CZ293784B6 - Analog peptidu p277, farmaceutický přípravek, který ho obsahuje pro léčení nebo diagnózu diabetu - Google Patents
Analog peptidu p277, farmaceutický přípravek, který ho obsahuje pro léčení nebo diagnózu diabetu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ293784B6 CZ293784B6 CZ19971908A CZ190897A CZ293784B6 CZ 293784 B6 CZ293784 B6 CZ 293784B6 CZ 19971908 A CZ19971908 A CZ 19971908A CZ 190897 A CZ190897 A CZ 190897A CZ 293784 B6 CZ293784 B6 CZ 293784B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- val
- peptide
- cells
- iddm
- cell
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 title abstract description 83
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 83
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 74
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 claims description 26
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 8
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 5
- 101100327692 Caenorhabditis elegans hsp-60 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 4
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 claims 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 88
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 18
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 18
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 13
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 11
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 9
- 229940028435 intralipid Drugs 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 8
- 101710104159 Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 7
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 4
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 3
- 239000002960 lipid emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N (2-nonanoyloxy-3-octadeca-9,12-dienoyloxypropoxy)-[2-(trimethylazaniumyl)ethyl]phosphinate Chemical compound CCCCCCCCC(=O)OC(COP([O-])(=O)CC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 101710154868 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100126625 Caenorhabditis elegans itr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N Sulfur-35 Chemical compound [35S] NINIDFKCEFEMDL-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 1
- 238000009171 T-cell vaccination Methods 0.000 description 1
- KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000007933 aliphatic carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001904 diabetogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000008344 egg yolk phospholipid Substances 0.000 description 1
- 229940068998 egg yolk phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical group NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014101 glucose homeostasis Effects 0.000 description 1
- 101150086609 groEL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical group [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001239 threonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Obesity (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Je popsán analog peptidu p277 obecné sekvence identifikační číslo 2, v níž X.sub.1.n. i X.sub.2.n. znamená skupinu Cys nebo Val a X.sub.3 .n.znamená skupinu Thr nebo Lys, ale X.sub.1.n. i X.sub.2.n. nemohou současně znamenat skupinu Cys, jestliže X.sub.3.n. znamená Thr, a jeho soli a funkční deriváty, jeho použití pro diagnózu, předcházení nebo léčení diabetes mellitus (IDDM).ŕ
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká analogu peptidu p277, způsobu stanovení diagnózy přítomnosti nebo počátku IDDM, sestavy pro stanovení diagnózy IDDM, přípravku pro předcházení nebo léčení IDDM, farmaceutického přípravku, který obsahuje uvedený analog peptidu, použití analogu peptidu p2277 a způsobu předcházení nebo léčení IDDM.
Dosavadní stav techniky
Diabetes typu I, nebo IDDM, je autoimunní onemocnění způsobené T buňkami, které napadají a ničí inzulín produkovaný β-buňkami umístěnými v ostrůvcích slinivky břišní [Castano L., Eisenbarth G. S.: Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouše, and rat. Annu. Rev. Immunol. 8, 647-79 (1990).]. Autoimunní postup kulminující v IDDM začíná a pokračuje bez příznaků. Nemocné povrchy jsou klinicky pouze ty, u nichž souhrnná ztráta β-buněk převyšuje kapacitu zbývajících β-buněk dodávat inzulín. Ve skutečnosti se předpokládá, že kolaps homeostase glukózy a klinický IDDM nastává teprve tehdy, když je 80 až 90 % β-buněk inaktivováno imunitním systémem. Pacienti, kteří jsou identifikováni jako pacienti s IDDM, jsou ti, kteří mají pokročilý stupeň destrukce svých β-buněk. Diagnóza počátečních preklinických diabetes detekcí imunologických markérů autoimunity β-buněk může být provedena pouze po nástupu autoimunního procesu. Terapeutickou otázkou je tedy nalézt bezpečnou, specifickou a efektivní cestu, jak zastavit autoimunní proces, který již probíhá.
Autoři předloženého vynálezu zkoumali tuto otázku před studiem vývoje spontánního diabetes umyší kmene NOD, který je považován za věrný model lidského IDDM [Castano L., Eisenbarth G. S.: Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouše, and rat, Annu. Rev. Immunol. 8, 647-79 (1990).]. U NOD myší se vyvinula inzulitida ve stáří 4 týdnů, kdy začíná jako mírný peri-ostrůvkový infiltrát a pokračuje na silný intra-ostrůvkový zánět. Hyperglykémie, která ukazuje nedostatek inzulínu, začíná u samiček této kolonie kolem 14 až 17 týdnů věku. Ve stáří 35 až 40 týdnů se u téměř všech samiček NOD myší vyvinuly silné diabetes a většina bez léčení inzulínem zemřela. U samců NOD myší byl výskyt onemocnění nižší. Důvody pro to nejsou zřejmé. Bylo ukázáno, že diabetes NOD myší byly způsobeny autoimunními T buňkami [Bendelac A., Camaud C., Boitard C., Bach J. F.: Syngeneic transfer of autoimunne diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirements for both L3T4+ and Ly+-2+ T cells, J. Exp. Med. 166. 823 až 832 (1987).].
U lidských pacientů s IDDM stejně jako u NOD myší byla identifikována reaktivita T buněk a protilátek na různé antigeny [EliasD.: The NOD mouše: A model for autoimmune insulindependent diabetes, Autoimmune Disease Models, A Guidebook, str. 147 až 161 (1994).]. Není jasné, jestli imunita na kterýkoliv jeden zmožných cílových antigenů je primární příčinou onemocnění. Vedle otázky příčiny existuje otázka léčení.
Bylo ukázáno, že iniciaci autoimunního procesu u NOD myší lze zabránit tak, že se NOD myši, před nástupem diabetes, podrobí různým manipulacím, jako je omezení dieta, virové infekce nebo nespecifické stimulace imunitního systému [Bowman M. A., Leiter E. H. a Atkinson M. A.: Prevention of diabetes in tne NOD mouše: impluications for therapeutic intervention in human disease, Immunology Today 15, 115 až 120 (1994).]. NOD diabetes lze zabránit také indukcí imunologické snášenlivosti u prediabetických myší na antigen dekarboxylázu glutamové kyseliny (GAD) [Kaufman D. L., Clare-Salzler M., Tian J., Forsthuber T., Ting G. S. P., Robinson P., Atkinson M. A.,., Sercarz E. E., Tobin A. J., Lehmann P. V.: Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependent diabetes, Nátuře 366, 69 až
-1 CZ 293784 B6 (1993) a Tisch R., Yang X. D., Singer S. M., Liblav R. S., Fuggar L., McDevitt H. O.: Immune response to glutamic acid decaboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice, Nátuře 366, 72 až 75 (1993).].
Autoři předloženého vynálezu již dříve zjistili, že diabetes NOD myší lze zabránit vakcinací T buňky použitím pro T buněk specifických sekvencí p277 peptidu lidské hsp60 molekuly [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3088 až 3091 (1991).]. Tento protein byl dříve označován hsp65, ale nyní se označuje hsp60 vzhledem k přesnější informaci o molekulové hmotnosti; ať jde o jakékoliv označení, oba proteiny jsou stejné.
Peptid p277, který je epitopem lidského hsp60, který hraje roli u IDDM, a odpovídající polohám 437 až 460 sekvence lidského hsp60 byl po prvé popsán v izraelské patentové přihlášce 94 241 přihlašovatele tohoto spisu a v práci Eliáše D. a Cohena I. R.: Peptide therapy for diabetes in NOD mice, The Lancet 343, 704 až 706 (1994). Tento peptid má následující sekvenci identifikační číslo 1
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-IlePro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (sekv. id. č. 1).
Bylo ukázáno, že podávání p277 peptidu samotného v době nástupu insulitidy zabraňuje vývoji diabetes, možná snížením anti-p277 imunity, která je podstatná pro NOD diabetes [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D, Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88. 3088 až 3091 (1991) a izraelská patentová přihláška č. 94 241.]. Nedávné studie ukázaly, že p277 peptid může být také použit pro převrácení autoimunity β-buněk, které dospěly do pokročilého stupně [Elias D. a Cohen I. R.: Peptide therape for diabetes in NOD mice, The Lancet 343. 704 až 706 (1994).].
Laboratoř autorů předloženého vynálezu nedávno popsala, že forma autoimunního diabetes může být indukována u myší kmene C57BL/KsJ podáním velmi malé dávky b-buněčného toxinového streptozotocinu (STZ) [Elias D., Prigozin H., Polák N., Rapoport M., Lohse A. W., Cohen I. R.: Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocin, Diabetes 43, 992 až 998 (1994).]. Zatímco standardní nízká dávka STZ 40 mg/kg podávaná denně po dobu 5 dnů obvykle indukuje klinický diabetes během tří týdnů, podávání 30 mg/kg po dobu 5 týdnů indukuje klinický diabetes teprve po prodloužené době kolem 3 měsíců. Tento model indukovaného diabetes se vyznačuje objevením se prodromu periody protilátek na inzulín, antiidiotypových protilátek na inzulínové protilátky a protilátek na hsp60. Tyto myši vykazují také spontánní T-buněčnou reaktivitu na hsp60 a na jeho p277 peptid [Elias D., Prigozin H., Polák N., Rapoport M., Lohse A. W. Cohen I. R.: Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocin, Diabetes 43, 992 až 998 (1994).] Zdá se tedy, že nižší než standardní nízká dávka STZ spouští autoimunní proces, ne nepodobně tomu, co je pozorováno u spontánního diabetes vyvíjejícího se u NOD myší [Elias D., Markovits D., Reshef T., van der Zee R. a Cohen I. R.: Induction and therapy of autoimnune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouše by a 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87.1576 až 1580 (1990).].
Předmětem předloženého vynálezu je poskytnout varianty peptidu p277, které jsou užitečné pro stanovení diagnózy a pro léčení IDDM.
-2CZ 293784 B6
Podstata vynálezu
Při studiu fragmentů a variant peptidů p277 bylo nečekaně zjištěno, že peptidy, v nichž pouze threoninová skupina byla nahrazena lysinovou skupinou a/nebo jedna nebo obě cysteinové skupiny byly nahrazeny valinovými skupinami, byly účinné jako p277 při léčení diabetes. Tyto výsledky byly dokonce ještě překvapivější, protože substituce cysteinových skupin serinovými vedla k neaktivním peptidům.
Předložený vynález se tedy týká analogu peptidů p277 obecné sekvence identifikační číslo 2 .6 11
V al-Leu-Gly-Gly-Gly-Xi-Ala-Leu-Leu-Arg-Xr-Ile-Pro-
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (sekv. id. č. 2), v níž X] i X2 znamená skupinu Cys nebo Val a X3 znamená skupinu Thr nebo Lys, ale Xi i X2 nemohou současně znamenat skupinu Cys, jestliže X3 znamená Thr.
Ve specifických provedeních vynálezu je analog peptidů p277 vybrán z peptidů obecné sekvence id. č. 2, v níž jak X] tak X2 znamená Cys a X3 znamená Lys, tedy p277(Lys19) (sekv. id. č. 3)
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro1 5 10
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp
20 (sekv. id. č. 3) nebo X] znamená Val, X2 znamená Cys a X3 znamená Thr nebo Lys, tedy p277(Val6) (sekv. id. č. 4)
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro1 510
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Xaa-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 4) a p277(Val6-Lys19) (sekv. id. č. 5)
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro1 510
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 5) nebo Xi znamená Cys, X2 znamená Val a X3 znamená Thr nebo, Lys, tedy p277(Valu) (sekv. id. č. 6)
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro1 510
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Xaa-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 6) a p277(Valn-Lys19) (sekv. id. č. 7)
V al-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-V al-Ile-Pro-
510
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 7)
-3CZ 293784 B6 nebo jak Xi tak X2 znamená Val a X2 znamená Thr nebo Lys, tedy p277 (Val6-Valn) (sekv. id. č. 8)
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-V al-Ala-Leu-Leu-Arg-V al-Ile-Pro1 510
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Xaa-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 8) a p277(Val6,1I-Lys19) (sekv. id. č. 9)
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro1 510
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 9).
Peptid 277(Val6-Valn) je označován také jako p277(V).
Dalším předmětem předloženého vynálezu je získat způsoby a sestavy pro časnou diagnózu IDDM použitím analogu peptidu sekv. id. 2 podle vynálezu. Během vývoje EDDM živočichové exprimují hsp60 molekuly nebo molekuly, které s nimi zkříženě reagují, které nalézají svoji cestu do krve a moče živočichů. Exprimují také protilátky a T buňky směrované specificky na tyto molekuly. Přítomnost hspóO (nebo molekul, které s nimi zkříženě reagují) nebo protilátek nebo T buněk specifických pro ně v krvi nebo moči slouží jako test detekce IDDM procesu před tím, než je destrukce β-buněk ukončena a jedinec je odsouzen k dlouhotrvajícímu diabetes.
Přítomnost nebo počátek IDDM u pacienta může být diagnostikován testováním krve nebo moče pacienta na přítomnosti anti-hsp60 protilátek nebo T buněk, které jsou imunologicky reaktivní s lidským hspóO použitím analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu jako antigenů. Jakékoliv dříve popsané postupy, popsané jako schopné pracovat s použitím peptidu p277, jako jsou ty, které jsou popsány v PCT mezinárodní přihlášce publikované pod číslem WO 90/10449, která je zde zahrnuta jako odkaz, mohou být také použity náhradou ze peptid p277 obecné sekv. id. č. 2 podle předloženého vynálezu.
Předložený vynález tedy poskytuje způsob stanovení diagnózy přítomnosti nebo počátku IDDM u pacienta, který se vyznačuje tím, že se pacient testuje na přítomnost anti-hsp60 protilátek nebo T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, při čemž výsledek ukazující na pozitivní přítomnost anti-hsp60 protilátek nebo T buňka, která je imunoreaktivní s shpóO, ukazuje na vysokou pravděpodobnost přítomnosti nebo počátku IDDM.
Při způsobu stanovení diagnózy IDDM může být pacient testován na přítomnost anti-hsp60 protilátek, při čemž tento způsob testu může zahrnovat radioimunoanalýzu nebo test ELISA.
Pacient může být také testován na přítomnost T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO. Podle jednoho provedení tohoto aspektu tento způsob testu zahrnuje test proliferace T buněk, který obsahuje stupně:
i) přípravu mononukleámí buněčné frakce obsahující T buňky ze vzorku krve získaného z uvedeného pacienta, ii) přidání antigenů, který je vybrán z analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu, k této mononukleámí buněčné frakci, iii) této buněčné frakce v přítomnosti antigenů po vhodné Časové období a za vhodných kultivačních podmínek,
-4CZ 293784 B6 iv) přidání označeného nukleotidu k inkubované buněčné kultuře podle iii) ve vhodné době před koncem inkubační doby, aby se dosáhla inkorporace označeného nukleotidu do DNA proliferujících T buněk, a
v) stanovení množství proliferujících T buněk analýzou množství označeného nukleotidu, který je inkorporován v T buňkách.
Ve stupni iv) shora uvedený nukleotid znamená s výhodou 3H-thymidin. Stanovení množství proliferujících T buněk se provádí vypočtením stimulačního indexu T buněk standardními způsoby.
Podle jiného provedení tohoto aspektu podle vynálezu způsob testu zahrnuje test odpovědi T buněk na cytokin, při kterém stupně i) až iii) jsou stejné jako ve shora uvedeném testu proliferace T buněk a ve čtvrtém stupni iv) se standardními způsoby komerčně dostupnými sestavami deteguje přítomnost cytokinů, jako je IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α nebo TGFp, sekretovaného odpovídajícími lymfocyty do média.
Podle jiného aspektu vynález poskytuje in vivo způsob, při němž se antigen vybraný z analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 injekčně subkutánně podá pacientovi a pozoruje se výskyt detegovatelné kožní reakce (DTHG).
Předložený vynález se také týká prostředků pro provedení těchto analýz stejně jako sestav pro provádění těchto analýz. Tyto sestavy se mohou vyrábět pro provedení jakýchkoliv různých testů používaných pro dosažení předloženého vynálezu. Každá taková sestava zahrnuje všechny materiály nutné pro provedení jednoho testu nebo daného počtu testů. Například sestava pro stanovení přítomnosti anti-hsp60 protilátek může obsahovat analog peptidu p2727 obecné sekv. id. č. 2 mobilizovaný na pevné fázi a označenou protilátku schopnou rozpoznávat nevariabilní oblast anti-hsp60 protilátky, která má být detegována, jako je označený anti-lidský Fab. Tato sestava může také obsahovat pokyny pro použití a nádoby, které uchovávají materiály sestavy. Může se používat jakékoliv označení nebo značka, jako je radioizotop, enzym, chromofor nebo fluorofor. Typickým radioizotopem je jod-125 nebo síra-35. Mezi typické enzymy pro toto použití patří křenová peroxidáza, β-galaktosidáza a alkalická fosfatáza.
Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti anti-hsp60 protilátek obsahuje:
i) antigen, který je vybrán z analogu peptidu p277 obecné sekvence id. č. 2, a ii) označenou protilátku, která je schopna rozpoznávat ne-variabilní oblast uvedených anti-hsp60 protilátek, které mají být detegovány.
Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, obsahuje:
i) antigen, který je vybrán z analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2, ii) médium vhodné pro kultivaci lymfocytů (T buněk) a iii) buď označený nukleotid pro testování proliferace T buněk, nebo testovací sestavu cytokinů, např. IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α nebo TGFfi, pro test cytokinů.
Pro in vivo test bude sestava obsahovat pouze analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 ve formě vhodné pro injekce.
-5CZ 293784 B6
Předložený vynález se dále týká prostředků pro předcházení nebo léčení IDDM. Očkování antigenovým peptidem obecné sekv. id. č. 2 podle předloženého vynálezu může poskytnout specifické snížení autoimunity na antigen a vytvořit účinnou rezistenci na autoimunní proces IDDM. Stejné platí o očkování T buňkami specifickými pro tento antigen v zeslabené nebo avirulentní formě nebo po tom, co byly ošetřeny, aby se zlepšila jejich antigeničnost, nebo jejich fragmenty nebo aktivní fragmenty. Jestliže bylo ukázáno, že pacient má již v preklinické počínající stavy IDDM, injekce tímto antigenem nebo T buňkou (nebo frakcí) může vést ke snížení autoimunity na tento antigen a tak se může tento autoimunní proces uzavřít dříve, než dojde k významnému stabilnímu poškození. Tento peptid se může použít také jako terapeutické činidlo pro uzavření autoimunního procesu dokonce i po tom, co je již značně pokročilý, jak bylo nedávno uvedeno vynálezci předloženého vynálezu, pokud jde o léčení NOD myší peptidem p277 [Elias D. a Cohen I. R.: Peptide therapy for diabetes inNOD mice, The Lancet 343, 704 až 706 (1994).].
Předložený vynález tedy poskytuje přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM, obsahující produkt T buňky, který je vybrán ze skupiny sestávající z: a) lidských T buněk, které vykazují specifičnost na sekvenci p277 lidského hsp60, při čemž tyto buňky byly aktivovány inkubováním v přítomnosti peptidů obecné sekv. id. č. 2, b) lidských T buněk ad a), které byly ozářeny nebo jinak oslabeny, c) lidských T buněk podle ad a), které byly podrobeny ošetření tlakem hydrostatickým tlakem, ošetření chemickým zesíťovacím činidlem a/nebo ošetření cytoskeletýlním zesíťovacím činidlem, d) fragmentů nebo povrchových proteinů T buněk podle ad a), b) nebo c) nebo e) peptidů obsahujícího v podstatě variabilní oblast receptorů ad a) specifického pro uvedený protein nebo jeho soli, funkčního derivátu, prekurzoru nebo aktivní frakce.
Ve výhodném provedení podle vynálezu tento přípravek obsahuje autologní lidské T buňky získané od IDDM pacienta, který má být léčen. T buňky aktivovány in vitro kontaktem s analogem peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2. Tyto specifické a aktivované T buňky se pak podají stejnému pacientovi, od kterého byly původně získány.
Předložený vynález poskytuje také farmaceutický přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM, který obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a jako účinnou složku efektivní množství analogu peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2, jeho soli nebo funkčního derivátu. Farmaceuticky přijatelným nosičem je s výhodou olejové ředidlo, jako je emulze minerálního oleje, známa jako neúplné Freundovo adjuvans (IFA). Avšak EFA, stejně jako úplné Freundovo adjuvans (CFA, prostředek minerálního oleje obsahující různá množství zabitých organizmů Mycobacterium) není povoleno pro použití u člověka, protože minerální olej není metabolizovatelný a nemůže být tělem degradován.
Autory předloženého vynálezu bylo nyní zjištěno, že některé tukové emulze, které jsou mnoho let používány pro intravenózní výživu lidských pacientů, mohou sloužit jako ředidlo pro peptidovou terapii s použitím peptidů podle předloženého vynálezu. Dvěma příklady těchto emulzí jsou dostupné komerční tukové emulze známé jako Intralipid a Lipofundin. „Intralipid“ je registrovaná obchodní značka firmy Kabi Pharmacia, Švédsko, pro tukovou emulzi pro intravenózní výživu, která je popsána v patentu USA 3 169 094. „Lipofundin“ je registrovaná obchodní značka firmy B. Braun Melsungen, Německo. Obě jako tuk obsahují sojový olej (100 nebo 200 g v 1000 ml destilované vody: tedy 10 nebo 20%). V Intralipidu se jako emulgační činidla používají fosfolipidy z vaječného žloutku (12 g/1 destilované vody) a v Lipofundinu lecithin z vaječného žloutku (12 g/1 destilované vody). Izotoničnost je jak u Intralipidu tak Lipofundinu upravena přidáním glycerolu (25 g/1).
Vynález se dále týká způsobu předcházení nebo léčení IDDM, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, farmaceutického přípravku, který obsahuje analog peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2, nebo přípravku, který obsahuje T buňky, u kterých se vyvinula specifičnost na uvedený analog peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu.
V další části budou stručně popsány obrázky.
-6CZ 293784 B6
Obrázek 1 je graf ukazující stabilitu p277 a p277(Val6-Valn). Plná kolečka označují výsledky s použitím p277 a prázdná kolečka s p277 (Val6-Valn). Velká kolečka představují výsledky po 1 týdnu skladování, střední kolečka velikost po 9 týdnech, nejmenší kolečka po 20 týdnech.
Obrázek 2 ukazuje, že NOD T buňky diabetogenního klonu C9 proliferují jako odpověď na peptidy p277 (plná kolečka) a p277(Val6-Valn) (prázdná kolečka).
Obrázek 3 ukazuje, že NOD slezinné T buňky proliferují v přítomnosti peptidu p277(Lys19). Sleziny 5 myších samiček NOD byly testovány v každé věkové skupině na proliferaci T buněk jako odpověď na peptidy p277 (Lys19) (plná kolečka), p277 (prázdná kolečka) a kontrolní peptid p278 (plné čtverečky).
Obrázek 4 ukazuje, že NOD T buňky diabetogenního klonu C9 proliferují jako odpověď na peptid p277(Lys19).
Obrázek 5 je graf, který ukazuje účinnost předběžného ošetření s p277(V) u IFA při prevenci diabetes indukovaného STZ při srovnání s kontrolním ošetřením nebo ošetřením s GADp34.
Jestliže je ve vynálezu uveden pojem „analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2“, tento pojem zahrnuje také jeho soli a funkční deriváty, pokud se zachovává biologická aktivita peptidu vzhledem k diabetes.
„Soli“ analogu peptidu p277 podle vynálezu znamenají fyziologicky přijatelné organické nebo anorganické soli.
Pojem „funkční deriváty“ analogu peptidu p277, jak se zde tento pojem používá, zahrnuje deriváty, které se mohou vyrobit z funkčních skupin, které se vyskytují jako postranní řetězce na zbytcích nebo na N- nebo C-koncových skupinách, způsoby známými z oblasti techniky, a které jsou zahrnuty v tomto vynálezu, pokud zůstávají farmaceuticky přijatelné, tj. neničí aktivitu peptidu týkající se podobnosti s aktivitou p277, nedávají přípravkům, které je obsahují, toxické vlastnosti a nemají nepříznivý vliv na jejich antigenní vlastnosti. Tyto „funkční deriváty“ nejsou zamýšleny jako zahrnující v sobě takové změny, které efektivně převádějí jednu kyselinu na jinou.
Vzhledem ke shora uvedeným kvalifikacím mohou tyto deriváty zahrnovat například alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin produkovaných reakcí s amoniakem, primárním nebo sekundárním aminem, N-acylderiváty volných aminových skupin aminokyselinových zbytků vytvořených reakcí s acylovými skupinami (např. alkanoylových nebo karbocyklických aroylových skupin) nebo O-acylderiváty volné hydroxylové skupiny (např. seiylové nebo threonylové skupiny) vytvořené reakcí s acylovými skupinami.
Analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu se může používat jako imunogen ve farmaceutických přípravcích, zvláště ve vakcínách pro zmírnění nebo léčení IDDM, stejně jako antigen v diagnostických prostředcích pro stanovení diagnózy IDDM. Tyto farmaceutické přípravky a diagnostické prostředky, které se mohou vyrábět způsoby známými v oblasti techniky, také tvoří část předloženého vynálezu.
Jestliže se používá pro terapeutické léčení nebo jako profylaktická vakcína, peptid podle předloženého vynálezu se s výhodou podává s biologicky aktivním nosičem, který podporuje ΤΗ1-ΊΉ2 posun autoimunních T buněk. T buňky CD4 pomocného typu se dělí do dvou skupin podle cytokinů, které sekretují, jestliže jsou aktivovány [Mosmann T. R. a Coffman R. I.: Ann. Rev. Immunol. 7, 145 až 173 (1989).]: ΊΉ1 buňky sekretují IL-2 a IFN-γ, zatímco ΊΉ2 buňky sekretují IL-4 a IL-10. Ředidlem je s výhodou tuková emulze obsahující 10 až 20 % hmotn. triglyceridů rostlinného a/nebo živočišného původu, 1,2 až 2,4 % hmotn. fosfolipidů rostlinného a/nebo živočišného původu, 2,25 až 4,5 % hmotn. osmoregulátoru, 0 až 0,5 % hmotn.
-7CZ 293784 B6 antioxidačního činidla a sterilní vodu do 100 % hmotn. Tímto ředidlem je nejvýhodněji Intralipid nebo Lipofundin. Použití těchto ředidel je popsáno v izraelské patentové přihlášce (identifikované číslem přihlašovatele 9523), podané stejný den jako je datum podání izraelské přihlášky předloženého vynálezu (identifikované číslem přihlašovatele 9451A), stejným přihlašovatelem jako předložená přihláška; celý její obsah je zde zahrnut jako odkaz.
Terapeutický přípravek podle předloženého vynálezu může být podáván orálně nebo parenterálně, jako subkutánně, intramuskulámě, intravenózně, intanazálně nebo intrarektálně.
Příklady, v nichž je uvedena účinnost terapeutického ošetření sloučeninami a přípravky podle předloženého vynálezu, jsou vědecky přijatými zvířecími modely lidského IDDM.
Příklady provedení vynálezu
Materiály a způsoby (i) Myši
Myší samičky kmene NOD/Lt byly získány od Animal Breeding Center of the Weizman Institute of Science, Rehovot, Izrael. Tyto myši spontánně vyvinuly autoimunní diabetes ve věku 14 až 17 týdnů, který se podobá IDDM u lidí.
(ii) Peptidy
Peptidy byly syntetizovány standardními Fmoc chemií použitím syntetizátoru ABIMED (SRN) a vyčištěny HPLC na obrácených fázích. Sekvence byly potvrzeny analýzou aminokyselin. Byly syntetizovány následující peptidy: peptid p277, kontrolní peptid p278 o sekvenci: Asn-Glu-AspGln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile (sekv. id. č. 10), která odpovídá polohám 458 až 474 molekuly lidského hsp60, fragmenty p277: aminová polovina p277 (p277.N), karboxylová polovina p277 (p277.C) a p277C kombinovaná s p278 (p277.C-p278), peptid p277(Lys19) a peptid p277 s různými substitucemi aminokyselin za dvě cysteinové skupiny v sekvenci: p277 s můstkovanými -SH skupinami (p277(můstkovaný Cys-Cys)), p277 s oběma cysteinovými skupinami nahrazenými valinem (p277(Val6-Valn)), respektive serinem (p277(Ser-Ser11).
(iii) Ošetření a pokračování
Myši byly ošetřeny emulzí p277, jinými peptidy nebo hovězím sérovým albuminem (BSA od firmy Sigma, St. Louis, Mo., USA) v objemu 0,1 ml podané subkutánní injekcí do zad. Antigeny byly zředěny PBS a emulgovány ve stejném objemu minerálního oleje (neúplné Freundovo adjuvans (IFA), Sigma) nebo 10 % (hmoto.) Intralipidu. Myši byly testovány na množství krevní glukózy v 10.00 h v neupevněném stavu, jak je popsáno v literatuře [Élias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88. 3088 až 3091 (1991).] v době ošetření (7,12, 15 nebo 17 týdnů) a ty myši, které přežily, ve stáří 40 týdnů. Za významnou hyperglykémii byla považována koncentrace glukózy 11,1 nebo více mM/Ι, protože tato koncentrace glukózy v krvi byla o 3 standardní odchylky vyšší než střední koncentrace glukózy změřená u 100 zdravých myší (neuvedeno). Histologické zkoumání ostrůvků slinivky břišní bylo prováděno na sekcích obarvených hematoxylinem a eosinem. Tyto sekce byly hodnoceny nezávisle na sobě dvěma pozorovateli, kteří neznali identitu skupin. Pro zjištění statistických rozdílů mezi různými ošetřeními byl použit test nejmenších čtverců.
-8CZ 293784 B6 (iv) Test proliferace T buněk
Suspenze buněk klonu C9 a buněk sleziny získaných od NOD myších samiček byly testovány na proliferaci T-buněk, jak bylo shora uvedeno [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., 5 Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3088 až 3091 (1991).]. Ve stručnosti - 1.105 klonovaných buněk/ml nebo 1.106 splenocytů/ml bylo inkubováno se čtyřmi opakováními 72 h v 0,2 ml kultivačního média v mikrotitrovacích jamkách v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých antigenů v množství 5 pg/ml. Proliferace byla měřena 10 inkorporací [3H]-thymidinu do DNA během posledních 12 h inkubace. Výsledky byly spočteny jako stimulační index: poměr středního počtu impulzů za minutu testu v přítomnosti antigenů ke střednímu počtu impulzů za minutu pozadí v nepřítomnosti antigenů. Standardní odchylka mezi čtyřmi pokusy byly vždy < 10 % středního počtu impulzů za minutu. Pozadí bylo menší než 1000 impulzů za minutu v pokusech se splenocyty a menší než 200 impulzů za minutu u buněk C9. 15 Slezina každé myši byla testována odděleně. Výsledky každé skupiny myší jsou uváděny jako střední hodnota ± SD (střední odchylka).
Příklad 1
Ošetření NOD myší p277 nebo jeho fragmenty
Pro testování toho, jestli kterákoliv ze dvou polovin o 12 aminokyselinách peptidu p277, samotná nebo v kombinaci, je účinná u NOD myší jako p277, byly NOD myší samičky ošetřeny ve stáří 7 týdnů subkutánním naočkováním 50 pg různých peptidů v oleji. Byl stanoven stav myší ve stáří 25 40 týdnů.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Lze vidět, že kontrolní hsp60 peptid p278 neměl na vývoj nemoci žádný vliv: ze 40 ošetřených myší byly všechny diabetické a ve 40. týdnu jich bylo 90 % mrtvých. Naproti tomu peptid p277 úplně zabraňuje smrti a vyléčil 60 % z 20 ošetřených 30 myší. Fragmenty p277 byly méně účinné: aminová polovina p277 (p277.N), karboxylová polovina p277 (p277.C) a směs obou (p277.N, p277.C) působily asi polovinou toho, co způsoboval neporušený p277. Peptid p277.C byl synteticky napojen na peptid p278, aby se získal delší peptid. Avšak p277.C-p278 nebyl lepší než p277.C samotný. Lze tedy shrnout, že plný terapeutický účinek vyžaduje neporušený p277 peptid.
Tabulka 1
Ošetření NOD myší p277 nebo jeho fragmenty; stav diabetů ve stáří 40 týdnů
| ošetření peptidem (50 pg) | počet myší | zdrávy (%) | hyperglykemické (%) | mrtvé (%) |
| p278 | 40 | 0 | 100 | 90 |
| p277 | 20 | 60’ | 40 | 0’ |
| p277.N | 20 | 20 | 80 | 50’ |
| p277.C | 20 | 30 | 70 | 40’ |
| p277.N,p277.C | 20 | 35’ | 65 | 40’ |
| p277.C-p278 | 20 | 25 | 75 | 50* |
* p<0,01 při srovnání se skupinou ošetřenou kontrolním peptidem p278
-9CZ 293784 B6
Příklad 2
Ošetření NOD myší substitučními peptidy p277
U NOD myší byly testovány následující peptidy: p277, p277 (můstkovaný Cys-Cys), p277(Val6Val11) ap277(Ser-Seru).
NOD samičky byly ošetřeny 100 pg peptidu v 0,2 ml emulze minerálního oleje (IFA) podané subkutánně. Myši byly ošetřeny ve věku 12 týdnů. Výskyt diabetů byl vyhodnocen ve stáří 30 týdnů.
Jak je uvedeno v tabulce 2, p277(Val6-Valu) byl při léčení diabetes tak účinný jako p277, výskyt diabetů u neošetřených myší byl 80 %, zatímco u myší ošetřených buď p277, nebo p277(Val6Val”) byl výskyt 22 a 23 %. Naopak, ani p277 (můstkovaný Cys-Cys) ani p277(Ser6-SerH) neměl žádný terapeutický účinek. Dvě další varianty p277, v nichž byly cysteinové skupiny v polohách 6 a 11 nahrazeny skupinou alaninu nebo zbytkem γ-aminomáselné kyseliny, byly také neúčinné, když byly testovány in vitro, jak na buňkách klonu C9, tak na NOD slezinných Tbuňkách. Jelikož tyto dva peptidy nebyly rozpoznávány anti-p277 specifickými T buňkami (neuvedeno), nebyly dále testovány in vivo na terapeutický účinek.
Tabulka 2
Ošetření NOD myší p277 substituenty
| ošetření peptidem | výskyt diabetů (%) | počet příjemců |
| žádný | 80 | 100 |
| p277 | 22' | 200 |
| p277 (můstkovaný Cys-Cys) | 70+ | 10 |
| p277(Val6-Valn) | 23' | 52 |
| p277(Ser6-Sern) | 85' | 20 |
+ p<0,01 při srovnání s výskytem diabetů u myší ošetřených pouze adjuvans + žádný významný rozdíl při srovnání počátku diabetů u myší ošetřených pouze adjuvans
Příklad 3
Stabilita p277(Val6-Valn)
Jelikož důvodem pro nahrazení cysteinů byla problematická stabilita p277 peptidu, stabilita p277(Val6-Valn) byla testována po několika časových úsecích od syntézy. p277 peptid je nestabilní a zhoršuje se i při přísných podmínkách skladování (lyofilizovaný ve vakuu, -20 °C).
Pro srovnání stability p277 s jeho p277(Val6-Val11) analogem, byly oba peptidy syntetizovány ve stejné době a skladovány jako suchý prášek při -20 °C. V 1., 9. a 20. týdnu od syntézy byl vždy jeden podíl odvážen, rozpuštěn a testován. Za stabilitu peptidu je považována jeho schopnost stimulovat T buněčný klon C9. Obr. 1 ukazuje výsledky pokusu. Lze vidět, že zatímco přírodní p277 ztratil většinu své aktivity během 9 týdnů a všechnu 20 týdnů po syntéze, p277(Val-Val11) byl nezměněn po 20 týdnech skladování.
Jelikož se předpokládá, že nestabilita p277 je způsobena cysteinovými zbytky, očekává se, že jakékoliv analogy podle předloženého vynálezu, které si zachovávají biologickou aktivitu p277, budou mít zlepšenou stabilitu při srovnání s p277 podobně, jak bylo v tomto příkladu ukázáno pro p277(Val6-Valn).
-10CZ 293784 B6
Příklad 4
Ošetření NOD myších samiček p277 nebo p277(Val6-Valn) převrací insulitidu
NOD myší samičky byly ošetřeny podkožní injekcí ve stáří 12 týdnů 100 pg/myš nemodifikovaného p277 nebo p277(Val6-Vallf) v 0,1 ml emulze minerálního oleje (neúplné Freundovo adjuvans). Kontrolním myším byla podána emulze PBS a minerální olej. Ve stáří 6 měsíců bylo 5 myší z každé skupiny usmrceno, pankreas byl odebrán, fixován v bouinu a sekce byly obarveny směsí hematoxylimeosin. Ve slepém pokusu byla vyhodnocena insulitida. Jelikož se u kontrolních myší vyvinul intenzivní diabetes, byly usmrceny ve stáří 5 měsíců. Potom byla hladina glukózy v krvi u kontrolních myší v rozmezí od 29 do 48 mmol/1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
Ošetření NOD myších samiček p277 nebo p277(Val6-Valn) převrací insulitidu
| ošetření peptidem (12 týdnů) | počet ostrůvků | histologický stav v % (22 týdnů) | ||
| čistý | insulitida peri-ostrůvků | intraostrůvky | ||
| žádným | 83 | 10 | 23 | 67 |
| p277 | 49 | 25 | 69 | 6 |
| p277(Val6-ValH) | 62 | 52 | 31 | 17 |
Ve stáří 12 týdnů, době ošetření, asi 60 % ostrůvků neošetřených myší vykazovalo intraostrůvkovou insulitidu, asi 20 % ostrůvků mělo peri-ostrůvkovou insulitidu a asi 20 % ostrůvků nevykazovalo žádnou insulitidu. Intra-ostrůvková infiltrace je považována za intenzivnější formu insulitidy související s nedostatkem funkce β-buněk. Jak je uvedeno v tabulce 3, značné rozdíly ve zjevu ostrůvků se vyvinuly u dvou ošetřených skupin při srovnání s kontrolními myšmi ošetřenými samotným olejem. Myši, které byly ošetřeny samotným olejem (kontrola), vykazovaly progresivní pokles podílu neovlivněných ostrůvků a ve stáří 22 týdnů, kdy všechny myši byly zjevně diabetické, pouze 10 % normálních ostrůvků. Asi 67 % ostrůvků vykazovalo intra-ostrůvkovou insulitidu ve stáří 22 týdnů, zbývajících 23 % ostrůvků vykazovalo periostrůvkovou insulitidu. Naproti tomu myši ošetřené p277 nebo p277(Val6-Val11) vykazovaly zvýšení počtu normálních ostrůvků (mezi 25 a 52 %) a pokles počtu ostrůvků s intraostrůvkovou insulitidou (mezi 6 a 17%). Počet ostrůvků s peri-ostrůvkovou insulitidou stoupl na 31 až 69 %. Ošetření p277 a p277(Val6-Valn) tedy souviselo se zlepšeným histologickým obrazem v souladu s převrácením stupně insulitidy přetrvávající více než 3 měsíce po ošetření.
Další výsledky používající p277 (v) u NOD myších samiček
V každé skupině po 10 NOD myších samičkách bylo uděláno 15 dalších pokusů, při nichž byly myši ve stáří 12 až 15 týdnů ošetřeny p277(V) v oleji nebo olejem samotným. Z celkového počtu 150 myší ošetřených samotným olejem se u 90 % vyvinul diabetes a 85 % jich zemřelo do 32. týdne. Naproti tomu u myší ošetřených p277(V) byl výskyt diabetů pouze 50 % (p<0,1) a pouze 20 % umřelo vlivem intenzivního onemocnění (p<0,01). Ošetření p277(V) je tedy účinným ošetřením pro zastavení vývoje smrtelného onemocnění.
Příklad 5
Peptidová terapie diabetů typu I použitím p277(Val6-Valn) v tukových emulzích
Autoimunní destrukce inzulín produkujících β-buněk vpankreasu je zprostředkována Tlymfocyty. Zánětlivý infiltrát se vyvíjí kolem pankreatických ostrůvků ve stáří 5 až 8 týdnů.
-11CZ 293784 B6
Destrukce β-buněk, vedoucí k deficitu inzulínu, a zjevný diabetes jsou zřejmé ve stáří 14 až 20 týdnů, přičemž ovlivňují téměř 100 % NOD myších samiček ve stáří 35 až 40 týdnů.
NOD myší samičky byly ošetřeny peptidem p277(Val6-Valn) (100 pg) na myš subkutánně v 0,1 ml PBS nebo 10% tukové emulzi sestávající z 10 % hmotn. sojového oleje, 1,2 % hmotn. vaječných fosfolipidů a 2,25 % hmotn. glycerolu (Intralipid, Kabi Pharmacia AB, Švédsko).
Byl sledován výskyt diabetes ve stáří 6 měsíců a produkce anti-p277(Val6-Valn) protilátek. Diabetes byl diagnostikován jako trvalá hyperglykémie s hladinou glukózy v krvi nad 11,1 mmolu/1 měřené alespoň dvakrát v týdenních intervalech přístrojem Beckman Glucose Analyzer Π. Úspěšné peptidové ošetření je dáno zachováním normální koncentrace glukózy v krvi (menší než 11,1 mmolů/1), remisí intra-ostrůvkového zánětu pankreatických ostrůvků (insulitida) a indukcí protilátek na terapeutický peptid jako indikátor imunitní odpovědi typu ΊΉ2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4
Výskyt diabetů (v %) v 6 měsících
| ošetření | výskyt diabetů | smrt |
| p277(Val6-Valn)/PBS | 90 | 80 |
| p277(Val6-Valu)/Intralipid | 45' | 20' |
| žádné | 100 | 90 |
* p<0,01 při srovnání s neošetřenými myšmi
Jak lze vidět z tabulky 4, ošetření peptidem podle předloženého vynálezu podávaného v Intralipidu bylo účinné pro snížení výskytu diabetů a smrti. Naopak, ošetření podávané v PBS nebylo účinné.
Příklad 6
Peptidy p277 a p277(Val6-Val) jsou imunologicky zkříženě reaktivní
T-buňky klonu C9, získané zprediabetických NOD myší, byly inkubovány s peptidem p277 (plná kolečka), p277(Val6-Val ’) (prázdná kolečka), p277(Ser6-Sern) (plné čtverečky) a p277 (můstkovaný Cys-Cys) (prázdné kosočtverečky). Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Bylo zjištěno, že klon C9 vykazuje pozitivní proliferační odpověď pouze na peptidy p277 a p277(Val6-Valu). To ukazuje, že p277 a p277(Val6-Valn) jsou zkříženě reaktivní a že peptidy p277(Ser6-Sern) a p277(můstkovaný Cys-Cys), které nejsou terapeuticky účinné, nejsou imunologicky zkříženě reaktivní.
Příklad 7
Nově diagnostikovaní IDDM pacienti vykazují proliferativní odpovědi T-buněk jak na p277 tak na277(Val6-Val”)
Nově diagnostikovaní (2 až 4 týdny) IDDM pacienti byli testováni testem proliferace. Periferní krevní lymfocyty byly izolovány z úplné heparinizované krve na ficol-hypaque a analyzovány na proliferaci in vitro, která byla měřena jako inkorporace 3H-thymidinu, indukovaná hsp60 peptidy p277, p277(Val6-Valn) a kontrolním peptidem p278. Proliferační odpověď T buněk je udávána jako stimulační index (SI): poměr mezi peptidem stimulovanou inkorporací thymidinu T buňkami a inkorporací thymidinu pozadím (žádný antigen).
-12CZ 293784 B6
Tabulka 5
Nově diagnostikovaní IDDM pacienti vykazují proliferační odpovědi T-buněk jak na p277 tak na p277(Val6-Valu)
| pacient | proliferace T buněk (SI) | ||
| p277 | p277(Valb-Val11) | p278 | |
| IDDM#68 | 3,5 | 3,2 | 0,8 |
| IDDM#69 | 2,5 | 5,0 | 0,5 |
Jak je ukázáno v tabulce 5, nově diagnostikovaný IDDM pacienti odpovídají na p277(Val6-Valu) stejně jako na p277 peptid. p277(Val6-Valn) je tedy imunologicky ekvivalentní sp277. Jelikož terapeutický účinek p277 je zprostředkován imunologickým rozpoznáváním, skutečnost, že p277(Val6-Valn) je imunologicky zkříženě reaktivní sp277, ukazuje, že může být použit při léčení diabetů místo p277.
Příklad 8
Odpovědi T buněk na hsp60 a na peptid u IDDM a u zdravých jedinců
Na anti-hsp60 a p277(V) bylo testováno 21 IDDM pacientů a 14 zdravých dárců krve způsoby testování proliferace podle příkladu 7. Tabulka 6 a 7 ukazují proliferační odpověď T buněk (stimulační index; SI) každého jedince na kontrolní antigen (kontrolní Ag), tj. toxoid tetanu a virus chřipky - kmen Texas, pro celý rekombinantní hsp60 a p277(V). Jako pozitivní byly vzaty hodnoty SI 3 nebo větší.
Tabulka 6
Proliferační odpovědi T buněk u IDDM pacientů
| pacient | věk (roky) | doba od diagnózy | odpověď T buněk (stimulační index na) | ||
| kontrolní Ag | hsp60 | p277(V) | |||
| l.LM | 32 | 3,5 měsíce | 4- | + | — |
| 2.G | 25 | 24 měsíců | + | + | - |
| 3.H | 23 | 6 měsíců | + | + | — |
| 4.DV | 20 | 3 týdny | + | + | - |
| 5 týdnů | + | + | + | ||
| 5. SD | 15 | 6 týdnů | + | + | + |
| 6.P | 15 | 4 týdny | + | — | — |
| 7.G | 60’ | 5 týdnů | + | + | + |
| 7 týdnů | + | + | + | ||
| 8.F | 45’ | 6 týdnů | + | + | + |
| 9. IS | 53 | 2 týdny | + | + | — |
| 10. T | 20 | 4 týdny | + | + | + |
| 11.KK | 21 | 4 týdny | + | + | - |
| 12. RI | 40 | 6 týdnů | + | — | — |
| 13. MS | 5 | 1 týden | + | — | - |
| 14. KB | 5 | 2 měsíce | + | + | + |
| 15. Bl | 11,3 | 3 týdny | + | — | — |
| 16. XY | 60 | 2 měsíce | + | + | — |
| 17. KA | 12 | 4 týdny | - | — | — |
| 18. ZA | 12 | 4 týdny | + | + | + |
| 19. A | 17,5 | 11,5 roku | + | + | + |
| 20. N | 17,5 | 7,5 roku | + | + | + |
| 21.A | 19,7 | 5,7 roku | + | + | + |
-13CZ 293784 B6 * Pacienti pozitivní na anti-GAD protilátky jsou diabetici typu I, nikoliv typu Π, přes pokročilý věk nástupu nemoci.
Tabulka 76
Proliferační odpovědi T buněk u zdravých dárců krve
| dárce | odpovědi T buněk (stimulační index na) | ||
| kontrolní Ag | hsp60 | p277(V) | |
| 1. | + | - | - |
| 2. | + | — | - |
| 3. | + | nd | + |
| 4. | + | - | - |
| 5. | + | + | + |
| 6. | + | - | - |
| 7. | + | — | — |
| 8. | + | — | — |
| 9. | + | — | — |
| 10. | + | — | — |
| 11. | + | + | — |
| 12. | + | — | — |
| 13. | + | + | — |
| 14. | + | - | - |
nd: znamená nestanoveno
Tabulka 8 je souhrnná tabulka ukazující, že 86 a 52 % pacientů odpovídalo na hsp60 a p277(V) při srovnání s 21 a 14 % kontroly (p<0,05). IDDM skupina byla tedy významně pozitivní, pokud jde o odpovědi T buněk na hsp60 a p277(V). To vede k závěru, že výskyt hsp60 a p277(V) reagujících jedinců je vyšší u IDDM pacientů než u zdravých lidí.
Tabulka 8
Výskyt pozitivních odpovědí T buněk u IDDM a u zdravých jedinců
| odpovídající | výskyt odpovědi | T buněk (%) na |
| hsp60 | p277(V) | |
| IDDM | 18/21(86) | 11/21(52)’ |
| zdraví | 3/14(21) | 2/14(14) |
* p<0,05 podle analýzy nejmenších čtverců při srovnání s výskytem anti-p277(V) odpovědí u zdravých dárců krve
Příklad 9
NOD T-buněčná proliferace účinkem p277(Lys19)
Peptid p277(Lys19) se liší od p277 jednou aminokyselinou. Aby se potvrdilo, že p277(Lys19) je autoantigenem u NOD IDDM, srovnali jsme proliferaci T-buněk účinkem peptidu p277 a peptidu p277(Lys19). Obrázek 3 ukazuje, že T buňky samičích NOD slezin proliferovaly s p277(Lys19) peptidem ve stejném množství jako s p277. Na kontrolní peptid p278 neexistovala žádná odpověď.
Shora uvedené výsledky byly potvrzeny použitím klonu C9, diabetogenního NOD T-buněčného klonu, o kterém bylo zjištěno, že odpovídá na lidský peptid p277 [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with
-14CZ 293784 B6 a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3088 až 3091 (1991).]. Bylo zjištěno, že C9 buňky proliferují na p277(Lys19) peptid stejnou úrovní jako na p277 peptid (obr. 4).
Příklad 10
Ošetření samičích NOD myší p277(Lys19)
Autoři předloženého vynálezu již dříve popsali, že pokročilá insulitida u samičích NOD myší starých 3 měsíce se může zastavit ošetřením myší jedinou injekcí lidského p277. U ošetřených myší došlo k nižšímu výskytu klinického zřejmého diabetů a smrti pocházející od silné hyperglykémie. Pro testování toho, jestli peptid p277(Lys19), který je vlastním myším p277 peptidem, bude také účinný, ošetřili jsme 3 měsíce staré myší NOD samičky 100 pg buď lidského p277, nebo p277(Lys19) v IFA.
Peptidy p277 nebo p277(Lys19) v koncentraci 2 mg/ml ve fosforečnanem pufrovaném solném roztoku (PBS) byly emulgovány se stejným objemem neúplného Freundova adjuvans (IFA). Skupinám 10 myších NOD samic ve stáří 3 měsíce bylo subkutánní injekcí podáno 0,1 ml (100 pg peptidů) emulze obsahující příslušný peptid. Kontrolním myším byla injekcí podána emulze PBS a IFA. Myším byla odebírána krev každé 4 týdny. Hladiny krevní glukózy byly stanovovány přístrojem Beckmann Glucose Analyser Π. Ve stáří 6 měsíců byla vyhodnocena hyperglykémie a smrt pocházející od diabetů. Myši byly považovány za diabetické, jestliže množství glukózy v jejich krvi bylo větší 11 mmol/1.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9. Ve stáří 6 měsíců bylo 90 % kontrolních myší zřetelně hyperglykemických a 60 % z nich zemřelo na diabetes. Naproti tomu ošetření buď peptidem p277, nebo p277(Lys19) zabránilo jako diabetů (40 a 50% výskyt), tak smrti (10 a 20% výskyt). Zdá se tedy, že myším vlastní peptid p277(Lys19) je při léčení pokročilé insulitidy tak účinný jako cizí p277.
Tabulka 9
Léčení diabetů p277 a p277(Lys19)
| léčení ve 3 měsících | diabetes v 6 měsících (%) | |
| hyperglykémie | úmrtnost | |
| p277(Lys19) | 50’ | 20’ |
| p277 | 40’ | 10* |
| PBS | 90’ | 60’ |
’ p<0,05
Tyto výsledky ukazují, že proliferační odpovědi NOD T buněk detegují použití lidské hsp60 molekuly a jejího p277 peptidů jsou ekvivalentní autoimunní odpovědi na myší hsp50 a myší p277(Lys19) sekvencí. Bylo to ukázáno pro diabetogenní C9 T buněčný klon, stejně jako pro spontánní odpověď vyvíjející se ve slezinách prediabetických myší. Navíc byl p277(Lys’9) stejně účinný jako p277 při léčení diabetů u NOD myší. Slezinné T buňky věkově a sexuálně spárovaných myší jiných kmenů nevykazovaly spontánní proliferační odpověď T buněk na p277 (neuvedeno).
Zjištění autoimunity na myší hsp60 sekvenci zacílenou diabetogenními T buňkami podporuje obecný předpoklad, že IDDM je způsobena autoimunním procesem.
-15CZ 293784 B6
Příklad 11
Léčení STZ-indukovaného diabetů p277(V)
Streptozotocin (STZ) je β-buněčný specifický toxin, kteiý způsobuje toxický diabetes ničením β-buněk během 24 až 48 h, jestliže se podá injekční dávka 200 mg/kg. Podán v malých podtoxických dávkách indukuje u geneticky vnímavé myši insulitidu vedoucí k diabetů. Zánětlivé procesy mohou trvat 20 až 30 dnů, podle dávky STZ. Obvyklý postup pro STZ-indukovaný diabetes je dávka 200 mg STZ na kg tělesné hmotnosti podávaná v 5 dávkách po 40 mg/kg 5 po sobě jdoucích dnů [Like A. A., Rossini A. A.: Streptozotocin-induced pancreaticinsulitis: new model of diabetes mellitus, Science 195. 415 až 417 (1976).]. Tento model je nazýván nízkodávkový STZ. Zjistili jsme, že jestliže celková dávka je snížena na 150 mg/kg (5 krát 30 mg/kg), diabetes se vyvine během 80 až 100 dnů. Tato pomalu postupující forma STZ-indukovaného diabetů možná lépe připomíná autoimunní diabetes u lidí a má stejné trvání jako preklinický stupeň spontánního diabetů u NOD myší [Castano L., Eisenbarth G. S.: Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouše, and rat, Annu. Rev. Immunol. 8, 647-79 (1990).]. Navíc jsou akutní toxické účinky sníženy, jak je sníženo dávkování.
Heat shock protein o molekulové hmotnosti 60 000 (hsp60) hraje úlohu jak u NOD [Elias D., Markovits D., Reshef T., van der Zee R. a Cohen I. R.: Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouše by a 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87.1576 až 1580 (1990).] tak u STZ-indukovaného [Elias D., Prigozin H., Polák N., Rapport M., Lohse A. W. Cohen I. R.: Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocin, Diabetes 43. 992 až 998 (1994).] diabetů. Dříve jsme ukázali, že jak protilátkové tak T buněčná proliferační odpověď na hsp60 se vyskytuje před nástupem zřejmého diabetů. T buněčné klony specifické na hsp60 byly odvozeny od prediabetických NOD myší a mohly by adoptivně přenášet insulitidu a hyperglykémii na mladé NOD [Elias D., Markovits D., Reshef T., van der Zee R. a Cohen I. R.: Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouše by a 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1576 až 1580 (1990).] nebo τγ/δ NOD myši. NOD diabetogenní T buněčné klony rozpoznávají peptid o délce 24 aminokyselin hsp60 sekvence 437 až 460, který nazýváme p277. STZ-indukovaný diabetes je také doprovázen anti-p277 T buněčnými odpověďmi v preklinickém stadiu.
Předcházející příklady ukázaly, že p277(Val6-Valn) peptid chrání NOD myši. Předložený pokus testuje účinnost ošetření p277(V) na STZ-modelu v nízkých dávkách.
Myší samci (skupiny po 10) byli ošetřeni dávkou 30 mg/kg STZ, podávanou denně 5 dnů. O týden později bylo myším podáno 100 pg buď p277(V) v oleji, peptidu dekarboxylázy glutamové kyseliny (GADp34) popsané Kaufmanem a spol. [Kaufman D. L., Clare-Salzer M., Tian J., Forsthuber T., Ting G. S. P., Robinson P., Atkinson M. A., Sercarz E. E., Tobin A. J., LehmannP. V.: Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decaroxylase in murine insulin-dependent diabetes, Nátuře 366, 69 až 72 (1993)], které jsou zahrnuty v diabetes NOD myší, nebo olej samotný. Ošetření bylo opakováno 85. den. Stý den byla myším odebrána krev. Krev byla testována na hyperglykémii (koncentrace glukózy větší než 15 nmol/1). Výsledky jsou shrnuty na obrázku 5. Je vidět, že střední hladina glukózy v krvi skupin myší ošetřených GADp34 nebo neošetřených myší byla v rozmezí pro hyperglykémii. Naproti tomu střední hladina glukózy v krvi myší ošetřených p277(V) byla v normálním rozmezí. p277(V) je tedy účinný při léčení diabetů indukovaného STZ u myších C57BL/ksj samců a také spontánního diabetů vyvinutého u geneticky rozdílných myších NOD samiček. Použití p277(V) terapie není omezeno na diabetes jenom jedné příčiny nebo jenom jednoho genotypu nebo pohlaví.
Všechny odkazy, které jsou zde uvedeny, včetně článků nebo abstrakt časopisů, publikovaných nebo odpovídajících USA nebo cizích patentových přihlášek, vydaných USA nebo cizích patentů, nebo jakýchkoliv jiných odkazů, jsou zde celé zahrnuty jako odkaz, celé včetně dat,
-16CZ 293784 B6 tabulek, obrázků a textů uvedených v citovaných odkazech. Jako odkazy jsou zde zahrnuty také úplné obsahy odkazů citované ve zde uvedených odkazech.
Odkaz na známý stupeň způsobu, stupeň konvenčního způsobu, známé způsoby nebo konvenční způsoby není v žádném případě připuštěním toho, že jakýkoliv aspekt, popis nebo provedení podle předloženého vynálezu je popsán, uveden nebo navržen v oblasti techniky.
Předcházející popis specifických provedení plně odhalil obecnou podstatu vynálezu, který mohou jiní, aplikací znalostí z oblasti techniky (včetně obsahů odkazů, které jsou zde citovány), snadno modifikovat a/nebo přizpůsobit na různé aplikace, jako jsou specifická provedení, bez nepatřičného experimentování, aniž by se tím odchýlili od obecného konceptu předloženého vynálezu. Takováto přizpůsobení a modifikace jsou považována za ekvivalentní rozsahu a významu popsaných provedení, založených na zde uvedeném popisu a vysvětlení. Tomu je třeba rozumět tak, že frazeologie nebo terminologie zde existuje pro účely popisu, nikoliv jako omezení, takže terminologii nebo fraseologii předloženého spisu je třeba interpretovat odborníky z oblasti techniky z hlediska popisů a vysvětlení zde uvedených v kombinaci se znalostí odborníka z oblasti techniky.
Claims (17)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Analog peptidu p277 obecné sekvence identifikační číslo 26 11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Xi-Ala-Leu-Leu-Arg-Xr-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (sekv. id. č. 2), v níž X! i X2 znamená skupinu Cys nebo Val a X3 znamená skupinu Thr nebo Lys, ale Xi i X2 nemohou současně znamenat skupinu Cys, jestliže X3 znamená Thr, a jeho soli a funkční deriváty.
- 2. Analog peptidu p277 podle nároku 1, který je vybrán z peptidu označeného p277(Val6), v němž X] znamená Val, X2 znamená Cys a X3 znamená Thr, p277(Valn), v němž Xi znamená Cys, X2 znamená Val a X3 znamená Thr, p277(Val6-Val11), v němž jak Xi tak X2 znamená Val a X3 znamená Thr, peptidu p277(Lys19), v němž jak X3 tak X2 znamená Cys a X3 znamená Lys, p277(Val6-Lys19), v němž Xi znamená Val, X2 znamená Cys a X3 znamená Lys, p277(ValnLys19), v němž Xi znamená Cys, X2 znamená Val a X3 znamená Lys a p277(Val6,n-Lys19), v němž jak Xi tak X2 znamená Val a X3 znamená Lys.
- 3. Použití analogu peptidu p277 podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu prostředku pro stanovení diagnózy diabetes mellitus závislého na inzulínu, IDDM.
- 4. Způsob stanovení diagnózy přítomnosti nebo počátku IDDM u pacienta, vyznačující se tím, že se krev nebo moč pacienta testuje s analogem peptidu p277 podle nároku 1 nebo 2 na přítomnosti protilátek nebo T buněk, které jsou imunologicky reaktivní s lidským hspóO, přičemž výsledek ukazující na pozitivní přítomnost anti-hsp60 protilátek nebo T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, ukazuje vysokou pravděpodobnost přítomnosti nebo počátku IDDM.
- 5. Způsob stanovení diagnózy podle nároku 4, vyznačující se tím, že přítomnost anti-hsp60 protilátek je testována radioimunoanalýzou nebo testem ELISA.-17CZ 293784 B6
- 6. Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti anti-hsp60 protilátek způsobem podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že obsahuje:i) antigen, kterým je analog peptidů p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 2, a ii) označenou protilátku schopnou rozpoznávat ne-variabilní oblast uvedených anti-hsp60 protilátek, které mají být detegovány.
- 7. Způsob stanovení diagnózy podle nároku 4, vyznačující se tím, že se testuje přítomnost T buňky, která je imunoreaktivní s hsp60, testem proliferace T buněk, který zahrnuje následující stupně:i) přípravu mononukleámí buněčné frakce obsahující T buňky ze vzorku krve získaného od vedeného pacienta, ii) přidání antigenu, který je vybrán z peptidů podle nároku 1, ktéto mononukleámí buněčné frakci, iii) inkubování této buněčné frakce v přítomnosti antigenu po vhodné časové období a za vhodných kultivačních podmínek, iv) přidání označeného nukleotidu k inkubované buněčné kultuře podle iii) ve vhodné době před koncem inkubační doby, aby se dosáhla inkorporace označeného nukleotidu do DNA proliferujících T buněk, av) stanovení množství proliferujících T buněk analýzou množství označeného nukleotidu, který je inkorporován do těchto T buněk.
- 8. Způsob stanovení diagnózy podle nároku 4, vyznačující se tím, že se testuje přítomnost T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, testem odpovědi T buněk na cytokin, který obsahuje následující stupně:i) přípravu mononukleámí buněčné frakce obsahující T buňky ze vzorku krve získaného od uvedeného pacienta, ii) přidání antigenu, který je vybrán zpeptidů podle nároku 1, ktéto mononukleámí buněčné frakci, iii) inkubování této buněčné frakce v přítomnosti antigenu po vhodné časové období a za vhodných kultivačních podmínek a iv) změření přítomnosti cytokinu sekretovaného odpovídajícími lymfocyty do média, přičemž cytokinem je DFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α nebo TGFp.
- 9. Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti T buňky, které je imunoreaktivní s hspóO, způsobem podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje:i) antigen, kterým je analog peptidů p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1, ii) označený nukleotid a iii) médium vhodné pro kultivaci lymfocytů.
- 10. Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, způsobem podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje:i) antigen, kterým je analog peptidů p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1, ii) médium vhodné pro kultivaci lymfocytů a iii) testovací sestavu pro měření přítomnosti cytokinu sekretovaného odpovídajícími lymfocyty do média.
- 11. Přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM, vyznačující se tím, že obsahuje produkt T buňky, který je vybrán ze skupiny sestávající z: a) lidských T buněk, které vykazují-18CZ 293784 B6 specifičnost na sekvenci p277 lidského hsp60, přičemž tyto buňky byly aktivovány inkubováním v přítomnosti peptidu p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1, b) lidských T buněk podle a), které byly ozářeny nebo jinak oslabeny, c) lidských T buněk podle a), které byly podrobeny ošetření hydrostatickým tlakem, ošetření chemickým zesíťovacím činidlem a/nebo ošetření cytoskeletálním zesíťovacím činidlem, d) fragmentů nebo povrchových proteinů T buněk podle a), b) nebo c); nebo e) peptidu obsahujícího v podstatě variabilní oblast receptoru podle a) specifickou pro uvedený protein nebo jeho soli, funkčního derivátu, prekurzoru nebo aktivní frakce.
- 12. Přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM podle nároku 11, vyznačující se tím, že lidské T buňky podle a) znamenají autologní T buňky získané od IDDM pacienta, který má být léčen, a specifičnost T buněk byla vyvinuta in vitro kontaktem s analogem peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2.
- 13. Přípravek pro předcházení nebo léčení EDDM podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že lidské Tbuňky si vyvinuly in vitro specifičnost na analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle nároku 1.
- 14. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje analog peptidu p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
- 15. Farmaceutický přípravek podle nároku 14, pro předcházení nebo léčení IDDM.
- 16. Farmaceutický přípravek podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se tím, že analog peptidu p277 znamená analog peptidu p277 podle nároku 2.
- 17. Použití analogu peptidu p277 podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu farmaceutického prostředku pro předcházení nebo léčení IDDM.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL11209494A IL112094A0 (en) | 1994-12-21 | 1994-12-21 | Novel peptides and pharmaceutical compositions comprising them |
| IL11446095A IL114460A0 (en) | 1995-07-05 | 1995-07-05 | Peptide p277 analogs and pharmaceutical compositions comprising them for treatment or diagnosis of diabetes |
| PCT/US1995/016596 WO1996019236A1 (en) | 1994-12-21 | 1995-12-20 | PEPTIDE p277 ANALOGS, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THEM FOR TREATMENT OR DIAGNOSIS OF DIABETES |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ190897A3 CZ190897A3 (en) | 1997-11-12 |
| CZ293784B6 true CZ293784B6 (cs) | 2004-07-14 |
Family
ID=26322965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19971908A CZ293784B6 (cs) | 1994-12-21 | 1995-12-20 | Analog peptidu p277, farmaceutický přípravek, který ho obsahuje pro léčení nebo diagnózu diabetu |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0820303B1 (cs) |
| JP (2) | JP3420245B2 (cs) |
| KR (1) | KR100400480B1 (cs) |
| CN (1) | CN1233417C (cs) |
| AR (1) | AR002949A1 (cs) |
| AT (1) | ATE242005T1 (cs) |
| AU (1) | AU707835B2 (cs) |
| BR (1) | BR9510102A (cs) |
| CA (1) | CA2208274C (cs) |
| CZ (1) | CZ293784B6 (cs) |
| DE (2) | DE69531004T2 (cs) |
| DK (1) | DK0820303T3 (cs) |
| ES (1) | ES2201137T3 (cs) |
| FI (1) | FI118373B (cs) |
| HR (1) | HRP950612B1 (cs) |
| HU (1) | HU224160B1 (cs) |
| IL (1) | IL116499A0 (cs) |
| IS (1) | IS1966B (cs) |
| MX (1) | MX9704738A (cs) |
| NO (1) | NO317350B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ301440A (cs) |
| PL (1) | PL184145B1 (cs) |
| PT (1) | PT820303E (cs) |
| RO (1) | RO116777B1 (cs) |
| RS (1) | RS49517B (cs) |
| SI (1) | SI0820303T1 (cs) |
| TR (1) | TR199501630A2 (cs) |
| TW (1) | TW496872B (cs) |
| UA (1) | UA42040C2 (cs) |
| UY (1) | UY24130A1 (cs) |
| WO (1) | WO1996019236A1 (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6488933B2 (en) | 1995-07-05 | 2002-12-03 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Preparations for the treatment of T cell mediated diseases |
| ATE249046T1 (de) * | 1996-05-14 | 2003-09-15 | Winnacker Ernst Ludwig Prof | Chaperone, die prionproteine binden und zwischen den isoformen prpc und prpsc unterscheiden können |
| AU2001282475A1 (en) * | 2000-08-25 | 2002-03-04 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of treatment or prevention of autoimmune diseases with CpG-containing polynucleotide |
| IL140233A0 (en) * | 2000-12-11 | 2002-02-10 | Peptor Ltd | Backbone cyclized analogs of heat shock proteins |
| EP2157101B1 (en) | 2002-01-31 | 2014-09-24 | Andromeda Bio Tech Ltd. | HSP peptides and analogs for modulation of immune responses via antigen presenting cells |
| CA2595520A1 (en) * | 2004-01-28 | 2005-08-11 | Develogen Israel Ltd. | Hsp therapy in conjunction with a low antigenicity diet |
| DE102004043750A1 (de) * | 2004-09-10 | 2006-03-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Formulierungen des Peptids p277 oder dessen Varianten mit optimierter Stabilität |
| RU2282453C2 (ru) * | 2004-12-14 | 2006-08-27 | Александр Борисович Смолянинов | Способ терапии больных сахарным диабетом ii типа |
| CN100352502C (zh) * | 2004-12-29 | 2007-12-05 | 中国药科大学 | 能通过免疫防治ⅰ型糖尿病的重组蛋白和重组基因 |
| US8691772B2 (en) | 2005-01-04 | 2014-04-08 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | HSP60, HSP60 peptides and T cell vaccines for immunomodulation |
| EP1858545A2 (en) | 2005-03-04 | 2007-11-28 | Curedm Inc. | Methods and pharmaceutical compositions for treating type 1 diabetes mellitus and other conditions |
| CA2726759C (en) | 2005-05-25 | 2016-02-16 | Curedm Group Holdings, Llc | Human proislet peptide, derivatives and analogs thereof, and methods of using same |
| JP4283812B2 (ja) * | 2006-01-06 | 2009-06-24 | 財団法人工業技術研究院 | 重症筋無力症の診断方法およびそのキット |
| US8785400B2 (en) | 2006-11-22 | 2014-07-22 | Curedm Group Holdings, Llc | Methods and compositions relating to islet cell neogenesis |
| PL2193142T3 (pl) | 2007-08-30 | 2015-06-30 | Curedm Group Holdings Llc | Kompozycje i sposoby z zastosowaniem peptydów prowysepkowych i ich analogów |
| CU23701A1 (es) * | 2008-12-29 | 2011-09-21 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Método de tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y diabetes tipo i |
| JP2015508812A (ja) | 2012-03-01 | 2015-03-23 | イエダ リサーチ アンド ディベロプメント カンパニー リミテッド | 非自己免疫性糖尿病を抑制および処置するためのｈｓｐ６０由来ペプチドおよびペプチド類似体 |
| WO2013128453A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Regeneration of islet beta cells by hsp60 derived peptides |
| CN104418948B (zh) * | 2013-09-10 | 2019-08-16 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种制备多肽药物的方法 |
| CN104650209B (zh) * | 2013-11-19 | 2018-04-06 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 多肽药物DiaPep277 的合成方法 |
| CN104650244B (zh) * | 2015-01-21 | 2017-12-08 | 中国药科大学 | 一种具有降血糖兼调脂作用的表位组合肽及其用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5114844A (en) * | 1989-03-14 | 1992-05-19 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Diagnosis and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
-
1995
- 1995-12-20 AU AU46866/96A patent/AU707835B2/en not_active Expired
- 1995-12-20 HU HU9901771A patent/HU224160B1/hu active IP Right Grant
- 1995-12-20 AT AT95944502T patent/ATE242005T1/de active
- 1995-12-20 PL PL95321091A patent/PL184145B1/pl unknown
- 1995-12-20 DE DE69531004T patent/DE69531004T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-20 MX MX9704738A patent/MX9704738A/es unknown
- 1995-12-20 CN CNB95197680XA patent/CN1233417C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-20 DK DK95944502T patent/DK0820303T3/da active
- 1995-12-20 UA UA97063404A patent/UA42040C2/uk unknown
- 1995-12-20 KR KR1019970704281A patent/KR100400480B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-20 ES ES95944502T patent/ES2201137T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-20 BR BR9510102A patent/BR9510102A/pt active IP Right Grant
- 1995-12-20 CA CA002208274A patent/CA2208274C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-20 DE DE0820303T patent/DE820303T1/de active Pending
- 1995-12-20 RO RO97-01173A patent/RO116777B1/ro unknown
- 1995-12-20 SI SI9530664T patent/SI0820303T1/xx unknown
- 1995-12-20 JP JP51996596A patent/JP3420245B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-20 CZ CZ19971908A patent/CZ293784B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-20 NZ NZ301440A patent/NZ301440A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-12-20 PT PT95944502T patent/PT820303E/pt unknown
- 1995-12-20 EP EP95944502A patent/EP0820303B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-20 WO PCT/US1995/016596 patent/WO1996019236A1/en active Search and Examination
- 1995-12-21 TR TR95/01630A patent/TR199501630A2/xx unknown
- 1995-12-21 RS YU78795A patent/RS49517B/sr unknown
- 1995-12-21 HR HR950612A patent/HRP950612B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-12-21 IL IL11649995A patent/IL116499A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-12-21 UY UY24130A patent/UY24130A1/es unknown
- 1995-12-21 AR AR10071295A patent/AR002949A1/es unknown
-
1996
- 1996-01-05 TW TW085100088A patent/TW496872B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-06-19 IS IS4510A patent/IS1966B/is unknown
- 1997-06-19 FI FI972669A patent/FI118373B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-06-19 NO NO19972849A patent/NO317350B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-30 JP JP2003022033A patent/JP3554319B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ293784B6 (cs) | Analog peptidu p277, farmaceutický přípravek, který ho obsahuje pro léčení nebo diagnózu diabetu | |
| JP3165148B2 (ja) | インスリン依存性糖尿病の診断と治療 | |
| KR100454554B1 (ko) | 당뇨병 치료를 위한 인간의 열쇼크 단백질60 유래의 신규펩티드들, 조성물들, 방법들 및 키트들 | |
| US6180103B1 (en) | Peptide p277 analogs, and pharmaceutical compositions comprising them for treatment or diagnosis of diabetes | |
| AU714970B2 (en) | Preparations and methods for the treatment of T cell mediated diseases | |
| MXPA98000190A (en) | Preparations and methods for the treatment of medium diseases by cellula | |
| US20030190323A1 (en) | Preparations and methods for the treatment of T cell mediated diseases | |
| RU2159250C2 (ru) | АНАЛОГИ ПЕПТИДА p277 И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТА | |
| JP3905126B2 (ja) | Ｔ細胞媒介疾患の治療の効力を検出又は監視する方法 | |
| US6488933B2 (en) | Preparations for the treatment of T cell mediated diseases | |
| JP3955627B6 (ja) | 糖尿病の治療のためのヒト熱ショックタンパク質６０由来の新規ペプチド、組成物、方法およびキット | |
| IL111361A (en) | Polypeptides derived from hHSP65 and pharmaceutical compositions comprising them for prevention or treatment of insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) | |
| JP2007119482A (ja) | 糖尿病の治療のためのヒト熱ショックタンパク質６０由来の新規ペプチド、組成物、方法およびキット | |
| MXPA98000191A (en) | Novedous peptides derived from human protein 60 produced by thermal shock, for the treatment of diabetes, compositions, methods and equi |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20151220 |