JPH11500907A - 膵島新生に関与するｉｎｇａｐタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ハムスター膵臓のセロファン包装は、管上皮細胞および引き続く内分泌細胞分化および島細胞の新生（ネオジェネシス）を誘導する。ｍＲＮＡの分別表示（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いて、セロファン包装中で発現したがコントロールの膵臓では発現しなかったｃＤＮＡクローンを同定した。このｃＤＮＡをプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、文献に記載されていない遺伝子を突き止め、ＩＮＧＡＰと命名した。

Description

【発明の詳細な説明】 膵島新生に関与するＩＮＧＡＰタンパク質発明の背景 ランゲルハンスの膵島は、体内でインスリンを産生する唯一の器官である。し かしながら、それらは、限られた再生能力しか有さない。この限られた再生能力 が、哺乳動物に真正糖尿病を発病させ易くしている。かくして、内分泌学の分野 において、真正糖尿病の症状を予防又は改善するために、ランゲルハンス島の再 生を刺激できる物質についての必要性が存在する。 膵島細胞再生の１つのモデルは、シリアンゴールデンハムスターの膵臓をセロ ハンで包むことを包含する（１）。膵臓をセロハンで包むと、上皮管から起こる と考えられる新たな内分泌細胞の形成が誘発される（２〜４）。当該技術分野で は膵島細胞再生を司る因子を同定及び単離する必要性が存在する。発明の要旨 本発明の目的は、膵島細胞新生に関与する哺乳動物タンパク質又はそのポリペ プチド部分の調製物を提供することである。 本発明の他の目的は、膵島細胞新生に関与する哺乳動物タンパク質をコードす るＤＮＡ分子を提供することである。 本発明の更なる他の目的は、哺乳動物ＩＮＧＡＰ（膵島新生関連タンパク質） タンパク質の調製物を提供することである。 本発明の更なる他の目的は、膵島細胞新生に関与する哺乳動物遺伝子を検出す るためのヌクレオチドプローブを提供することである。 本発明の目的は、哺乳動物からのＩＮＧＡＰ遺伝子を単離する方法を提供する ことである。 本発明の他の目的は、ＩＮＧＡＰタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体 調製物を提供することてある。 本発明の更なる他の目的は、ＩＮＧＡＰタンパク質を製造する方法を提供する ことである。 本発明の目的は、真正糖尿病を治療する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、膵島細胞を培養で増殖させる方法を提供することである 。 本発明の更なる他の目的は、ポリカーボン殻内に被包された膵島細胞の寿命を 伸ばす方法を提供することである。 本発明の目的は、哺乳動物における膵島細胞の数を増加させる方法を提供する ことである。 本発明の目的は、トランスジェニック哺乳動物を提供することである。 本発明の他の目的は、遺伝子操作された哺乳動物を提供することである。 本発明の更なる他の目的は、糖尿病の危険のある個々の哺乳動物を同定する方 法を提供することである。 本発明の目的は、哺乳動物からのサンプル中のＩＮＧＡＰタンパク質を検出す る方法を提供することである。 本発明の更なる他の目的は、単離した膵島細胞が細胞自滅を回避できるように 処置する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、膵島細胞移植を受けている哺乳動物を処置する方法を提 供することである。 本発明の目的は、β始原細胞の分化を誘発する方法を提供することである。 本発明の目的は、β始原細胞を同定する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、膵臓内分泌不全症を患っている哺乳動物を治療する方法 を提供することである。 本発明の目的は、ＩＮＧＡＰの発現を調節するためのアンチセンス構築体を提 供することである。 本発明の更なる他の目的は、膵島細胞症を治療する方法を提供することである 。 本発明の更なる他の目的は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を検出するキット を提供することである。 本発明の目的は、膵臓不全症の治療のための医薬組成物を提供することである 。 本発明のこれら及び他の目的が、以下に記載する１又はそれを越える態様によ り与えられる。 １つの態様においては、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物が提供される 。この調製物は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない。 他の態様においては、単離したＤＮＡ分子が提供される。このＤＮＡ分子は、 哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質をコードする。 本発明の更なる他の態様においては、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物 が提供される。この調製物は、 セロハンで包むことにより哺乳動物膵臓細胞を誘発してＩＮＧＡＰタンパク質 を発現させ；そして 前記ＩＮＧＡＰタンパク質を前記誘発哺乳動物膵臓細胞から精製する 方法により作られる。 本発明の更なる他の態様においては、ヌクレオチドプローブが提供される。こ のプローブは、配列番号：１に示した配列の少なくとも２０の連続したヌクレオ チドを含む。 本発明の他の態様においては、哺乳動物のＩＮＧＡＰタンパク質の調製物が提 供される。この調製物は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない。ＩＮＧ ＡＰタンパク質は、哺乳動物の膵臓をセロハンで包むことで誘発可能である。 本発明の更なる他の態様においては、哺乳動物からＩＮＧＡＰ遺伝子を単離す る方法が提供される。この方法は、 配列番号：１に示した配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む１ 又はそれを越えるオリゴヌクレオチドを前記哺乳動物のゲノミックＤＮＡ又はｃ ＤＮＡにハイブリダイズさせ； 前記１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前記ゲノミ ックＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する ことを含む。 本発明の更なる他の態様においては、単離したｃＤＮＡ分子が提供される。こ のｃＤＮＡ分子は、 配列番号：１に示した配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む１ 又はそれを越えるオリゴヌクレオチドを前記哺乳動物のゲノミックＤＮＡ又はｃ ＤＮＡにハイブリダイズさせ； 前記１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前記ゲノミ ックＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する 方法により得られる。 本発明の他の態様においては、抗体が提供される。この抗体は、哺乳動物ＩＮ ＧＡＰタンパク質と特異的に免疫反応性である。 本発明の更なる他の態様によれば、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を製造する 方法が提供される。この方法は、 哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするｃＤＮＡで形質転換された宿主細 胞を準備し； 該宿主細胞を栄養培地中で培養して該ＩＮＧＡＰタンパク質を発現させ；そし て 該該宿主細胞又は該栄養培地から該ＩＮＧＡＰタンパク質を採取する 工程を含む。 本発明の更なる他の態様によれば、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を製造する 方法が提供される。この方法は、 配列番号：１に示した配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む１ 又はそれを越えるオリゴヌクレオチドを前記哺乳動物のゲノミックＤＮＡ又はｃ ＤＮＡにハイブリダイズさせ；前記１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドにハ イブリダイズする前記ゲノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する 方法により得られるＤＮＡ分子を含む宿主細胞を準備し； 該宿主細胞を栄養培地中で培養して該哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を発現さ せ；そして 該該宿主細胞又は該栄養培地から該哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を採取する 工程を含む。 本発明の他の態様によれば、糖尿病の哺乳動物を治療する方法が提供される。 この方法は、糖尿病の哺乳動物に治療有効量のＩＮＧＡＰタンパク質を投与して 膵島細胞の増殖を刺激することを含む。 本発明の他の態様によれば、膵島細胞を培養で増殖させる方法が提供される。 この方法は、 膵島細胞を増殖させるためにＩＮＧＡＰタンパク質を培地中に供給し；そして ＩＮＧＡＰタンパク質を含む前記培地中で膵島細胞を増殖させる ことを含む。 本発明の他の態様によれば、ポリカーボン殻内に被包された膵島細胞の寿命を 伸ばす方法が提供される。この方法は、被包された膵島細胞にＩＮＧＡＰタンパ ク質を、前記膵島細胞の生存率又は生存時間を伸ばすのに十分な量で加えること を含む。 本発明の他の態様によれば、哺乳動物における膵島細胞の数を増加させる方法 が提供される。この方法は、ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を哺 乳動物の膵臓に投与することを含む。 本発明の他の態様によれば、哺乳動物における膵島細胞の数を増加させる方法 が提供される。この方法は、ＩＮＧＡＰタンパク質を哺乳動物の膵臓に投与する ことを含む。 本発明の他の態様によれば、トランスジェニック哺乳動物が提供される。この 哺乳動物は、第２啼乳動物のＩＮＧＡＰ遺伝子を含む。 本発明の別の態様に従えば、非ヒト哺乳動物が提供される。哺乳動物は、該哺 乳動物のＩＮＧＡＰ遺伝子の挿入または欠失突然変異を含むように遺伝子工学的 に処理されている。 本発明の別の態様に従えば、糖尿病のリスクを有する個々の哺乳動物を同定す る方法が提供される。この方法は、個々の哺乳動物の試料のＩＮＧＡＰ遺伝子に おける突然変異を同定することを含み、該突然変異は該遺伝子によりコードされ るＩＮＧＡＰ蛋白質に構造的異常性を引き起こすか、または該ＩＮＧＡＰ遺伝子 発現の低下または抹消につながる調節欠陥を引き起こす。 本発明の別の態様に従えば、哺乳動物からの試料中のＩＮＧＡＰ蛋白質を検出 する方法が提供される。この方法は、該試料を哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白質に対し て特異的に免疫反応性である抗体調製物と接触させることを含む。 本発明の別の態様に従えば、哺乳動物の単離された膵島細胞を処置して該細胞 のアポプトシスを回避する方法が提供される。この方法は、単離された哺乳動物 の膵島細胞を、他の哺乳動物蛋白質から実質的に精製された、該単離された膵島 細胞の生存率を増加させるのに十分な量の哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白質の調製物と 接触させることを含む。 本発明の別の態様に従えば、膵島細胞の移植を受けた哺乳動物を処置する方法 が提供される。この方法は、哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白質の調製物を膵島細胞の移 植を受けた哺乳動物に投与することを含み、ここで該投与工程は、該移植の前、 間もしくは後に実施される。 本発明の別の態様に従えば、β細胞始原細胞の分化を誘導する方法が提供され る。この方法は、β細胞を含む膵管細胞の培養物を、他の哺乳動物蛋白質を実質 的に含まない哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白質の調製物と接触させて、該β細胞始原細 胞の分化を誘導させることを含む。 本発明のさらに別の態様においては、β細胞始原細胞を同定するための方法が 提供される。この方法は、膵管細胞の集団を哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白質と接触さ せ；そして該ＩＮＧＡＰ蛋白質が特異的に結合する細胞を該集団中から検出する ことを含む。 本発明の別の態様に従えば、膵臓内分泌不全を有する哺乳動物を処置する方法 が提供される。この方法は、膵臓内分泌不全に苦しむ哺乳動物から単離されたβ 細胞始原細胞を含む膵管細胞の調製物を、他の哺乳動物蛋白質を実質的に含まな い哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白質の調製物と接触させて、該β細胞始原細胞の分化を 誘導し；そして該処置された膵管細胞を該哺乳動物中に自家移植することを含む 。 本発明の別の態様に従えば、哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子のアンチセンス構築物 が提供される。この構築物は、プロモーター、ターミネーターおよび哺乳動物Ｉ ＮＧＡＰ遺伝子からなるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は該プロ モーターと該ターミネーターとの間にあり、該ヌクレオチド配列は該プロモータ ーに関して反転されており、このことにより該プロモーターからの発現の際に元 の哺乳動物ＩＮＧＡＰｍＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが生成される。 本発明の別の態様に従えば、膵島細胞症を処置する方法が提供される。この方 法は、膵島細胞症を有する哺乳動物に上述のアンチセンス構築物を投与すること を含み、このことにより該哺乳動物のβ細胞の過剰増殖が阻害される。 本発明の別の態様に従えば、哺乳動物からの試料中の哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白 質を検出するためのキットが提供される。このキットは、哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋 白質に対して特異的に免疫反応性である抗体調製物；および哺乳動物ＩＮＧＡＰ 蛋白質の少なくとも１５個の連続するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む 。 本発明の別の態様に従えば、膵臓機能不全を処置するための医薬組成物が提供 される。この組成物は、薬学的に許容しうる希釈剤または担体中の哺乳動物ＩＮ ＧＡＰ蛋白質を含む。 本発明の別の態様に従えば、医薬組成物が提供される。この組成物は、哺乳動 物ＩＮＧＡＰ蛋白質の少なくとも１５個の連続するアミノ酸の配列を含むポリペ プチドの調製物および薬学的に許容しうる希釈剤または担体を含む。 本発明のこれらのおよび他の態様は、膵島細胞新生を刺激または阻害する手段 を当該技術分野に提供する。真性糖尿病の発症の診断方法もまた本発明により提 供される。図面の簡単な記載 図１。ハムスターＩＮＧＡＰのヌクレオチド配列およびコードされる未成熟蛋 白質の推定配列。非コード配列は小文字で表され、ポリアデニル化シグナルには 下線が施されている。 図２。ＩＮＧＡＰ、ラットＰＡＰ−Ｉ（ＰＡＰ−Ｉ）（１８）、ヒトＰＡＰ／ ＨＩＰ（ＰＡＰ−Ｈ／ＨＩＰ）（１０、１１）、ラットＰＡＰ−ＩＩＩ（ＰＡＰ −ＩＩＩ）（９）、ラットＰＡＰ−ＩＩ（ＰＡＰ−ＩＩ）（８）、ラットＲｅｇ ／ＰＳＰ／リソスタチン(Ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎｅ)（ＲＥＧ／ＬＩＴＨ）（１ ３、１５）およびＤｒｉｃｋａｍｅｒによりＣ型レクチンのすべてのメンバーに 見いだされた不変モチーフ（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ）（１２）のアミノ酸配列の比 較。６個の保存的システインはアスタリスクにより示され、ＩＮＧＡＰ中の２個 の推定上のＮ−グリコシル化部位は下線および太字で示される。 図３。対照および包まれた（ｗｒａｐｐｅｄ）ハムスター膵臓からの膵臓組織 におけるＩＮＧＡＰおよびアミラーゼ遺伝子発現のノザンブロット分析。３０ｇ の熱変性させた全ＲＮＡを、１．２％アガロース、０．６％ホルムアルデヒド／ ＭＯＰＳ変性ゲル上で電気泳動することにより分離し、ナイロン膜に移した。膜 は、７４７ｂｐのハムスターＩＮＧＡＰｃＤＮＡプローブ（我々の研究室におい てクローニングした）（Ａ）、１０００ｂｐのラットアミラーゼｃＤＮＡプロー ブ（Ｃｈｒｉｓ Ｎｅｗｇａｒｄ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）により寛大に供 与された）（Ｂ）、およびＲＮＡの一体性および負荷の対照として１８Ｓリボソ ーム２４量体合成オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）とハイブリダイズさせた。好ましい態様の詳細な記載 我々はここで膵炎関連蛋白質（ＰＡＰ）ファミリーの遺伝子（７−１１）と著 しい相同性を示す遺伝子ＩＮＧＡＰの同定を報告する。推定される蛋白質は、Ｄ ｒｉｃｋａｍｅｒ（１２）により定義されたカルシウム依存性Ｃ型レクチンの炭 水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を共有する。ＩＮＧＡＰ蛋白質は膵島新生の刺激 、特に膵管細胞からのβ細胞再生において役割を果たす。 哺乳動物ＩＮＧＡＰのｃＤＮＡ配列は配列番号１で与えられる。推定アミノ酸 配列は配列番号２に示される。これらの配列はハムスターから単離された核酸か ら決定されたが、他の哺乳動物種は極めて類似したＩＮＧＡＰ遺伝子を有するで あろうと考えられる。ヒトＩＮＧＡＰｃＤＮＡは、配列番号１の２３−２６８お よび３８９−６０９の配列を共有しており、配列の中程に１５９ｂｐのギャップ を含む。ヒトＩＮＧＡＰ蛋白質の推定アミノ酸配列は配列番号２の１−８３およ び１２４−１７４であり、配列の中程に５３アミノ酸を含む。相同遺伝子は少な くとも約７０％の同一性を有するであろうと予測される。より近接した種は、少 なくとも約７５％、８０％、あるいは８５％もの同一性を有すると予測される。 これに対し、カルシウム依存性Ｃ型レクチンのファミリーの他のメンバーはＩＮ ＧＡＰと多くとも６０％の同一性を含む。 本明細書で提供するＤＮＡ配列を用いて、宿主細胞中で遺伝子を複製するベク ターを作製し、ＩＮＧＡＰタンパク質を発現することができる。配列番号２に示 すのと同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列も本発明の目的を逸脱すること なく使用できる。その他の哺乳動物ＩＮＧＡＰをコードするＤＮＡ配列も本発明 で意図している。真核細胞及び原核細胞に適したベクターは当業者に公知である 。転写及び翻訳制御部位の下流にある興味のあるＤＮＡセグメントを発現させる ためにいくつかのベクターを特別にデザインする。真核細胞で発現させるための このようなベクターの１つでは、ＩnＶitrogen Ｃorpから市販されているプラス ミドであるＥＢＮＡ Ｈisを用いる。装填したベクターは、ヒスチジン生合成酵 素の一部とＩＮＧＡＰとを含む融合タンパク質を生産する。原核細胞で使用する のに適した別のベクターはpＣＤＮＡ3である。特定の目的に適したベクターの選 択は、有用な発現制御配列などのベクターの性質や特徴の知識を用いて行うこと ができる。ベクターを用いて宿主細胞を安定的又は一過的に形質転換又はトラン スフェクトすることができる。形質転換やトランスフェクトの方法は当業者に公 知であり、特定の宿主細胞に適したものを用いることができる。トランスフェク ションの目的に従って宿主細胞を選択できる。適当な原核細胞宿主は大腸菌ＤＨ ５αである。適当な真核細胞宿主はアフリカミドリザル腎臓セルラインのｃｏｓ ７である。いくつかの目的にとっては、ＩＮＧＡＰの正しいグリコシル化が望ま しく、このような場合にはＩＮＧＡＰのグリコシル化シグナルを認識する適当な 宿主細胞を用いるべきである。 配列番号１に示す連続配列の少なくとも１０、１５、２０又は３０ヌクレオチ ドを含むプローブを用いて、特定の個体又はその他の種のメンバー中のＩＮＧＡ Ｐ遺伝子を同定することができる。同じ種のＤＮＡ又は異なる種のＤＮＡに対す る適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者にそれぞれ高ストリンジェンシ ー及び低ストリンジェンシーとして公知である。所望の用途に従って各種の形態 においてこれを用いることができる。例えば、当業者に公知のサザンブロット、 ノーザンブロット及びin situ コロニーハイブリダイゼーションを用いることが できる。ブローブは典型的には少なくとも１０、１５、２０又は３０ヌクレオチ ドのＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーである。ブローブは放射性標識、蛍光標識、酵 素などを含む当業者に公知の検出可能な部分で標識してもよい。プローブはその 他の哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子配列由来のものであってもよい。 ＩＮＧＡＰ遺伝子はここに提供するヌクレオチド配列の情報を用いてその他の 哺乳動物から単離することができる。（より詳細には、ハムスターＩＮＧＡＰ遺 伝子の単離について下記に詳述するのと同じ方法を用いて単離できる。）ここに 開示するＩＮＧＡＰのヌクレオチド配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオ チドを含むオリゴヌクレオチドを哺乳動物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとハイブ リダイズさせる。便宜的にはＤＮＡはクローンライブラリーの形である。オリゴ ヌクレオチドは、放射性標識又は酵素又は蛍光標識等の都合のよい標識で標識で きる。プローブとハイブリダイズするＤＮＡ分子を単離する。オーバーラップす るＤＮＡセグメントを単離することによって、例えば最初に単離したＤＮＡを連 続するＤＮＡのプローブとして同じライブラリー又は哺乳動物ＤＮＡの調製物中 で用いることによって、完全な遺伝子を構築する。単離したＤＮＡの同定の確認 は、例えばセロファンラッピングに付したときの膵臓中での遺伝子発現のパター ンを観察することによって行うことができる。同様に、コードされた産物の膵臓 管細胞に及ぼす生物的効果も該遺伝子がＩＮＧＡＰ遺伝子であることの同定に役 立っであろう。 もしも２つのオリゴヌクレオチドが補乳動物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡにハ イブリダイズする場合には、これらを例えばポリメラーゼチェインリアクション 又はリガーゼチェインリアクションを用いてＤＮＡ合成のプライマーとして用い ることができる。全長遺伝子の構築及び単離遺伝子の同定の確認は上述したよう にして行うことができる。 ＩＮＧＡＰタンパク質は、本発明に従って、セロファンラッピング法によりＩ ＮＧＡＰタンパク質を発現するように哺乳動物膵臓細胞を誘導することによって 単離することができる。この方法は本明細書に援用する参照文献１に詳述されて いる。このようにして産生したＩＮＧＡＰタンパク質を、例えば免疫アフィニテ ィ法又はタンパク質精製の分野で公知のその他の方法を用いて他の哺乳動物タン パク質から精製できる。配列番号２に示すようなＩＮＧＡＰタンパク質のアミノ 酸配列の全て又は断片を免疫源として用いて哺乳動物ＩＮＧＡＰに特異的な抗体 を産生できる。この免疫源を用いて免疫反応性抗体を同定し精製できる。モノク ローナル又はポリクローナル抗体を当業者に公知の方法で作製できる。抗体は検 出可能な標識又は固体支持体物質等のその他の部分と結合できる。このような抗 体を用いて、哺乳動物膵臓細胞又は組換え細胞から単離したタンパク質を精製で きる。ＩＮＧＡＰタンパク質に対する特異的抗体を分泌するハイブリドーマも本 発明で意図する範囲内である。 上述した宿主細胞を用いて哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を生産できる。宿主 細胞は哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む。該ＤＮＡ は配列番号１に従うものであるか、あるいは上述の方法でその他の哺乳動物から 単離できる。宿主細胞は、ＩＮＧＡＰタンパク質が発現する条件下に栄養培地中 で培養できる。ＩＮＧＡＰタンパク質が宿主細胞から分泌されると、宿主細胞又 は栄養培地からＩＮＧＡＰタンパク質を単離できる。 ＩＮＧＡＰ及びその断片が島細胞の成長を誘導及び刺激できることが今や見い だされた。さらにこれらは、膵臓管細胞の分化を誘導し、このような細胞がアポ トーシス経路を避けることができるようにすることができる。従って、ＩＮＧＡ Ｐ、その断片、及びＩＮＧＡＰをコードするヌクレオチド配列を用いて多くの治 療様式が可能となる。治療的有効量のＩＮＧＡＰを患者膵臓、単離した島細胞、 及びポリカーボンシェルなどに封入した膵臓島細胞に供給する。治療目的に適当 なＩＮＧＡＰの量は，１−１５０μｇ／ｋｇ体重又はin vitroで１−１００００ μｇ／ｍｌの範囲である。このような投与量の最適量は日常的試験によって確認 できる。哺乳動物にＩＮＧＡＰを投与する方法は当業者に公知であり、皮下投与 、門静脈経由、局部灌流経由などを含む。 本発明に従ってＩＮＧＡＰ供給により治療できる症状にはインシュリン依存性 及びインシュリン非依存性の糖尿病、膵臓不全、膵臓障害などを含む。ＩＮＧＡ Ｐの発現阻害を島細胞腫の治療に用いることができる。 本発明によると、生物活性を与えるにはＩＮＧＡＰの小部分で十分であること が今や見いだされた。配列番号２の配列の２０アミノ酸の断片、アミノ酸＃１０ ３−＃１２２が、膵臓管細胞の成長及び増殖を刺激するのに十分である。ラット 腫瘍管セルライン、ハムスター管セルライン、ハムスターインシュリノーマセル ライン、及びラットインシュリノーマセルラインで効果が観察された。その他の 哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の類似部分が同様の活性をもつ可能性が高い。タ ンパク質のこの部分は膵臓関連タンパク質（ＰＡＰ）ファミリーのその他のメン バーと似ていない。これにはグリコシル化部位を含み、またタンパク質の主要抗 原部位でもあるらしい。この断片を用いてマウスを免疫し、モノクローナル抗体 を作製した。 ＩＮＧＡＰ発現の生理学的部位を決定した。ＩＮＧＡＰは膵臓の外分泌部分に おいて、腺房組織中で発現する。ＩＮＧＡＰは管細胞又は島細胞、即ち膵臓のパ ラクリン部位では発現しない。セロファンラッピングによる誘導の２４−４８時 間以内に発現が起こる。 本発明によるトランスジェニック動物は異なる哺乳動物由来のＩＮＧＡＰ遺伝 子をもつ哺乳動物である。転写制御領域をうまく選択することによって、内在性 ＩＮＧＡＰ遺伝子よりも高レベルで外来遺伝子を発現させることができる。トラ ンスジェニック動物の作製法は当業者に公知であり、そのような方法のいずれを 用いてもよい。挿入、欠失又はＩＮＧＡＰタンパク質の構造又はＩＮＧＡＰの発 現制御を変更するその他の突然変異を有するように遺伝子操作された動物も本発 明で意図している。これらの突然変異を行う方法は当業者に公知である。 診断アッセイも本発明の意図する範囲内にある。ＩＮＧＡＰの突然変異を血液 、羊水、絨毛膜の絨毛、胚盤胞、及び膵臓細胞などのサンプル中で確認できる。 このような突然変異は糖尿病の危険にさらされた個体を同定する。突然変異は、 ヌクレオチド配列をＩＮＧＡＰ遺伝子の野生型配列と比較することにより同定で きる。当業者に公知のいかなる方法でこれを行ってもよく、制限断片長多型の比 較、ポリメラーゼチェインリアクション産物の比較、ヌクレアーゼ保護アッセイ などを含む。あるいは、改変タンパク質を例えば免疫学的又は生物学的に同定す ることができる。 本発明はまた、ＩＮＧＡＰアンチセンス構築物を、β細胞の過増殖によって特 徴づけられる状態である、膵島細胞症（nesidioblastosis）の治療に使用するこ とも意図している。アンチセンス構築物を膵島細胞症を有する哺乳動物に投与し 、よって、β細胞の過増殖を抑制する。アンチセンス構築物は、典型的にはプロ モーター、ターミネーターおよび哺乳類ＩＮＧＡＰ遺伝子からなる核酸配列を含 む。ＩＮＧＡＰ遺伝子はプロモーターとターミネーターとの間にあり、そして、 プロモーターに対して天然に発現する場合とは逆さになっている。当該プロモー ターからの発現に際し、天然の哺乳類ＩＮＧＡＰとは相補的なｍＲＮＡが産生さ れる。 哺乳動物由来の試料中のＩＮＧＡＰを分析するための免疫学的方法は、例えば 、ＩＮＧＡＰの治療上の投与をモニターするのに有用である。典型的には、ＩＮ ＧＡＰに特異的な抗体を試料に接触させ、そして抗体と試料中に存在するあらゆ るＩＮＧＡＰとの結合を検出できるであろう。これは、便利には検出可能なよう に標識されていてもよい既知の量の標準ＩＮＧＡＰ調製物と、インキュベーショ ン混合物をスパイクさせる（ｓｐｉｋｅｄ）、競合結合アッセイでもよい。ある いは、ＩＮＧＡＰのポリペプチド断片を競合因子として使用することもできる。 ある特定のアッセイ形式では、ビーズ、ポリマーマトリックス、もしくはマイク ロタイタープレート等の固相または支持体に抗体を結合させる。 本発明において、膵臓内分泌疾患を伴う哺乳動物の膵管細胞（pancreatic duc t cells）を体内から取り出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理することができる。膵 管細胞は典型的にはβ細胞前駆体を含む。よって、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質 の調製物による処理は、β細胞前駆体の分化を誘導するであろう。管細胞を、実 質的に他の哺乳類タンパク質を含まない哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物と 接触させる。次いで、処理された細胞は、それらが由来した哺乳動物への自己移 植として用いることができる。このような自己治療は、移植に伴う不都合な対宿 主移植片反応を最小化する。 ＩＮＧＡＰタンパク質はまた、ＩＮＧＡＰに対する受容体を生じるそれらの細 胞を同定するために用いることもできる。それらの細胞は、ＩＮＧＡＰの生物学 的作用に感受性を有するβ細胞前駆体であると思われる。放射標識、または蛍光 標識等によってＩＮＧＡＰタンパク質を検出可能なように標識し、そして、膵管 由来の細胞集団と接触させることができる。標識タンパク質に結合する細胞は、 ＩＮＧＡＰに対する受容体を産生する細胞、よってβ細胞前駆体として同定させ るであろう。また、ＩＮＧＡＰの断片もこの目的のために使用でき、さらに、混 合された細胞集団から固相支持体に細胞を分離するために、固定化したＩＮＧＡ Ｐを用いることもできる。ＩＮＧＡＰは、表面への吸着、抗体、あるいは結合（ conjugation）によって、固相または支持体に固定化することができる。当該技 術分野において知られている他のいかなる方法を用いてもよい。 試料中の哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質を検出するためのキットも、本発明によ って提供される。これは、とりわけ、ＩＮＧＡＰの哺乳動物への投与を含む治療 の際にＩＮＧＡＰの代謝をモニターするのに有用でありうる。キットは、典型的 には、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質に特に免疫反応性の抗体調製物を含むであろ う。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。ポリク ローナルの場合、それらを単特異的にするためにアフィニティー精製することが できる。キットはさらに、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１５の連続 するアミノ酸を有するポリペプチドを含むであろう。ポリペプチドは、抗体への 結合について試料中のＩＮＧＡＰタンパク質と競合させるのに使用する。好まし くは、ポリペプチドは検出可能なように標識されるであろう。ポリペプチドは、 抗体が結合するＩＮＧＡＰ部分を含むであろう。よって、抗体がモノクローナル な場合、ポリペプチドは抗体のエピトープを含むために、ＩＮＧＡＰと首尾よく 競合するであろう。また、ポリマービーズ、棒、プレート等の固相または支持体 に抗体を結合させることも好ましいであろう。 哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質を含む薬剤組成物を、膵臓不全の治療に用いてい ることができる。あるいは、組成物は、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくと も１５の連続するアミノ酸をの配列を含むポリペプチドを含んでもよい。ポリペ プチドは、タンパク質の他の部分を欠いても生物学的に活性であるＩＮＧＡＰの 部分を含むであろう。ポリペプチドは、例えば第二のタンパク質またはポリペプ チドとの遺伝融合物等の、より大きなタンパク質の一部であってもよい。あるい は、例えば架橋剤によって、ペブチドを第二のタンパク質に結合させてもよい。 ＩＮＧＡＰタンパク質の適当な部分は、配列番号２のアミノ酸#１０３−#１２２ との相同性によって、あるいは披験ポリペプチドが膵管細胞の成長および増幅を 刺激する能力によって、決定することができる。当該技術分野において知られて いるように、活性を損なうことなく、タンパク質のいずれかの端から比較的少数 のアミノ酸を除くことができることはしばしばある。従って、タンパク質の約１ ０％までを削除することができ、そして、なおＩＮＧＡＰの全ての機能を本質的 に提供することも本発明の範囲に意図される。ハムスターＩＮＧＡＰの場合、そ のようなタンパク質は少なくとも１３０アミノ酸を含む。 薬剤組成物は、薬剤学的に可能な希釈剤または担体を含むであろう。一般に液 体処方が好ましい。ＩＮＧＡＰは異なる濃度で、または異なる剤型を用いて処方 することができる。例えば、これらの調剤は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化 物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤または増量剤（bulking ag ent）を含むことができる。好ましくは、炭水化物はモノ−、ジ−またはポリサ ッカライド、あるいは水溶性グルカン等の糖または糖アルコールを含む。サッカ ライドは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノー ス、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラ ン、デキストリン、アルファもしくはベータシクロデキストリン、溶解性澱粉、 ヒドロキシエチル澱粉、並びにカルボキシメチルセルロース、あるいはこれらの 混合物を含む。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは、−ＯＨ基を有する Ｃ₄−Ｃ₈の炭化水素として定義され、イノシトール、マンニトール、キシリトー ル、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールを含む。マンニトールが最 も好ましい。上述された糖または糖アルコールは、単独で用いても、あるいは組 み合わせて用いてもよい。糖または糖アルコールが水性調製物に溶解しうる限り 、用いられる量に定められた限界はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃 度は、１.０ｗ／ｖ％と７.０ｗ／ｖ％の間であり、より好ましくは２.０ｗ／ｖ ％と６.０ｗ／ｖ％の間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（levorotary） （Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含むが、他のアミノ酸を 加えてもよい。好ましいポリマーは、２０００−３０００の間の平均分子量を有 するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、あるいは３０００−５０００の間の平均 分子量 を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。これらを用いる場合、凍結 乾燥前または再構成後の溶液中のｐＨ変化を最小にするために、組成物中に緩衝 剤も用いるのが好ましい。ほとんどいかなる生理学的緩衝剤も使用できるが、ク エン酸、リン酸、コハク酸およびグルタミン酸緩衝剤、あるいはそれらの混合物 が好ましい。好ましくは、濃度は０．０１−０．３モルである。界面活性剤も調 剤に加えてもよい。 さらに、ＩＮＧＡＰまたはそのポリペプチド部分を、例えば、そのサイクル半 減期を延ばすために、ポリマーに対する共有結合によって化学的に修飾すること ができる。好ましいポリマー、並びにそれらをペプチドに結合させる方法は、米 国特許第４,７６６,１０６号、第４,１７９,３３７号、第４,４９５,２８５号お よび第４,６０９,５４６号に示されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエ チル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、 室温で水に溶解性であり、以下のような一般式を有する：Ｒ（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂ ）_nＯ−Ｒ［式中、Ｒは、水素でもよく、あるいはアルキル基もしくはアルカノ ル基等の保護基でもよい］ 好ましくは、保護基は１−８の間の炭素を有し、よ り好ましくはメチルである。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１−１,００ ０の間であり、より好ましくは２−５００の間である。ＰＥＧは好ましくは平均 分子量が１０００−４０,０００の間であり、より好ましくは２０００−２０,０ ００の間であり、最も好ましくは３０００−１２,０００の間である。好ましく は、ＰＲＧは少なくとも１つの水酸基を有し、より好ましくはそれは末端水酸基 である。抑制因子上の遊離のアミノ基と反応するために好ましくは活性化される のは、この水酸基である。 液体薬剤組成物を調製後、分解を防ぎ無菌状態（sterility）を保持するため に好ましくはそれを凍結乾燥させる。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に 知られている。使用直前に、追加の成分を含んでもよい無菌希釈剤（例えば、リ ンガー溶液、滅菌水または無菌食塩水）を用いて組成物を再構成することができ る。再構成後、組成物を好ましくは、当業者に公知のそれらの方法を用いて対象 に投与する。 以下の実施例は、本発明の限定を意図するものではなく、失に開示されたそれ を単に例示するためのものである。 実施例 実施例１ この実施例は新規な、発生学的に調節された膵臓蛋白質をコードするｃＤＮＡ のクローニングおよび単離を説明する。 特有の局部的に産生された因子が島細胞発生に関係すると仮定した。最近開発 されたｍＲＮＡ分別デイスプレイ技術（５，６）を使用してセロファンで包んだ 状態（ＣＷ）で発現された遺伝子と対照の膵臓（ＣＰ）で発現された遺伝子とを 弁別的に比較したところ、セロファンで包んだ膵臓で特有の発現をするｃＤＮＡ クローン（ＲＤ１９−２）を特定できた。 オリゴｄ（Ｔ）活性化合成およびｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロゲン（Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に結合させることによってセロファンで包んだハムスタ ー膵臓から単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。該ライブ ラリーの１次組換え体数は１．２×１０⁶で、平均サイズは１．１ｋｂであった 。このｃＤＮＡライブラリーを高密度コロニー平板培養技術を使用して目的クロ ーンについてスクリーニングした。コロニーをナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ ｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にのせてプロテアーゼＫ（５０ｇ／ｍｌ）で分解した。処 理された膜を８０℃で１時間焼き、５０℃で１６−１８時間１−５×１０⁶ｃｐ ｍ／ｍｌの［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ（デュポン−ニューイングランドニュクレアー） で標識したＲＤ１９−２プローブとハイブリダイズした。陽性のハイブリダイゼ ーション信号を発するコロニーを単離してノーザーンｍＲＮＡ転写体とサイズ比 較し、配列決定してＲＤ１９−２配列との同一性を確認した。実施例２ この実施例はＩＮＧＡＰの配列をこれと相同性を分け合っている他の蛋白質と 比較したものである。 最長ｃＤＮＡ挿入物を有するハムスターＩＮＧＡＰクローンのヌクレオチド配 列を決定した。図１に示すようにハムスターｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）尾を除く７ ４７ヌクレオチド（ｎｔ）からなり、１７５アミノ酸蛋白質をコードする主オー プン・リーデイング・フレームを含む。このオープン・リーデイング・フレーム の次は２０６ｎｔの３’−未翻訳領域である。典型的ポリアデニル化信号が上記 ポリ（Ａ）尾の１１ｎｔ上流に存在する。予測されたＩＮＧＡＰ蛋白質は膵臓炎 または肝臓腺癌（７−１１）に伴うＰＡＰ／ＨＩＰファミリーの遺伝子および膵 臓β細胞生育を促す（１４）と見られ膵臓島再生に役立つＲｅｇ／ＰＳＰ／リト スタチンファミリーの遺伝子の両方に対してＰＡＰ構造相同性を示す。ヌクレオ チド配列およびそれらの減成されたアミノ酸をハムスターＩＮＧＡＰとラットＰ ＡＰ−Ｉで比較したところ、コード領域で高度の相同性（ヌクレオチド配列およ びアミノ酸配列で各々６０および５８％）を示した。ハムスターＩＮＧＡＰの予 測アミノ酸配列はＰＡＰＩＩに対して４５％およびＰＡＰＩＩＩに対して５０％ （ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰＩＩＩは急性膵臓炎に伴う）、および肝細胞性肝癌に 見られたＨＩＰに対して５４％の同一性を示した。ＩＮＧＡＰはラットＲｅｇ／ ＰＳＰ／リソスタチンに対して４０％の同一性をも示した（図２）。Ｒｅｇは膵 臓石蛋白質（ＰＳＰ）（１５，１６）または膵臓糸蛋白質（ＰＴＰ）（１７）考 えられている。ＩＮＧＡＰ蛋白質の予測配列のＮ−末端は高度に疎水性であるの で蛋白質を排泄させるようにし得るシグナルペプチドの良好な候補である。ＰＡ Ｐ／ＨＩＰに類似であるがＲｅｇ／ＰＳＰ／リソスタチン蛋白質とは異なり、潜 在性Ｎ−グリコシル化部位はＩＮＧＡＰ配列の１３５位と仮定されている。ＩＮ ＧＡＰに特有なのは、１１５位と仮定されたもう１つの潜在性Ｎ−グリコシル化 部位である。２つのジスルフィド結合を有する４つの完全保存システイン類を含 むＤｒｉｋａｍｅｒによって測定することによって、ＩＮＧＡＰはまたカルシウ ム依存性（Ｃ−タイプ）動物レクチンの膜の一致した特徴と高度の相同性（１２ ／１８）（図２）を示す（１２）。ＩＮＧＡＰのアミノ末端に見られるさらに２ つのシステイン類（図２）もＲｅｇ／ＰＳＰおよびＰＡＰＨＩＰに存在する。し かし、生物学的有意性がどのようなものかは不明である。実施例３ この実施例はセロファン一包みでのＩＮＧＡＰの一時的発現パターンを示す。 ＩＮＧＡＰの一時的発現を決定するため、ＣＰおよびＣＷ膵臓から抽出された 総ＲＮＡをノーザーンブロット分析においてハムスターＩＮＧＡＰｃＤＮＡクロ ーンでプローブした。セロファン包みの１及び２日後９００ｂｐの強力な単一転 写体を検出した（図３）。これは６ないし４２日までに消失しＣＰからは存在し なかった。ＩＮＧＡＰｍＲＮＡはＣＷ後のみに存在するので、ＣＷ誘導膵臓島新 生に伴う。ＰＡＰファミリーの遺伝子についてはＩＮＧＡＰの増加した発現が急 性膵臓炎に伴うことはないらしい。膵臓炎の急性期の間に、アミラーゼを含む膵 臓酵素をコードする大部分のｍＲＮＡの濃度は有意に減少した（１６．１８）。 反対に、高度のＩＮＧＡＰ発現が見られた島新生のＣＷモデルにおいては、アミ ラーゼ遺伝子発現は同時に正常より低下するよりむしろ増加し（図３）、ＩＮＧ ＡＰ発現は膵臓炎に伴うのではなく、むしろ島新生に伴うことを示唆している。 ＣＷ１および２日後増加したアミラーゼ遺伝子発現の原因は未だ不明であり、こ のテーマを解明するためさらなる研究が必要である。実施例４ この実施例はＩＮＧＡＰ蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡのクローニングおよ び部分的配列を説明する。 ヒトポリＡ⁺ＲＮＡを正常ヒト膵臓から、Ｑｉａｇｅｎから市販のポリＡ⁺抽出 キットを使用して単離した。次いで、５００ｎｇのポリＡ⁺ＲＮＡを逆転写およ びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の鋳型として使用した。実験条件をパ ーキンエルマーからのＲＴ−ＰＣＲキットの指示によりセットした。オリゴｄ（ Ｔ）を逆転写のプライマーとして使用した。配列Ｎｏ．１においてヌクレオチド ４対２３および６１０対６２９に相当するプライマーをポリメラーゼ連鎖反応の 特異的プライマーとして使用した。６２６ｂｐＰＣＲ断片をＩｎｖｉｔｏｒｏｇ ｅｎからのＴＡクローニングキットを使用してクローニングした。ヒトクローー ンの部分配列は配列の中間に１２０ｂｐギャップを有する４６６ｂｐからなる。 ヒトＩＮＧＡＰｃＤＮＡは、ハムスターＩＮＧＡＰｃＤＮＡ配列とヌクレオチド ４−２６８が、配列Ｎｏ．１のヌクレオチド２８９−６２９が１００％同一であ る。中間部の１２０ｂｐの配列は未だ同定されていない。実施例５ この実施例はＩＮＧＡＰからの合成ペプチドが島新生の促進の役割を演じ、ヒ トＩＮＧＡＰの配列が未だ決定されない１２０ｂｐ断片によってコードされた少 なくとも１つのエピトープがハムスターＩＮＧＡＰに割り当てられることを示す 。 演繹されたアミノ酸１０４−１１８に相当する合成ペプチドを免疫原として使 用してウサギのポリクローナル抗体を上昇させた。抗血清を次いで免疫組織化学 検定においてアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）法によって使用した。新島形 成したヒト末梢島領域の細胞はＩＮＧＡＰに対して陽性に染色され、ヒトとハム スターＩＮＧＡＰが共通のエピトープを配列ＮＯ．２のアミノ酸１０４−１１８ の間で分け合うことを示した。 同一の合成ペプチドを³Ｈ−チミジンのラット膵臓腫瘍導管細胞（ＡＲＩＰ） およびハムスターインスリノーマ腫瘍細胞（ＨＩＴ）への取り込み能力について 試験した。１０μＣｉの³Ｈ−チミジン（８０．４Ｃｉ／ミリモル濃度）をＨａ ｍのＦ−１２Ｋ培地で培養された約１０⁶個の細胞に加えた。２４時間後、細胞 を回収し溶解した。トリクロル酢酸（ＴＣＡ）で核酸の分別沈殿をＲｏｓｅｎｂ ｅｒｇらの変法により行い、³Ｈ−チミジン取り込み割合を計算した。培養物中 のＡＲＩＰに合成ペプチドを添加すると該合成ペプチド不存在の２．４倍の³Ｈ −チミジンを取り込んだ。この合成ペプチドは対照細胞株ＨＩＴに対して何ら作 用を有しなかった。この結果はＩＮＧＡＰが島新生を促進する役割を演じている ことを示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＣＪ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＰ 48/00 ＡＤＰ Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 16/24 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ｃ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＴ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヴィニック，エアロン・アイ アメリカ合衆国ヴァージニア州23510，ノ ーフォーク，レイダー・ストリート 40, ナンバー 603 (72)発明者 ピッテンガー，ゲイリー・エル アメリカ合衆国ヴァージニア州23452，ヴ ァージニア・ビーチ，プリンス・アンドリ ュー・レーン 3701 (72)発明者 ラファエロフ，ロニット アメリカ合衆国ヴァージニア州23507，ノ ーフォーク，スポッツウッド・アベニュー 1040，ナンバー 102 (72)発明者 ローゼンバーグ，ローレンス カナダ国エイチ４ブイ・１イー４ ケベッ ク，モントリオール，ファーン・ロード 6507 (72)発明者 デュガイド，ウィリアム・ピー カナダ国エイチ９エックス・２エル６ ケ ベック，モントリオール，バイエ・デュル フ，カレイス・ドライブ 209

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．他の哺乳動物蛋白質を実質上含まない、哺乳動物INGAP蛋白質の調製物。 ２．INGAP蛋白質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記 載の調製物。 ３．哺乳動物INGAP蛋白質の少なくとも１５の連続するアミノ酸配列を含むポ リペプチド調製物。 ４．ポリペプチドが上記配列と第２蛋白質由来の第２ポリペプチドとの融合物 である、請求項３記載の調製物。 ５．ポリペプチドが第２ポリペプチドに結合している、請求項３記載の調製物 。 ６．ポリペプチドが固相支持体に結合している、請求項３記載の調製物。 ７．ポリペプチドが哺乳動物INGAP蛋白質の生物活性を有する、請求項３記載 の調製物。 ８．生物活性が膵管細胞の成長および増殖を刺激する能力である、請求項７記 載の調製物。 ９．ポリペプチドが配列番号２に示される哺乳動物INGAP蛋白質のアミノ酸番 号１０３番から１２２番を含む、請求項３記載の調製物。 １０．ポリペプチドが哺乳動物INGAP蛋白質の少なくとも１３０の連続するア ミノ酸を含む、請求項３記載の調製物。 １１．哺乳動物INGAP蛋白質をコードする、単離されたＤＮＡ分子。 １２．INGAP蛋白質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１ １記載のＤＮＡ分子。 １３．INGAP蛋白質が配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１ １記載のＤＮＡ分子。 １４．請求項１１記載のＤＮＡを含むベクター。 １５．さらに発現制御配列を含むことによりＤＮＡが宿主細胞中で発現される 、請求項１４記載のベクター。 １６．ＥＢＮＡ Ｈｉｓプラスミドを含む、請求項１５記載のベクター。 １７．請求項１１記載のＤＮＡで形質転換された宿主細胞。 １８．請求項１４記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 １９．アフリカミドリザルの腎臓細胞ｃｏｓ７である、請求項１７記載の宿主 細胞。 ２０．以下の工程： セロファンラッピングにより哺乳動物膵臓細胞がINGAP蛋白質を発現するよう に誘導し；そして 誘導された哺乳動物膵臓細胞からINGAP蛋白質を精製すること により製造された、哺乳動物INGAP蛋白質の調製物。 ２１．哺乳動物INGAP遺伝子の少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む ヌクレオチドプローブ。 ２２．哺乳動物INGAP遺伝子が配列番号１に示された配列を有する、請求項２ １記載のヌクレオチドプローブ。 ２３．プローブが検出可能なモイエティにより標識されている、請求項２１記 載のヌクレオチドプローブ。 ２４．哺乳動物INGAP遺伝子の少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む ＤＮＡ分子。 ２５．哺乳動物INGAP遺伝子が配列番号１に示された配列を有する、請求項２ ４記載のＤＮＡ分子。 ２６．検出可能なモイエティにより標識されている、請求項２４記載のＤＮＡ 分子。 ２７．他の哺乳動物蛋白質を実質上含まない、哺乳動物の膵臓のセロファンラ ッピングにより誘導可能な哺乳動物INGAP蛋白質の調製物。 ２８．配列番号１に示される配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドを 含むひとつまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物のゲノミックＤＮＡ またはｃＤＮＡにハイブリダイズさせて、 ひとつまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするゲノミック ＤＮＡまたはｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定すること からなる、哺乳動物からINGAP遺伝子を単離する方法。 ２９．２つのオリゴヌクレオチドをゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡにハイブ リダイズさせ、且つこれらのオリゴヌクレオチドをポリメラーゼチェイン反応（ ＰＣＲ）のプライマーとして用いることにより哺乳動物からINGAPヌクレオチド を合成する、請求項２８記載の方法。 ３０．ひとつまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドが標識されている、請求項 ２８記載の方法。 ３１．ハイブリダイズ工程において使用される哺乳動物のゲノミックＤＮＡま たはｃＤＮＡが分子クローンのライブラリーの形態である、請求項２８記載の方 法。 ３２．配列番号１に示される配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドを 含むひとつまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物のゲノミックＤＮＡ またはｃＤＮＡにハイブリダイズさせて、 ひとつまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするゲノミック ＤＮＡまたはｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する 方法により得られた、単離されたｃＤＮＡ分子。 ３３．哺乳動物INGAP蛋白質に特異的に免疫反応する抗体調製物。 ３４．哺乳動物INGAPが配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項 ３３記載の抗体調製物。 ３５．ポリクローナルである、請求項３３記載の抗体調製物。 ３６．モノクローナルである、請求項３３記載の抗体調製物。 ３７．固相支持体に結合した抗体を含む、請求項３３記載の抗体調製物。 ３８．哺乳動物INGAP蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を生成するハイブリ ドーマ。 ３９．以下の工程： 請求項１７記載の宿主細胞を用意し； 宿主細胞を栄養培地中で培養してINGAP蛋白質を発現させ；そして、 宿主細胞または培地からINGAP蛋白質を回収すること からなる、哺乳動物INGAP蛋白質の製造方法。 ４０．以下の工程： 請求項１１記載のＤＮＡ分子を含む宿主細胞を用意し； 宿主細胞を栄養培地中で培養して哺乳動物INGAP蛋白質を発現させ；そして、 宿主細胞または培地から哺乳動物INGAP蛋白質を回収すること からなる、哺乳動物INGAP蛋白質の製造方法。 ４１．治療に効果的な量のINGAP蛋白質を糖尿病の哺乳動物に投与して膵島細 胞の成長を刺激することからなる、糖尿病の哺乳動物の治療方法。 ４２．哺乳動物がインスリン依存性の真性糖尿病である、請求項４１記載の方 法。 ４３．哺乳動物がインスリン非依存性の真性糖尿病である、請求項４１記載の 方法。 ４４．INGAP蛋白質を膵島細胞増殖用培地に供給し；そして INGAP蛋白質を含有する培地中で膵島細胞を成長させること からなる、膵島細胞の成長方法。 ４５．膵島細胞の生存率または生存時間を高めるのに十分な量のINGAP蛋白質 を、ポリカーボンの殻で封入された膵島細胞に加えることからなる、ポリカーボ ンの殻で封入された膵島細胞の寿命を高める方法。 ４６．哺乳動物の膵臓にINGAP蛋白質をコードするＤＮＡ分子を投与すること からなる、哺乳動物の膵島細胞の数を増やす方法。 ４７．ＤＮＡ分子が配列番号１に示される配列を有する、請求項４６記載の方 法。 ４８．INGAP蛋白質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４ ６記載の方法。 ４９．哺乳動物の膵臓にINGAP蛋白質を投与することからなる、哺乳動物の膵 島細胞の数を増やす方法。 ５０．INGAP蛋白質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４ ９記載の方法。 ５１．第２の哺乳動物のＩＮＧＡＰ遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物 。 ５２．該ＩＮＧＡＰ遺伝子が配列番号１に示される配列である、請求項５１記 載のトランスジェニック哺乳動物。 ５３．該ＩＮＧＡＰ遺伝子が、当該哺乳動物のどの内在性ＩＮＧＡＰ遺伝子よ りも高い水準で発現される、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物。 ５４．遺伝子工学的に操作され、当該哺乳動物のＩＮＧＡＰ遺伝子の挿入、欠 失を含むヒト以外の哺乳動物。 ５５．個々の哺乳動物のサンプルＩＮＧＡＰ遺伝子における突然変異を同定し 、該突然変異がその遺伝子によってコードされたＩＮＧＡＰ蛋白における構造上 の異常を起こすか、又はＩＮＧＡＰ遺伝子の消失（デミニッシュド又はオブリタ レーテッド）発現を導く調節欠損を生じるものである、糖尿病の危険がある個々 の哺乳動物の同定方法。 ５６．該サンプルが血液サンプルである請求項５５記載の方法。 ５７．該サンプルが羊水サンプルである請求項５５記載の方法。 ５８．該サンプルが絨毛膜サンプルである請求項５５記載の方法。 ５９．該サンプルが胚盤胞サンプルである請求項５５記載の方法。 ６０．該サンプルが膵細胞サンプルである請求項５５記載の方法。 ６１．前記サンプルを請求項３３による抗体製剤を接触させることから成る、 哺乳動物からのサンプル中のＩＮＧＡＰ蛋白を同定する方法。 ６２．哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の少なくとも１５個の連続したアミノ酸からな る所定量のポリペプチドも前記サンプルと接触させる、請求項６１記載の方法。 ６３．該ポリペプチドが検出可能に標識されている、請求項６２記載の方法。 ６４．前記抗体製剤が固体支持体に固定されている抗体からなる、請求項６１ 記載の方法。 ６５．前記抗体製剤が固体支持体に固定されている抗体からなる、請求項６２ 記載の方法。 ６６．前記固体支持体に固定されていない標識ポリペプチドを検出する工程を 含む、請求項６５記載の方法。 ６７．単離した哺乳動物の膵島細胞を、他の哺乳動物蛋白から実質上精製され た、哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の製剤と、該膵島細胞の生存率を増加させる量で、 接触させることから成る、前記細胞のアポトーシスを避けるために、哺乳動物の 膵島細胞を処理する方法。 ６８．哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白を、膵島細胞の移植を受けた哺乳動物に投与し 、該投与が移植の前、間、又は後に行われる、膵島の移植を受けた哺乳動物の処 置方法。 ６９．前記投与工程が静脈内である、請求項６８記載の方法。 ７０．前記投与工程が前記移植の局所に対する局所潅流で行う、請求項６８記 載の方法。 ７１．前記投与工程が門静脈投与である請求項７１記載の方法。 ７２．膵島細胞を門静脈から連続移植する、請求項７１記載の方法。 ７３．β細胞前駆細胞から成る膵管細胞の培養物を、実質上他の哺乳動物蛋白 を含まない哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白製剤と接触させることから成る、β細胞の前 駆細胞の分化を誘導する方法。 ７４．膵臓内分泌不全の哺乳動物から単離されたβ細胞前駆細胞からなる膵管 細胞製剤を、実質上他の哺乳動物蛋白を含まない哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の製剤 と接触させ；ついで この哺乳動物に、上記のように処置された膵管細胞を、自家移植することから 成る、膵臓内分泌不全の哺乳動物の治療方法。 ７５．プロモーター、ターミネーター、及び哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子から成 るヌクレオチド配列から成り、該ヌクレオチド配列が、該プロモーターとターミ ネータとの間に有り、該ヌクレオチドが、該プロモーターに対して逆方向であり 、それによって、該プロモーターからの発現の際に、ネイティブ哺乳動物ＩＮＧ ＡＰｍＲＮＡに相補的なｍＲＮＡを生産する、ことからなる哺乳動物ＩＮＧＡＰ 遺伝子のアンチセンス構造体。 ７６．膵島細胞症の哺乳動物に請求項７５のアンチセンス構造体を投与し、そ れによって該哺乳動物のβ細胞の過度の成長を防止する、ことから成る膵島細胞 症の治療方法。 ７７．哺乳動物からのサンプル内の哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白を検出するための キットであって、 哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白と特異的に免疫反応性である抗体製剤；及び 哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の少なくとも１５個の連続したアミノ酸からなるポリ ペプチドから成る、キット。 ７８．前記ポリペプチドが検出可能に標識されている、請求項７７記載のキッ ト。 ７９．前記抗体製剤が、固体支持体に固定されている抗体からなる、請求項７ ７記載のキット。 ８０．薬学上許容される希釈剤又は担体中に配合された、哺乳動物ＩＮＧＡＰ 蛋白から成る、膵臓不全の治療のための医薬組成物。 ８１．ＩＮＧＡＰ蛋白が、配列番号２に示されるアミノ酸配列である、請求項 ８０記載の医薬組成物。 ８２．哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の少なくとも１５個の連続したアミノ酸からな るポリペプチド製剤と薬学上許容される希釈剤又は担体とからなる、医薬組成物 。 ８３．前記ポリペプチドが、第２の蛋白から誘導される第２のポリペプチドと 前記配列との融合物である、請求項８２記載の医薬組成物。 ８４．前記ポリペプチドが、第２のポリペプチドと複合している、請求項８２ 記載の医薬組成物。 ８５．前記ポリペプチドが、前記哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の生物活性をもって いる、請求項８２記載の医薬組成物。 ８６．前記生物活性が膵管細胞の成長、増殖を刺激する能力である、請求項８ ５記載の医薬組成物。 ８７．前記ポリペプチドが配列番号２に示される哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白にお ける１０３〜１２２アミノ酸である、請求項８２記載の医薬組成物。 ８８．前記ポリペプチドが前記哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の少なくとも１３０個 の連続するアミノ酸からなる、請求項８２記載の医薬組成物。 ８９．膵管細胞の集団を哺乳動物ＩＮＧＡＰ蛋白の製剤と接触させ；次いで 該集団から、ＩＮＧＡＰ蛋白に特異的に結合する細胞を検出する、ことから成 るβ細胞前駆細胞を同定する方法。 ９０．前記ＩＮＧＡＰ蛋白が検出可能に標識されている、請求項８９記載の方 法。 ９１．前記ＩＮＧＡＰ蛋白が固体相上に固定化されている、請求項８９記載の 方法。 ９２．ＩＮＧＡＰ蛋白がヒト由来のものであり、配列番号２に示される１〜８ ３及び１２４〜１７４のアミノ酸配列から成る、請求項１記載の製剤。 ９３．ＩＮＧＡＰ蛋白がヒト由来のものであり、Ｎ末端からＣ末端への配向で 、配列番号２に示される１〜８３、４０アミノ酸、及び配列番号２の１２４〜１ ７４のアミノ酸配列から成る、請求項１記載の製剤。 ９４．ＩＮＧＡＰ蛋白がヒト由来のもである、請求項１１記載のＤＮＡ分子。 ９５．前記ＩＮＧＡＰ蛋白が、配列番号２の１〜８３及び１２４〜１７４のア ミノ酸配列である、請求項９４のＤＮＡ分子。 ９６．ＩＮＧＡＰ蛋白がヒト由来のものであり、Ｎ末端からＣ末端への配向で 、配列番号２に示される１〜８３、４０アミノ酸、及び配列番号２の１２４〜１ ７４のアミノ酸配列から成る、請求項９４記載のＤＮＡ分子。 ９７．配列番号２の１〜８３及び１２４〜１７４のアミノ酸配列から選択され るアミノ酸配列をコードする、請求項２４のＤＮＡ分子。 ９８．配列番号１の４〜２６８、及び３８９〜６２９のヌクレオチドから成る 、請求項１１記載のＤＮＡ分子。