したことを開示している［Ｎａ ｔｕｒｅ　２８４：４２２（１９８２）］。

この化学的方法は、低い能率性という本質的な欠点を有している。

トランスフェクションは、細胞１０”または１０７個当たり１つしか起こらない ことが見いだされた。したがって、骨髄移植によっては個体から約１０７または １０”個の細胞しか得ることができないので、この化学的方法は、１０から１０ ０９の幹細胞のトランスフェクトが必要であろう。さらに、このような細胞を数 日以上にわたって培養することが困難であることにより、本方法は実質的に制限 されている。骨髄集団の全細胞と比較したとき、非常に少ない修飾細胞しか存在 しないことは、治療学的価値が殆どないと一般に考えられる。

遺伝子治療についての３番目の主流の方法は、マイクロインジェクシジンまたは エレクトロポレーシジン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）などの物理的手法 を使用することである。マイクロインジェクシッンは単離した個体細胞にＤＮＡ を注入することに関連する。この方法は極めて有効であるが、一度に１つの細胞 しか注入できないという欠点を有する。これは、マウスの受精卵へのＤＮＡの注 入に最も成功を６（１９８１）　；ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ、　Ｔ、　Ｆ、　） らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　＋■、　Ｓ、　Ａ。

７８：６３７６（１９８１）　；バルミタ−（Ｐａｌｍｉｔｅｒ、　Ｒ，Ｄ、　 ）らのＮａｔｕｒｅ　腹：６１１（１９ｇ２）］　、ハマー（ＨａｌＩｌｍｅｒ 、　Ｒ，Ｅ、　）らは、この手法を成長ホルモン産生１１：６５（１９８４）］ 。エレクトロポレーションは、電流を使用して細胞膜を介し直接ＤＮＡを移入さ せることである。これはＤＮＡを８９７８球に移すのに使用されている［二ニー マン（Ｎｅｕｎ＋ａｎｎ、　Ｅ、　）　ラのＥＭＢＯＪ、　Ｌ：８４１（１９８ ２）］。

要約すれば、遺伝子疾患に対処するために、種々の常法および組換え法が提示さ れている。しかし、現在は、完全に満足のいくような単一の手法はない。ウィル スベクターを使用するのは、内生遺伝子の再配列のおそれ、および発癌作用を誘 発させるおそれがある。

物理的手法は非常に効率的ではあるが、現在では妥当な治療法を行うためにトラ ンスフェクトが必要であると考えられる非常に多（の細胞には適用することがで きない。化学的方法は既に対象個体から抽出している細胞にＤＮＡを導入するこ とに関連する。現在、この手法は骨髄細胞および線維芽細胞に限定されており、 実行可能な治療法を構成するには効率的でない。この分野の状態は、フリードマ る。

抗体などの結合性タンパク質は、抗原またはハブテンなどの特定の分子の存在ま たは濃度を検定するために広範に使用されている。

抗原は、動物に導入したとき、動物を刺激してそれと結合することが可能な抗体 を産生せしめる分子である。これとは対照的に、ハブテン分子は、抗体と結合す ることができるが、その産生を誘発することはできない。抗体は、個々の構造領 域（「エピトープ」として知られている）を確認することによってハブテンおよ び抗原の両者と結合する。ハブテンまたは抗原分子は１つ以上のエピトープ領域 を有する場合がある。

抗体の調製物は、大きく２つに分類される。ポリクローナル抗体は、抗原分子を 動物に注入（またはそうでなければ提示する）することによって調製される。抗 原分子の存在により、抗体−産生細胞がその抗原のエピトープと結合できる抗体 種を産生ずるよう該細胞は刺激される。異なる抗体−産生細胞は異なる抗体分子 を産生ずることができる。このように、抗原を動物に導入すれば、その抗原分子 のエピトープそれぞれと結合することができる抗体など、異なる抗体分子の系列 が産生される。このような調製物は、異なる産生細胞から産生された抗体群を包 含するので、「ポリクローナル」抗体調製物と命名される。

ポリクローナル抗体を調製するための方法および手法の優れた概説を、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌｏｇｙ、　２版：ディビス（Ｄａｖｉｓ、　Ｂ、　Ｄ、　）ら：　Ｈ ａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ。

二ニーヨーク（１９７３）、　３４５−３５８頁；およびＲｅａ＋ｉｎｇｔｏｎ ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１６版、　０ｓｏ １．　Ａ、　、ｔｉＡ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌ　ｉｓｈｉｎｇ、イーストン、　 Ｐａ（１９８０）、　１３１５−１３５１頁に見いだすことができる。

特定の抗体産生細胞はただ１種の抗体を産生ずることもできるので、非常に意義 がある。このような特定の細胞はクローンして精製し、不滅化骨髄腫細胞（ミエ ローマ）と融合することによって、単一の抗体種を産生ずることができる不滅化 細胞を調製することができる。このような融合細胞は、「ノ＼イブリドーマ」細 胞として知られ、それから産生される抗体は、「モノクローナル」抗体として知 られている。モノクローナル抗体を産生させる操作法は、米国特許第４゜１７２ ．１２４号（コブロウスキー（Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ、　Ｈ，ら））、およびモノ クローナル抗体、バイブリド−ｖ　（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏ＋ｍａｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉ＠ｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ）　１ケネツト（Ｋｅｎｎｅｔｔ、　Ｒ ，Ｈ，ら）編、ブレラム・プレス（Ｐｌｅｕａ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ １９８０）に開示されている。

モノクローナル抗体とポリクローナル抗体との違いは、それら個々の特異性また は結合親和性にあるのではない。両タイプの抗体分子は抗原分子に対して同等の 特異性と結合親和性を示す。ポリクローナル抗体の調製物は、多くは異なるエピ トープと結合することができる異なる抗体種の１ｇ０分子の、分画されていない 混合物またはその精製混合物のいずれかからなるものである。対照的に、モノク ローナル抗体の調製物は、ただ１つの抗体種を含有するものである。これらは単 一種の抗体から構成されているので、モノクローナル抗体の調製物は（必ずしも 抗体自身は必要でない力りポリクローナル抗体の調製物で得られるよりも大きな 特異性を有する可能性がある。

モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかを産生させるためには、一 般に実質的な量の抗原を抗体産生細胞に提示させることが必要であることは明ら かである。したがって、一般には、抗体産生を誘発させる前に、抗原を単離し、 精製することが必須である。しかし、実際には、特定の抗原分子を単離精製する ことは困難であることが多い。このことは、抗原分子がホルモン、膜タンパク質 、または供給材料中に極めて少ない濃度でしか存在しない他の分子の場合には、 特に当てはまる。したがって、このような分子では、抗体を得るのが困難である か、あるいは得られないことが多い。このような事情から、抗原分子を前もって 単離または精製する必要のない抗体の生産方法が要求されている。

発明の要旨 本発明は、所望の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させるための方法を提供す るものである。さらに、本発明は、対象における目的遺伝子の発現に存在し得る 欠陥を補償する手段、あるいは対象における特定遺伝子を増加または減少させる 手段を提供するものである。

詳細には、本発明は、所望の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させるための方 法であって、受容対象に供給したとき、所望の遺伝子配列の発現を指令して所望 の遺伝子産物を産生させる所望の遺伝子配列を含有するトランスフェクト細胞を 少なくとも１つ含有しているトランスフェクト細胞調製物を受容対象に供給する ことを特徴とする方法を提供するものである。

また、本発明は、所望の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させるための方法で あって、受容対象に供給したとき、エフェクター遺伝子配列の発現を指令して所 望の遺伝子産物を産生させるエフェクター遺伝子配列を含有するトランスフェク ト細胞を少なくとも１つ含有しているトランスフェクト細胞調製物を受容対象に 供給することを特徴とする方法を提供するものである。

本発明はさらに、生物学的化合物の産生を誘導する方法であって、受容対象に供 給したとき、受容対象の非−トランスフェクト細胞の生物学的化合物の産生を誘 発させるに十分な所望の遺伝子配列の発現を指令することによって所望の遺伝子 産物（１）を産生させる所望の遺伝子配列を含有するトランスフェクト細胞を少 な（とも１つ含有しているトランスフェクト細胞調製物の有効量を受容対象に供 給することを特徴とする方法を提供するものである。

本発明はさらに、試料中の所望の遺伝子産物（ＩＩ）の濃度を測定するための方 法であって、 （ａ）所望の遺伝子産物（ＩＩ）と結合できる生物学的化合物の存在下に試料を インキュベートし、受容対象に供給したとき、受容対象の非−トランスフェクト 細胞の生物学的化合物の産生を誘発させるに十分な所望の遺伝子配列の発現を指 令することによって所望の遺伝子産物（１）を産生させる所望の遺伝子配列を含 有するトランスフェクト細胞を少なくとも１つ含有しているトランスフェクト細 胞調製物の有効量を受容対象に供給することを特徴とする方法によって生物学的 化合物の産生を誘発し、 （ｂ）所望の遺伝子産物（ＩＩ）と結合した生物学的分子の量を測定することに よって所望の遺伝子配列の濃度を測定することを特徴とする方法を提供するもの である。

さらに、本発明は、所望の遺伝子産物（ＩＩ）の試料中濃度を測定する方法であ って、 （ａ）所望の遺伝子産物（ＩＩ）と結合できる２つの異なる生物学的化合物の存 在下に試料をインキユベートし、受容対象に供給したとき、受容対象の非−トラ ンスフェクト細胞の生物学的化合物の産生を誘発させるに十分な所望の遺伝子配 列の発現を指令することによって所望の遺伝子産物（１）を産生させる所望の遺 伝子配列を含有するトランスフェクト細胞を少なくとも１つ含有しているトラン スフェクト細胞調製物の有効量を受容対象に供給することを特徴とする方法によ って少な（とも１つの生物学的化合物の産生を誘発し、（ｂ）所望の遺伝子産物 （ＩＩ）と結合した生物学的化合物の量を測定することによって所望の遺伝子産 物の濃度を測定することを特徴とする方法を提供するものである。

本発明はさらに、免疫抑制活性を有するのでないか疑わしい物質の評価法であっ て、 （ａ）抗原を発現するトランスフェクト細胞調製物を受容対象に導入し、 ・（ｂ）評価すべき物質を該受容対象に投与し、そして（Ｃ）物質の投与により 、抗原と結合できる抗体の受容対象における産生能に影響を受けたか否かを決定 することを特徴とする方法をも包含するものである。

さらに、本発明はトランスフェクト細胞からなる移植物をも包含するものである 。

図面の簡単な説明 第１図は、トランス力リオチック移植の１態様を示す模式図である。培養細胞に 、治療目的とした遺伝子および選択マーカーをフードしている遺伝子を共に共ト ランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）する。

選択手法に対する生存能として評価されるマーカー遺伝子の発現能によって、安 定にトランスフェクトされた細胞を同定する（マーカー遺伝子を取り込んでいな い細胞はこれにより破壊される）。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞 の個々のコロニーを増幅し、治療目的とした遺伝子の発現および調節に関して特 性化する。次いで、所望の発現性を有するクローン系統（それ自身は目的とする 遺伝子の発現として特性化される）を、宿主動物における種々の解剖学的位置の ひとつに導入する。

第２図は、一時的にトランスフェクトされた（点線）、または安定にトランスフ ェクトされた（実線）細胞を腹腔内注射したマウスの血流で検出されたヒト成長 ホルモンの量を示すものである。

第３図は、トランスフェクト細胞を皮下投与した（実線、三角）、またはトラン スフェクト細胞を被膜下に移植した（実線、丸）マウスの血流で検出されたヒト 成長ホルモンの量を示すものである。点線は、移植した細胞の数に対して正規化 した被膜下トランス力リオチック移植に関するデータを示している。

第４図は、成長ホルモン遺伝子がメタロチオネイン−■プロモーターによって制 御された、トランスフェクト細胞を含有するマウスにおける成長ホルモンのレベ ルに対する亜鉛投与の作用を示している。

第５図は、被膜移植から回収したトランスフェクト細胞におけるマウスメタロチ オネイン−Ｉ／ヒト成長ホルモン＠ＲＮＡの検出を示している。

第６図は、前もってトランスカリオチック移植物を投与しておいた受容マウスに 安定にトランスフェクトされた細胞を移植した後日数の関数としてヒト成長ホル モンのレベルを示している。

第７図は、異１ｉ（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）マウスにおいて、トランスフェクト 移植物によって発現された成長ホルモンのレベルを示している（実線）。点線は 、その後の別の移植に起因した成長ホルモンの発現を示している。

第８図は、トランスカリオチック移植物を使用した正常および糖尿病マウスへの 機能的なインシュリン遺伝子のデリバリ−を示している。マウスのメタロチオネ イン−１／ヒトインシュリン融合遺伝子（挿入）で共トランスフェクトした後、 Ｌｔｋ”Ｉｎｓセルラインを選択した。ヌードマウス１０匹に約１０７個Ｌｔｋ ”Ｉｎｓ細胞を腹腔内注射した。図示したトランスフェクト後の日数の日にマウ スを２時間給食させ、次いで採血した。推奨された手順（Ｙｏｒｔｈｉｎｇｔｏ ｎ）によって血清グルコースレベル（実線）を測定し、平均レベルおよび標準誤 差を示す。マウスから得た血清試料を採取し、推奨された手順（Ｄｉａｇｎｏｓ ｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）にしたがって血清インシュリンの平均レベル（点線 ）を測定した。

第９図は、トランスカリオチック移植物により生理学的に有意なレベルのインシ ュリンが得られるその能力を示すものである。既述のように、１０匹のＣ３Ｈマ ウスを免疫抑制し、腹腔内注射した。

絶食させて２時間後にマウスから採血し、血清グルコースレベルを測定シタ。５ 匹のマウスが長時間の血清グルコースレベルの下１４　’ｅ示しく実線）、結局 、低血糖症になった。トランスカリオチック移植を行わなかった５匹の糖尿病マ ウスのグループから得られた血清グルコースレベルは、対照としてモニターした （点線）。

好ましい態様の説明 本発明の組成物および方法は、２つの異なる方法で使用することができる。第１ の態様では、本発明の組成物および方法の目的は、遺伝子療法を受容対象に供す ることにある。第２の態様では、本発明の組成物および方法の目的は、トランス フェクト細胞から産生される化合物の存在に対応して特異的な生物学的化合物を 産生ずるよう受容対象を誘発させることにある。

■０本発明の用語の定義 本発明は所望の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させるための新規な方法を提 供するものである。この変化方法は、所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝 子配列のいずれかを受容対象に運ぶトランスフェクト細胞の導入に関連する。本 発明の目的に使用するためには、導入した所望の遺伝子配列は受容対象内で発現 できなければならない。第１図はトランスカリオチック移植の模式図を示すもの である。

本発明で使用することができる「対象受容体」としては、動物、およびヒトなど が挙げられる。本明細書で使用している「対象受容体」なる用語は、所望の遺伝 子を含有するトランスフェクト細胞の受容体を意味するものとする。

本発明では、「トランスフェクト細胞」とは、受容対象において発現させようと 望む特定遺伝子を含有するようインビトロで増殖された細胞を呼ぶものとする。

したがって、たとえば、ある特定の対象において成長ホルモン遺伝子を発現させ たい場合、細胞が受容対象への導入時にこの遺伝子を発現するような態様で、成 長ホルモンに係る遺伝子を細胞に導入するであろう（これによって、トランスフ ェクト細胞が形成される）。この遺伝子配列は、受容対象の属する種の正常遺伝 子配列と同一であるのが通常であるが、これは必ずしも必須でない。したがって 、付加的に成長ホルモンを動物へ供給したい場合には、その動物の成長ホルモン 遺伝子、またはそれに代わって、使用する成長ホルモン遺伝子がその受容対象内 で発現可能である限り、それと異なる種の成長ホルモン遺伝子のいずれかを含有 するトランスフェクト細胞を使用することができるであろう。

このようなトランスフェクト細胞を含有する受容対象は、「トランスカリオチッ ク（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ）Ｊな受容対象と言われる。トランスカリオチ ック動物は、遺伝子導入動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｎｉｍａｌｓ）とは本 質的に異なっている。遺伝子導入動物では、すべてのその動物の細胞が、同種の 他の動物では天然に存在しない遺伝子配列を含有している。トランス力リオチッ ク動物では、導入したトランスフェクト細胞しかこのような配列を含有しておら ず、その動物の細胞の大多数は変化していない。このように、遺伝子導入療法は 、動物の細胞の各々の遺伝子内容を変化させる方法によって、動物の生殖細胞ラ インを変化させることである。これとは対照的に、トランスカリオチック療法は 、体細胞に関連しており、動物の細胞の遺伝子内容は変化させない。

本明細書では、トランスフェクト細胞を受容対象に導入することを「トランス力 リオチック移植」と命名する。

「トランスフェクト細胞調製物」は、（１）生理学的に許容され得る緩衝液もし くは担体、または（２）生理学的に許容され得る容器内のいずれかにおいて、少 なくとも１つのトランスフェクト細胞を含有している細胞懸濁液である。リン酸 緩衝化食塩水は、このような担体として適当な例である。「トランス力リオチッ ク移植物」は、少な（とも１つのトランスフェクト細胞を含有する移植物である 。

■、受容対象におけるトランスフェクト細胞の発現本発明は、受容対象に遺伝子 療法を行うことができる手段を提供するものである。このような治療法は、（特 定の遺伝子配列を対象内で発現することができる）トランスフェクト細胞を導入 することによって行うことができる。対象に導入するべき特定の配列、またはそ の遺伝子配列の性質は、濃度を変化させたいと望む特定の遺伝子産物に応じて選 択されるものである。導入した遺伝子配列は、所望の遺伝子産物（または所望の 遺伝子産物との等個物またはその変異体）を発現し得ることに基づいて所望の遺 伝子産物の濃度を変化させることができる（ここに、導入される遺伝子配列を「 所望の遺伝子配列」と命名する）。さらに、導入した遺伝子配列は、受容対象の トランスフェクトされていない細胞（すなわち、それ本来の細胞）［ここに、そ の遺伝子配列を「エフェクター遺伝子配列」と命名する］から所望の遺伝子産物 が発現されることによって所望の遺伝子産物の濃度を変化させることができる。

したがって、成長ホルモンの濃度を変化させたい場合、成長ホルモンを発現する トランスフェクト細胞を供給することによって成長ホルモンの濃度を直接的に変 化させるか、またはトランスフェクトされていない動物の細胞からの成長ホルモ ンの発現を誘発させることによって間接的にホルモン濃度を変化させることので きる遺伝子配列を導入すればよいであろう。同様に、本発明では、単離、クロー ンが可能なあらゆる遺伝子を使用することができる。

本明細書中で使用する「発現」なる用語は、遺伝子配列のｍＲＮＡへの転写、そ のｍＲＮＡのタンパク質への翻訳、およびそのタンパク質の細胞外への分泌を指 令する細胞の作用を意味する。遺伝子産物の分泌は、天然で起こり得るものであ り、あるいは所望のもしくはエフェクター遺伝子を分泌シグナル配列に機能的に 連結させて行わしめることができる。発現がある種のある遺伝子産物に関して許 容された標準量内のレベルであるならば、またはその発現レベルが受容対象と同 種の非処置対象で得られるものと実質的に同等であるならば、その発現は「正常 」であると言われる。「正常でない発現」とは通常、対象の種の正常個体で見い だされるよりも少ない発現を意味するが、特定の遺伝子産物の過剰発現を説明す るのにも使用することができる。発現は、それにより受容対象の生理機能が変化 するならば、生理学的に意義があると考えられる。したがって、受容対象にとっ て生理学的意味を持たない程に低いレベルの発現は、生理学的に意義があるとは 考えられない。これとは逆に、発現が受容対象の全体的生理機能に影響したとき は、たとえば本明細書で使用する用語では生理学的に意義があるものである。

遺伝子発現を行うためには、所望のエフェクター遺伝子の構造配列をプロモータ ー領域と機能的に連結させることが必要である。プロモーター領域は、トランス フェクト細胞が遺伝子配列の転写を開始する部位として認識するＤＮＡ配列であ る。遺伝子配列がプロモーター領域の存在によって転写できる程に連結が十分で あるなら、その遺伝子配列はプロモーター領域と機能的に連結していると言われ る。本発明の１つの態様では、所望のＤＮＡ配列またはエフェクターＤＮＡ配列 を、正常かつ自生のプロモーター領域に連結したトランスフェクト細胞に導入す る。このようなトランスフェクト細胞は、遺伝子の正常調節の制御下でその所望 の遺伝子またはエフェクター遺伝子の産物を産生ずることができる。あるいは、 好ましい態様としては、特定の所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列 を、伴っていないのが普通であるプロモーター領域に連結することができる。し たがって、トランスフェクト細胞内で機能できるあらゆるプロモーターが所望の またはエフェクター遺伝子配列と連結することができ、これを使用すればトラン ス力リオチック細胞内で遺伝子を発現させることができる。

プロモーター領域はいずれにせよ（すなわち、ある特定の条件下でしか遺伝子を 連続して発現することができないか、あるいはそうでなくても、このような発現 を実質的にプロモートできない場合でも）構築することができる。使用すること ができる好ましい調節可能なプロモーター領域の中には、マウスのメタロチオネ インプロモーター領域がある。このプロモーター領域は、ある種の重金属（すな わち、亜鉛またはカドミウム）の濃度に直接応答して、機能的に連結した遺伝子 配列の転写を指令している。したがって、このようなイオンを受容対象に投与す ることによって、機能的に連結した遺伝子配列の発現レベルを制御することがで きる。

あるいは、温度、糖、２本鎖ＲＮＡなどによって調節可能なプロモーター領域（ 温度についてドロソフィラ・ヒート・ショック・プロモーター（Ｄｒｏｓｏｐｈ ｉｌａ　ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ　ｐｒｏａ＋ｏｔｅｒ）、糖について酵母ｇａ１ −４プロモーター）を使用することもできる。

遺伝子療法の有用性は、古典的な遺伝子障害、不存在性または異所性タンパク質 産物に至らしめる遺伝子の欠損または突然変異に起因する遺伝し得る疾患の治療 は言うに及ばず広範である。糖尿病に対して遺伝子療法を適用するなど、特定の タンパク質を供給することによって、種々の病態生理学的症状を処置することが できる。夏型および■型の両糖尿病は遺伝的素因を有し得るが、非常に多くの場 合、インシュリン遺伝子自身は影響を受けていない。障害性遺伝子の置換に適合 しない種々の一時的な介入もこのカテゴリーに属する。たとえば、組織プラスミ ／−ゲンアクチベータ−（大量生産が非常に困難である）は日の浅い心筋梗塞に 罹患した患者の治療のためのものとして広く評価されている。このような患者か ら入手した細胞は組織ブラスミノーゲンアクチベーターを発現するように操作し 、再移植することが可能であり、以後の生命を脅かす血餅が形成されるおそれが 減じるであろう。同様に、トランス力リオチツク移植は特定の悪性腫瘍を破壊す るように設計した産物を供給するのに使用することもできる。トランスカリオチ ック移植は外傷または火傷の罹病者を一時的に治療するのにも使用することがで きる。

トランスカリオチック移植を利用する遺伝子治療には望ましい幾つかの特徴があ る：■）患者に移植する前に、トランスフェクト細胞を十分に特性化する必要が ある；■）遺伝子（群）を効率的に供給し、所望のレベルの調節された発現を行 う必要がある；■）トランスフェクシヨンに係る異なる組織から誘導した細胞を 利用し、臨床上の配慮から、それらを異なる解剖学的位置に再移植することが可 能なはずである；■）トランスフェクト細胞移植後の機能を検出し、モニターし 、おそらくは調節することができるはずである；■）移植した細胞を要すれば移 植後の任意の時点で完全に破壊し、または不活化することができるように、それ らを操作する必要がある；■）このシステムは明らかな治療上の利点を有してい るに違いないが、患者または個体群を過度の危険性にさらしてはならない。既述 のように、この変化法によれば、受容対象のゲノムに存在していなかった新規な 遺伝子を受容対象に供給することができる。このような場合に、導入した遺伝子 配列を受容対象に初めて発現させることができるであろう。さらに、本発明は、 遺伝子発現の受容対象内レベルを増大させる手段を提供するものである。

■、遺伝子治療を行うためのトランス力リオチック移植の使用本発明は、遺伝子 発現の受容対象内レベルを変化させるための手段を提供するものである。この変 化方法では、遺伝子発現の増大または減少のいずれも行うことができる。

発現を増大させることを所望とする対象受容体の遺伝子と実質的に同一のまたは 等価の遺伝子を含有するトランスフェクト細胞をその受容体に供給することによ って遺伝子発現を増大させることができる。このような遺伝子がトランスフェク ト細胞から発現されることにより、所望の遺伝子産物の濃度が受容対象内で増大 する。ここで使用している「等価遺伝子」は、受容対象の遺伝子と同様のもので あるが、異なる種から誘導された遺伝子である。たとえば、ウシ成長ホルモンの 遺伝子はヒト成長ホルモンの遺伝子と等価であろう。

「同一の遺伝子」は、受容対象に正常かつ天然で存在する遺伝子配列と実質的に 同様の遺伝子である。「等価」または「同一」の遺伝子配列は、「所望の遺伝子 配列」または「エフェクター遺伝子配列」のいずれかになり得る。

本発明に従えば、「エフェクター遺伝子配列」　（すなわち、その増大した発現 を望む遺伝子を調節する遺伝子配列）を含有するトランスフェクト細胞を受容対 象に供給することによって、遺伝子発現を増大させることができる。したがって 、たとえば、特定の遺伝子の受容対象内における発現レベルは、別の所望の遺伝 子配列の受容対象内における内生発現を刺激する産物の遺伝子を発現するトラン スフェクト細胞を受容対象に供給することによって増大させることができる。た とえば、増大したレベルで成長ホルモンを分泌するよう受容対象を誘導する産物 の遺伝子を発現したトランスフェクト細胞を受容対象に供給することによって遺 伝子発現を増大させることができるであろう。

本発明はさらに、遺伝子発現の受容対象内レベルを減少させるためにも使用する ことができる。内生遺伝子の受容対象内における発現を抑制する産物のエフェク ター遺伝子配列を発現するトランスフェクト細胞を受容対象に供給することによ って、遺伝子発現を減少させることができる。すなわち、たとえば、成長ホルモ ンの発現を抑制する産物（すなわち、ソマトスタチン）の遺伝子を発現するトラ ンスフェクト細胞を供給することによって、受容対象における成長ホルモン遺伝 子の内生発現量を制限することができるであろう。あるいは、特定遺伝子の正常 活性またはその機能を妨害する遺伝子産物を発現したトランスフェクト細胞を受 容対象に供給することによっても遺伝子発現を減少させることができるであろう 。たとえば、そのトランスフェクト細胞から、特定の内生遺伝子産物と複合体化 することのできる遺伝子産物を得ることができるであろうし、これにより、その 遺伝子産物の活性が減衰される。

受容対象内における遺伝子発現を増大または減少させる他の方法は、受容対象内 における所望の遺伝子産物の生理学的に意義のある濃度を変化させるために、ト ランスフェクト細胞を使用することである。このようなトランスフェクト細胞は 、（１）発現の変化を望む遺伝子、または（２）発現が、目的とする遺伝子配列 の発現レベルに作用するその遺伝子のいずれかの突然変異アレルを発現すること ができる。したがって、たとえば、成長ホルモン遺伝子の発現レベルを増大させ る１つの手段は、増大した活性を有する突然変異成長ホルモンを産生ずることが できる成長ホルモン遺伝子の突然変異アレルを発現したトランスフェクト細胞を 受容対象に供給することである。同様に、突然変異ヒト成長ホルモン産物を産生 ずることができるトランスフェクト細胞（実質的に補償された活性を有する）を 受容対象に供給することによって、受容対象の内生の正常成長ホルモンと対にな ることができる成長ホルモンレセプターの数を減少することができるであろう。

このような事象は、内生成長ホルモンの量を減少させるのと実質的に同じであり 、内生遺伝子発現の生理学的効果が減少するであろう。

トランスフェクト細胞に存在する所望の遺伝子配列は、受容対象自身、または受 容対象と同種の動物、またはそれと異なる種の動物のいずれからでも得ることが できるし、または合成遺伝子であってもよいと考えられる。トランスフェクト細 胞の所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列の供給源を選択するに当た っては、トランスフェクト細胞から発現される遺伝子産物が受容対象において抗 原として認識されるか否かを考慮することが重要である。したがって、トランス フェクト細胞の発現産物のあらゆる免疫学的拒絶反応を回避するため、受容対象 と極めて近縁の種から所望の遺伝子またはエフェクター遺伝子を入手することが 望ましく、さらにその配列は受容対象と同種の動物から入手することが好ましい 。最も好ましくは、受容対象自身から得られた遺伝子を使用することである。ト ランスカリオチック細胞から発現される遺伝子配列のあり得る抗原性は、受容対 象の血清が発現される遺伝子産物と特異的に反応できる抗体を有しているか、ま たはプライミングして該抗体を有し得るかを確認することによって容易に決定す ることができる。タンパク質の抗原性を決定する手法は当業者にとって周知であ る。

■、受容対象中において生物学的化合物の産生を誘導するためのトランス力リオ チック移植の使用 本発明の１態様は、受容対象に通常存在している非−トランスフェクト細胞から 生物学的化合物を産生せしめるためにトランスカリオチック細胞を使用すること である。この態様にしたがって生産することができる生物学的化合物の例として は、抗体、細胞レセプター分子、ホルモン、酵素などがある。特定の所望遺伝子 産物の「有効量」を発現することのできる特定のトランスフェクト細胞を移植す ることによって、別の特定遺伝子産物の合成を（受容対象内の非−トランスフェ クト細胞から）誘導させることができる。「有効量」なる用語は、生理学的に意 義のある発現量を意味するものとする。

したがって、ホルモン遺伝子の有効量が受容対象内で発現された場合、そのホル モンのレベルは対象の生理に対する検出可能な作用を有する程に十分高いもので ある。抗原性物質の有効量が受容対象内で発現された場合、その物質のレベルは 抗体産生を誘発する程に十分高い。したがって、たとえば、トランスフェクト細 胞が抗原を発現するとき、受容細胞１ネそれと結合できる抗体の産生が誘発され る。

あるいはまた、トランスフェクト細胞が抗原性でないホルモンまたはホルモンレ セプターを発現するとき、受容対象の非トランスフェクト細胞は、標準的な生理 機構によってホルモンレセプターまたはホルモン分子を産生ずるよう誘発される 。

本発明の上記の態様により、第１に発現産物分子を精製しなければならない工程 が省略され、トランスフェクト細胞の発現産物の存在に対応して産生される生物 学的化合物を回収することができるようになることは重要なことである。現在、 たとえば、精製抗原の実質的な量を提供するだけで、高い親和性の特異的ポリク ローナル抗体を生産することができる。抗原分子の精製が困難である故に、ポリ クローナル抗体の生産は極めて困難な仕事であることが多い。対称的に、目的と する抗原をコードしている遺伝子を単離することはしばしば単純な作業である。

このような遺伝子を細胞に導入すれば、その抗原を発現するトランスフェクト細 胞を生産することができる。

次いで、それを発現させて、発現された抗原と特異的に結合できる抗体を受容対 象から産生させる。したがって、本発明は、抗原分子を精製するための現行の必 要性を克服した、ポリクローナル抗体の生産手段を提供するものである。

発現される抗原は、無傷かつ全体の遺伝子の産物である必要がないことは、重要 なことである。さらに、「遺伝子フラグメント」の発現産物であってもよい。「 遺伝子フラグメント」は、発現時に、無傷かつ全体遺伝子のフラグメントからし か構成されていないポリペプチドの産生を導＜ＤＮＡ配列である。たとえば、ホ ルモンを認識できる抗体の産生誘導を望む場合には、完全なホルモン分子を発現 したトランスフェクト細胞を使用する必要はないであろう（すなわち、代わって 、ホルモン分子遺伝子の遺伝子フラグメントを含有する細胞を使用することがで きるであろう）。

抗体産生を誘発するために遺伝子フラグメントを使用できることは当業界におけ る実質的な進歩である。都合の良いことに、遺伝子産物、完全長の遺伝子のいず れをも単離しなかった場合でさえ、この操作法は、遺伝子のクローニングに使用 することができる。さらに、この方法により、免疫診断および免疫治療上におい て実質的に重要である領域−特異的なポリクローナル抗体を単離することが可能 となる。

■１本発明の抗体の使用 トランスフェクト細胞で発現された所望の遺伝子産物は、免疫抑制療法を施さな いならば、受容対象にとって「抗原性」である（すなわち、抗体の発現を誘発す る）ことが非常に多い。遺伝子産物は「エピトープ」を含有しているとき、抗原 性（すなわち、抗原）である。「エピトープ」は、受容対象から認識され、受容 対象の誘発抗体と結合する分子の部分である。抗原は１つまたはそれ以上のエピ トープから構成されている場合がある。

本発明を実施することにより、２つの異なる抗体分子、すなわち「ポリクローナ ル抗体」および「領域−特異的ポリクローナル抗体」を産生させることができる 。「ポリクローナル抗体」は、完全（すなわち、全部または天然の）遺伝子の産 物の存在に応答して対象から産生される。「領域−特異的ポリクローナル抗体」 は、完全遺伝子の産物のフラグメントの存在に応答して対象から産生される。た とえば、ヒトインシュリンタンパク質を免疫コンピーテントなマウスで発現させ た場合、そのマウスは、インシュリンエピトープと結合できる−組みのポリクロ ーナル抗体を産生ずるであろう。一般に、個々の抗体それぞれは１つのインシュ リンエピトープにしか結合できないので、その組みは異なるインシュリンエピト ープそれぞれと結合できる抗体を含有しているであろう。これとは対称的に、ヒ トインシュリンタンパク質の半分しかマウスで発現されていない場合、発現され るインシュリンフラグメント上に存在するインシュリンエピトープとしか結合で きないポリクローナル抗体の組みをマウスは産生ずるであろう。このような抗体 は発現されるフラグメントに関して「ポリクローナル抗体」であるが、それらは 完全なインシュリン分子に関しては「領域−特異的なポリクローナル抗体」であ る。

要約すれば、ポリクローナル抗体の試料が完全な遺伝子産物上に天然で存在する 幾つかのエピトープとのみ結合できる場合、その抗体はその完全な遺伝子産物に 関して領域−特異的なポリクローナル抗体である。代わって、試料中に存在する 抗体が抗原のすべてのエピトープを結合する場合、その試料はその抗原に関して ポリクローナル抗体を含有しているのである。本発明に従えば、完全遺伝子産物 と結合できる抗体は、その完全遺伝子産物と結合できる領域−特異的な抗体を含 有した抗血清から得られるか、またはその中に存在するならば、領域−特異的な 抗体と呼ばれる。

本発明のトランスフェクト細胞は、完全抗原の遺伝子配列または完全抗原のフラ グメントの遺伝子配列を含有することができるので、ポリクローナル抗体または 領域−特異的ポリクローナル抗体のいずれかを産生ずるトランスカリオチック受 容体を生産するのに使用することができる。これらの抗体は、抗体が従来使用さ れてきた免疫検定法のいずれかに利用することができる。本発明の領域−特異的 なポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体が従来使用されてきた免疫検定に 使用することができる。１つの態様では、当業者に周知の通常の標識方法を利用 して抗体を検出可能に標識する。このように、結合性分子は、たとえばｓＨ，＋ ＊ｓ１．＋ａ＋１５および３５３などのような放射活性同位元素を使用すること によって、放射線標識することができる。

さらに抗体は、当業界既知の方法によって、発光標識物、酵素標識物、遊離ラジ カル標識物、またはバクテリオファージ標識物を使用して標識することができる 。

代表的な蛍光標識物には、イソチオシアン化フルオレセイン、ローダミン、フイ フエリスリン、フィコシアニン、アルフィコシアニン（ａｌｐｈｙｃｏｃｙａｎ ｉｎ）、およびテキサス・レッドなどがある。

適当な酵素には、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ 、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ 、およびペルオキシダーゼなどがある。

酵素免疫検定の２つの主要なタイプは、酵素−結合免疫吸着検定（Ｅ　Ｌ　Ｉ　 Ｓ　Ａ）、および酵素−多重化免疫検定（ＥＭＩ　Ｔ）として知られている同種 酵素検定（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ） である。

Ｅ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ａシステムでは、たとえば固相に結合した抗体を使用すること によって、分離を行うことができる。ＥＭＴＴシステムは、トレーサー−抗体複 合体において酵素の失活に依存しており、すなわち活性は、分離工程を必要とせ ずに測定することができる。

さらに、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）化合物も標識物として 使用することができる。代表的な化学発光化合物には、ルミノール、イソルミノ ール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およ びオキサレートエステルなどがある。同様に、生物発光化合物として、ルシフェ リン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンなどを挙げることができる。

標識すれば、当業界周知の方法によって、その結合性分子を使用して検出、すな わち免疫学上の相手を同定、および／または定量することができる。このように 、本発明では、「検出」なる用語は、分子または官能基の存在を同定すること、 およびそれを定量することを包含するものである。

ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）についての適切な説明は、ワーク（Ｗｏｒｋ、 　Ｔ、　Ｓ、　）らのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　 Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ中に 見いだすことができ、チャード（Ｃｈａｒｄ、　Ｔ、）。

Ｎｏｔｒｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋Ｎｅｖ 　Ｙｏｒｋ、二ニーヨーク（１９７ｇ）の章タイトル「ラジオイムノアッセイお よびその関連技術への手引き（Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄ ｉｏｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ）Ｊを特に参照のこと（これらを引用して本発明に包含させる）。

本発明のポリクローナル抗体（および特に領域−特異的ポリクローナル抗体）は さらに、「２点」または「サンドウィッチ」検定としても知られているイムノメ トリック（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）検定に利用するために使用することがで きる。代表的なイムノメトリ、り検定では、未知量の標識されていない抗体を、 試験する液中において不溶性である固相に結合させ、固相抗体、抗原、および標 識化抗体の３つから形成される複合体の検出および／または定量を可能とする標 識物を担う未知量の可溶性抗体を加える。

代表的なイムノメトリック検定には、固相に結合した抗体をまず試験すべき試料 と接触させ、２つの固相抗体−抗原複合体の形成によって試料から抗原を抽出す る「前」検定（“ｆｏｒｗａｒｄ″ａｓｓａｙ）がある。適当なインキュベート 時間経過後、固体支持体を洗浄し、未反応の抗原を含有する液試料の残りを除去 し、次いで要すれば、未知量の標識化抗体を含有する溶液と接触させる。標識化 抗体が標識されていない抗体を介して固体支持体に結合した抗原と複合体化する のを許容する２回目のインキュベート時間経過後に、その固体支持体を別の時点 で洗浄し、反応していない標識化抗体を除去する。このタイプの前サンドウィッ チ検定は、抗原が存在しているか否かを測定する試料「イエス／ノー」検定であ り得、またはこの検定により、標識化抗体の測定値と、既知量の抗原を含有する 標準試料から得られた値とを比較することによって定量することができる。これ らの「２点」または「サンドウィッチ」検定は、ワイド（ｗｉａｅ）の［Ｒａｄ ｉｏｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ　ＭｅｔｈｏｄＪ　Ｋｉｒｋｈａｍ　ａｎｄ　Ｈ ｕｎｔｅｒ、　Ｅ、　＆　Ｓ、　Ｌｉｖｉｎｇｓｔ。

ｎｅ、ニシンバラ、　１９７０で説明されている。

さらに、本発明の抗原を用いると有用である他のタイプの「サンドウィッチ」検 定では、いわゆる「同時」および「逆」検定が使用される。同時検定は、固体支 持体に結合した抗体および標識化抗体の両者を試験する試料に同時に加える単回 インキュベーション工程が関連している。このインキュベーションが完了した後 、固体支持体を洗浄して残りの液試料および複合体化していない標識化抗体を除 去する。次いで、通常の「前」サンドウィッチ検定の場合のように、固体支持体 に伴う標識化抗体の存在を測定する。

逆検定では、まず、標識化抗体の溶液を液試料に徐々に加え、次いで固体支持体 に結合した標識されていない抗体を適当なインキュベーション後に加える。さら にインキユベーションした後、常法によって固相を洗浄し、残った試験する試料 および反応していない標識化抗体の溶液からそれを取り出す。次いで、固相に伴 われた標識化抗体の測定を、同時および前検定のようにして行う。

既述したように、抗原についてのイムノメトリック検定では、特定の結合性分子 を「レポーター分子」で標識する必要がある。これらの既述したレポーター分子 または標識物は、当業者には普通であり、周知である。本発明を実施する上では 、酵素標識物が好ましい実施態様である。考えられるあらゆるイムノメトリック 検定における標識物としての使用にとって理想的である単一酵素はない。それよ りも、いずれの酵素が特定の検定システムに適当であるかどうかを確認しなけれ ばならない。酵素の選択に当たって重要な基準は、純品酵素の回転数（ターンオ ーバー数）（単位時間当たりの酵素部位当たり、産物に変換する基質分子の回数 ）、酵素調製物の純度、その産物の検出感度、酵素反応の検出容易性およびその スピード、試験液中における妨害因子または酵素様活性の不存在、酵素およびそ のフンシュゲート体の安定性、酵素およびそのフンシュゲート体の入手可能性お よび値段などである。本発明のイムツメドリンク検定において標識物として使用 される酵素の中には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 β−ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコミラ ーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒ ドロゲナーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどがあ る。ウレアーゼは、特にその活性が肉眼で容易に視覚化せしめる色素原のｐＨイ ンジケーターに基づいて、好ましい酵素標識物の中の１つである。

当業界周知の方法によって、本発明の抗体を標識することができる。代表的な方 法は、ケネディ−（Ｋｅｎｎｅｄｙ、　Ｊ、　Ｈ，）らのＣｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、 Ａｃているカップリング法はグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、シマレイ ミド（ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ）法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル法である。これらすべての方法は引用によって本発明に 包含されている。

Ｖｌ、　本発明のトランスフェクト細胞の調製付加的な遺伝子配列を細胞にイン ビトロ導入してトランス力リオチック細胞を調製する（第１図）。このような配 列がトランスフェクト細胞の染色体に組込み、または染色体外プラスミドとして 複製可能である場合、その細胞は導入された遺伝子配列の発現を指令する永久能 力を獲得することができる。このような細胞を、「安定にトランスフェクト」さ れていると言う。このような細胞は導入遺伝子配列を発現する永久能力を獲得し ているので、所望の遺伝子産物またはエフェクター遺伝子産物を長期にわたって 産生できる能力を受容対象に供給したいような場合には、安定なトランスフェク ト細胞を使用するのが好ましいであろう。

さらに、所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列が細胞の染色体に組み 込まれていないか、または染色体外複製しないトランスフェクト細胞を使用する こともできる。このような細胞は所望の遺伝子配列を発現する能力を一時的にし か維持しない。一時的にしか所望の遺伝子配列を発現しない遺伝子配列を有する 細胞を「一時的トランスフェクト」と呼ぶ。このような一時的発現のレベルは、 所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列のコピーをさらにトランスフェ クト細胞に供給することによって増大させることができる。したがって、一時的 および安定なトランスフェクト細胞の両者共に、このような配列を実質的なレベ ルで発現することができるが、安定にトランスフェクトされた細胞は、一時的ト ランスフェクト細胞よりも、長い時間、所望の遺伝子配列またはエフェクター遺 伝子配列を発現することができる。実際のところ、細胞に導入できる（一時的ト ランスフェクト）遺伝子配列のコピーの数が、安定に維持できるコピーの数より も多いならば、その一時的トランスフェクト細胞は安定な感染細胞で得られるよ りも高いレベルの発現を示すであろう。したがって、短時間の発現を望む場合、 または安定なトランスフェクト細胞を使用して得られるものとは異なった発現レ ベルを得たい場合には、対象内には一時的トランスフェクト細胞を使用するのが 好ましい。

安定なトランスフェクト細胞を得るためには、ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ 、　）らの（セル（Ｃｅｌｌ）、　１１：２２３（１９７７））の方法を利用す ればよい。この方法によれば、（所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配 列を含有する）ＤＮＡ懸濁液を複合体化し、リン酸カルシウムを使用して小さい 沈澱物にする。これらの沈澱物を、組織培養皿（３７℃）中で増殖している単層 の細胞に加える。

好ましくは、所望の遺伝子またはエフェクター遺伝子を単離し、細胞と共にイン キュベートする前にプラスミドにクローンする。しかし、異なる遺伝子配列をそ れぞれ含有するプラスミドの分画していない採取物、または所望の遺伝子配列も しくはエフェクター遺伝子配列のみと共にその細胞をインキュベートすることも できる。分画していないプラスミドを使用する場合、所望の遺伝子配列を含有し 、発現する細胞に関し、得られたトランスフェクト細胞をスクリーニングするの が望ましい。次いで、対象受容体に導入する前に、既知の常法によって他のトラ ンスフェクト細胞からこのような細胞を精製するのが好ましい。細胞培養の方法 は、フレ・ノシュネイ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ，１，）（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｒ 　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅにおいてＸＡ］ｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　、二ニーヨーク５５ −７８頁（１９８３）、およびランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ、　Ｋ、　Ｊ、ら） （Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１巻。

スピア−（Ｓｐｉｅｒ、　Ｒ，Ｅ、　）ら編、アカデミツク・プレス、ニューヨ ーク、８６−１２２頁（１１８５））によって包括的に開示されている（これら は引用によって本発明に包含させる）。

安定なトランスフェクト細胞を同定するためには、一般には、トランスフェクト 細胞の全培養物からこのような細胞をスクリーニングするか、または選択するこ とが必要である。したがって、トランスフェクト細胞を、その細胞に選択特性を 付与できる別の遺伝子配列と共に共トランスフェクトすることが望ましい。この 別の配列は、異なる分子に存在するものであってもよいし、または所望の遺伝子 配列を有する分子と結合することもできる。この第２の配列によって付与される 選択特性としては、たとえば０４１８などの薬物耐性、またはヒポキサンチンも しくは８−アザグアニジンなどの代謝産物の存在下における、またはチミジンな どのヌクレオチドの不存在下における増殖能などが挙げられる。チミジンキナー ゼ遺伝子の発現が障害を受けているトランスフェクト細胞を使用し、そして第２ の選択可能な遺伝子配列として単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子 を使用することが好ましい。選択特性の安定な発現を示すトランスフェクト細胞 を調査し、所望の遺伝子配列をも発現しているか否かを確認する。この調査は、 このような発現に由来するタンパク質産物を検定することによって行われる。当 然ながら、使用する特定の検定法は、タンパク質産物の性質および機能に応じて 異なるものである。

２（１９８５）　；コツプチック（Ｋｏｐｃｈｉｃｋ、　Ｊ、　）らのＤＮＡ　 ４：２３−３１（１９８５）　；口］（これらは引用によって本発明に包含され る）。

一時的トランスフェクション実験を行う場合には、所望の遺伝子配列またはエフ ェクター遺伝子配列を含有するＤＮＡｌ０−５０μｇを細胞５Ｘ　１０’−５ｘ 　１０”に供給するのが好ましい。安定なトランスフェクション実験では、所望 の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列を含有するＤＮＡ　１−２０μｇを 細胞５Ｘ１０’−５×１０８に供給するのが好ましい。選択特性を付与する遺伝 子配列が所望の遺伝子配列を含有する分子と同じ分子上にないならば、別個にそ れを細胞に供給しなければならない。この場合は、この遺伝子配列を受容細胞５ Ｘ　１０’−５Ｘ　１０＠当たり１．０−１００μｇを供給するのが好ましい。

トランスフェクトした後、得られたトランスフェクト細胞を増殖させ、次いで受 容対象それぞれに１０５＝１０１０細胞を供給する。受容体に導入された細胞の 数は、所望の遺伝子またはエフェクター遺伝子の産物の発現、産物の回転速度、 および所望の程度の生理学的活性に要する産物量などの基準に応じて測定される 。

本発明のトランスフェクト細胞は、受容対象の腹膜腔、または皮肉（ｓｕｂｄｅ ｒｍａｌｌｙ）　（すなわち、皮下または筋肉下）、皮肉、筋肉内のいずれに導 入することによっても、受容対象に導入することができ、好ましくは腎を取り囲 む被膜に被膜下移植物を挿入することである。さらに、頭蓋内移植、または肺内 、静脈内、腹腔内、肺内、眼内、畢丸内、内蔵内手段によっても導入することが できる。導入は、注射または移植によって行うことができる（すなわち、細胞に おける導入部位からの拡散能または移動能が制限されている場合である）。好ま しい態様では、移植は腎の被膜下であり、あるいは、受容体から容易に回収でき 、研究できる移植物も同様に好ましい。

本発明は、細胞が（１）導入遺伝子配列を享受し、発現でき、また（２）インビ トロ培養でき、受容対象に再導入できる限りは、数多くの別種の組織から誘導さ れたトランス力リオチック細胞を用いて実施することができる。たとえば、本発 明は、線維芽細胞（フィブロブラスト）、筋細胞、肝細胞、腎被膜細胞、内蔵の 内皮細胞、上皮細胞、下垂体細胞などを使用して行うことができる。本発明は、 −次細胞またはトランスフェクト細胞のいずれを使用しても実施することができ る。好ましいタイプの細胞としては、マスウし細胞、腎被膜細胞、およびＡｔＴ −２０細胞などが挙げられる。しかし、トランスフェクト細胞としてはフィブロ ブラスト細胞を使用するのが最も好ましい。トランス力リオチソク細胞に対する 受容対象のあらゆる免疫反応を最小限にしたいならば、受容対象の種と近縁の種 由来の細胞を使用するのが望ましく、受容対象と同一の種由来の細胞を使用する のが好ましい。免疫応答を回避するには、予め受容対象自身から得ておいた細胞 を使用するのが最も好ましい。あるいは、受容対象の反応またはトランスカリオ チック移植物の破壊を防ぎ、または減じる程に十分な投与量の免疫抑制剤（たと えば、デキサメタシン、または抗−胸腺細胞抗血清）を受容対象に投与してもよ い。

さらに、免疫応答を刺激（たとえば、抗体産生を誘発）したいならば、同種また は別種いずれかの安定または一時的なトランスフェクト細胞を含有するトランス カリオチック移植物を導入すればよいであろう。

このように、本発明は、組織培養細胞または器官性移植（ｏｒｇａｎ　ｅｘｐｌ ａｎｔ）由来の一次細胞のインビトロ培養から始まる。次いで、所望の遺伝子配 列またはエフェクター遺伝子配列を、細胞への吸着を許容する条件下において、 該細胞の存在下にインキニベートする。

次いで、種々のあらゆる手段によって、得られたトランスフェクト細胞を受容対 象に導入することができる。次いで、受容対象内に一旦導入されれば、トランス フェクト細胞にインビトロ導入された遺伝子配列が発現され、受容対象に所望の 遺伝子産物が供給される。

以下の実施例では、ヒト成長ホルモンまたはインシュリンを発現するトランスフ ェクト細胞を使用した。しかし、本発明はこのようなトランスフェクト細胞の使 用には限定されないと考えられ、むしろ、受容対象内であらゆる遺伝子を発現で きるあらゆるトランスフェクト細胞の使用をも包含するものである。さらに、使 用することのできた他の遺伝子としては、ホルモン、酵素、抗体などの遺伝子を 挙げることができる。

さらに、以下の実施例で使用したフィブロブラストおよび下垂体細胞は、受容対 象として使用した特定のマウスから誘導したものでないが、その受容対象自身か ら誘導されたトランスフェクト細胞を使用することもできる。以下に記載の実験 は、遺伝学的に操作した細胞を移植するための幾つかの部位が満足のいくもので あり、受容対象に運搬した後では、このような細胞が活発に機能できることを示 している。

トランスフェクト細胞を皮膜下移植した受容対象マウスの成長が、少なくとも移 植後７日間で、対照マウスよりも急速に成長することが見いだされたので、ヒト 成長ホルモンを使用することは実際上意義がある。したがって、トランスフェク ト細胞の投与により、生理学的に意義のあるレベルで発現されたことにある。こ のような移植は、新生児の動物の迅速成長を促進するのに使用することができる （免疫抑制療法を行わないために、トランスフェクト細胞に対して動物を寛容に する必要があるかもしれない）。同様に、インシュリンの発現も、生理学的に意 義があることが見いだされた。

本発明を概略説明したが、本明細書に記載した特定の実施例の引用は本発明を単 に説明するためのもであって、特記しない限り、本発明の限定を意図するもので ないことは理解されるであろう。

実施例１　ヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランスフェクト細胞の形成 Ａ、一時的にトランスフェクトされた細胞（一時的トランスフェクト細胞）の形 成 培養マウスＬｔＫ−線維芽細胞を、プラスミドｐＸＣＨ５と一緒に、線維芽細胞 がそれを取り込む条件下で培養した。プラスミドｐＯＧＨの誘導体であるプラス ミドｐＸＧＨ５はマウスメタロチオネイン−Ｉ（ｍＭＴ−１）プロモーター領域 と融合したヒト成長ホルモン遺伝子を含有している。このプラスミドは同時係属 中の米国特許出願Ｎｏ、８９６，４８３に記載されている。プラスミドｐＯＧＨ はＡ　ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　 　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに、受託番号ＡＴＣＣ６７１８０の 下で寄託されている。プラスミドによるトランスフェクションはロパタら（Ｌ　 ｏｐａｔａ、　Ｍ）の方法に従った。

Ｂ、安定なトランスフェクト細胞の形成安定なトランスフェクト細胞を生産する ために、マウスＬＴＫ−（チミジンキナーゼ欠損）線維芽細胞をプラスミドｐＸ ＣＨ５と単純性庖疹ウィルス（単純ヘルペスウィルス）のチミジンキナーゼ遺伝 子とによるコトランスフェクションに付し、ＨＡＴ耐性細胞系統（セルライン） をヒト成長ホルモンの発現に関して分析した。安定なトランスフ　エクシｇンは ウィグラーら［Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｃｅ１ｌ、　１１　：　２２３（１９７７）］ の方法に従って行われた。ヒト成長ホルモン発現物を産生じていることが分かっ た一個の細胞系統をＬｔｋ″ＧＨと命名した。

実施例２一時的なトランスフェクト細胞の腹腔内移植実施例ＩＡ記載の方法に従 って一時的なトランスフェクト細胞を得た。ｐＸＣＨ５ＤＮＡでトランスフェク トした４日後にＬｔｋ−受容細胞をチブシン処理（ｔｙｐｓｉｎｉｚｅ）　Ｌ、 ベレット化し、りん酸緩衝化食塩水に再懸濁し、１０匹のＣ３Ｈマウス群に腹腔 内注射した。

これらのマウスは培養Ｌｔｋ−細胞系統の供給源と同一種であった。

各動物に約２Ｘ１０’細胞を導入した。移植後３時間以内に、ヒト成長ホルモン が受容体マウスの血清中に現れた。血清中のヒト成長ホルモン濃度は翌日中に低 下し始め（平均値４５　、１　ｚｇ／　ｍＱ）、移植後４日目にホルモンをよう やく検出できる程度になった（平均値０゜６　ｘｇ／　ｘＱ’）。この実験結果 は第２図に点線で示されている。この実験は、一時的なトランスフェクト細胞の トランスカリオチック移植によって、移植後４日間（トランスフェクション後約 ５−８日に相当）、受容体マウスの血清中にタンパク質生産を引き起こし得るこ とを示すものである。移植された細胞は、受容体の有する該細胞へのなんらかの 不活化作用または排斥作用によってヒト成長ホルモンの生産を停止する。

実施例３　安定なトランスフェクト細胞の腹腔内移植実施例ＩＢ記載の方法に従 って安定なトランスフェクト細胞を得た。Ｌ　ｔｋ’Ｇ　Ｈ細胞系統から得た細 胞を１０匹のＣ３Ｈマウス群に腹腔内注射し、血清中のヒト成長ホルモンを測定 するために、移植後の様々な時期に数回、採血した。この実験の結果は第２図に 実線で示されている。これらの実験において、移植細胞の機能上の完全性（健全 性）を３期に分けることができた。実施例２の一時的なトランスフェクト細胞に おいては、血清中ヒト成長ホルモンは移植後３時間以内に検出され、続く２日間 の内に迅速に減少し始めた（“外傷期”）。次いで、血清中のヒト成長ホルモン 濃度は７日目までに劇的に増大した（“順応期間（日）′）後、１５５日目は辛 うじて検出される程に減少した（消失期）。

一時的なトランスフェクト細胞および安定なトランスフェクト細胞の移植の比較 は、移植当初数日間におけるヒト成長ホルモン発現の停止の原因がおそら（、細 胞操作による損傷作用と腹腔内での細胞の増殖条件とが重なって細胞が死ぬこと にあることを示唆していた。安定なトランスフェクト細胞はこの初期ショックか ら回復するが、一時的なトランスフェクト細胞は、その一時的なトランスフェク ション処理において、細胞がそれ以後に外傷を受けた際の生存を危うくされてい るために回復しない。順応期間中には、ヒト成長ホルモンの生産に反映されてい るように、生存細胞は増殖している。

第７日間以降のヒト成長ホルモンの減少は移植された細胞が本来、長期的に生存 し得ないものであるからというよりは、むしろ受容体の移植に対する応答による ものと思われる。

実施例４　トランスフェクト細胞の発現および長寿に及ぼす移植部位の影響 トランスフェクトされた細胞の発現および長寿に対する移植部位の影響を決定す るために実施例ＩＢ記載の如くにして得られた安定なトランスフェクト細胞をＣ ３Ｈマウスの様々な部位に皮下移植した。動物あたり約２Ｘ１０’細胞を導入し た。この実験の結果を第３図に示す。皮下移植されたトランスフェクト細胞は１ ００日目でヒト成長ホルモンを産生ずることが分かった（第３図、実線、三角） 。

血清中のヒト成長ホルモン濃度は移植後４日間から着実に低下し、腹腔内移植の 際に見られた順応期は、皮下移植においては認められなかった。同様のパターン は、育成膜下に移植した細胞についても認められた（第３図、実線、丸）。破線 は被膜下移植における結果を移植細胞数について標準化して示したものである。

この実験では各動物を３Ｘ１０”細胞で感染させた。移植後７日目までは、これ らの移植物による血清中成長ホルモンの生産は殆んどなかった。皮下移植物を摘 出し組織学的研究に付した。被膜下移植物中にはヒト成長ホルモン陽性に染色さ れる細胞が存在しており、腎ブレンキマ（ｐｒａｅｎｃｂｙｍａ）の形態学は正 常であることが分かった。ヒト成長ホルモンの働き（あるとすれば）と移植細胞 の生存に関する対照として、トランスフェクトされていないＬｔｋ−細胞をも被 膜下移植した。これらの細胞の死は被膜下に移植したトランスフェクト細胞のそ れと同一であった。

体内の様々な部位における移植細胞のヒト成長ホルモン産生能力の相違には、種 々の因子が関与している。移植部位が多いことは、生きるための栄養物の細胞へ の供給によって細胞の生存性と循環系に取り込まれるヒト成長ホルモンの量の両 者に影響を及ぼし得る。

細胞が受ける静水圧も育成膜下の移植−一細胞、例えば、おそらく腹腔内よりも 有意に高い静水圧下にある、の機能化に影響を及ぼしたであろう。細胞は幾つか の部位によりよく付着し、最終的には免疫系細胞による相対的な監視によってヒ ト成長ホルモンの量が左右されたであろう。

実施例５　移植細胞の状態 上記のごとく、プラスミドｐＸＧＨ５はマウスのメタロチオネイン−Ｉプロモー ターを含有している。移植細胞がそれらの局所環境に応答するのに十分な程度に 健常であるか否を決定するために、高レベルのヒト成長ホルモンの発現を誘導す る亜鉛の能力を調べた。

７５表平、’２−５０３２６５　（１９）実施例ＩＢ記載のごとくにして調製し た、安定なトランスフェクト細胞をマウス（その内、数匹は７６ｍＭ　Ｚｎ５Ｏ −を飲料水から摂取）の腹腔内に移植した。亜鉛処理動物の血清中には、未処理 動物と比較してヒト成長ホルモンが１０倍多く発現された。この実験の結果を第 ４図に示す。この誘導はメタロチオネイン融合遺伝子に関して以前に報告された 結果に匹敵しておりしシールら（Ｓ　ｅａｒｌｅ、　Ｐ、　Ｆ、）、１７９（１ ９８６）］、細胞が腹腔内環境にも応答し得ることを示すものであった。また、 被膜下移植物から回収した細胞から調製したＲＮＡは正しく、ｍＭＴ−Ｉ／ヒト 成長ホルモン融合１ＲＮＡを含有していた（第５図）。これらの実験は総合的に 、移植細胞が健常であって予測した行動をとることを強く示唆している。実質的 に重要な点は、一度動物に移植された細胞を外的手段でなおも変調（モデュレー ト）シ得るという事実である。この結果は、臨床面で所望の遺伝子産物またはエ フェクター産物の発現を薬学的な作用を介して変調し得ることを強く示唆してい る。

受容対象の血清中にヒト成長ホルモンが検出されれば、常にトランスフェクトさ れた細胞の存在を検出できる。例えば、移植後１〜７日間、育成膜下にヒト成長 ホルモン産生細胞が観察された（肉眼または光学顕微鏡による）。血清中のヒト 成長ホルモンが消失した時点で、移植細胞は検出されなくなった。ヒト成長ホル モンが一度血清から消失すると、移植細胞が再び検出されることはなかった。

しかも、ヒト成長ホルモンを発現している（トランス力リオチック移植により） マウスから被膜下移植にかかる腎臓を摘出すると、腎摘出後数時間以内にそのよ うな発現の痕跡がすべて消失した。トランスフェクト細胞は腹腔内および皮下の 移植部位に止まっているようであった。これらの知見はヒト成長ホルモンの発現 の停止が移植細胞の分解によることを示唆している。

実施例６　トランス力リオチック移植における免疫系の役割ヒト成長ホルモンの 血清中濃度は腹腔内移植後７〜１５日の間に厳格な低下を示したことから、この 消失期は免疫系に仲介されていると思われた。トランスカリオチック移植におけ る免疫系の役割の研究の第１段階として、あらかじめ安定なトランスフェクト細 胞を腹腔内移植された６匹のＣ３Ｈマウス（実施例２記載の１０匹のマウスから 得た）を、安定なトランスフェクト細胞に再挑戦させた。

新しいトランスフェクト細胞への第１回の暴露に際して、これらのマウスでのヒ ト成長ホルモン発現パターンは１５日間持続した（第６図、実線）が第２回目の 挑戦の後には、７日間でヒト成長ホルモンがようやく検出できる程になり、９白 目までに存在しなくなった（第６図、破線）。再挑戦マウスの血清中ヒト成長ホ ルモン濃度にも順応期が存在しなかった。これらの結果はトランスフェクト細胞 に対する宿主マウスのアナメスティック（ａｎａｍｅｓｔ　ｉｃ）な応答と一致 していた。元々、トランスフェクト細胞はＣ３Ｈマウスから導かれているが、細 胞またはマウスのいずれかが元の細胞系統から樹立された後、はぼ４個のデケー ドのコース中に何等かの遺伝的変化を受け、その結果、もはや完全に相互にシン ジェネイックでな（なったと思われる。平明なアロゲネイソク（異種型）マウス （Ｃ５７ＢＬ／６；非適合性に基づいて決定した結果、Ｈ−２と非Ｈ−２の両者 を表す）をトランスフェクト細胞の腹腔内移植に付すと、それらのヒト成長ホル モン発現パターンは再挑戦したＣ３Ｈマウスの発現パターンと似通っていた（第 ７図、実線）。第２回目の挑戦の４日後、アロゲネイック受容体にはヒト成長ホ ルモンが検出されなかった（第７図、破線）。これらの実験は、腹腔内移植後の ヒト成長ホルモン発現の停止が主として宿主の免疫系による細胞の死に起因する ことを示唆トランスフェクトされた細胞が移植拒否反応によって破壊されるのな らば、免疫抑制によって移植物の機能的寿命が延長されるはずである。この仮説 を試験するために、安定なトランスフェクト細胞のトランスカリオチック移植物 を移植されたマウスを３種の異なる免疫抑制法で処した：家兎抗マウス胸腺細胞 血清［バルドムスら（Ｂａｌｄａｓｕｓ、ｃ、Ａ、）、Ｉ　＋ｕ＋ｕｎｏ１．、 上↓Ｏ：　１５３２〜１５４１（１９ヒト成長ホルモンを発現するトランスフェ クト細胞を腹腔内移植した後、免疫抑制処理し、血清中ヒト成長ホルモンを監視 した。抗マウス胸腺細胞血清を投与されたマウス（移植臼に関して、−１、ｌ、 ０、＋１、および＋３日に、マウスあたり０．２５１１＜１重日を投与）は、高 い血清中ヒト成長ホルモン濃度を示し、非処理マウスに比べて約２週間長くヒト 成長ホルモンを発現した（表Ｉ）。デキサメサゾン処理マウスも高められ、延長 された発現を示し、移植後４８日まで血清中にヒト成長ホルモンが検出された。

ｉｌ：ＩＰ細胞に対する免疫抑制の影響移植後の　　　　　非免疫　　　　　　 　　抗−リンノく　　　　　デキサメサ゛／ン一旦麩−−−−−−−初暉ｊ　　 　　　　　　　　Ｉ勾叫生−一一一一一一一一一□１　　　７４．１＋／−３， ８８９，７＋／−１８，６９４，８÷／−９，２２３１，５＋／−５，４８６， ６＋／−１０，５３８４，７＋／−２０，４ ４８０，０＋／−１１，４５４，３＋／−１４，２５１７３、１−／−３４，６ ７１０７，５＋／−２１，６１６０，８＋／−７５，４８〜１０　　　２４．３ ＋／−２，１３８，３＋／−５，４９９，３＋／−４８，Ｏ１２〜１３　　　　 ７．４＋／−２，１２８，３＋／−５，６３２，０＋／−１５，１１５〜ｌｙ　 　　　　１．５＋／−０，７２８，８＋／−７，５２８，３＋／−１８，１２１ −−−１３，９＋／−３，７２８，０＋／−１３，６２７−−−１０，４＋／− ６，６１３，９＋／−６，９抗マウス胸腺細胞血清とデキサメサゾンによる２重 の免疫抑制を受けているマウスへの投与は上記のごとくにして行われた。これら のマウスは３力月にわたってヒト成長ホルモンを発現した（表■）。

このグループのほぼ２０％で、ヒト成長ホルモン濃度は約５００ｍｇ／ＷＱに達 した。長期間に及ぶそのような高レベルの血清中ヒト成長ホルモンは、しばしば 腎摘出術を受けたマウスにとって致死的であることが分かっており、多くの腹腔 表面に広範囲に分布し新組織のプラークを形成している多数のトランスフェクト 細胞の集合を発見した。腹水中にも生存細胞が浮遊していることが見い出された 。

トランスフェクトされていない線維芽細胞を注射した対照Ｃ３Ｈマウスの約２０ ％も同様の細胞増殖を示したことから、これらのマウスの究極の死因は腹腔内移 植後の増加ではなかった。しかしながら、対照マウスは移植後１００日間生存し た。従って、トランス力リオチック移植を受けたマウスの死亡は、極端に高い血 清中成長ホルモン濃度に帰された。

人１：２重免疫抑制の影響 移植後ノ日数　　腹腔内ＡＬＳ＋ＤＥＸ　　　被膜下ＡＬＳ＋ＤＥＸ１　　　　 　　　９．４＋／−２，９２５，８＋／−４，５２２，９＋／−０，８１１，４ ＋／−１．６４　　　　　　　５．８＋／−１，７１７，５”／−２，２７７， ５＋／−３，６１９，４＋／−２，４１０９，６＋／＝　　　３．９　　　５３ ．４＋／−１６，２１３４３，７＋／−１９，３２６，２＋／−７．２１６　　 　　　　２２．０＋／−８，５７，５＋／−２，１２１１８，３＋／−７，５６ ，１＋／−１，７２８１４，１＋／−５，９１２，２＋／−６，５３５１３，１ ＋／−６，９９，２＋／−２，８４２９，７＋／−４，９９，７＋／−５，０５ ０１２，２＋／−６，４７，４＋／−４，６５８８，６＋／−４，１２，７＋／ −１，８６６１４４，２＋／−８４，４４，０＋／−２，６７３１３２，２＋／ −１０５，８３，７＋／−２，４８０３１，７＋／−２４，０３，Ｏ＋／−２， ４８７１６，９＋／−１３，８４，０＋／−３，３９４１４，０＋／−１１，５ ６，２＋／−４，３実施例８　免疫抑制マウスにおける被膜下移植物の生存免疫 抑制によって、被膜下移植物のトランスフェクト細胞にょるヒト成長ホルモンの 発現が延長されるか否かを決定するために、胃液膜下にそのような移植物を移植 されたマウスを、ラットの抗マウス胸腺細胞血清とデキサメサゾンの併用により 処理し、ヒト成長ホルモンの発現レベルを監視した。移植後的１０８目に血清中 ヒト成長ホルモン濃度はピークに達し、続く６日間で下降した後、２力月間以上 、濃度的５−１０　ｍｇ／ｘＱを維持した。腹腔内または被膜下細胞移植の１週 間後にこれらのマウスにデキサメサゾンを投与したが、それはデキサメサゾン投 与中止の数週間後まで移植物を生存させた。

最終的な細胞の破壊は移植後すぐに起きたデキサメサゾン感受性事象と関連して いた可能性がある。Ｃ３Ｈ細胞をデキサメサゾン単独による継続処理に付すと、 トランスフェクト細胞は最終的に破壊されたので、破壊に関与しているのはこの 事象のみではなかった。

実施例９　トランスカリオチソク移植によるヒトインシニリンの生産 マウスＬｔｋ−細胞をチミジンキナーゼ遺伝子とヒトプレプロインニリンメソセ ンジャーＲＮＡを発現するように設計された融合遺伝子でトランスフェクトした 。そのような融合遺伝子でトランスフェクトされるとマウスＬｔｋ−細胞は構成 的にプロインシュリンを分泌するが、成熟インシュリンを産生ずることはできな い。幾つかのヒトインシュリン融合遺伝子、合成ヒトインシニリンメッセンジャ ーＲＮＡを含有し、ヒトプロインシュリンを分泌する一個のクローナルライン（ クローン細胞系統）（Ｌ　ｔｋ−Ｉ　ｎｓ）を選択し以後の分析に用いた。

免疫抑制の必要性を打開するためにヌードマウスをＬｔｋ−Ｉｎｓｎｓ細胞容体 として用いた。１０匹の各マウスの腹腔内に約１０７の細胞を注射し、血清試料 を（２時間の絶食の後）−週間に２〜３回採取した（第８図）。移植の約−週間 後、血清中のグルコース濃度は移植前の値（１６０’ｘｇ％＋／−標準誤差１０ ｍｇ％）に止まった。第１週および第２週の間にグルコース濃度の急速な減少が 認められ（７７Ｈｇ％＋／　−４ｍｇ％）濃度は実験の持続中、低いままであっ た。このグルコース濃度の低下と並行して総インシュリン濃度は移植前の約１７ ｕｌＵ／ｘＱから約６０ｕＩＵ／ｗＱに上昇した。総インシュリン分析のプロイ ンシュリンとの交差反応性は２０％にすぎないので、これらの動物における実際 のプロインシュリン濃度はこれらの測定に反映された濃度よりもかなり高いであ ろう。これらの結果はトランスカリオチック移植を、マウスにおける機能的なイ ンシュリン遺伝子の伝達および血糖値の低下に使用できることを示している。

実施例１０　糖尿病の治療へのトランス力リオチック移植の利用糖尿病治療への トランス力リオチック移植適用の可能性のモデル実験を糖尿病マウスにＬｔｋ− １ｎｓ細胞を腹腔内注射して行った。化学的な糖尿病動物を得るために、Ｃ３Ｈ マウスをストレプトシトシン（８ｘｇ／マウス）で処理し、（２時間給食）血清 中グルコース濃度を約１０および１５日後に測定した。この研究の目的から、空 腹時の血清グルコース濃度が４００ｍｇ％またはそれ以上であればそのマウスは 糖尿病と判断し、そのようなマウス１０匹にＬ　ｔｋ−１ｎｓ細胞を腹腔内注入 した。家兎抗マウス胸腺細胞血清およびデキサメサゾンを用いてマウスを免疫抑 制した。移植後１週間以内に、５匹のマウスに劇的な血糖値の低下が認められた （第９図、実線）。移植後２週間までにこれらの糖尿病マウスは正常の血糖値を 回復した。残る５匹のマウスは、一過性の血糖値の低下を示すか、全く低下を示 さないかのいずれかであり、免疫抑制が必ずしも個々のマウスに等しく有効とは 限らないことを示唆していた（データは記載されていない）。

糖尿病マウス対照は血糖値の低下を示さなかった（第９図、破線）。

５匹の反応した動物群で血糖値は低下し続け、最終的にはこれらの糖尿病マウス はトランスカリオチック移植で誘導された低血糖症によって死亡した。

幾つかの疾患は糖尿病よりも扱い易いことが分がっており、糖尿病の遺伝子治療 の処方を検索することにより、供給されたタンパク質を厳密に刻々（分−分）調 節することが必須でないような症状の治療法が得られる。例えば、血友病は、遺 伝子工学的に操作された細胞によって欠損された凝血因子を供給することで治療 し得る。恐らく、因子の濃度範囲およびそれを産生ずるために用いる細胞のタイ プは糖尿病治療における場合程厳格ではない。

実施例１１　ポリクローナル抗体の取得のためのトランスヵリオチック移植の使 用 ヒト成長ホルモンに対する抗体は以下のようにして製造された。

セルデンら［５ｅｌｄｅｎ、　Ｒ，、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、＋　６ 　：　３１７３〜３１７９（１９８６）コのＤＥＡＥ−デキストラントランスフ ェクシジン法により約２Ｘ１０’のマウスＬｔｋ−細胞をｐＸＧＨ５で一時的に トランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、細胞を洗浄し、トリプ シン処理し、Ｃ３Ｈマウスの腹腔に移植した。この処理を２週間後に繰り返し、 動物から毎週採血してＥＬＩ　ＳＡ用の試料を得た。

実験前にはマウスは検出可能なヒト成長ホルモンに対する抗体を含有していなか った。一時的トランスフェクト細胞投与後２週間以内に５匹のマウスについて抗 −ｈＧＨ力価（ＥＬＩＳＡにより）の平均値は１６００に達した。最初の注射か ら１５日経過後、動物に一時トランスフエクト細胞の第２投与を与え、その２週 間後（即ち、最初の注射から２７日後）には平均力価は３８．　ＯＯＯであった 。５匹のマウス全部が抗ｈＧＨ抗体を産生じ、個々の力価は１２，８００から１ ０２．４００に達した。動物を追加の細胞処理に付さなければ、抗ｈＧＨ抗体の 力価は徐々に低下し、最初の注射後６８日目までに力価は約４．ＯＯＱであるこ とが認められた。

上記のプロトコールの幾つかの変法も成功裏に用い得る。例えば、安定なトラン スフェクト細胞を（一時的トランスフェクト細胞の代わりに）用いることができ る。トランスフェクトされたＬｔｋ−細胞はマウス、モルモット、およびウサギ における抗体産生に用いられた。

ヒト成長ホルモン、ヒト成長ホルモン変異体、インシュリンについての抗体も産 生され、プロインシュリン細胞、例えばＡＬＴ−２０細胞を別法として用いるこ ともできる。

実施例１２　トランス力リオチック移植におけるＡＬＴ−２０細胞の使用 ＡＬＴ−２０細胞系統はＬＡＦ　１マウスの自発性腫瘍から導かれ、十分に特性 化された脳下垂体細胞系統である。これらの細胞をＸＧＨ５（ｍＭＴ−１／ｈＧ Ｈ融合遺伝子を含有するプラスミド）およびｐＫＯＮＥＯ（薬物Ｇ４１８に対す る耐性をコードしている遺伝子を含有するプラスミド）でトランスフェクトした 。安定にトランスフェクトされた細胞のクローナルライン、（ＡＬＴ−２０（ｎ ｅｏ＋）Ｆ　６と命名）を以後の分析のために選択した。この細胞系統は有意量 のｈＧＨを発現し、この細胞はその分泌手段を保持しているので、ｈＧＨの約２ ／３が分泌され、残る１／３は分泌顆粒中に残存保持された。

ＬＡＦＩマウスの腹腔に約５Ｘ１０＠細胞を注射し、血清ｈＧＨ濃度の測定のた めにこれらのマウスから移植後はぼ１週間隔で採血した。移植後最初の数日間、 血清中ｈＧＨ濃度はかなり低かった（１−３ｎｇ／ｘの。続く１力月間、これら の濃度は徐々に上昇し、約Ｉｏｎｇ／ｚＱに達した。

ＡＬＴ−２０（ｎｅｏ＋）Ｆ６細胞を用いるｈＧＨ発現のパターンはＬｔｋ＋Ｇ Ｈ細胞（実施例１１）を用いた場合のそれと全く異なっていることは注目に値す る。この相異を臨床面で有利に利用することができる：ａ、細胞型が異なると性 質も異なる。例えば、ＡＬＴ−２０細胞は環状ＡＭＰ類似体に反応し７てｈＧＨ を分泌する。ｂ、細胞型が異なるとトランス力リオチック動物内での行動が異な る、即ち、タイムコース、レベル、発現の寿命（長さ）が異なる。

安定的にヒトインシュリンを発現しているＡＬＴ−２０細胞を用いて同様の研究 を行った。ｐＨＩＮＴ５（マウスメタロチオネイン−Ｉ／ヒトインシコリン融合 遺伝子）を含有する安定なトランスフェクト細胞のクローナルラインを調製した 。ＡＬＴ　−２０（ｎｅｏ十）　１０ａと命名されたこの細胞系統は適切にプロ セッシングされたインシュリンを培地に分泌した（ｐＨＩＮＴ５分泌プロインシ ュリンでトランスフェクトされたし細胞と対照的に）。ヌードマウスの腹腔に移 植すると、血糖値はｐＨＩＮＴ５含有し細胞と殆んど同様に減少し、血清中ヒト インシュリン濃度の増加が認められた。

実施例１３　トランスフェクト細胞調製物の使用による領域特異的ポリクローナ ル抗体の生産 タンパク質分子のアミノ末端フラグメントを発現するトランスフェクト細胞を上 記のごとくにして調製し、受容対象に移植した。受容対象には免疫抑制剤を投与 しなかった。トランスフェクト細胞はタンパク質のアミノ末端フラグメントを発 現した。受容対象内にこのフラグメントが存在することで対象内の非トランスフ ェクト細胞による発現したアミン末端タンパクフラグメントに対するポリクロー ナル抗体の産生を誘発することができる。このようなポリクローナル抗体は領域 特異的である（即ち、発現されたアミノ末端フラグメント上に存在するエピトー プとのみ結合し得る）。

上記と同じタンパク質分子のカルボキシ末端フラグメントをコードしている遺伝 子フラグメントを単離し、タンパク質分子のカルボキシ末端フラグメントの生産 に用いる。この細胞を用いて調製物を調製し、受容対象に移植する。トランスフ ェクトされた細胞によるカルボキシ末端フラグメントの発現により受容対象のト ランスフェクトされていない細胞による、発現されたタンパク質分子のカルボキ シ末端フラグメント上に存在するエピトープと特異的に結合し得ルポリクローナ ル抗体の産生が誘導される。これらのポリクローナル抗体は領域特異的である。

実施例１４　ポリクローナルイムノアッセイ実施例１２記載の領域特異的ポリク ローナル抗体を様々に異なるイムノアッセイに用いることができる。例えば、タ ンパク質分子のアミノ末端フラグメントを認識し得るポリクローナル抗体を固体 支持体に結合させることができる。実施例１２のタンパク質分子を含有する可能 性のある試料を、試料中の任意のタンパク質がポリクローナル抗体と結合するの に十分な時間、固体支持体と一緒にインキュベートする。タンパク質分子のカル ボキシ末端を認識し得る実施例１２記載のポリクローナル抗体を検出可能に標識 し、固体支持体と試料の存在下でインキュベートする。カルボキシ末端特異的ポ リクローナル抗体が存在する任意のタンパク質分子（試料中に遊離した、または 固体支持体と結合した）に結合するのに十分な時間の後、固体支持体に結合した 検出可能の標識されたポリクローナル抗体の量を測定する。結合したカルボキシ 末端特異的ポリクローナル抗体は試料中のタンパク質濃度と正比例する。

当業者にとっては自明のことであるが、上記の領域特異的ポリクローナル抗体を 広範囲に及ぶイムノアッセイに使用することができく即ち、ホモジーニアス、ヘ テロジーニアス等々）、本発明はそのような使用をも包含することを意図してい る。一般に、本発明のポリクローナル抗体は既存のモノクローナル抗体イムノア ッセイに適用することができる。

実施例１−４のいずれかに記載の方法で特定の遺伝子産物を発現するトランスカ リオチノク細胞を製造し、受容体動物に導入する。

受容体動物内の発現された所望の遺伝子産物の存在はこれらの発現された所望の 遺伝子産物と結合し得る抗体を産生ずる、抗体産生細胞の発現および増殖を刺激 する。受容体動物の膵細胞を得、当業者既知の方法［例えば、ゲルハードらの方 法（Ｇｅｒｈａｒｄ、　　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉ龍ｕｎｏ１．＋　　５　：　７２ ０−７２５（１９７５））参照コにより培養する。次いで、コブロフスキーら（ 米国特許Ｎｏ、４，１７２，１２４）またはコーラ−［Ｋｏｈｌｅｒ、Ｎａｔｕ ｒｅ、２５６：４９５　４９７（１９７５）］の方法に従って摘出した膵細胞を 骨髄腫細胞と融合させ、所望の遺伝子産物と結合し得るモノクローナル抗体を産 生じ得るハイブリドーマ細胞を製造する。

上記のハイブリドーマ細胞の製造方法は抗原分子を必要とする動物の免疫法に比 較して、実質上、幾つかの利点を有する。上記の新規な方法は抗原分子の最初の 精製を必要としないので、かかる精製が実際的でない場面でもそれを用いること ができる。

上記の方法は所望のモノクローナル抗体を産生ずる得られたハイブリドーマ細胞 のスクリーニングを容易にするために用いることができる。従来のハイブリドー マ技術では生産したハイブリドーマ細胞をスクリーニングして所望のエピトープ に対する抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を同定しなければならない。本発明 によれば、抗原遺伝子のフラグメントのみを含有する（従って、抗原遺伝子のフ ラグメントのみを産生じ得る）トランスカリオチック細胞を導入することで、回 避することができる。トランス力リオチック細胞によって発現されるべき遺伝子 フラグメントを予め選択することによリハイブリドーマ集団の多様化を制限する ことが可能である。

実施例１６　免疫抑制物質の同定のためのトランスカリオチック移植の使用 トランスカリオチック移植実験において移植された細胞と宿主動物がシンジェニ ックでない場合には免疫能（免疫コンビ−テント）宿主細胞は移植された細胞の 拒否反応を起こすであろう。この拒否反応は、移植された細胞の産物、好ましく はｈＧＨの分析により監視することができる。しかしながら、トランス力リオチ ック動物が免疫を抑制されている場合には、免疫抑制療法に依存して拒否反応は 遅延、または阻止される。換言すると、血清中ｈＧＨ発現の濃度と長さを監視す ることにより、免疫抑制療法を定量的に評価することができる。この方法を用い てシクロスポリン、シクロホスファミド、デキサメサトン、家兎抗マウス胸腺細 胞抗血清、および抗マウス胸腺細胞モノクローナル抗体等の幾つかの免疫抑制剤 を研究した。この方法は平易かつ定量的な、現行の免疫抑制評価法の別法である 。

本明細書では、本発明の特定の態様について記載したが、本発明はさらに改変す ることができ、また本出願は一般に、発明の基本思想に従っており、また以下に 示す本願の特許請求の範囲に含まれる前記の基本的な特徴の応用であり、発明の 関与する技術分野において既知または通常の実施とされる範囲内での本願の開示 内容の発展を含む、任意の変異、使用、または適用をも包含することを意図して いることは理解されるであろう。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．所望の遺伝子配列を含有する少なくとも１つのトランスフェクト細胞を含有 するトランスフェクト細胞調製物を受容対象に供給することを特徴とする該所望 の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させる方法であって、該細胞が該受容対象 に供給された場合に該所望の遺伝子配列の発現を指令し、それにより所望の遺伝 子産物が産生されるものである方法。 ２．エフェクター遺伝子配列を含有する少なくとも１つのトランスフェクト細胞 を含有するトランスフェクト細胞調製物を受容対象に供給することを特徴とする 所望の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させる方法であって、該細胞が該受容 対象に供給された場合に該エフェクター遺伝子配列の発現を指令し、それにより 所望の遺伝子産物が産生されるものである方法。 ３．該所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列が構成的なプロモーター 領域と機能的に結合している請求項１または請求項２に記載の方法。 ４．該所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列が調節可能なプロモータ ー領域と操作可能に結合している請求項１または請求項２に記載の方法。 ５．該トランスフェクト細胞が元々、受容対象と同一の種の動物から得られたも のである請求項１または請求項２に記載の方法。 ６．該トランスフェクト細胞が元々、該受容対象から得られたものである請求項 １または請求項２に記載の方法。 ７．該所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列の発現により、これまで 該対象から発現されたことのない遺伝子産物が該対象に供給されるものである請 求項１または請求項２に記載の方法。 ８．発現された所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列が該受容対象本 来の遺伝子と等価である請求項７に記載の方法。 ９．該受容対象内での該所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列の発現 により該対象から通常発現される遺伝子の発現レベルが増大されるものである請 求項１または請求項２に記載の方法。 １０．該所望の遺伝子配列の該発現が該受容対象の遺伝子発現の欠損を補償する ものである請求項９に記載の方法。 １１．該受容対象内での該所望の遺伝子配列の発現により該対象から通常発現さ れる遺伝子の発現レベルが減少されるものである請求項１または請求項２に記載 の方法。 １２．該所望の遺伝子配列の該発現が該受容対象の過剰の遺伝子発現を補償する ものである請求項１１記載の方法。 １３．該所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列の該発現が生理学的に 意義のある請求項１または請求項２に記載の方法。 １４．該トランスフェクト細胞調製物を、被膜下移植、皮内移植、腹腔内移植、 頭蓋内移植、肝臓内移植、腹膜後移植、筋肉内移植、肺内移植、眼内移植、睾丸 内移植、または内蔵内移植からなる群がら選択される手段によって該対象に供給 する請求項１または請求項２に記載の方法。 １５．該トランスフェクト細胞調製物を該受容対象に被膜下移植によって供給す る請求項１４に記載の方法。 １６．該トランスフェクト細胞調製物を該受容対象に皮内移植によって供給する 請求項１４に記載の方法。 １７．該受容対象が遺伝子疾患に罹患しており、該トランスフェクト細胞の供給 が該遺伝子疾患の治療を構成するものである請求項１または請求項２に記載の方 法。 １８．該受容対象が非遺伝子疾患に罹患しており、該トランスフェクト細胞の供 給が該非遺伝子疾患の治療を構成するものである請求項１または請求項２に記載 の方法。 １９．所望の遺伝子配列を含有する少なくとも１つのトランスフェクト細胞を含 有するトランスフェクト細胞調製物の有効量を受容対象に供給することを特徴と する生物学的化合物の産生を誘導する方法であって、該細胞が該受容対象に供給 された場合に該所望の遺伝子配列の発現を指令し、それにより所望の遺伝子産物 （１）が産生されるものであり、該所望の遺伝子配列の発現が受容対象に該生物 学的化合物を産生させるに十分なものである方法。 ２０．該生物学的分子が該所望の遺伝子産物と結合し得るものである請求項１９ に記載の方法。 ２１．該所望の遺伝子産物が抗原であり、該生物学的化合物が抗体である請求項 ２０に記載の方法。 ２２．該所望の遺伝子産物が完全な遺伝子産物のフラグメントであり、該生物学 的化合物が該完全な遺伝子産物の領域一特異的抗体である請求項２０に記載の方 法。 ２３．試料中の所望の遺伝子産物（ＩＩ）の濃度を測定する方法であって： （ａ）請求項１９に記載の方法によってその産生が誘導される、該所望の遺伝子 産物（ＩＩ）と結合し得る生物学的化合物の存在下に該試料をインキュベートし 、 （ｂ）該所望の遺伝子産物（ｎ）と結合した該生物学的化合物の量を測定するこ とにより、該所望の遺伝子産物（ＩＩ）の濃度を測定することを特徴とする方法 。 ２４．該遺伝子産物（Ｉ）および該遺伝子産物（ＩＩ）が同一であり、該生物学 的化合物が抗体である請求項２３に記載の方法。 ２５．該遺伝子産物（Ｉ）が該遺伝子産物（ＩＩ）のフラグメントであり、該生 物学的化合物が該遺伝子産物（ＩＩ）の領域−特異的抗体である請求項２３記載 の方法。 ２６．試料中の所望の遺伝子産物（ＩＩ）の濃度を測定する方法であって： （ａ）該所望の遺伝子産物（ＩＩ）と結合し得る２つの異なる生物学的化合物で あって、その少なくとも１つの産生が請求項１９に記載の方法によって誘導され るものである該２つの生物学的化合物の存在下に該試料をインキュベートし、 （ｂ）該所望の遺伝子産物（ＩＩ）と結合した該生物学的化合物の量を測定する ことにより、該所望の遺伝子産物（ＩＩ）の濃度を測定することを特徴とする方 法。 ２７．該遺伝子産物（Ｉ）および該遺伝子産物（ＩＩ）が同一であり、該生物学 的化合物の少なくとも１つが抗体である請求項２６に記載の方法。 ２８．該遺伝子産物（Ｉ）が該遺伝子産物（ＩＩ）のフラグメントであり、該生 物学的化合物の少なくとも１つが該遺伝子産物（ＩＩ）に関する領域−特異的抗 体である請求項２７に記載の方法。 ２９．請求項２１に記載の方法によって生産される抗体。 ３０．請求項２２に記載の方法によって生産される領域一特異的抗体。 ３１．免疫抑制活性を有すると予測される物質を評価する方法であって； （ａ）抗原を発現するトランスフェクト細胞調製物を受容対象に導入し、 （ｂ）評価すべき該物質を該受容対象に投与し、そして（ｃ）該物質の投与が、 受容対象の、該抗原と結合し得る抗体の産生能力に影響を及ぼすか否かを測定す ることを特徴とする方法。 ３２．モノクローナル抗体を生産する方法であって；（ａ）請求項２１または請 求項２２に記載の方法によって抗体の産生を誘導し、 （ｂ）該受容対象から該抗体を産生し得る細胞を取り出し、（ｃ）該抗体を産生 する、該細胞（ｂ）と不滅化骨髄種細胞とのハイプリドーマを形成することを特 徴とする方法。 ３３．トランスフェクト細胞からなる移植物。 ３４．被膜下移植物である請求項３３に記載の移植物。 ３５．腹腔内移植物である請求項３４に記載の移植物。