FI118373B - Peptidin p277 analogeja ja niitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia diabeteksen hoitamiseksi ja diagnosoimiseksi - Google Patents

Description

118373

Peptidin p277 analogeja ja niitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia diabeteksen hoitamiseksi ja diagnosoimiseksi Analoger tili peptiden p277 och farmaceutiska kompositioner innehällande dessa för behandling och diagnostisering av diabetes

Keksintö koskee sellaisia uusia peptidejä, jotka ovat erään ihmisperäisen 60 kDa lämpöshokkiproteiinin (hsp60) epitoopin muunnelmia ja niitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia ja menetelmiä insuliinihoitoisen diabetes mellituksen (IDDM) diagnosoimiseksi ja käsittelemiseksi tällaisilla peptideillä.

V Tyypin I diabetes eli IDDM on insuliinia tuottavien haiman saarekkeissa sijaitseviin soluihin hyökkäävien ja niitä tuhoa- • *’ vien T-solujen aiheuttama autoimmuunisairaus (Castano ja Eisen- ·«« barth, 1990). IDDM:ään kulminoituva autoimmuuniprosessi alkaa * j\ ja etenee oireitta. Sairaus ilmenee kliinisesti vasta kun ]·#· β-solujen yhteenlaskettu hävikki ylittää jäljelle jääneiden • · * β-solujen insuliinitarpeen tyydyttämiskyvyn. Glukoosin sisäisen tasapainon (homeostaasin) äkillisen heikentymisen ja kliinisen IDDM:n uskotaan todellakin ilmenevän vasta sen jälkeen, kun immuunijärjestelmä on inaktivoinut 80-90 % β-soluista.

« · ; ** IDDM:ää poteviksi todettavien potilaiden on siten oltava pit- *11 V källe edenneessä β-solujensa autoimmuunituhoutumisen vaihees-sa. Alkava, prekliininen diabetes voidaan diagnosoida toteamal- • · 4··ν la β-solujen autoimmuniteetin immunologiset markkerit vasta * sen jälkeen kun autoimmuuniprosessi on alkanut. Siten terä- • · : peuttisena tavoitteena on löytää turvallinen, spesifinen ja "" tehokas tapa jo meneillään olevan autoimmuuniprosessin katkai semiseksi .

Esillä olevat keksijät ovat tarkastelleet tätä kysymystä aikaisemmin tutkimalla NOD-hiirikannassa tapahtuvan spontaanin diabeteksen kehittymistä, minkä katsotaan olevan luotettava malli ihmisessä esiintyvälle IDDM:lie (Castano ja Eisenbarth, 1990) . NOD-hiiriin kehittyy haiman saarekkeiden tulehdus (insu- 118373 2 liitti) kun ne ovat noin kuukauden ikäisiä, sen alkaessa lievänä ulkosaarekkeiden tiivistymänä (infiltraattina) ja edetessä sitten vakavaksi saarekkeen sisäiseksi tulehdukseksi. Hyper-glykemia, joka osoittaa insuliinin riittämättömyyden, alkaa populaatiomme naaraissa kun ne ovat noin 14-17 viikon ikäisiä. Kun ikä on 35-40 viikkoa miltei kaikille NOD-hiirinaaraille on kehittynyt vakava diabetes ja useimmat kuolevat insuliinihoidon puuttuessa. Sairauden ilmaantuvuus (insidenssi) urospuolisissa NOD-hiirissä on tuntemattomista syistä pienempi. On osoitettu että NOD-hiirien diabetes johtuu autoimmunisoivista T-soluista (Bendelac et ai., 1987) IDDM:ää potevilla ihmispotilailla samoin kuin NOD-hiirillä on lV todettu T-solujen reagointia (reaktiivisuutta) ja autovasta- : aineita eri vasta-aineille (Elias 1994) , muttei ole selvää * »* ; »' onko sairauden primaarinen syy immuniteetti jollekin yksittäi- ··« ,\ : selle mahdolliselle kohdeantigeenille. Syy-yhteyttä tärkeämpi • * - ··, on kuitenkin hoitokysymys.

» ä -« • · • » • · - * On osoitettu, että autoimmuuniprosessin alkaminen NOD-hiirissä voidaan estää manipuloimalla hiiret eri tavoin ennen diabeteksen puhkeamista, kuten rajoittavalla ruokavaliolla, altistamalla niitä virusinfektioille tai stimuloimalla immuunijärjes- 4 4 ; ** telmää epäspesifisestä, (Bowman et ai., 1994). NOD-diabetes on

• M

J.J estettävissä myös indusoimalla immunologinen toleranssi, joka .V* kehittyy prediabetestä potevissa hiirissä glutamiinihappodekar- • * l.l boksylaasiantigeenia (GAD) vastaan, (Kaufmann et ai., 1993;

Tisch et ai.; 1993).

• * • t • ♦ ' ·♦· - *:*·; Esillä olevan keksinnön keksijät ovat aikaisemmin todenneet että NOD-hiirten sokeritauti voidaan estää rokottamalla T-so-luilla käyttäen T-soluja, jotka ovat spesifisiä ihmisen hsp60-molekyylin p277-peptidin sekvenssille (Elias et ai., 1991). Proteiinia kutsuttiin aikaisemmin nimellä hsp65, mutta nyttemmin sitä nimitetään hsp60:ksi siitä johtuen, että sen molekyy-lipainosta on tarkempia tietoja. Riippumatta nimityksestä proteiinit ovat samoja.

3 118373 IDDM:ään liittyvä p277-peptidi, joka on ihmisen hsp60:n epi-tooppi ja vastaa ihmisen hsp60-sekvenssin positioita 437-460, kuvattiin ensimmäisen kerran esillä olevan hakijan israelilaisessa patenttihakemuksessa No. 94241 sekä julkaisussa Elias ja Cohen, 1994 ja sillä on seuraava sekvenssi:

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEK ID N0:1)

Osoitettiin että yksinomaan p277-peptidin anto insuliitin puhjetessa esti diabeteksen kehittymisen, luultavasti säätelemällä alas NOD-diabeteksen kehittymiselle välttämättömän anti-p277-immuniteetin (Elias et ai., 1991; Israelilainen patenttihakemus No. 94241). Vastikään tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että p277-peptidiä voidaan myös käyttää vakavaan tilaan edenneen S-soluimmuniteetin parantamiseksi.

I·» • · 1 2 3 • · · : Esillä olevien keksijöiden laboratoriosta on äskettäin rapor- * 1 · . .·. toitu, että eräs diabeteksen autoimmuuni muoto voidaan indusoi- * 1 4 »(1 .·. ; da C57BL/KsJ-hiirikannoissa antamalla hyvin alhainen annos jb-solutoksiinia, streptotsotosiinia (STZ) (Elias et ai., 2 * · 1 1994) . Sitä vastoin standardoitu 40 mg/kg:n alhainen STZ-an- • · · 3 nos annettuna päivittäin viitenä peräkkäisenä päivänä yleensä indusoi kliinisen sokeritaudin kolmessa viikossa, 30 mg/kg:n annos viitenä päivänä indusoi kliinisesti todettavan sokeritaudin vasta kolmen kuukauden viive- eli lag-vaiheen jälkeen.

• « • Indusoidulle diabetes-mallille on tunnusomaista insuliinin autoimmuunivasta-aineiden, insuliinin autovasta-aineille anti- • V idiotyyppisten vasta-aineiden ja hsp60:n autovasta-aineiden * · ilmestyminen ennakoivan (prodromaalisen) jakson aikana. Hii-**;·" ret osoittavat myös itsestään syntyvää (spontaanista) T-solu- : reaktiivisuutta hsp60-proteiinia ja sen p277-peptidiä vastaan ·:··; (Elias et ai., 1994). Siten näyttää siltä, että standardoitua matala-STZ-annosta pienempi annos laukaisisi autoimuuniproses-sin, joka ei paljoakaan poikkea siitä, mikä havaitaan itses- 4 118373 tään (spontaanisesti) syntyvän diabeteksen kehittyessä hiirissä (Elias et ai., 1990).

Esillä olevan keksinnön kohteena on aikaansaada p277-peptidin muunnelmia, tällaisten muunnelmien ollessa hyödyllisiä IDDM:n diagnosoinnissa ja hoidossa.

Tutkimuksessa, joka kohdistui p277-peptidin fragmentteihin ja muunnelmiin, havaittiin yllättäen, että peptidit, joissa ainoa treoniinijäännös korvattiin lysiinijäännöksellä ja/tai yksi tai molemmat kysteiinijäännökset korvattiin valiinijäännöksel-lä (jäännöksillä) olivat yhtä aktiivisia diabeteksen hoidossa kuin p277. Nämä tulokset olivat vielä yllättävämmät, koska kysteiinijäännöksen korvaaminen seriinijäännöksellä johti inaktiiviseen peptidiin.

Esillä oleva keksintö kohdistuu siten peptidiin, joka koostuu sekvenssistä I: * * · 6 11 * .1.: Vai -Leu-Gly-Gly-Gly-Χχ -Ala-Leu-Leu-Arg-X2 -1 le- Pro-Ala-Leu- « 19 : Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEK ID NO:2) (I) , « » • « • · * · 9 V. missä Xi ja X2 ovat kukin Cys- tai Vai-jäännös ja X3 on Thr- • · * tai Lys-jäännös, mutta Χχ ja X2 eivät molemmat voi olla Cys-jäännöksiä silloin kuin X3 on Thr-jäännös.

Keksinnön erityisissä sovellutusmuodoissa peptidi sisältää « · : *** sekvenssin I, missä sekä Χχ ja X2 ovat Cys, X3 on Lys, tässä

yhteydessä p277(Lys^·9) (SEK ID NO:3:) tai Χχ on Vai, X2 on Cys ,·’·] ja X3 on Thr tai Lys, tässä yhteydessä p277(Val6) (SEK ID

• n !.! NO:4:) ja p277(Val6-Lys19) (SEK ID NO:5:) vastaavasti; tai Χχ *!'. on Cys, X2 on Vai ja X3 on Thr tai Lys, tässä yhteydessä : p277(Vali:L) (SEK ID NO: 6 :) ja p277 (Vali:L-Lys19) (SEK ID NO:7:) *:*·: vastaavasti; tai sekä Χχ että X2 ovat Vai ja X3 on Thr tai Lys tässä yhteydessä p277 (Val6-Vali;L) (SEK ID NO:8:)ja p277 (Vai® ^-Lys19) (SEK ID NO:9:) vastaavasti. Peptidiä p277(ValS-Val11) kutsutaan tässä yhteydessä myös p277(V):ksi.

118373 5

Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen aikaansaada menetelmiä ja reagenssipakkauksia IDDMm varhaiseksi diagnosoimiseksi käyttäen keksinnön mukaisen peptidin sekvenssiä I. Kun IDDM on puhkeamaisillaan eläimet ilmentävät hsp60-molekyyliä tai molekyylejä, jotka ristireagoivat sen kanssa ja erittyvät eläimen vereen ja virtsaan. Ne ilmentävät myös tällaisiin molekyyleihin spesifisesti kohdistuneita vasta-aineita ja T-soluja. Siten hsp60m (tai molekyylin, joka ristireagoi sen kanssa) tai sellaisten vasta-aineiden tai T-solujen läsnäolo, jotka ovat veressä ja virtsassa esiintyessään spesifisiä sille (hsp60) toimii määritysmenetelmänä IDDM-prosessin ilmaantumisen toteamiseksi ennenkuin β-solujen tuhoutuminen on saatettu päätökseen ja yksilö on tuomittu elinikäiseen sokeritautiin.

IDDM:n läsnäolo tai sen esiasteet potilaassa voidaan diagnosoida testaamalla, onko kyseisen potilaan veressä tai virtsassa • * * : anti-hsp60 vasta-aineita tai T-soluja, jotka reagoivat immuno- * logisesti ihmisperäisen hsp60:n kanssa, käyttämällä antigee- : ;* nina keksinnön mukaista sekvenssin I omaava peptidi. On todel- * · · :'v la niin, että mikä tahansa edellä toimivaksi kuvattu menetel- « · j*.^ mä, jossa käytetään p277-peptidiä, kuten ne menetelmät, jotka on kuvattu kansainvälisessä POT-hakemuksessa W0 90/10449, joka • · · täten viitteenä sisällytetään tähän hakemukseen, voidaan myös käyttää korvaamaan esillä olevan keksinnön p277-peptidin sekvenssiä I.

• · • · • ** Niinpä esillä olevalla keksinnöllä aikaansaadaan sellainen • i» menetelmä diagnosoida IDDMm läsnäolo tai sen esiaste potilaas- * · .*.* sa, johon menetelmään sisältyy potilaan testaaminen anti-hsp60 • · .·*·. vasta-aineiden tai hsp60m kanssa immunor ego ivan T-solun läsnä- • * **· olon suhteen, jolloin tulos, joka osoittaa anti-hsp60 vasta- : aineiden, hsp60:n kanssa immunoreagoivien T-solujen, tai T-solun tai hsp60:n kanssa immunoreagoivien T-solujen positiivisen läsnäolon on merkki siitä, että on olemassa suuri todennäköisyys IDDMm puhkeamiselle.

118373 6 * IDDM-tautia diagnosoivalla menetelmällä IDDM-potilaalle voi daan tehdä koe, jossa osoitetaan anti-hspSO vasta-aineita, mikä koemenetelmä voi olla radioimmunomääritys tai ELISA-testi .

Potilaalle voidaan myös tehdä koe, jolla osoitetaan hsp60:n kanssa immunoreagoivia T-soluja. Eräässä tämän aspektin sovel-lutusmuodossa testimenetelmä sisältää T-solun lisääntymis/-jakaantumis- eli proliferaatio-testin, johon sisältyy vaiheet: (i) valmistetaan potilaan verinäytteestä saatuja T-soluja sisältävä mononukleaarinen solufraktio; (ii) lisätään mainittuun mononukleaariseen solufraktioon antigeeni, joka on valittu keksinnön mukaisen sekvenssin I omaa-vien peptidien joukosta; *n V * (iii) solufraktio inkuboidaan antigeenin läsnäollessa sopivan ·,;*· ajanjakson ja sopivissa kasvusolosuhteissa; t * · * • « * • ** *\i (iv) lisätään leimattu nukleotidi kohdan (iii) mukaiseen inku- :·. boituun soluviljelmään sopivana ajankohtana ennen mainitun • · * ,V. inkubointiajan päättymistä, jotta aikaansaataisiin mainittujen « « · leimattujen nukleotidien sisällyttäminen eli inkorporoiminen lisääntyvien T-solujen DNA:han; ja (v) määritetään lisääntyvien T-solujen määrä analysoimalla : *' T-soluihin inkorporoidun leimatun nukleotidin määrää.

• e· » · -• ·

Edellä mainitussa vaiheessa (iv) mainittu leimattu nukleotidi .···, on edullisesti 3H-tymidiini, Jakaantuvien T-solujen määrän « määrittäminen suoritetaan laskemalla T-solujen stimulointi- * · . indeksi standardimenetelmillä.

• ·

Keksinnön toisessa tämän näkökulman sovellutusmuodossa testi-menetelmä sisältää T-solun sytokiinivastetestin, jossa vaiheet (i)-(iii) ovat samanlaiset kuin edellä kuvatussa T-solun proli- 118373 7 feraatiotestissä ja neljännessä vaiheessa (iv) vastaavien lymfosyyttien kasvualustaan erittämien sytokiinien, kuten gamma-IFN, IL-2, IL-4, IL6, IL10, TNFa tai TGFfi, läsnäolo osoitetaan standardimenetelmillä kaupallisesti saatavilla reagenssipakkauksilla.

Toisesta näkökulmasta keksinnöllä aikaansaadaan in vivo-mene-telmä, missä valitun sekvenssin I omaavan peptidin antigeeniä injisoidaan ihonalaisesti potilaaseen ja osoitettavissa olevan ihoreaktion (DTH) esiintyminen havainnoidaan.

Esillä oleva keksintö koskee myös sellaisia välineitä, joilla voidaan suorittaa tälläisia määrityksiä, kuten myöskin reagens-sipakkauksia, joilla voidaan suorittaa tällaisia määrityksiä. Reagenssipakkaukset voidaan valmistaa siten, että niillä voidaan suorittaa mikä hyvänsä esillä olevista keksinnön toteuttamista varten kehitetyistä erilaisista määrityksistä. Jokainen tällainen testi sisältää kaikki aineet, jotka tarvi- • J taan, jotta voitaisiin suorittaa yhden ainoan tai tietyn ennal- tee . ta määrätyn määrän määrityksiä. Esimerkiksi tällaisen anti- e «e ,·. · hsp60 vasta-aineen läsnäolon määritykseen tarkoitettu reagens- • e * sipakkaus voi sisältää kiinteään faasiin kiinnitetyn eli immo- • i* *. . bilisoidun peptidin, jolla on sekvenssi I ja merkillä varuste- • » · *’ tun vasta-aineen, joka kykenee tunnistamaan määritettävän anti-hsp60 vasta-aineen muuntumattoman alueen, kuten leimalla varustettu anti-ihmis-Fab. Reagenssipakkaus voi myös sisältää ohjeet reagenssipakkauksen käyttämiseksi ja astiat reagenssi- • t • *·. pakkauksen aineita varten. Voidaan käyttää mitä hyvänsä tavan- ί]Γ omaista merkkiä tai leimaa kuten radioisotooppi, entsyymi, t.V kromofori tai fluorofori. Tyypillinen radioisotooppi on m · iodi-125 tai rikki-35. Tyypilliset entsyymit ovat piparjuuri- **\ peroksidaasi, β-galaktosidaasi ja alkaalinen fosfataasi.

• · * * -• * * ·*· *:*·: Reagens sipakkaus IDDM: n läsnäolon diagnosoimiseksi testaamalla anti-hsp60 vasta-aineen läsnäolon sisältää: δ 118373 (i) antigeenin, joka on valittu sekvenssin I omaavista peptideistä; ja (ii) merkillä varustetun vasta-aineen, joka kykenee tunnistamaan mainitun tunnistettavaksi tarkoitetun anti-hspSO vasta-aineen muuntumattoman osan.

Reagenssipakkaus, jolla diagnosoidaan IDDM, testaamalla hsp60:n kanssa immunoreagoivien T-solujen läsnäolo sisältää : (i) antigeenin, joka on valittu sekvenssin I omaavasta peptideistä; (ii) sopivan kasvualustan lymfosyyttien (T-solujen) viljelemiseksi; ja (iii) joko leimatun nukleotidin T-solujen proliferaatiotestiin :Ti tai sytokiinin, esimerkiksi gamma-IFN, IL-2, IL-4, IL-6, : j\* IL-10, TNFa tai TGFS, määrityspakkauksen sytokiini-testiä • /· varten.

* · »·* • * · · - ··, In vivo testejä varten reagenssipakkauksen tulee sisältää vain • · - \ . sekvenssin I omaavan peptidin sopivassa injektoitavassa muo-

S I

dossa.

Esillä oleva keksintö kohdistuu lisäksi IDDM:n estämiseen ja hoitamiseen tarkoitettuihin välineisiin. Rokottamalla keksin- ·· * ’· nön mukaisella sekvenssin I omaavalla antigeenipeptidillä voidaan aikaansaada tätä antigeeniä vastaan spesifisen auto- yy immuniteetin alassäätelyn ja se lisää tehokkaasti vastustus- * · '.,'t kykyä IDDM:n autoimmuuniprosessia vastaan. Sama koskee myös • * rokottamista antigeeneille spesifisillä heikennetyillä tai t i |,· · avirulenttisessa muodossa olevilla T-soluilla, tai rokottamal- *:**: la niiden antigeeni syyden lisäämiseksi tähtäävän käsittelyn jälkeen tai niiden fragmentteja tai aktiivisia fraktioita. Jos potilaalla osoittautuu olevan jo prekliinisen IDDM .-n esiasteen vaihe, tällaisen antigeenin tai T-solun (tai fraktion) inji- 1 1 8373 9 sointi voi aikaansaada tätä antigeeniä vastaan kohdistuvan autoimmuniteetin alassäätelyn ja siten pysäyttää autoimmuuni-prosessin ennenkuin se on aiheuttanut merkittävää, pysyvää haittaa. Peptidiä voidaan myös käyttää terapeuttisena aineena pysäyttämään autoimmuunista prosessia myös sen jälkeen kun se on pitkälle edennyt, kuten esillä olevan keksinnön keksijät äskettäin ovat osoittaneet hoitamalla NOD-hiiriä p277-peptidil~ lä (Elias ja Cohen, 1994).

Niinpä esillä olevalla keksinnöllä aikaansaadaan valmiste insuliiniriippuvaisen diabetes mellituksen (IDDM) estämiseksi ja hoitamiseksi, mikä valmiste sisältää sellaisesta ryhmästä valitun T-solutuotteen, joka sisältää: (a) ihmisen hsp60:n p277-sekvenssille spesifisyyttä osoittavia ihmisen T-soluja, jotka on aktivoitu inkuboimalla sekvenssin I omaavan peptidin läsnäollessa; (b) mainittuja (a)-kohdan ihmisen T-soluja, jotka on säteilytetty tai muuten heikennetty; (c) mainittuja (a)-kohdan ihmisen T-soluja, joihin on kohdistettu painekäsittely hydrostaattista puristusta käyttäen, käsittelemällä kemiallisella ristikytkevällä aineella ja/tai .···. käsittelemällä solun tukirankaa ristikytkevällä aineella.

• · · • · 1 2 • · » ·«· • · · *···1 Keksinnön edullisessa sovellutusmuodossa, valmiste sisältää • · • · ♦ *·autologisia hoidettavaksi valituista IDDM-potilaista valittuja ·· • ’·· ihmisen T-soluja, jotka on aktivoitu kontaktoimalla ne in • ·· V ’ vitro sekvenssin I mukaisella peptidillä. Tällaiset spesifi set ja aktivoidut T-solut voidaan sitten palauttaa samalle ·1·.. potilaalle, josta ne oli alunperin saatu.

··· • · • · ··· ·· • · • ·· *·1 # ♦ • · ··· · 2 « • · · • · • 1 118373 10

Esillä olevalla keksinnöllä aikaansaadaan myös sellainen farmaseuttinen koostumus IDDM:n estämiseksi ja hoitamiseksi, joka sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan ja aktiivisena aineosana vaikuttavan annoksen sekvenssin I omaavasta peptidistä tai sen suolasta tai toimivastaa johdannaista. Farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja on edullisesti öljymäi-nen väline kuten mineraaliöljyemulsio, joka tunnetaan Freundin epätäydellisenä adjuvanttina (IFA). Kuitenkin IFA, kuten myös Freundin täydellinen adjuvantti (CFA, mineraaliöljypitoinen valmiste, joka sisältää eri määriä tapettuja Mycobacterium-organismeja) ei ole hyväksytty ihmiskäyttöön, koska mineraali-öljy ei metaboloidu eikä elimistö pysty sitä hajottamaan.

Esillä olevat keksijät ovat nyt havainneet, että tietyt rasva-emulsiot, jotka ovat olleet käytössä monia vuosia ihmispotilai-den suonensisäisessä ravinnonannossa, voivat myös toimia esillä olevan keksinnön peptidien siirtovälineinä peptiditerapias- ·«« V ' sa. Kaksi esimerkkiä tällaisista emulsioista ovat kaupallisesti/ ti saatavissa olevat rasvaemulsiot, jotka tunnetaan nimellä : **: Intralipid ja Lipofund. "Intralipid" on ruotsalaisen yrityk- m ·*» : sen Kabi Pharmacian rekisteröimä tavaramerkki suonensisäiseen • * * * ·· Ϊ*. ravinnonantoon tarkoitetulle rasvaemulsiolle ja on kuvattu ,V US-patentissa 3,169,094. "Lipofund" on saksalaisen yrityksen • e -

Braun Melsungenin rekisteröimä tavaramerkki. Molemmat sisältävät rasvana soijaöljyä (100 tai 200 g 1,000 ml:ssa tislattua vettä: 10 % tai vastaavasti 20 %) . Kananmunakeltuaisen fosfoli-pidejä käytetään emulgoivina aineina Intralipidissä (12 g/1 ; *· tislattua vettä) ja keltuaislesitiiniä löytyy Lipofundista tlf V (12 g/1 tislattua vettä). Isotoonisuus saadaan aikaiseksi • · lisäämällä glyserolia (25 g/1) sekä Intralipidiin että Lipofun- ,··», diin.

·· * • i • ‘ Edelleen keksintö kohdistuu menetelmään estää ja hoitaa IDDM, *·** mihin sisältyy sellaisen farmaseuttisen koostumuksen anto sen tarpeessa olevalle potilaalle, mikä koostumus sisältää sekvenssin I omaavan peptidin tai valmisteen, joka sisältää mainituil u 118373 le keksinnön mukaisille sekvenssin I omaaville peptideille spesifisyyttä kehittäneitä T-soluja.

Kuva 1 esittää graafisesti p277:n ja p277(Val^-Val11) tn sta-biilisuudet. Suljetut ympyrät osoittavat p277:llä saatuja tuloksia ja avoimet ympyrät p277(Val^-Val11):11a saatuja. Isot ympyrät esittävät tuloksia viikon säilytyksen jälkeen, keskikokoiset ympyrät tuloksia 9 viikon kuluttua ja pienimmät ympyrät tuloksia 20 viikon kuluttua.

Kuva 2 esittää sokeritautia kehittävän (diabetogeenisen) kloonin C9 NOD-T-solujen proliferaatiota p277-peptidin (suljetut ympyrät) ja p277(Val6-Val11) :n (avoimet ympyrät) vasteena.

Kuva 3 esittää NOD-pernan T-solujen proliferaatiota peptidin p277(Lys19) läsnäollessa. Jokaisesta ikäryhmästä testattiin viiden NOD-naarashiiren pernan T-soluproliferaatio p277(Lys19)

«•I

V : (suljetut ympyrät), p277-peptidien (avoimet ympyrät) ja kont- ' i' rollipeptidin p278 (suljetut neliöt) vasteena.

« • * -» · I»* t’, - Kuva 4 esittää sokeritautia aiheuttavan kloonin C9 NOD-T-solu-• * !*, jen proliferaatiota p277 (Lys19) -peptidin vasteena.

• * s a • » a a

Kuva 5 esittää graafisesti IFA:an sisällytetyllä p277(v):llä aikaansaatua esihoidon tehokkuutta STZ-indusoiman diabeteksen estämisessä verrattuna kontrollihoitoon tai GADp34-hoitoon.

e · ! v Aina kun keksinnössä mainitaan "sekvenssin I omaava peptidi", «ta V sillä tarkoitetaan myös niiden suoloja ja toimivia johdannai- • a siä, edellytyksenä on että peptidin biologinen aktiivisuus t · ,··ί diabeteksen suhteen säilyy.

• aa v * • » : Peptidi I:n "suolat" tarkoittavat keksinnössä fysiologisesti ”**·' hyväksyttäviä orgaanisia ja epäorgaanisia suoloja.

Peptidin I "toimivat johdannaiset" käytetään tässä kattamaan sellaiset johdannaiset, jotka voidaan valmistaa funktionaali 118373 12 sista ryhmistä, jotka esiintyvät jäännösten sivuketjuissa tai N- tai C-terminaalisessa ryhmässä, käyttämällä tekniikasta tunnettuja välineitä ja menetelmiä ja sisällytetään keksintöön aina kun ne ovat edelleen farmaseuttisesti hyväksyttäviä, s.o. ne eivät tuhoa peptidin aktiivisuutta verrattuna sen yhtäläisyyteen p277:n tunnettuun aktiviteettin, eivätkä aiheuta toksisia ominaisuuksia niitä sisältäville koostumuksille, eivätkä vaikuta haitallisesti sen antigeenisiin ominaisuuksiin. Tällaisilla "toimivilla johdannaisilla" ei ole tarkoitus kattaa muutoksia, jotka toimivasti muuttavat yhden aminohapon toiseksi.

Ylläesitettyjen vaatimusten johdosta kyseiset johdannaiset voivat esimerkiksi käsittää karboksyylihappojen alifaattiset esterit, karboksyylihappojen amidit, jotka valmistetaan antamalla niiden reagoida ammoniumin tai primäärisen tai sekundäärisen amiinin kanssa, aminohappojäännösten vapaiden aminoryh-mien N-asyylijohdannaiset, jotka muodostuvat asyyliryhmän * * * *.* (esimerkiksi alkanoyyli- tai karbosyklinen aroyyliryhmä) tai vapaan OH-ryhmän O-asyylijohdannaiset (esimerkiksi seryyli-: tai treonyylijäännös) , jotka muodostuvat reaktiossa asyyliryh- män kanssa.

• * .·.·. Keksinnön mukaisen sekvenssin I omaavaa peptidiä voidaan käyt tää immunogeenina farmaseuttisissa koostumuksissa, erityisesti rokotteissa IDDMm lieventämiseksi ja hoitamiseksi kuten myöskin antigeeninä diagnostisissa koostumuksissa. Nämä farmaseuttiset ja diagnostiset koostumukset, jotka voidaan valmistaa * * • " tekniikassa tunnetuin menetelmin muodostavat myös osan esillä • · * * olevasta keksinnöstä.

* · • · · • * ,·*·. Esimerkit • - Materiaali ja metodit • * ** * * * * * * # * < * (i) Hiiret. Umpisiitetyt NOD/Lt-kannan hiirinaaraat saatiin Weizmann instituutin Animal Breeding Center'istä, Rehovot, Israel. Kyseiset hiiret kehittävät 14-17 viikon ikäisinä 118373 13 itsestään eli spontaanisti autoimmuunisen sokeritaudin, joka muistuttaa ihmisen XDDM-tautia.

(ii) Peptidit. Peptidit syntesoitiin standardoitua Fmoc-kemiaa käyttäen ABIMED-synteesilaitetta (FRG) ja puhdistettiin HPLC-käänteisfaasikromatografilla. Sekvenssit varmistettiin aminohappoanalyysillä. seuraavat peptidit syntesoitiin: p277-peptidi; kontrollipeptidi p278, jolla oli sekvenssi: Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile (SEK ID NO:10), joka vastaa positioita 458-474 ihmisen hsp60-molekyylissä; p277:n fragmentteja; p277:n (p277.N) aminopuolta, p277:n (p277.C) karboksyylipuolta ja p277C:ää yhdistettynä p278:aan (p277.C-p278), peptidiä p277(Lys19); ja peptidiä p277, jossa on erilaisia substituutioita kahden kys-teiinijäännöksen kohdalla seuraavassa sekvenssissä: siltaamuo-dostavia SH-ryhmiä sisältävä p277 (p277(silloitettu

Cys-Cys)); p277, jossa molemmat kysteiinijäännökset on korvat- **' tu valiinilla (p277(Val^-Val^1)) tai seriinillä (p277(Ser^-

Ser11)).

»Il

• * I

• * · * * :/·: (iii) Hoito ja seuranta. Hiiret käsiteltiin p277-peptidiä, muita peptidejä, tai naudan seerumialbumiinia (BSA, ostettu yrityksestä Sigma, St. Louis, Mo, USA) sisältävillä emulsioil- * la ja annettiin 0,1 ml:n tilavuuksina injisoimalla ihonalaisesti selkään. Antigeeni laimennettiin PBS:llä ja emulgoitiin käyttäen samaa mineraaliöljytilavuutta (Freundin epätäydelli- .. nen adjuvantti (IFA); Sigma) tai 10 %:lla Intralipid:illä.

Hiirien veren glukoositasot testattiin kymmeneltä aamupäivällä • · ’·’ _ paastoamattoma olevassa tilassa kuten on kuvattu julkaisussa (Elias et ai., 1991) hoidon aikana (7, 12, 15 tai 17 viikon * » ikäisenä) ja niissä hiirissä, jotka jäivät eloon 40 viikon • * * . *.* iässä. Merkittävänä hyperglykemiana pidettiin glukoosipitoi- ; suutta, joka oli ll.l mM/L tai suurempi, koska tämä veren glukoosipitoisuus oli 3 standardipoikkeamaa korkeampi kuin keskimääräinen veren sokeripitoisuus mitattuna 100 terveestä hiirestä (ei näytetty). Haiman saarekkeiden histologinen tutkiminen tehtiin leikkeistä, jotka oli värjätty hematoksylii- 118373 14 nillä ja eosiinilla. Leikkeet pisteytettiin kahden riippumattoman havainnoitsijan avulla, jotka molemmat olivat tietämättömiä ryhmien identiteetistä. Chi-square-testiä käytettiin varmistamaan statistinen eroavuus erilaisten hoitojen välillä.

(iv) T-solujen lisääntymismääritys. NOD-hiirinaaraista saadut kloonin C9 solu- ja pernasolususpensiot testattiin T-solu-proliferaation suhteen, kuten on kuvattu edellä (Elias et ai., 1991). Lyhyesti, 1 x 105 kloonisolu/ml tai 1 x 108 splenosyyt-tiä/ml inkuboitiin neljässä erässä 72 tuntia 0,2 ml:ssa kasvualustaa mikrotiitterikuopissa erilaisten antigeenien 0,5 Mg/ml läsnäollessa tai puuttuessa. Lisääntyminen mitattiin [3H]-tyrni-diinin inkorporoitumisena DNA:hän inkuboinnin viimeisten 12 tunnin aikana. Tulokset laskettiin stimulointi-indeksinä; testissä saadun cpm:n keskiarvon suhde antigeenin läsnäollessa taustan cpm:n keskiarvoon antigeenin puuttuessa. Standardi- ... poikkeama (SD) neljästä rinnakkaiskokeesta oli aina <10 % * · « * , keskimääräisestä cpmistä. Tausta oli <1000 cpm:ä splenosyytti- « 1 ·· '1·· kokeessa ja <200 cpm:ä C9-soluja käytettäessä. Jokaisen hii- ♦ % 1 *♦"' ren perna testattiin erikseen. Jokaisen hiiriryhmän tulokset *.1·; esitetään keskiarvona + SD.

• · • « • 1 1 « ' t : Esimerkki 1 NOD-hiirten käsittely p277:llä tai sen fragmenteilla

Sen testaamiseksi oliko jokin kahdesta p277 peptidin 12-amino- :·, happopuolikkaasta, yksin tai yhdistettynä tehokkaampi kuin [... peptidi p277 NOD-hiirissä, NOD-hiirinaaraita käsiteltiin 7 • 1 *. , viikon ikäisinä ihonalaisella inokuloinnilla 50 μg:n erissä * · V,' olevilla erilaisilla öljyyn sisällytetyillä peptideillä. Hiir- » · · ten tila eli status määritettiin kun ne olivat 40 viikon ikäi- • · • 1 siä.

• · · ·1· · ·

Tulokset esitetään taulukossa 1. Voidaan todeta, että kontrollina käytetyllä hsp60-peptidillä p278 ei ollut mitään vaikutusta sairauden kehittymiseen. Neljästäkymmenestä käsitellystä hiirestä kaikilla oli diabetes ja 90 % niistä olivat

IS

118373 kuolleet kun niiden ikä oli 40 viikkoa. Sitä vastoin peptidi p277 esti täysin niiden kuolemisen ja paransi 60 % kahdestakymmenestä käsitellystä hiirestä. Peptidin p277 fragmentit olivat vähemmän toimivia: p277:n aminohappopuolikas (p277.N), p277:n karboksyylipuolikas (p277.C) ja molemmista koostuvan seoksen (p277.N,p277.C) toimivuus oli vain puolet ehjän p277 toimivuudesta. Peptidi p277.C syntesoitiin kiinnitettynä peptidiin p278 pidemmän proteiinin aikaansaamiseksi; kuitenkin p277.C-p278 ei ollut parempi kuin p277.C yksin. Sen vuoksi voidaan päätellä että täydellisen terapeuttisen toimivuuden aikaansaaamiseksi tarvitaan kokonainen p277 peptidi.

Taulukko 1 NOD-hiirten käsittely p277:llä tai sen fragmenteilla ,,, Status 40 viikon kestoisessa sokeritaudissa V - Peptidi- Hiirten Terveet Hyperglykeemiset Kuolleet käsittely (50 μg) luku % % % • * « «ti ♦ · * p278 40 0 100 90 * · · j p277 20 60* 40 0* ‘ V p277.N 20 20 80 50* V ; p277.C 20 30 70 40* p277.N, p277.C 20 35* 65 40* p277.C-p278 20 25 75 50* •\t * p<0,0l verrattuna kontrollipeptidillä p278 hoidettuun ryh- « .*:* mään • · « * # • i • · * V. Esimerkki 2 • · · NOD hiirten käsittely p277:n substituoiduilla peptideillä « · * · • · • · * * * · * .... Seuraavat peptidit testattiin NOD-hiirissä: p277, p277 (silloi tettu Cys-Cys), p277 (Val^-Val11) ja p277 (Ser6-Ser·1·^) .

NOD-naaraita käsiteltiin 100 μg:lla peptidiä sisällettynä 0,2 ml-.aan mineraaliöljyemulsiota (IFA) ihonalaisesti annettuna.

118373 ie

Hiiret käsiteltiin 12 viikon ikäisinä ja sokeritaudin esiintyminen todettiin 30 viikon iässä.

Kuten taulukossa 2 esitetään, p277 (Val^-Val11) oli yhtä tehokas kuin p277 diabeteksen hoidossa, hoitamattomissa hiirissä diabeteksen esiintyminen oli 80 %, kun taasen p277:llä ja p277(Val^-Val11):llä käsitellyillä hiirillä esiintyminen oli 22 % ja vastaavasti 23 %. Toisaalta p277:llä (silloitettu Cys-Cys) samoin kuin p277(Ser^-Ser11):llä ei ollut hoidollista tehoa. Kaksi muutaa p277:n muunnosta, joissa kysteiinijäännökset kohdissa 6 ja 11 korvattiin alaniinilla tai gamma-amino-voihappojäännöksellä, olivat myöskin tehottomia kun ne testattiin in vitro kloonista C9 peräisin olevissa soluissa ja NOD-pernasta peräisin olevissa T-soluissa. Koska anti-p277-spesifiset T-solut eivät tunnistaneet näitä kahta peptidiä (ei näytetä), niitä ei testattu sen enempää in vivo-hoidon toimi-vuuden osoittamiseksi.

• » 4 • · -t * 1

Taulukko 2 NOD-hiirten käsittely p277-substituutioilla • · · • ♦ - • V Peptidikäsittely Diabeteksen Vastaanottajien esiintyminen (%) lukumäärä * « - ei mitään 80 100 p277 221 200 p277(silloitettu Cys-Cys) 702 10 p277 (Val6-Val1;L) 231 52 p277 (Ser6-Ser11) 852 20 * · • » 1 v · • · · • · » · :"\ 1 p<0,01 verrattuna diabeteksen esiintymiseen hiirillä, jotka on käsitelty pelkästään adjuvantilla • 1V 2 Ei merkittävää eroa verrattuna diabeteksen esiintymiseen hiirillä, jotka on käsitelty pelkällä adjuvantilla.

• · 1 « · 2 » 118373 17

Esimerkki 3 p277(Val6-Val11):n stabiilisuus

Koska syy kysteiinien korvaamiseen oli p277-peptidin ongelmallinen stabiilisuus, p277(Val6-Val11):n stabiilisuus testattiin useina ajankohtina sen synteesin jälkeen. Peptidi p277 on epästabiili ja hajoaa myös tarkkaan säädellyissä olosuhteissa (kylmäkuivattu eli lyofilisoitu jauhe vakumissa -20 °C).

Jotta voitaisiin verrata p277:n stabiilisuus sen p277(Val6-Val11)-analogiin, molemmat peptidit syntesoitiin samanaikaisesti ja säilytettiin kuivana jauheena -20 °C:ssa. Näyte punnittiin, liuotettiin ja testattiin 1, 9 ja 20 viikon kuluttua synteesin jälkeen. Peptidin stabiilisuuden osoittimena käytettiin sen kykyä stimuloida T-solukloonia C9. Kuvassa 1 esitetään kokeen tulokset. Voidaan todeta, että kun alkuperäinen ,,, (natiivi) p277 menetti suurimman osan tehostaan 9 viikossa ja *, kaiken tehon 20 viikossa synteesin jälkeen, p277(Val^-Val11) t « ·- **" oli muuttumaton 20 viikon säilytyksen jälkeen. Koska usko- » « · *·:· taan, että p277:n epästabiilisuus aiheutuu Cys-jäännöksistä V* voidaan olettaa, että millä hyvänsä keksinnön mukaisista analo- * · • *· geista, joilla p277:n biologinen aktiivisuus on säilynyt on :V parempi stabiilisuus p277-peptidiin verrattuna osoitettuna esimerkissä p277(Val^-Val11):lle muistuttavalla tavalla.

Esimerkki 4 ;·, NOD naarashiirten käsittely p277:lla tai p277 (Val6-Val1:L) :llä f % saa insuliitin parantumaan • · • * » · V,’ NOD-hiirinaaraat käsiteltiin 12 viikon ikäisinä ihonalaisesti :)11- 100 μg:lla modifioimatonta p277 tai p277 (Val6-Val1:L) 0,1 • V ml:ssa mineraaliöljyemulsiota (Freundin epätäydellinen adju- « · ' ’ vantti) per hiiri. Kontrollihiiret saivat PBS-emulsiota ja mineraaliöljyä. Kun hiiret olivat 6 kuukauden ikäisiä uhrattiin 5 hiirtä jokaisesta ryhmästä, niiden haimat poistettiin ja fiksattiin bouiinissa ja leikkeet värjättiin hematoksyliini-eosiinilla. Insuliitti pisteytettiin sokkotestinä. Koska 118373 18 kontrollihiirille kehittyi pahalaatuinen diabetes ne uhrattiin 5 kuukauden ikäisinä. Siinä vaiheessa kontrollihiirten veren sokeripitoisuus oli alueella 29-48 mmoolia/1. Tulokset osoitetaan taulukossa 3.

Taulukko 3 NOD-hiirinaaraiden käsittely p277:lla tai p277 (Val^ValU) :llä saa insuliitin parantumaan

Peptidi- Saarekkeiden Histologinen tarkistus (22 viikkoa) käsittely lukumäärä kirkas insuliitti sisä- (12 viikkoa) ulkosaareke saareke % % %

Ei mitään 83 10 23 67 p277 49 25 69 6 p277 (Val^-Val^·1) 62 52 31 17 ϊ,ί : Hoidon kestettyä 12 viikkoa hoitamattomien hiirien saarekkeis- ; sa noin 60 %:ssa voitiin todeta sisäsaarekkeen insuliittia, · · • ·*· noin 20 %:ssa ulkosaarekkeen insuliittia ja noin 20 %:ssa ei • · * * * ·* .·, ; voitu todeta mitään insuliittia. Sisäsaareke-tiivistymää pide- ··. tään pahalaatuisena insuliittina, johon kytkeytyy β-solutoimin- f · - v nan puuttuminen. Kuten näkyy taulukosta 3, merkittävä eroa- • i - ’ vuus saarekkeiden ulkonäössä kehittyi kahdessa käsitellyssä ryhmässä verrattuna kontrollihiiriin, jotka käsiteltiin pelkällä öljyllä. Hiirillä, jotka oli käsitelty öljyllä (kontrollit) voitiin osoittaa progressiivinen lasku sairautta kehittämättö- ·» • *·- mien saarekkeiden määrän suhteessa ja vain 10 % normaaleja • e* ϊ,ί saarekkeita voitiin todeta 22 viikon iässä ajankohtana, jol- ,V* loin kaikki hiiret olivat avoimesti sokeritautia potevia. Noin * · 67 %:ssa saarekkeista oli sisäsaareke-insuliitti 22 viikon 9 jälkeen ja lopuissa 23 %-.ssa saarekkeista oli ulkosaareke- • · : insuliitti. Sitä vastoin hiiret, jotka oli käsitelty p277:llä ’·** tai p277 (Val^-Val11) :llä osoittivat nousun normaalien saarek keiden lukumäärässä (25 ja 52 % välillä) ja laskun sellaisten saarekkeiden lukumäärässä, jossa on sisäsaarekkeiden insuliitti (6 % ja 17 % välillä). Niiden saarekkeiden lukumäärä, joissa oli ulkosaarekkeiden insuliitti, nousi noin 31 - 69 %.

118373 19

Siten, p277 ja p277 (Val^Val11) käsittely oli kytkeytynyt parantuneeseen histologiseen kuvaan, mikä on yhteensopivaa sellaiseen insuliittiasteen parantumiseen, joka kesti yli 3 kuukautta hoidosta.

p277 (V):tä käyttäen NOD-hiirinaarailla saatuja lisätuloksia.

Viisitoista lisäkoetta tehtiin, missä jokaisessa ryhmässä, johon kuului 10 NOD-hiirinaarasta, jokainen käsiteltiin öljyssä olevalla p277(V):llä tai pelkällä ölyllä 12-15 viikon ikäisinä. Niistä 150 hiirestä, jotka käsiteltiin pelkällä öljyllä, 90 %:lle kehittyi diabetes ja 85 % kuoli 32 viikon iässä. Sitä vastoin p277(V):llä käsitellyillä hiirillä ainoastaan 50 %:ssa (p<0,01) ilmeni diabeteksen esiintyminen ja ainoastaan 20 % kuoli vakavan sairauden seurauksena (p<0,01). Siksi, myöhäinen käsittely p277(V):llä oli tehokas letaalisen diabeteksen kehittymisen katkaisemisessa.

» i -» * * ♦ : ***» Esimerkki 5 t

Tyypin I diabetes peptiditerapia käyttäen p277 (Vai6- f

Vai11) :ta lipidiemulsiossa.

• · • » * * -

Insuliinia tuottavien S-solujen autoimmuuninen tuhoutuminen haimassa on T-lymfosyyttien välittämä. Tulehduksellinen tiivistymä kehittyy haiman saarekkeiden ympärille noin 5-8 viikon iässä ja S-solujen tuhoutuminen johtaa insuliinipuutokseen ja ... siihen että selvä diabetes puhkeaa 14-20 viikon iässä vaikut- ♦ »* taen miltei 100 %:iin NOD-hiirinaaraista 3 5-40 viikon iässä.

• « • a • · • a ί.ί. NOD-hiirinaaraat käsiteltiin antamalla ihonalaisesti 100 /xg peptidiä p277 (Val^Val11) hiirtä kohden 0,1 ml:ssa PBS:ää tai , V 10 %:ssa lipidiemulsiota, joka koostuu soijaöljystä 10 %, *** " kananmunan fosfolipidistä 1,2 % ja glyserolistaa (Intralipid, *»»»

Kabi Pharmacia Ab, Ruotsi) .

Diabeteksen esiintyminen 6 kuukauden iässä ja anti-p277(Val6-Val11) :n vasta-aineita seurattiin. Pysyvä hyperglykemia eli 118373 20 veren glukoositasot, jotka olivat yli 11,1 mmoolia/1 mitattuna ainakin kaksi kertaa viikon väliajoin käyttäen Beckmanin Glu-koosianalysaattoria II diagnosoitiin diabeteksenä. Onnistuneena peptidikäsittelynä pidettiin mittaustuloksia, joilla todettiin normaalin veren glukoosipitoisuuden ylläpito (vähemmän kuin 11,1 mmoolia/1), haimasaarekkeiden sisäsaareketulehduksen (insuliitti) lieveneminen ja vasta-aineiden indusoituminen terapeuttisille peptideille käyttäen TH2-tyyppistä immuunivastetta indikaattorina. Tulokset esitetään taulukossa 4.

Taulukko 4

Diabeteksen esiintyminen 6 kuukauden iässä Käsittely Diabeteksen Kuolema (%) esiintyminen (%) :T; p277(Val6-Vali:L)/PBS 90 80 : p277 (Val6-Val1;L)/Intralipid 45* 20* * · · . ei mitään 100 90 • * · • 4 f * * * ' * p<0,01 verrattuna käsittelmättömiin NOD-hiiriin.

* · · t 4 « 4 • · ·

Kuten taulukosta 4 voidaan todeta, käsittely keksinnön mukai sella peptidillä antamalla se Intralipid:issä oli tehokasta diabeteksen esiintymisen ja kuoleman vähentämisessä. Toisaalta käsittely PBS:ssä annettuna oli tehoton.

* « 4 » • · · • : i Esimerkki 6 .•V Peptidit p277 ja p277(Val6-Val11) ovat immunologisesti ristiin • m reagoivia.

• ψ • m 4 • · ·,· · T-solukloonin C9 solut, jotka oli eristetty diabeteksen esi- ·:·*: asteita potevista NOD-hiiristä inkuboitiin peptidin p277 (sul jetut ympyrät), p277 (Val^Val11) (avoimet ympyrät, p277(Ser6-Ser11) (suljetut neliöt) ja p277(silloitettu Cys-Cys) avoimet vinoneliöt). Tulokset esitetään kuvassa 2. Kloonin C9 todettiin ilmentävän positiivisen proliferäätion vasteena pelkästään peptideille p277 ja p277(Val^-Val11):ta. Tämä todistaa 118373 21 sen, että p277 ja p277 (Val^-Val^·1) reagoivat ristiin ja että peptidit p277(Ser^-Ser11) ja p277 (silloitettu Cys-Cys), jotka eivät ole terapeuttisesti toimivia eivät ole immunologisesti ristiinreagoivia.

Esimerkki 7

Vastadiagnosoidut IDDM-potilaat osoittavat T-solu-proliferaa-tiota sekä p277.-n että p277 (Val6-Val11) :n vasteena

Vastadiagnosoidut (2-4 viikkoa) IDDM-potilaat testattiin proli-feräätiomenetelmällä. Perifeerisen veren lymfosyytit eristettiin heparinoidusta kokoverestä ficol-hypaque:illa, ja seulottiin in vitro proliferaation suhteen, joka mitattiin 3H-tymi-diinin inkorporoitumisena hsp60:n peptidien p277, p277(Val6-

Val11) ja kontrollipeptidin p278 indusoimana. T-soluproliferaa-* tion vaste esitetään stimulointi-indeksinä (SI) : peptidisti- muloidun tymidiinin inkorporoitumisen ja taustan (ei lisätty antigeeniä) tymidiini-inkorporoitumisen suhteena T-soluissa.

• * • « * • · * * ·

Taulukko 5

Vastadiagnosoidut IDDM-potilaat osoittavat T-solu-proliferaa-tiota vasteena sekä p277:lle että p277(Vai6-Vai11):lle

Potilas T-solu lisääntyminen (SI) p277 p277(Val6-Val13·) p278 Γ·.. IDDM #68 3,5 3,2 0,8

:*·*: IDDM#69 2,5 5,0 0,S

* • · • * · * • ·

Kuten taulukossa 5 esitetään, vastadiagnosoidut IDDM-potilaat • · antavat vasteen p277 (Val6-Vai.H) : lie kuten myöskin peptidille p277. siksi p277(Val^-Val11) on immunologisesti ekvivalentti ·:··: p277:lle. Koska p277:n terapeuttinen tehokkuus välittyy immu nologisen tunnistamisen kautta, se tosiasia että p277(Val^-ValU) on p277:n kanssa immunologisesti ristireagoiva, osoittaa, että sitä voitaisiin käyttää p277 tilalla diabeteksen hoitamisessa.

118373 22

Esimerkki 8 T-solujen vaste hsp60:een ja peptidiin IDDM-tautia potevissa ja terveissä yksilöissä

Seulottiin 21 IDDM-potilasta ja 14 tervettä verenluovuttajaa anti-hsp60:n ja anti-p277(V):n läsnäolon toteamiseksi esimerkki 7 mukaisen proliferaatiotestin avulla. Taulukot 6 ja 7 osoittivat T-solu-proliferaatiovasteen (stimulointi-indeksi; SI) jokaisesta yksilöstä kontrolliantigeeniä (kontrolli Ag) # s.o. tetanus toksoidia ja influensa virusta - Texas kantaa, kokonaista yhdistelmä-hsp60:tä ja p277(V):tä vastaan. SI-arvo-ja 3 tai suurempi pidettiin positiivisena.

# · » • « v » f I * * · • « · • ·* * • · » • · • « 9 « * • · < « · ♦ • · • t * * * * - · • * * • · * • · • » • ♦ » • · -• · • · • * • · » m · • · • · · • t * · ·· · * ♦ « · · • · · ····* • *

Taulukko 6 118373 23 T-soluproliferaatiovaste IDDM-potilaissa

Potilas Ikä Aika T-solu vasteet diagnoosista (stimulointi-indeksi) (vuosia) (viikkoja/ kontrolli hsp60 p277(V) kuukausia) Ag 1. LM 32 3,5 kuukautta + + 2. G 25 24 kuukautta + + 3. H 23 6 kuukautta + + 4. DV 20 3 viikkoa + + 5 viikkoa + + + 5. SD 15 6 viikkoa + + + 6. P 15 4 viikkoa + - 7. G 601 5 viikkoa + + + * · ♦ : 7 viikkoa + + + * ϊ,;,· 8. F 451 6 viikkoa + + + : : · 9. IS 53 2 viikkoa + + « ·« 10. T 20 4 viikkoa + + + * 11. KK 21 4 viikkoa + + ,N\ 12. Rl 40 6 viikkoa + - • 13. MS 5 1 viikko + - 14. KB 5 2 kuukautta + + + 15. BI 11,3 3 viikkoa + - 16. YY 60 2 kuukautta + + * » : ’1 17. KA 12 4 viikkoa - - «•e *.1 18. ZA 12 4 viikkoa + + + * 1 ;1:1 19. A 17,5 11,5 vuotta + + + % · .··· 20. N 17,5 7,5 vuotta + + + • · ·· 21. A 19,7 5,7 vuotta + + + • · · • ♦ ·«« 1 • 1 • «

Anti-GAD vasta-aineille positiiviset potilaat ovat tyypin I eikä tyypin II diabeetikkoja huolimatta korkeasta iästä puhkeamisen sattuessa.

Taulukko 7 118373 24

Proliferaatiivinen T-solu-vaste terveissä verenluovuttajissa

Luovuttaja T-solu vasteet (stimulointi-indeksi) kontrolli hsp60 p277(V)

Ag 1 + - 2 + “ 3 + nd + 4 + - 5 + + + 6 + - 7 + - 8 + - - 9 + - ::-io + - »«*11 + + - * « 4 »I» , 12 + - 9 9 999 »13 + + :v; i« ♦ - 9 9 9 9 9 9 9 9 9 * * · * 9 nd: ei tehty

Taulukko 8 on yhteenvetotaulukko, joka osoittaa, että 86 % ja :’*. 52 % potilaista antoivat vasteen hsp60:lle ja p277(v):lle verrattuna 21 % ja 14 % kontrolleilla (p<0,05). Siten IDDM- 9 «V ryhmällä oli merkittävä positiivinen T-soluvaste hsp60:lle ja p277 (V) :lie. Tämä johtaa siihen päätelmään että hsp60:n ja • p277(V):n esiintyminen reaktiivisissa yksilöissä on korkeampi jj*: IDDM-potilaiden joukossa kuin terveiden ihmisten joukossa.

9999 f 25 1 1 8373

Taulukko 8

Positiivisen T-solu vasteen esiintyminen IDDM-tautia potevissa ja terveissä yksilöissä

Vasteen- T-solu vasteen esiintyminen (%) kehittäjä hsp60 p277(V) IDDM 18/21 (86) 11/21 (52)

Terve 3/14 (21) 2/14 (14) * p<0,05 X2-analyysillä verrattuna anti-p277(V):lie vastetta kehittävien esiintymiseen terveissä verenluovuttajissa.

Esimerkki 9 NOD T-soluproliferaatio p277(Lys19) vasteena • •a * · -• · * v Peptidin p277(Lys19) ja p277 välillä on yhden aminohapon ero.

***; Jotta voitaisiin vahvistaa, että p277 (Lys19) on autoantigeeni • » a ';·· NOD-IDDM:ssä, T-solujen proliferaatiota verrattiin peptidiin *** p277 ja peptidiin p277(Lys19). Kuvassa 3 osoitetaan, että ·· ί ’* NOD-naaraspernoista peräisin olevat T-solut proliferoivat • t V vasteena peptidille p277(Lys19) saman verran kuin vasteena p277:lle. Mitään vastetta ei syntynyt kontrollipeptidistä p278.

j·,^ Ylläolevat tulokset vahvistettiin käyttämällä kloonia C9, )··· diabetestä kehittävä NOD T-soluklooni, joka osoitettiin reagoi- • · van vasteena ihmisen p277-peptidille (Elias et ai., 1991). V. C9-solujen todettiin proliferoivan vasteena p277(Lys19)-pepti- i...' dille saman verran kuin p277-peptidille (kuva 4) .

* · * · • 9 * • · -

Esimerkki 10 • 999' NOD-naarashiirten käsittely p277(Lys19):llä

Esillä olevat keksijät ovat aikaisemmin raportoineet, että pitkälle edennyt insuliitti, joka on puhjennut kolmen kuukauden ikäisissä NOD-hiirinaaraissa voitiin pysähdyttää yhdellä ainoalla ihmisestä peräisin olevalla p277-injektiolla; käsitel 1 1 8373 26 lyissä hiirissä esiintyi vähemmän kliinisesti selvää diabetes-tä ja vakavasta hyperglykemiasta aiheutuvaa kuolemaa. Jotta olisi saatu selvitettyä onko peptidi p277(Lys19), hiiren oma p277-peptidi myös tehokas, käsittelimme kolmen kuukauden ikäisiä NOD-hiirinaaraita 100 /xg:lla joko ihmisen p277-peptidiä tai p277(Lys19)-peptidiä IFA:ssa.

Peptidit p277 tai p277(Lys19) 2 mg/ml:n pitoisuuksina fosfaat-tipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) emulgoitiin yhtä suurella tilavuudella Freundin täydellistä adjuvanttia (IFA). Ryhmät, joihin kuuluivat kymmenen kolmen kuukauden ikäistä NOD-hiirinaarasta injektoitiin PBS- ja IFA-emulsiolla. Hiirestä otettiin verinäytteet joka neljäs viikko ja veren glukoosi-tasot määritettiin Beckmanin Glukoosianalysaattorilla XI. Hyperglykemian ja diabeteksestä aiheutuvan kuoleman esiintymi- ·»· ϊ,ϊ ' nen pisteytettiin 6 kuukauden iässä. Hiiret pidettiin diabee- ϊ jV tikkoina, jos niiden veren glukoosi oli suurempi kuin 11 • mmoolia/1.

»·« * • 1 • 1 - * ··, Tulokset esitetään taulukossa 9. Kun hiiret olivat 6 kuukau- t 1 - [·,·. den ikäisiä 90 % kontrollihiiristä oli selvästi hyperglykeemi- * · ‘ siä ja 60 % oli kuollut diabetekseen. Sitä vastoin käsittely joko p277:llä tai p277(Lys19):llä esti sekä diabeteksen (10 % ja 20 % esiintyminen vastaavasti) ja kuoleman (10 % ja 20 % vastaavasti). Siten hiiren oma peptidi p277(Lys19) näyttää • t : ’1 olevan yhtä toimiva kuin vieras p277 pitkälle edenneen insulii- • f · V tin hoidossa.

• « % · • · ' « 1 ,···, Taulukko 9 "1· Diabeteksen hoito p277:llä ja p277(Lys19):llä • · · f · 1 « · · "**· Hoito 3 kk:n Diabetes 6 kuukauden iässä ikäisenä Hyperglykemia (%) Kuolleisuus p277(Lys19) 501 201 p277 40 101 PBS 901 60 p<0,05 118373 27 Nämä tulokset osoittavat, että NOD-T-solujen proliferäätiovas-te, joka havaitaan käyttäen ihmisen hsp6o-molekyyliä ja sen p277-peptidiä on ekvivalentti autoimmuuniseen vasteeseen, joka syntyy hiiren hsp60-proteiinia ja hiiren p277(Lys19)-sekvenssiä vastaan. Tämä osoitettiin diabetesta kehittävällä C9 T-solukloonilla sekä myöskin itsestään syntyvälle vasteelle, joka kehittyy prediabeettisten hiirien pernassa. Lisäksi p277(Lys19) oli yhtä toimiva kuin p277 diabeteksen hoidossa NOD-hiirissä. Iän ja sukupuolen suhteen yhteensopivien muiden kantojen hiirien pernojen T-solut eivät osoittaneet spontaanisesti syntyvää T-soluproliferaatiota vasteena p277:lle (ei näytetty)

Sellaisen autoimmuniteetin löytyminen hiiren hsp60-sekvenssil- le, joka on diabetesta kehittävien T-solujen kohdistama tukee iT yleistä uskomusta siitä, että IDDM aiheutuu autoimmuunisesta : }*: prosessista.

$ * • · ·«·

Esimerkki li • * - ··, STZ-indusoidun diabeteksen hoito p277 (V) :llä t «· « * • I ‘ • · ’ Streptotsosiini (STZ) on β-soluspesifinen toksiini, joka voi aiheuttaa toksisen diabeteksen tuhoamalla β-soluja 24-48 tunnissa, jos injisoidaan yksi 200 mg/kg sisältävä annos. Annettaessa pieninä subtoksisina annoksina se indusoi geneettisesti • e • *·· alttiissa hiirissä diabetekseen johtavan insuliitin. Inflamma- ·«« i/ toorinen prosessi voi kestää 20-30 päivää riippuen STZ-annok- .V* sesta. Ohjesäännön mukainen protokolla STZ-indusoidulle dia- betekselle on 200 mg STZ:a kg kehopainoa kohden annettuna "*» viitenä yhtä suurena 40 mg/kg:n annoksena perättäisinä päivinä • · :.· : (Like and Rossini, 1976) ja tätä mallia kutsutaan nimellä matala-annos STZ. Totesimme, että jos kokonaisannos pienennetään 150 mg/kg (30 mg/kg x 5), diabetes kehittyyy 80-100 päivässä. Tämä hitaasti kehittyvä STZ-indusoidun diabeteksen muoto muistuttaa luultavasti enemmän ihmisen autoimmuunista diabetesta ja on samankestoinen kuin prekliininen vaihe spontaanisesti syntyvässä diabeteksessä NOD-hiirissä (Castano and 28 118573

Eisenbarth, 1990). Lisäksi akuuttinen toksinen vaikutus pienenee kun annosta pienennetään.

Sekä NOD-diabeteksessä (Elias et ai., 1990) että STZ-indusoi-dussa (Elias et ai., 1994) diabeteksessa 60 kDa lämpöshokkiproteiinilla on tärkeä rooli. Aikaisemmin keksijät ovat esittäneet että sekä vasta-aine että T-solun proliferaatiovaste hsp60:ä vastaan tapahtuu ennen selvän eli akuutin diabeteksen puhkeamista. T-solukloonit, jotka ovat spesifisiä hsp60:lle saatiin esidiabetestä potevista NOD-hiiristä ja ne pystyivät omaksuen (adoptatiivisesti) siirtämään insuliitin ja hypergly-kemian nuoriin NOD- (Elias et ai., 1991) tai rytS NOD-hii-riin. NOD-sokeritautia aiheuttavat T-solukloonit tunnistavat 24 aminohapon pituisen peptidin hsp60:n sekvenssistä 437-460, jota tässä kutsutaan p277:ksi. STZ-indusoitua diabetesta seu-;*·*: raa myös anti-p277 T-soluvasteen syntyminen prekliinisessä . »' vaiheessa.

·»» ♦ « I * * .·, : Edellä kuvatut esimerkit ovat osoittaneet, että p277(Val6- f * .. Vai11) peptidi suojaa NOD-hiiriä. Esillä olevalla kokeella * \ Y. testataan p277(V) käsittelyn tehokkuutta matala-annos-STZ-mal- • · Γ lissa. Uroshiiret, 10 per ryhmä, käsiteltiin 30 mg/kg:n STZ-annoksella päivittäin viitenä päivänä. Viikkoa myöhemmin hiiret käsiteltiin 100 μg:lla joko p277(V):tä öljyssä, gluta-miinihappo dekarboksylaasin peptidiä (GADp34), jonka Kaufmann 9 * S V et ai., 1993 on kuvannut liittyvän diabetekseen. NOD-hiirissä i*j* tai pelkällä öljyllä. Käsittely toistettiin 85 päivän jälkeen, i*.* Hiiristä otettiin verinäytteet 100 päivän jälkeen ja niiden t 9 Y veri testattiin hyperglykemian (glukoosipitoisuus suurempi **;·, kuin 15 nmoolia/1) suhteen. Tuioksista on tehty yhteenveto kuvassa 5. Voidaan todeta, että keskimääräinen veren glukoosi *;♦»: hiiriryhmässä, joka oli käsitelty GADp34:llä tai oli käsitte lemättä oli hyperglykeemisellä alueella. Sitä vastoin, keskimääräinen veren glukoosi hiirissä, jotka oli käsitelty p277(V):llä oli normaalilla aluella. Siten p277(V) voi olla tehokas kun hoidetaan STZ:11a indusoitua diabetestä C57BL/ksj uroshiirissä, kuten myöskin spontaanisesti syntyvässä diabetek- 118373 29 sessä, joka kehittyy geneettisesti vertailukelvottomissa NQD-hiirinaaraissa. p277(V)-terapian soveltuvuus ei rajoitu pelkästään sellaisen diabeteksen hoitoon, joka johtuu yhdestä ainoasta syystä tai yhdestä tietystä genotyypistä tai on sukupuoleen sidottu.

Kaikki viitteet, joihin tässä on viitattu, mukaan lukien lehtien artikkelit ja abstraktit, jotka on julkaistu tai vastaavat US tai muun maan patenttihakemuksia, myönnettyjä US tai muun maan patentteja tai mitä hyvänsä muuta viitettä sisällytetään viitteenomaisesti tähän, mukaanlukien kaikki tiedot, taulukot, kuvat ja tekstit, jotka on esitetty viitteissä, joihin on viitattu. Lisäksi viitatun viitteen koko sisältö viitteissä, joihin on viitattu näissä viitatuissa viitteissä on kokonaisuudessan sisällytetty viitteenä.

Viitteet tunnettuihin menetelmävaiheisiin, perinteisiin mene- telmävaiheisiin, tunnettuihin menetelmiin ja perinteisiin menetelmiin ei ole missään nimessä mikään myönnetys sille että ... tämän keksinnön jokin näkökohta, selitys tai sovellutusmuoto * * * , ‘ olisi julkaistu, opetettu tai ehdotettu asianomaisessa teknii- *·!·* kassa.

» 4 · • · · • · · « * V*i Edellä kuvattu spesifisten sovellutusmuotojen selitys paljas- taa siten niin täydellisesti keksinnön yleisen luonteen että muut voivat soveltamalla tietoa alan yleisellä asiantuntemuk- » sella (mukaanlukien viitattujen viitteiden sisältö) helposti moifioida ja/tai soveltaa erilaisiin sovelluksiin sellaiset spesifiset sovellutusmuodot ilman kohtuutonta kokeilemista, .. poistumatta esillä olevan keksinnön yleisestä periaattesta.

* * * *... Siksi tällainen soveltaminen ja modifiointi on tarkoitus sisäl- « · t tyä niihin julkaisujen sovellutusmuotojen ekvivalenttien mer- :V* kityksiin ja alueisiin, jotka perustuvat opetukseen ja ohjei- :***: siin, jotka on esitetty tässä. Tässä yhteydessä on ymmärrettä- • * · . V vä, että fraseologia ja terminologia tässä yhteydessä käyte- *" | tään kuvaamiseen eikä rajaamiseen siten että esillä olevan selityksen fraseologia ja terminologia on alan asiantuntijan 118373 30 tulkittavissa tässä esitetyn kuvauksen ja ohjeiston valaisemana, yhdistettynä alan asiantuntijalla olevaan tietoon.

• · · • · 1 2 3 • 1 » * • » « • 1 1 • 1 1 * • » ♦ * · * · 1 • 1 • « 1 * · - • 1 • · • ·

• M

* • · 1 • · 1 • · • ·

* M

» t « « · • · * • 1 • · » 1 » • · * 1 · · • · • · 2 • · · • · • · • · · < t · 3 · * * 1 31 1 1 8373 VIITTEET:

Bendelac A, Carnaud C, Boitard C, Bach JF. (1987) Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD ice to healthy neonates. Requirement for both L3T4 + and Ly+-2+ T cells. J Exp Med. 166:823-32.

Bowman MA, Leiter EH and Atkinson MA. (1994) Prevention of diabetes in the NOD mouse: implications for therapeutic intervention in human disease. Immunology Today. 15:115-20.

Castano L, Eisenbarth GS. (1990) Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse, and rat. Annu Rev Immunol, 8:647-79.

Elias, Dana. (1994) The NOD mouse: A model for autoimmune insulinrdependent diabetes. Autoimmune Disease Models, A Guidebook, pp 147-61.

·« · V * Elias D, Markovits D, Reshef T, van-Der Zee R and

Cohen IR (1990) Induction and therapy of autoimmune diabetes : in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouse by a 65-kDa heat ··· · :\! shock protein. Proc Natl Acad Sei TJSA. 87:1576-80.

·· • * • *» *

Elias D, Prigozin H, Polak N, Rapoport M, Lohse AW, • · ·

Cohen IR (1994) Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocin. Diabetes. 43:992-98.

Elias D, Reshef T, Birk OS, van der Zee R, Walker ϊ ** MD, Cohen IR. (1991) Vaccination against autoimmune mouse « · t ' diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock .*.· protein. Proc Natl Acad Sci USA. 88:3088-91.

« · ··· ♦ · • * ’**· Elias D. and Cohen IR. (1994) Peptide therapy for :.:: diabetes in NOD mice. The Lancet. 343:704-06.

• * 118373 32

Kaufman DL, Clare-Salzler M, Tian J, Forsthuber T, Ting GSP, Robinson P, Atkinson MA, Sercarz EE, Tobin AJ, Lehmann PV. (1993) Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependent diabetes. Nature. 366:69-72.

Like AA, Rossini AA (1976) Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new model of diabetes mellitus. Science. 193:415-17.

Mosmann T.R. and Coffman R.I. (19Θ9) Ann Rev Immunol, 7:145-73.

Tisch R, Yang XD, Singer SM, Liblav RS, Fuggar L, McDevitt HO. (1993) Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature. 366:72-75.

* · t * · * * * * * * » * 9 * t • · * • » ♦ ·· f * · • · #· • ·

• «I

♦ * - · * · * · -« * » • * • t · * * * * · « * · t I • · ' * · 9 * ··« • · ♦ ·· • a • · t » • -««· * *#** *

• I

33 1 1 8373

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEINEN INFORMAATIO: (i) HAKIJA: (A) NIMI: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

at the Weizmann Institute of Science (B) OSOITE: P.O. Box 95 (C) KAUPUNKI: Rehovot (E) MAA: Israel (F) POSTINUMERO: 76100

(A) NIMI: Irun R. COHEN

(B) OSOITE: 11 Hankin Street (C) KAUPUNKI: Rehovot (E) MAA: Israel (F) POSTINUMERO: 76354

(A) NIMI: Dana ELIAS

(B) OSOITE: 57 Derech Yavne (C) KAUPUNKI: Rehovot (E) MAA: Israel (F) POSTINUMERO: 76344

(A) NIMI: Matityahu FRIDKIN

(B) OSOITE: 23 Miller Street (C) KAUPUNKI: Rehovot (E) MAA: Israel (F) POSTINUMERO: 76284 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: PEPTIDIN p277 ANALOGIT JA NIITÄ

* . SISÄLTÄVÄT FARMASEUTTISET KOOSTUMUKSET DIABETEKSEN

HOITAMISEKSI JA DIAGNOSOIMISEKSI

*;!·* (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 10 • · * (vi) PRIORITEETTIHAKEMUKSEN TIEDOT: • ’·' (A) HAKEMUSNUMERO: IL 112094 /.*. (B) HAKEMISPÄIVÄ: 21.12.94 (vi) PRIORITEETTIHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: IL 114460 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 05.07.95 (2) SEK ID NO:1:N INFORMAATIO: • * ' • · * * (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo v. (C) SÄIKEISYYS: yksi .·**. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ··· •V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • · »•e ' »···* • « „ 118373 34 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID N0:1:

Vai Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2) SEK ID NO:2:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) SIJAINTI: 6, 11, 19 (D) MUU INFORMAATIO:/huom= "Xaa asemassa 6/11 = Cys tai Vai; Xaa asemassa 19 = Thr tai Lys, missä Xaa asemassa 6/11 eivät molemmat ole Cys, Xaa asemassa 19 on Thr." (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:2:

Vai Leu Gly Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Xaa Ile Pro Ala Leu Asp 15 10 15 » · * · · , ,· Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp 20 • · n (2) SEK ID NO:3:N INFORMAATIO: • * * • · * ’ (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ^ (A) PITUUS: 24 aminohappoa :Y; (B) TYYPPI: aminohappo • (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi .. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:3: • * * « * • ,*:* Vai Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp *·* 15 10 15 * * V. Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp 20 i *«· j (2) SEK ID NO:4 :N INFORMAATIO: M· ♦ « 4 35 1 1 8 3 7 3 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 11 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) SIJAINTI: 19 (D) MUU INFORMAATIO :/huom=*"Xaa asemassa 19 * Thr tai Lys" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:4:

Vai Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2) SEK ID NO:5:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ««» * * - (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi * · * . Ä (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:5: * ► ' ' ··♦ :*V Vai Leu Gly Gly Gly Vai Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp .,*1 5 10 15

• I

• Φ ♦V Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2) SEK ID NO:6:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: „ (A) PITUUS: 24 aminohappoa 5*.- (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi *.* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · V. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi *·· • · • · • · * • · ♦ ·· 3o 1 1 8373

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) SIJAINTI: 19 (D) MUU INFORMAATIO:/huom="Xaa asemassa 19 = Thr tai

Lys" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:6:

Vai Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2) SEK ID NO:7:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:7:

Vai Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Vai Ile Pro Ala Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp : 20 * (2) SEK ID NO:8 :N INFORMAATIO:

« · I

(i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: V*: (A) PITUUS: 24 aminohappoa :*, (B) TYYPPI: aminohappo : · (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAIN: Peptidi .. (B) SIJAINTI: 19 ; '·- (D) MUU INFORMAATIO :/huom*"Xaa asemassa 19 on Thr tai ,*ί4 Lys" • * » ,V* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 8: » » } · ·*'*: Vai Leu Gly Gly Gly Vai Ala Leu Leu Arg Vai Ile Pro Ala Leu Asp V. 15 10 15

• I

f · ϊ,: Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp 20 37 1 1 8373 (2) SEK ID NO :9:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 24 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:9:

Vai Leu Gly Gly Gly Vai Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2) SEK ID NO:10:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 17 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · 1 . .·. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi * · · : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 10: 4 f « * 4 *.1: Asn Glu Asp Gin Lys Ile Gly Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys :\ 15 10 15 • 4 · | • 4 4 * · * 1 • «a • · · • · t • » - • 1 • a • · a * 1 • | • « a

• I

• · · • 1 1 * 1 · 4 · i i 1 • ·

Claims (17)

118373

1. Sekvenssin I omaava peptidi, tunnettu siitä, että sillä on sekvenssi I: 6 11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Xi-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro- 19 Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEK ID NO:2), missä Xi ja X2 ovat kumpikin Cys- tai Vai-jäännös ja X3 on Thr-tai Lys-jäännös, mutta Xi ja X2 eivät molemmat voi olla Cys-jäännöksiä, silloin kun X3 on Thr, ja sen suolat ja toimivat johdannaiset.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että se on valittu peptideistä, joille on annettu nimitykset p277 (Vai6) , missä Xi on Vai, X2 on Cys ja X3 on Thr; p277 (Vai11), missä Xi on Cys, X2 on Vai ja X3 on Thr; p277 (Val6-Valn), missä X3 :T: ja X2 on Vai ja X3 on Thr; p277 (Lys19), missä Xi ja X2 on Cys ja X3 ·*.:.·* on Lys; p277 (Val6-Lys19), missä Xi on Vai, X2 on Cys ja X3 on Lys; p277 (Valn-Lys19), missä Xi on Cys, X2 on Vai ja X3 on Lys; p277 (Vai6,11-Lys19) , missä Xi ja X2 on Vai ja X3 on Lys. • * • « • ·· * * * V

* 3. Jonkin patenttivaatimuksen 1-2 mukaisen peptidin käyttö, tunnettu siitä, että sillä valmistetaan koostumus insuliini- • · ; *· riippuvaisen diabeteksen (jäljempänä IDDM) diagnosoimiseen. • * • « • » · * ei*i*

4. Menetelmä diagnosoida IDDM: n läsnäolo tai ilmentyminen :'"i potilaassa, tunnettu siitä, että mainitun potilaan veri tai .*.4j virtsa testataan käyttäen antigeeninä jotakin • ♦ ··.·· patenttivaatimuksen 1-2 mukaista peptidiä ihmisen hsp60:n kanssa immunoreaktiivisen vasta-aineen tai T-solun läsnäolon 118373 osoittamiseksi, jolloin tulos joka osoittaa anti-hsp60 vasta-aineen tai hsp60:n kanssa immunoreagoivan T-solun positiivisen läsnäolon on osoitus suuresta IDDMrn läsnäolon tai puhkeamisen todennäköisyydestä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-hsp60 vasta-aineen läsnäolo testataan radioimmunoassaymenetelmällä tai ELISA-testillä.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hsp60:n kanssa immunoreagoivan T-solun läsnäolo testataan T-solun proliferaatiotestillä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (i) T-soluja sisältävän mononukleaarisen solufraktion valmistaminen verinäytteestä, joka on saatu mainitusta potilaasta; (ii) patenttivaatimuksen 1 mukaisista peptideistä valitun antigeenin lisääminen mainittuun mononukleaariseen solufraktioon; (iii) mainitun solufraktion inkubointi mainitun antigeenin «i· ί,ί : läsnäollessa sopivan ajanjakson ja sopivien kasvuolosuhteiden vallitessa; %;.· (iv) leimatun nukleotidin lisääminen inkuboituun soluviljelmään • m ·',*·: (iii) sopivana ajankohtana ennen mainitun inkubointi jakson M ; *·· päättymistä mainitun leimatun nukleotidin inkorporoimiseksi *.· · proliferoivien T-solujen DNA:han; ja (v) proliferoivien T-solujen määrän määrittäminen analysoimalla * * • · ϊ *' leimatun nukleotidimäärän inkorporoituminen T-soluihin. • * · • · « · • · · 9

« *:* 7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • 9 · · ' f 9 9 9 että hsp60:n kanssa immunoreagoivan T-solun läsnäolo tutkitaan 9 T-solun sytokiinivaste-testillä, joka käsittää seuraavat 9 9 ·;··· vaiheet: (i) T-soluja sisältävän mononukleaarisen solufraktion 118373 valmistaminen verinäytteestä, joka on saatu mainitusta potilaasta; (ii) patenttivaatimuksen 1 mukaisista peptideistä valitun antigeenin lisääminen mainittuun mononukleaariseen solufraktioon; (iii) mainitun solufraktion inkubointi mainitun antigeenin läsnäollessa sopivan ajanjakson ja sopivien kasvuolosuhteiden vallitessa; ja (iv) vastaavista lymfosyyteistä kasvualustaan erittyneen sytokiinin läsnäolon mittaaminen, missä sytokiini on gamma-IFN, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α tai TGF-β.

8. Reagenssipakkaus IDDM:n läsnäolon diagnosoimiseksi testaamalla anti-hsp60 vasta-aineiden läsnäolo jonkin patenttivaatimuksen 4 ja 5 mukaisen menetelmän avulla, tunnettu siitä, että reagenssipakkaus käsittää: (i) antigeenin, joka on patenttivaatimuksen 1 mukaisen sekvenssin (I) omaava peptidi; ja (ii) merkillä varustetun vasta-aineen, joka kykenee tunnistamaan t*· V * mainitun tunnistettavan anti-hsp60 vasta-aineen muuntumattoman alueen. • * · • i

· «* • · ·.**: 9. Reagenssipakkaus IDDM:n läsnäolon diagnosoimiseksi # : ** testaamalla hsp60:n kanssa immunoreagoivan T-solun läsnäolo *.* * patenttivaatimuksen 6 mukaisen menetelmän avulla, tunnettu siitä, että reagenssipakkaus käsittää: • · •ft)’ (i) antigeenin, joka on patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi; • · *·;*’ (ii) leimatun nukleotidin; ja ..*·* (iii) sopivan kasvualustan lymfosyyttien viljelemiseksi. • · · i

· • * ··· :*·.· 10. Reagenssipakkaus IDDM:n läsnäolon diagnosoimiseksi • t ·:·*· testaamalla hsp60:n kanssa immunoreagoivan T-solun läsnäolo patenttivaatimuksen 7 mukaisen menetelmän avulla, tunnettu 118373 siitä, että se käsittää: (i) antigeenin, joka on patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi; (ii) lymfosyytille sopivan kasvualustan; ja (iii) assay-reagenssipakkauksen, joka sopii vasteen antavien lymfosyyttien kasvualustaan erittämien sytokiinien läsnäolon mittaamiseksi.

11. Valmiste IDDM:n estämiseksi tai hoitamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää T-solu tuotteen, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat: (a) sellaiset ihmisen T-solut, jotka manifestoivat spesifisyyttä ihmisen hsp60:n p277 sekvenssille, mitkä solut on aktivoitu inkuboimalla patenttivaatimuksen 1 mukaisen sekvenssin I omaavan peptidin läsnäollessa; (b) mainitut (a)-kohdan mukaiset ihmisen T-solut, jotka on säteilytetty tai muuten heikennetty; (c) mainitut (a)-kohdan mukaiset ihmisen T-solut, joihin on kohdistettu painekäsittely hydrostaattisella paineella, käsittely kemiallisella ristikytkevällä aineella ja/tai käsittely solun tukirakennetta ristikytkevällä aineella. « ·· • · • · * m

::: 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen valmiste, tunnettu siitä, ·* ' ' että mainitut (a)-kohdan ihmisen T-solut ovat autologisia T- ·.*«; soluja, jotka on saatu IDDM-potilailta, joita aiotaan hoitaa ja ·· ί *·* mainittu T-solun spesifisyys on kehitetty in vitro ·»· V · kontaktoinnilla patenttivaatimuksen 1 mukaisella sekvenssin I omaavalla peptidillä.

·· • ♦ • ·· ·*· • · *···* 13. Patenttivaatimusten 11 tai 12 mukainen valmiste, tunnettu ί4*ϊ* siitä, että mainitut ihmisen T-solut ovat kehittäneet in vitro ·«· ·...* spesifisyyden patenttivaatimuksen 1 mukaiselle sekvenssin I .•.φϊ omaavalle peptidille. • * • ·

14. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää 118373 patenttivaatimuksen 1 mukaisen sekvenssin I omaavan peptidin ja farmaseuttisen hyväksyttävän kantajan.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se estää tai hoitaa IDDM:ää.

16. Patenttivaatimusten 14 tai 15 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että mainittu peptidi on jokin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen peptidi.

17. Patenttivaatimusten 1 tai 2 mukaisen peptidin käyttö, tunnettu siitä, että sillä valmistetaan farmaseuttinen koostumus IDDM:n estämiseksi tai hoitamiseksi. ·»» • · 1 # · · m • · · * 1 1 • · · » · · • · » ··· * · • # · • M • 1 *# • f • ·1 « · « * · · • f • · • · m ··· f · • 1 • M ··· *··· ·· · • · • · • ft Iti • ·· • » ft * ft 118373