CZ293784B6

CZ293784B6 - Analog peptidu p277, farmaceutický přípravek, který ho obsahuje pro léčení nebo diagnózu diabetu

Info

Publication number: CZ293784B6
Application number: CZ19971908A
Authority: CZ
Inventors: Irun R. Cohen; Dana Elias; Matityahu Fridkin
Original assignee: Yeda Research And Development Co. Ltd.
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2004-07-14
Also published as: PT820303E; MX9704738A; DE69531004T2; FI118373B; EP0820303A4; JP3554319B2; AU4686696A; IS1966B; AU707835B2; SI0820303T1; HRP950612A2; NO317350B1; YU78795A; PL321091A1; CA2208274C; JP2004026797A; DE820303T1; HU224160B1; RO116777B1; HUT78092A

Abstract

Je popsán analog peptidu p277 obecné sekvence identifikační číslo 2, v níž X.sub.1.n. i X.sub.2.n. znamená skupinu Cys nebo Val a X.sub.3 .n.znamená skupinu Thr nebo Lys, ale X.sub.1.n. i X.sub.2.n. nemohou současně znamenat skupinu Cys, jestliže X.sub.3.n. znamená Thr, a jeho soli a funkční deriváty, jeho použití pro diagnózu, předcházení nebo léčení diabetes mellitus (IDDM).ŕ

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká analogu peptidu p277, způsobu stanovení diagnózy přítomnosti nebo počátku IDDM, sestavy pro stanovení diagnózy IDDM, přípravku pro předcházení nebo léčení IDDM, farmaceutického přípravku, který obsahuje uvedený analog peptidu, použití analogu peptidu p2277 a způsobu předcházení nebo léčení IDDM.

Dosavadní stav techniky

Diabetes typu I, nebo IDDM, je autoimunní onemocnění způsobené T buňkami, které napadají a ničí inzulín produkovaný β-buňkami umístěnými v ostrůvcích slinivky břišní [Castano L., Eisenbarth G. S.: Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouše, and rat. Annu. Rev. Immunol. 8, 647-79 (1990).]. Autoimunní postup kulminující v IDDM začíná a pokračuje bez příznaků. Nemocné povrchy jsou klinicky pouze ty, u nichž souhrnná ztráta β-buněk převyšuje kapacitu zbývajících β-buněk dodávat inzulín. Ve skutečnosti se předpokládá, že kolaps homeostase glukózy a klinický IDDM nastává teprve tehdy, když je 80 až 90 % β-buněk inaktivováno imunitním systémem. Pacienti, kteří jsou identifikováni jako pacienti s IDDM, jsou ti, kteří mají pokročilý stupeň destrukce svých β-buněk. Diagnóza počátečních preklinických diabetes detekcí imunologických markérů autoimunity β-buněk může být provedena pouze po nástupu autoimunního procesu. Terapeutickou otázkou je tedy nalézt bezpečnou, specifickou a efektivní cestu, jak zastavit autoimunní proces, který již probíhá.

Autoři předloženého vynálezu zkoumali tuto otázku před studiem vývoje spontánního diabetes umyší kmene NOD, který je považován za věrný model lidského IDDM [Castano L., Eisenbarth G. S.: Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouše, and rat, Annu. Rev. Immunol. 8, 647-79 (1990).]. U NOD myší se vyvinula inzulitida ve stáří 4 týdnů, kdy začíná jako mírný peri-ostrůvkový infiltrát a pokračuje na silný intra-ostrůvkový zánět. Hyperglykémie, která ukazuje nedostatek inzulínu, začíná u samiček této kolonie kolem 14 až 17 týdnů věku. Ve stáří 35 až 40 týdnů se u téměř všech samiček NOD myší vyvinuly silné diabetes a většina bez léčení inzulínem zemřela. U samců NOD myší byl výskyt onemocnění nižší. Důvody pro to nejsou zřejmé. Bylo ukázáno, že diabetes NOD myší byly způsobeny autoimunními T buňkami [Bendelac A., Camaud C., Boitard C., Bach J. F.: Syngeneic transfer of autoimunne diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirements for both L3T4+ and Ly+-2+ T cells, J. Exp. Med. 166. 823 až 832 (1987).].

U lidských pacientů s IDDM stejně jako u NOD myší byla identifikována reaktivita T buněk a protilátek na různé antigeny [EliasD.: The NOD mouše: A model for autoimmune insulindependent diabetes, Autoimmune Disease Models, A Guidebook, str. 147 až 161 (1994).]. Není jasné, jestli imunita na kterýkoliv jeden zmožných cílových antigenů je primární příčinou onemocnění. Vedle otázky příčiny existuje otázka léčení.

Bylo ukázáno, že iniciaci autoimunního procesu u NOD myší lze zabránit tak, že se NOD myši, před nástupem diabetes, podrobí různým manipulacím, jako je omezení dieta, virové infekce nebo nespecifické stimulace imunitního systému [Bowman M. A., Leiter E. H. a Atkinson M. A.: Prevention of diabetes in tne NOD mouše: impluications for therapeutic intervention in human disease, Immunology Today 15, 115 až 120 (1994).]. NOD diabetes lze zabránit také indukcí imunologické snášenlivosti u prediabetických myší na antigen dekarboxylázu glutamové kyseliny (GAD) [Kaufman D. L., Clare-Salzler M., Tian J., Forsthuber T., Ting G. S. P., Robinson P., Atkinson M. A.,., Sercarz E. E., Tobin A. J., Lehmann P. V.: Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependent diabetes, Nátuře 366, 69 až

-1 CZ 293784 B6 (1993) a Tisch R., Yang X. D., Singer S. M., Liblav R. S., Fuggar L., McDevitt H. O.: Immune response to glutamic acid decaboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice, Nátuře 366, 72 až 75 (1993).].

Autoři předloženého vynálezu již dříve zjistili, že diabetes NOD myší lze zabránit vakcinací T buňky použitím pro T buněk specifických sekvencí p277 peptidu lidské hsp60 molekuly [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3088 až 3091 (1991).]. Tento protein byl dříve označován hsp65, ale nyní se označuje hsp60 vzhledem k přesnější informaci o molekulové hmotnosti; ať jde o jakékoliv označení, oba proteiny jsou stejné.

Peptid p277, který je epitopem lidského hsp60, který hraje roli u IDDM, a odpovídající polohám 437 až 460 sekvence lidského hsp60 byl po prvé popsán v izraelské patentové přihlášce 94 241 přihlašovatele tohoto spisu a v práci Eliáše D. a Cohena I. R.: Peptide therapy for diabetes in NOD mice, The Lancet 343, 704 až 706 (1994). Tento peptid má následující sekvenci identifikační číslo 1

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-IlePro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (sekv. id. č. 1).

Bylo ukázáno, že podávání p277 peptidu samotného v době nástupu insulitidy zabraňuje vývoji diabetes, možná snížením anti-p277 imunity, která je podstatná pro NOD diabetes [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D, Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88. 3088 až 3091 (1991) a izraelská patentová přihláška č. 94 241.]. Nedávné studie ukázaly, že p277 peptid může být také použit pro převrácení autoimunity β-buněk, které dospěly do pokročilého stupně [Elias D. a Cohen I. R.: Peptide therape for diabetes in NOD mice, The Lancet 343. 704 až 706 (1994).].

Laboratoř autorů předloženého vynálezu nedávno popsala, že forma autoimunního diabetes může být indukována u myší kmene C57BL/KsJ podáním velmi malé dávky b-buněčného toxinového streptozotocinu (STZ) [Elias D., Prigozin H., Polák N., Rapoport M., Lohse A. W., Cohen I. R.: Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocin, Diabetes 43, 992 až 998 (1994).]. Zatímco standardní nízká dávka STZ 40 mg/kg podávaná denně po dobu 5 dnů obvykle indukuje klinický diabetes během tří týdnů, podávání 30 mg/kg po dobu 5 týdnů indukuje klinický diabetes teprve po prodloužené době kolem 3 měsíců. Tento model indukovaného diabetes se vyznačuje objevením se prodromu periody protilátek na inzulín, antiidiotypových protilátek na inzulínové protilátky a protilátek na hsp60. Tyto myši vykazují také spontánní T-buněčnou reaktivitu na hsp60 a na jeho p277 peptid [Elias D., Prigozin H., Polák N., Rapoport M., Lohse A. W. Cohen I. R.: Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocin, Diabetes 43, 992 až 998 (1994).] Zdá se tedy, že nižší než standardní nízká dávka STZ spouští autoimunní proces, ne nepodobně tomu, co je pozorováno u spontánního diabetes vyvíjejícího se u NOD myší [Elias D., Markovits D., Reshef T., van der Zee R. a Cohen I. R.: Induction and therapy of autoimnune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouše by a 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87.1576 až 1580 (1990).].

Předmětem předloženého vynálezu je poskytnout varianty peptidu p277, které jsou užitečné pro stanovení diagnózy a pro léčení IDDM.

-2CZ 293784 B6

Podstata vynálezu

Při studiu fragmentů a variant peptidů p277 bylo nečekaně zjištěno, že peptidy, v nichž pouze threoninová skupina byla nahrazena lysinovou skupinou a/nebo jedna nebo obě cysteinové skupiny byly nahrazeny valinovými skupinami, byly účinné jako p277 při léčení diabetes. Tyto výsledky byly dokonce ještě překvapivější, protože substituce cysteinových skupin serinovými vedla k neaktivním peptidům.

Předložený vynález se tedy týká analogu peptidů p277 obecné sekvence identifikační číslo 2 .6 11

V al-Leu-Gly-Gly-Gly-Xi-Ala-Leu-Leu-Arg-Xr-Ile-Pro-

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X₃-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (sekv. id. č. 2), v níž X] i X₂ znamená skupinu Cys nebo Val a X₃ znamená skupinu Thr nebo Lys, ale Xi i X₂nemohou současně znamenat skupinu Cys, jestliže X₃ znamená Thr.

Ve specifických provedeních vynálezu je analog peptidů p277 vybrán z peptidů obecné sekvence id. č. 2, v níž jak X] tak X₂ znamená Cys a X₃ znamená Lys, tedy p277(Lys¹⁹) (sekv. id. č. 3)

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro1 5 10

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp

20 (sekv. id. č. 3) nebo X] znamená Val, X₂ znamená Cys a X₃ znamená Thr nebo Lys, tedy p277(Val⁶) (sekv. id. č. 4)

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro1 510

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Xaa-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 4) a p277(Val⁶-Lys¹⁹) (sekv. id. č. 5)

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro1 510

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 5) nebo Xi znamená Cys, X₂ znamená Val a X₃ znamená Thr nebo, Lys, tedy p277(Val^u) (sekv. id. č. 6)

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro1 510

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Xaa-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 6) a p277(Valⁿ-Lys¹⁹) (sekv. id. č. 7)

V al-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-V al-Ile-Pro-

510

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 7)

-3CZ 293784 B6 nebo jak Xi tak X₂ znamená Val a X₂ znamená Thr nebo Lys, tedy p277 (Val⁶-Valⁿ) (sekv. id. č. 8)

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-V al-Ala-Leu-Leu-Arg-V al-Ile-Pro1 510

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Xaa-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 8) a p277(Val^6,1I-Lys¹⁹) (sekv. id. č. 9)

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro1 510

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp 1520 (sekv. id. č. 9).

Peptid 277(Val⁶-Valⁿ) je označován také jako p277(V).

Dalším předmětem předloženého vynálezu je získat způsoby a sestavy pro časnou diagnózu IDDM použitím analogu peptidu sekv. id. 2 podle vynálezu. Během vývoje EDDM živočichové exprimují hsp60 molekuly nebo molekuly, které s nimi zkříženě reagují, které nalézají svoji cestu do krve a moče živočichů. Exprimují také protilátky a T buňky směrované specificky na tyto molekuly. Přítomnost hspóO (nebo molekul, které s nimi zkříženě reagují) nebo protilátek nebo T buněk specifických pro ně v krvi nebo moči slouží jako test detekce IDDM procesu před tím, než je destrukce β-buněk ukončena a jedinec je odsouzen k dlouhotrvajícímu diabetes.

Přítomnost nebo počátek IDDM u pacienta může být diagnostikován testováním krve nebo moče pacienta na přítomnosti anti-hsp60 protilátek nebo T buněk, které jsou imunologicky reaktivní s lidským hspóO použitím analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu jako antigenů. Jakékoliv dříve popsané postupy, popsané jako schopné pracovat s použitím peptidu p277, jako jsou ty, které jsou popsány v PCT mezinárodní přihlášce publikované pod číslem WO 90/10449, která je zde zahrnuta jako odkaz, mohou být také použity náhradou ze peptid p277 obecné sekv. id. č. 2 podle předloženého vynálezu.

Předložený vynález tedy poskytuje způsob stanovení diagnózy přítomnosti nebo počátku IDDM u pacienta, který se vyznačuje tím, že se pacient testuje na přítomnost anti-hsp60 protilátek nebo T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, při čemž výsledek ukazující na pozitivní přítomnost anti-hsp60 protilátek nebo T buňka, která je imunoreaktivní s shpóO, ukazuje na vysokou pravděpodobnost přítomnosti nebo počátku IDDM.

Při způsobu stanovení diagnózy IDDM může být pacient testován na přítomnost anti-hsp60 protilátek, při čemž tento způsob testu může zahrnovat radioimunoanalýzu nebo test ELISA.

Pacient může být také testován na přítomnost T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO. Podle jednoho provedení tohoto aspektu tento způsob testu zahrnuje test proliferace T buněk, který obsahuje stupně:

i) přípravu mononukleámí buněčné frakce obsahující T buňky ze vzorku krve získaného z uvedeného pacienta, ii) přidání antigenů, který je vybrán z analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu, k této mononukleámí buněčné frakci, iii) této buněčné frakce v přítomnosti antigenů po vhodné Časové období a za vhodných kultivačních podmínek,

-4CZ 293784 B6 iv) přidání označeného nukleotidu k inkubované buněčné kultuře podle iii) ve vhodné době před koncem inkubační doby, aby se dosáhla inkorporace označeného nukleotidu do DNA proliferujících T buněk, a

v) stanovení množství proliferujících T buněk analýzou množství označeného nukleotidu, který je inkorporován v T buňkách.

Ve stupni iv) shora uvedený nukleotid znamená s výhodou ³H-thymidin. Stanovení množství proliferujících T buněk se provádí vypočtením stimulačního indexu T buněk standardními způsoby.

Podle jiného provedení tohoto aspektu podle vynálezu způsob testu zahrnuje test odpovědi T buněk na cytokin, při kterém stupně i) až iii) jsou stejné jako ve shora uvedeném testu proliferace T buněk a ve čtvrtém stupni iv) se standardními způsoby komerčně dostupnými sestavami deteguje přítomnost cytokinů, jako je IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α nebo TGFp, sekretovaného odpovídajícími lymfocyty do média.

Podle jiného aspektu vynález poskytuje in vivo způsob, při němž se antigen vybraný z analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 injekčně subkutánně podá pacientovi a pozoruje se výskyt detegovatelné kožní reakce (DTHG).

Předložený vynález se také týká prostředků pro provedení těchto analýz stejně jako sestav pro provádění těchto analýz. Tyto sestavy se mohou vyrábět pro provedení jakýchkoliv různých testů používaných pro dosažení předloženého vynálezu. Každá taková sestava zahrnuje všechny materiály nutné pro provedení jednoho testu nebo daného počtu testů. Například sestava pro stanovení přítomnosti anti-hsp60 protilátek může obsahovat analog peptidu p2727 obecné sekv. id. č. 2 mobilizovaný na pevné fázi a označenou protilátku schopnou rozpoznávat nevariabilní oblast anti-hsp60 protilátky, která má být detegována, jako je označený anti-lidský Fab. Tato sestava může také obsahovat pokyny pro použití a nádoby, které uchovávají materiály sestavy. Může se používat jakékoliv označení nebo značka, jako je radioizotop, enzym, chromofor nebo fluorofor. Typickým radioizotopem je jod-125 nebo síra-35. Mezi typické enzymy pro toto použití patří křenová peroxidáza, β-galaktosidáza a alkalická fosfatáza.

Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti anti-hsp60 protilátek obsahuje:

i) antigen, který je vybrán z analogu peptidu p277 obecné sekvence id. č. 2, a ii) označenou protilátku, která je schopna rozpoznávat ne-variabilní oblast uvedených anti-hsp60 protilátek, které mají být detegovány.

Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, obsahuje:

i) antigen, který je vybrán z analogu peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2, ii) médium vhodné pro kultivaci lymfocytů (T buněk) a iii) buď označený nukleotid pro testování proliferace T buněk, nebo testovací sestavu cytokinů, např. IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α nebo TGFfi, pro test cytokinů.

Pro in vivo test bude sestava obsahovat pouze analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 ve formě vhodné pro injekce.

-5CZ 293784 B6

Předložený vynález se dále týká prostředků pro předcházení nebo léčení IDDM. Očkování antigenovým peptidem obecné sekv. id. č. 2 podle předloženého vynálezu může poskytnout specifické snížení autoimunity na antigen a vytvořit účinnou rezistenci na autoimunní proces IDDM. Stejné platí o očkování T buňkami specifickými pro tento antigen v zeslabené nebo avirulentní formě nebo po tom, co byly ošetřeny, aby se zlepšila jejich antigeničnost, nebo jejich fragmenty nebo aktivní fragmenty. Jestliže bylo ukázáno, že pacient má již v preklinické počínající stavy IDDM, injekce tímto antigenem nebo T buňkou (nebo frakcí) může vést ke snížení autoimunity na tento antigen a tak se může tento autoimunní proces uzavřít dříve, než dojde k významnému stabilnímu poškození. Tento peptid se může použít také jako terapeutické činidlo pro uzavření autoimunního procesu dokonce i po tom, co je již značně pokročilý, jak bylo nedávno uvedeno vynálezci předloženého vynálezu, pokud jde o léčení NOD myší peptidem p277 [Elias D. a Cohen I. R.: Peptide therapy for diabetes inNOD mice, The Lancet 343, 704 až 706 (1994).].

Předložený vynález tedy poskytuje přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM, obsahující produkt T buňky, který je vybrán ze skupiny sestávající z: a) lidských T buněk, které vykazují specifičnost na sekvenci p277 lidského hsp60, při čemž tyto buňky byly aktivovány inkubováním v přítomnosti peptidů obecné sekv. id. č. 2, b) lidských T buněk ad a), které byly ozářeny nebo jinak oslabeny, c) lidských T buněk podle ad a), které byly podrobeny ošetření tlakem hydrostatickým tlakem, ošetření chemickým zesíťovacím činidlem a/nebo ošetření cytoskeletýlním zesíťovacím činidlem, d) fragmentů nebo povrchových proteinů T buněk podle ad a), b) nebo c) nebo e) peptidů obsahujícího v podstatě variabilní oblast receptorů ad a) specifického pro uvedený protein nebo jeho soli, funkčního derivátu, prekurzoru nebo aktivní frakce.

Ve výhodném provedení podle vynálezu tento přípravek obsahuje autologní lidské T buňky získané od IDDM pacienta, který má být léčen. T buňky aktivovány in vitro kontaktem s analogem peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2. Tyto specifické a aktivované T buňky se pak podají stejnému pacientovi, od kterého byly původně získány.

Předložený vynález poskytuje také farmaceutický přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM, který obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a jako účinnou složku efektivní množství analogu peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2, jeho soli nebo funkčního derivátu. Farmaceuticky přijatelným nosičem je s výhodou olejové ředidlo, jako je emulze minerálního oleje, známa jako neúplné Freundovo adjuvans (IFA). Avšak EFA, stejně jako úplné Freundovo adjuvans (CFA, prostředek minerálního oleje obsahující různá množství zabitých organizmů Mycobacterium) není povoleno pro použití u člověka, protože minerální olej není metabolizovatelný a nemůže být tělem degradován.

Autory předloženého vynálezu bylo nyní zjištěno, že některé tukové emulze, které jsou mnoho let používány pro intravenózní výživu lidských pacientů, mohou sloužit jako ředidlo pro peptidovou terapii s použitím peptidů podle předloženého vynálezu. Dvěma příklady těchto emulzí jsou dostupné komerční tukové emulze známé jako Intralipid a Lipofundin. „Intralipid“ je registrovaná obchodní značka firmy Kabi Pharmacia, Švédsko, pro tukovou emulzi pro intravenózní výživu, která je popsána v patentu USA 3 169 094. „Lipofundin“ je registrovaná obchodní značka firmy B. Braun Melsungen, Německo. Obě jako tuk obsahují sojový olej (100 nebo 200 g v 1000 ml destilované vody: tedy 10 nebo 20%). V Intralipidu se jako emulgační činidla používají fosfolipidy z vaječného žloutku (12 g/1 destilované vody) a v Lipofundinu lecithin z vaječného žloutku (12 g/1 destilované vody). Izotoničnost je jak u Intralipidu tak Lipofundinu upravena přidáním glycerolu (25 g/1).

Vynález se dále týká způsobu předcházení nebo léčení IDDM, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, farmaceutického přípravku, který obsahuje analog peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2, nebo přípravku, který obsahuje T buňky, u kterých se vyvinula specifičnost na uvedený analog peptidů p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu.

V další části budou stručně popsány obrázky.

-6CZ 293784 B6

Obrázek 1 je graf ukazující stabilitu p277 a p277(Val⁶-Valⁿ). Plná kolečka označují výsledky s použitím p277 a prázdná kolečka s p277 (Val⁶-Valⁿ). Velká kolečka představují výsledky po 1 týdnu skladování, střední kolečka velikost po 9 týdnech, nejmenší kolečka po 20 týdnech.

Obrázek 2 ukazuje, že NOD T buňky diabetogenního klonu C9 proliferují jako odpověď na peptidy p277 (plná kolečka) a p277(Val⁶-Valⁿ) (prázdná kolečka).

Obrázek 3 ukazuje, že NOD slezinné T buňky proliferují v přítomnosti peptidu p277(Lys¹⁹). Sleziny 5 myších samiček NOD byly testovány v každé věkové skupině na proliferaci T buněk jako odpověď na peptidy p277 (Lys¹⁹) (plná kolečka), p277 (prázdná kolečka) a kontrolní peptid p278 (plné čtverečky).

Obrázek 4 ukazuje, že NOD T buňky diabetogenního klonu C9 proliferují jako odpověď na peptid p277(Lys¹⁹).

Obrázek 5 je graf, který ukazuje účinnost předběžného ošetření s p277(V) u IFA při prevenci diabetes indukovaného STZ při srovnání s kontrolním ošetřením nebo ošetřením s GADp34.

Jestliže je ve vynálezu uveden pojem „analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2“, tento pojem zahrnuje také jeho soli a funkční deriváty, pokud se zachovává biologická aktivita peptidu vzhledem k diabetes.

„Soli“ analogu peptidu p277 podle vynálezu znamenají fyziologicky přijatelné organické nebo anorganické soli.

Pojem „funkční deriváty“ analogu peptidu p277, jak se zde tento pojem používá, zahrnuje deriváty, které se mohou vyrobit z funkčních skupin, které se vyskytují jako postranní řetězce na zbytcích nebo na N- nebo C-koncových skupinách, způsoby známými z oblasti techniky, a které jsou zahrnuty v tomto vynálezu, pokud zůstávají farmaceuticky přijatelné, tj. neničí aktivitu peptidu týkající se podobnosti s aktivitou p277, nedávají přípravkům, které je obsahují, toxické vlastnosti a nemají nepříznivý vliv na jejich antigenní vlastnosti. Tyto „funkční deriváty“ nejsou zamýšleny jako zahrnující v sobě takové změny, které efektivně převádějí jednu kyselinu na jinou.

Vzhledem ke shora uvedeným kvalifikacím mohou tyto deriváty zahrnovat například alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin produkovaných reakcí s amoniakem, primárním nebo sekundárním aminem, N-acylderiváty volných aminových skupin aminokyselinových zbytků vytvořených reakcí s acylovými skupinami (např. alkanoylových nebo karbocyklických aroylových skupin) nebo O-acylderiváty volné hydroxylové skupiny (např. seiylové nebo threonylové skupiny) vytvořené reakcí s acylovými skupinami.

Analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle vynálezu se může používat jako imunogen ve farmaceutických přípravcích, zvláště ve vakcínách pro zmírnění nebo léčení IDDM, stejně jako antigen v diagnostických prostředcích pro stanovení diagnózy IDDM. Tyto farmaceutické přípravky a diagnostické prostředky, které se mohou vyrábět způsoby známými v oblasti techniky, také tvoří část předloženého vynálezu.

Jestliže se používá pro terapeutické léčení nebo jako profylaktická vakcína, peptid podle předloženého vynálezu se s výhodou podává s biologicky aktivním nosičem, který podporuje ΤΗ1-ΊΉ2 posun autoimunních T buněk. T buňky CD4 pomocného typu se dělí do dvou skupin podle cytokinů, které sekretují, jestliže jsou aktivovány [Mosmann T. R. a Coffman R. I.: Ann. Rev. Immunol. 7, 145 až 173 (1989).]: ΊΉ1 buňky sekretují IL-2 a IFN-γ, zatímco ΊΉ2 buňky sekretují IL-4 a IL-10. Ředidlem je s výhodou tuková emulze obsahující 10 až 20 % hmotn. triglyceridů rostlinného a/nebo živočišného původu, 1,2 až 2,4 % hmotn. fosfolipidů rostlinného a/nebo živočišného původu, 2,25 až 4,5 % hmotn. osmoregulátoru, 0 až 0,5 % hmotn.

-7CZ 293784 B6 antioxidačního činidla a sterilní vodu do 100 % hmotn. Tímto ředidlem je nejvýhodněji Intralipid nebo Lipofundin. Použití těchto ředidel je popsáno v izraelské patentové přihlášce (identifikované číslem přihlašovatele 9523), podané stejný den jako je datum podání izraelské přihlášky předloženého vynálezu (identifikované číslem přihlašovatele 9451A), stejným přihlašovatelem jako předložená přihláška; celý její obsah je zde zahrnut jako odkaz.

Terapeutický přípravek podle předloženého vynálezu může být podáván orálně nebo parenterálně, jako subkutánně, intramuskulámě, intravenózně, intanazálně nebo intrarektálně.

Příklady, v nichž je uvedena účinnost terapeutického ošetření sloučeninami a přípravky podle předloženého vynálezu, jsou vědecky přijatými zvířecími modely lidského IDDM.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a způsoby (i) Myši

Myší samičky kmene NOD/Lt byly získány od Animal Breeding Center of the Weizman Institute of Science, Rehovot, Izrael. Tyto myši spontánně vyvinuly autoimunní diabetes ve věku 14 až 17 týdnů, který se podobá IDDM u lidí.

(ii) Peptidy

Peptidy byly syntetizovány standardními Fmoc chemií použitím syntetizátoru ABIMED (SRN) a vyčištěny HPLC na obrácených fázích. Sekvence byly potvrzeny analýzou aminokyselin. Byly syntetizovány následující peptidy: peptid p277, kontrolní peptid p278 o sekvenci: Asn-Glu-AspGln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile (sekv. id. č. 10), která odpovídá polohám 458 až 474 molekuly lidského hsp60, fragmenty p277: aminová polovina p277 (p277.N), karboxylová polovina p277 (p277.C) a p277C kombinovaná s p278 (p277.C-p278), peptid p277(Lys¹⁹) a peptid p277 s různými substitucemi aminokyselin za dvě cysteinové skupiny v sekvenci: p277 s můstkovanými -SH skupinami (p277(můstkovaný Cys-Cys)), p277 s oběma cysteinovými skupinami nahrazenými valinem (p277(Val⁶-Valⁿ)), respektive serinem (p277(Ser-Ser¹¹).

(iii) Ošetření a pokračování

Myši byly ošetřeny emulzí p277, jinými peptidy nebo hovězím sérovým albuminem (BSA od firmy Sigma, St. Louis, Mo., USA) v objemu 0,1 ml podané subkutánní injekcí do zad. Antigeny byly zředěny PBS a emulgovány ve stejném objemu minerálního oleje (neúplné Freundovo adjuvans (IFA), Sigma) nebo 10 % (hmoto.) Intralipidu. Myši byly testovány na množství krevní glukózy v 10.00 h v neupevněném stavu, jak je popsáno v literatuře [Élias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88. 3088 až 3091 (1991).] v době ošetření (7,12, 15 nebo 17 týdnů) a ty myši, které přežily, ve stáří 40 týdnů. Za významnou hyperglykémii byla považována koncentrace glukózy 11,1 nebo více mM/Ι, protože tato koncentrace glukózy v krvi byla o 3 standardní odchylky vyšší než střední koncentrace glukózy změřená u 100 zdravých myší (neuvedeno). Histologické zkoumání ostrůvků slinivky břišní bylo prováděno na sekcích obarvených hematoxylinem a eosinem. Tyto sekce byly hodnoceny nezávisle na sobě dvěma pozorovateli, kteří neznali identitu skupin. Pro zjištění statistických rozdílů mezi různými ošetřeními byl použit test nejmenších čtverců.

-8CZ 293784 B6 (iv) Test proliferace T buněk

Suspenze buněk klonu C9 a buněk sleziny získaných od NOD myších samiček byly testovány na proliferaci T-buněk, jak bylo shora uvedeno [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., 5 Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3088 až 3091 (1991).]. Ve stručnosti - 1.10⁵ klonovaných buněk/ml nebo 1.10⁶ splenocytů/ml bylo inkubováno se čtyřmi opakováními 72 h v 0,2 ml kultivačního média v mikrotitrovacích jamkách v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých antigenů v množství 5 pg/ml. Proliferace byla měřena 10 inkorporací [³H]-thymidinu do DNA během posledních 12 h inkubace. Výsledky byly spočteny jako stimulační index: poměr středního počtu impulzů za minutu testu v přítomnosti antigenů ke střednímu počtu impulzů za minutu pozadí v nepřítomnosti antigenů. Standardní odchylka mezi čtyřmi pokusy byly vždy < 10 % středního počtu impulzů za minutu. Pozadí bylo menší než 1000 impulzů za minutu v pokusech se splenocyty a menší než 200 impulzů za minutu u buněk C9. 15 Slezina každé myši byla testována odděleně. Výsledky každé skupiny myší jsou uváděny jako střední hodnota ± SD (střední odchylka).

Příklad 1

Ošetření NOD myší p277 nebo jeho fragmenty

Pro testování toho, jestli kterákoliv ze dvou polovin o 12 aminokyselinách peptidu p277, samotná nebo v kombinaci, je účinná u NOD myší jako p277, byly NOD myší samičky ošetřeny ve stáří 7 týdnů subkutánním naočkováním 50 pg různých peptidů v oleji. Byl stanoven stav myší ve stáří 25 40 týdnů.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Lze vidět, že kontrolní hsp60 peptid p278 neměl na vývoj nemoci žádný vliv: ze 40 ošetřených myší byly všechny diabetické a ve 40. týdnu jich bylo 90 % mrtvých. Naproti tomu peptid p277 úplně zabraňuje smrti a vyléčil 60 % z 20 ošetřených 30 myší. Fragmenty p277 byly méně účinné: aminová polovina p277 (p277.N), karboxylová polovina p277 (p277.C) a směs obou (p277.N, p277.C) působily asi polovinou toho, co způsoboval neporušený p277. Peptid p277.C byl synteticky napojen na peptid p278, aby se získal delší peptid. Avšak p277.C-p278 nebyl lepší než p277.C samotný. Lze tedy shrnout, že plný terapeutický účinek vyžaduje neporušený p277 peptid.

Tabulka 1

Ošetření NOD myší p277 nebo jeho fragmenty; stav diabetů ve stáří 40 týdnů

ošetření peptidem (50 pg)	počet myší	zdrávy (%)	hyperglykemické (%)	mrtvé (%)
p278	40	0	100	90
p277	20	60’	40	0’
p277.N	20	20	80	50’
p277.C	20	30	70	40’
p277.N,p277.C	20	35’	65	40’
p277.C-p278	20	25	75	50*

* p<0,01 při srovnání se skupinou ošetřenou kontrolním peptidem p278

-9CZ 293784 B6

Příklad 2

Ošetření NOD myší substitučními peptidy p277

U NOD myší byly testovány následující peptidy: p277, p277 (můstkovaný Cys-Cys), p277(Val⁶Val¹¹) ap277(Ser-Ser^u).

NOD samičky byly ošetřeny 100 pg peptidu v 0,2 ml emulze minerálního oleje (IFA) podané subkutánně. Myši byly ošetřeny ve věku 12 týdnů. Výskyt diabetů byl vyhodnocen ve stáří 30 týdnů.

Jak je uvedeno v tabulce 2, p277(Val⁶-Val^u) byl při léčení diabetes tak účinný jako p277, výskyt diabetů u neošetřených myší byl 80 %, zatímco u myší ošetřených buď p277, nebo p277(Val⁶Val”) byl výskyt 22 a 23 %. Naopak, ani p277 (můstkovaný Cys-Cys) ani p277(Ser⁶-Ser^H) neměl žádný terapeutický účinek. Dvě další varianty p277, v nichž byly cysteinové skupiny v polohách 6 a 11 nahrazeny skupinou alaninu nebo zbytkem γ-aminomáselné kyseliny, byly také neúčinné, když byly testovány in vitro, jak na buňkách klonu C9, tak na NOD slezinných Tbuňkách. Jelikož tyto dva peptidy nebyly rozpoznávány anti-p277 specifickými T buňkami (neuvedeno), nebyly dále testovány in vivo na terapeutický účinek.

Tabulka 2

Ošetření NOD myší p277 substituenty

ošetření peptidem	výskyt diabetů (%)	počet příjemců
žádný	80	100
p277	22'	200
p277 (můstkovaný Cys-Cys)	70⁺	10
p277(Val⁶-Valⁿ)	23'	52
p277(Ser⁶-Serⁿ)	85'	20

⁺ p<0,01 při srovnání s výskytem diabetů u myší ošetřených pouze adjuvans ⁺ žádný významný rozdíl při srovnání počátku diabetů u myší ošetřených pouze adjuvans

Příklad 3

Stabilita p277(Val⁶-Valⁿ)

Jelikož důvodem pro nahrazení cysteinů byla problematická stabilita p277 peptidu, stabilita p277(Val⁶-Valⁿ) byla testována po několika časových úsecích od syntézy. p277 peptid je nestabilní a zhoršuje se i při přísných podmínkách skladování (lyofilizovaný ve vakuu, -20 °C).

Pro srovnání stability p277 s jeho p277(Val⁶-Val¹¹) analogem, byly oba peptidy syntetizovány ve stejné době a skladovány jako suchý prášek při -20 °C. V 1., 9. a 20. týdnu od syntézy byl vždy jeden podíl odvážen, rozpuštěn a testován. Za stabilitu peptidu je považována jeho schopnost stimulovat T buněčný klon C9. Obr. 1 ukazuje výsledky pokusu. Lze vidět, že zatímco přírodní p277 ztratil většinu své aktivity během 9 týdnů a všechnu 20 týdnů po syntéze, p277(Val-Val¹¹) byl nezměněn po 20 týdnech skladování.

Jelikož se předpokládá, že nestabilita p277 je způsobena cysteinovými zbytky, očekává se, že jakékoliv analogy podle předloženého vynálezu, které si zachovávají biologickou aktivitu p277, budou mít zlepšenou stabilitu při srovnání s p277 podobně, jak bylo v tomto příkladu ukázáno pro p277(Val⁶-Valⁿ).

-10CZ 293784 B6

Příklad 4

Ošetření NOD myších samiček p277 nebo p277(Val⁶-Valⁿ) převrací insulitidu

NOD myší samičky byly ošetřeny podkožní injekcí ve stáří 12 týdnů 100 pg/myš nemodifikovaného p277 nebo p277(Val⁶-Val^lf) v 0,1 ml emulze minerálního oleje (neúplné Freundovo adjuvans). Kontrolním myším byla podána emulze PBS a minerální olej. Ve stáří 6 měsíců bylo 5 myší z každé skupiny usmrceno, pankreas byl odebrán, fixován v bouinu a sekce byly obarveny směsí hematoxylimeosin. Ve slepém pokusu byla vyhodnocena insulitida. Jelikož se u kontrolních myší vyvinul intenzivní diabetes, byly usmrceny ve stáří 5 měsíců. Potom byla hladina glukózy v krvi u kontrolních myší v rozmezí od 29 do 48 mmol/1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

ošetření peptidem (12 týdnů)	počet ostrůvků	histologický stav v % (22 týdnů)
čistý	insulitida peri-ostrůvků	intraostrůvky
žádným	83	10	23	67
p277	49	25	69	6
p277(Val⁶-Val^H)	62	52	31	17

Ve stáří 12 týdnů, době ošetření, asi 60 % ostrůvků neošetřených myší vykazovalo intraostrůvkovou insulitidu, asi 20 % ostrůvků mělo peri-ostrůvkovou insulitidu a asi 20 % ostrůvků nevykazovalo žádnou insulitidu. Intra-ostrůvková infiltrace je považována za intenzivnější formu insulitidy související s nedostatkem funkce β-buněk. Jak je uvedeno v tabulce 3, značné rozdíly ve zjevu ostrůvků se vyvinuly u dvou ošetřených skupin při srovnání s kontrolními myšmi ošetřenými samotným olejem. Myši, které byly ošetřeny samotným olejem (kontrola), vykazovaly progresivní pokles podílu neovlivněných ostrůvků a ve stáří 22 týdnů, kdy všechny myši byly zjevně diabetické, pouze 10 % normálních ostrůvků. Asi 67 % ostrůvků vykazovalo intra-ostrůvkovou insulitidu ve stáří 22 týdnů, zbývajících 23 % ostrůvků vykazovalo periostrůvkovou insulitidu. Naproti tomu myši ošetřené p277 nebo p277(Val⁶-Val¹¹) vykazovaly zvýšení počtu normálních ostrůvků (mezi 25 a 52 %) a pokles počtu ostrůvků s intraostrůvkovou insulitidou (mezi 6 a 17%). Počet ostrůvků s peri-ostrůvkovou insulitidou stoupl na 31 až 69 %. Ošetření p277 a p277(Val⁶-Valⁿ) tedy souviselo se zlepšeným histologickým obrazem v souladu s převrácením stupně insulitidy přetrvávající více než 3 měsíce po ošetření.

Další výsledky používající p277 (v) u NOD myších samiček

V každé skupině po 10 NOD myších samičkách bylo uděláno 15 dalších pokusů, při nichž byly myši ve stáří 12 až 15 týdnů ošetřeny p277(V) v oleji nebo olejem samotným. Z celkového počtu 150 myší ošetřených samotným olejem se u 90 % vyvinul diabetes a 85 % jich zemřelo do 32. týdne. Naproti tomu u myší ošetřených p277(V) byl výskyt diabetů pouze 50 % (p<0,1) a pouze 20 % umřelo vlivem intenzivního onemocnění (p<0,01). Ošetření p277(V) je tedy účinným ošetřením pro zastavení vývoje smrtelného onemocnění.

Příklad 5

Peptidová terapie diabetů typu I použitím p277(Val⁶-Valⁿ) v tukových emulzích

Autoimunní destrukce inzulín produkujících β-buněk vpankreasu je zprostředkována Tlymfocyty. Zánětlivý infiltrát se vyvíjí kolem pankreatických ostrůvků ve stáří 5 až 8 týdnů.

-11CZ 293784 B6

Destrukce β-buněk, vedoucí k deficitu inzulínu, a zjevný diabetes jsou zřejmé ve stáří 14 až 20 týdnů, přičemž ovlivňují téměř 100 % NOD myších samiček ve stáří 35 až 40 týdnů.

NOD myší samičky byly ošetřeny peptidem p277(Val⁶-Valⁿ) (100 pg) na myš subkutánně v 0,1 ml PBS nebo 10% tukové emulzi sestávající z 10 % hmotn. sojového oleje, 1,2 % hmotn. vaječných fosfolipidů a 2,25 % hmotn. glycerolu (Intralipid, Kabi Pharmacia AB, Švédsko).

Byl sledován výskyt diabetes ve stáří 6 měsíců a produkce anti-p277(Val⁶-Valⁿ) protilátek. Diabetes byl diagnostikován jako trvalá hyperglykémie s hladinou glukózy v krvi nad 11,1 mmolu/1 měřené alespoň dvakrát v týdenních intervalech přístrojem Beckman Glucose Analyzer Π. Úspěšné peptidové ošetření je dáno zachováním normální koncentrace glukózy v krvi (menší než 11,1 mmolů/1), remisí intra-ostrůvkového zánětu pankreatických ostrůvků (insulitida) a indukcí protilátek na terapeutický peptid jako indikátor imunitní odpovědi typu ΊΉ2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Výskyt diabetů (v %) v 6 měsících

ošetření	výskyt diabetů	smrt
p277(Val⁶-Valⁿ)/PBS	90	80
p277(Val⁶-Val^u)/Intralipid	45'	20'
žádné	100	90

* p<0,01 při srovnání s neošetřenými myšmi

Jak lze vidět z tabulky 4, ošetření peptidem podle předloženého vynálezu podávaného v Intralipidu bylo účinné pro snížení výskytu diabetů a smrti. Naopak, ošetření podávané v PBS nebylo účinné.

Příklad 6

Peptidy p277 a p277(Val⁶-Val) jsou imunologicky zkříženě reaktivní

T-buňky klonu C9, získané zprediabetických NOD myší, byly inkubovány s peptidem p277 (plná kolečka), p277(Val⁶-Val ’) (prázdná kolečka), p277(Ser⁶-Serⁿ) (plné čtverečky) a p277 (můstkovaný Cys-Cys) (prázdné kosočtverečky). Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Bylo zjištěno, že klon C9 vykazuje pozitivní proliferační odpověď pouze na peptidy p277 a p277(Val⁶-Val^u). To ukazuje, že p277 a p277(Val⁶-Valⁿ) jsou zkříženě reaktivní a že peptidy p277(Ser⁶-Serⁿ) a p277(můstkovaný Cys-Cys), které nejsou terapeuticky účinné, nejsou imunologicky zkříženě reaktivní.

Příklad 7

Nově diagnostikovaní IDDM pacienti vykazují proliferativní odpovědi T-buněk jak na p277 tak na277(Val⁶-Val”)

Nově diagnostikovaní (2 až 4 týdny) IDDM pacienti byli testováni testem proliferace. Periferní krevní lymfocyty byly izolovány z úplné heparinizované krve na ficol-hypaque a analyzovány na proliferaci in vitro, která byla měřena jako inkorporace ³H-thymidinu, indukovaná hsp60 peptidy p277, p277(Val⁶-Valⁿ) a kontrolním peptidem p278. Proliferační odpověď T buněk je udávána jako stimulační index (SI): poměr mezi peptidem stimulovanou inkorporací thymidinu T buňkami a inkorporací thymidinu pozadím (žádný antigen).

-12CZ 293784 B6

Tabulka 5

Nově diagnostikovaní IDDM pacienti vykazují proliferační odpovědi T-buněk jak na p277 tak na p277(Val⁶-Val^u)

pacient	proliferace T buněk (SI)
p277	p277(Val^b-Val¹¹)	p278
IDDM#68	3,5	3,2	0,8
IDDM#69	2,5	5,0	0,5

Jak je ukázáno v tabulce 5, nově diagnostikovaný IDDM pacienti odpovídají na p277(Val⁶-Val^u) stejně jako na p277 peptid. p277(Val⁶-Valⁿ) je tedy imunologicky ekvivalentní sp277. Jelikož terapeutický účinek p277 je zprostředkován imunologickým rozpoznáváním, skutečnost, že p277(Val⁶-Valⁿ) je imunologicky zkříženě reaktivní sp277, ukazuje, že může být použit při léčení diabetů místo p277.

Příklad 8

Odpovědi T buněk na hsp60 a na peptid u IDDM a u zdravých jedinců

Na anti-hsp60 a p277(V) bylo testováno 21 IDDM pacientů a 14 zdravých dárců krve způsoby testování proliferace podle příkladu 7. Tabulka 6 a 7 ukazují proliferační odpověď T buněk (stimulační index; SI) každého jedince na kontrolní antigen (kontrolní Ag), tj. toxoid tetanu a virus chřipky - kmen Texas, pro celý rekombinantní hsp60 a p277(V). Jako pozitivní byly vzaty hodnoty SI 3 nebo větší.

Tabulka 6

Proliferační odpovědi T buněk u IDDM pacientů

pacient	věk (roky)	doba od diagnózy	odpověď T buněk (stimulační index na)
kontrolní Ag	hsp60	p277(V)
l.LM	32	3,5 měsíce	4-	+	—
2.G	25	24 měsíců	+	+	-
3.H	23	6 měsíců	+	+	—
4.DV	20	3 týdny	+	+	-
		5 týdnů	+	+	+
5. SD	15	6 týdnů	+	+	+
6.P	15	4 týdny	+	—	—
7.G	60’	5 týdnů	+	+	+
		7 týdnů	+	+	+
8.F	45’	6 týdnů	+	+	+
9. IS	53	2 týdny	+	+	—
10. T	20	4 týdny	+	+	+
11.KK	21	4 týdny	+	+	-
12. RI	40	6 týdnů	+	—	—
13. MS	5	1 týden	+	—	-
14. KB	5	2 měsíce	+	+	+
15. Bl	11,3	3 týdny	+	—	—
16. XY	60	2 měsíce	+	+	—
17. KA	12	4 týdny	-	—	—
18. ZA	12	4 týdny	+	+	+
19. A	17,5	11,5 roku	+	+	+
20. N	17,5	7,5 roku	+	+	+
21.A	19,7	5,7 roku	+	+	+

-13CZ 293784 B6 * Pacienti pozitivní na anti-GAD protilátky jsou diabetici typu I, nikoliv typu Π, přes pokročilý věk nástupu nemoci.

Tabulka 76

Proliferační odpovědi T buněk u zdravých dárců krve

dárce	odpovědi T buněk (stimulační index na)
kontrolní Ag	hsp60	p277(V)
1.	+	-	-
2.	+	—	-
3.	+	nd	+
4.	+	-	-
5.	+	+	+
6.	+	-	-
7.	+	—	—
8.	+	—	—
9.	+	—	—
10.	+	—	—
11.	+	+	—
12.	+	—	—
13.	+	+	—
14.	+	-	-

nd: znamená nestanoveno

Tabulka 8 je souhrnná tabulka ukazující, že 86 a 52 % pacientů odpovídalo na hsp60 a p277(V) při srovnání s 21 a 14 % kontroly (p<0,05). IDDM skupina byla tedy významně pozitivní, pokud jde o odpovědi T buněk na hsp60 a p277(V). To vede k závěru, že výskyt hsp60 a p277(V) reagujících jedinců je vyšší u IDDM pacientů než u zdravých lidí.

Tabulka 8

Výskyt pozitivních odpovědí T buněk u IDDM a u zdravých jedinců

odpovídající	výskyt odpovědi	T buněk (%) na
hsp60	p277(V)
IDDM	18/21(86)	11/21(52)’
zdraví	3/14(21)	2/14(14)

* p<0,05 podle analýzy nejmenších čtverců při srovnání s výskytem anti-p277(V) odpovědí u zdravých dárců krve

Příklad 9

NOD T-buněčná proliferace účinkem p277(Lys¹⁹)

Peptid p277(Lys¹⁹) se liší od p277 jednou aminokyselinou. Aby se potvrdilo, že p277(Lys¹⁹) je autoantigenem u NOD IDDM, srovnali jsme proliferaci T-buněk účinkem peptidu p277 a peptidu p277(Lys¹⁹). Obrázek 3 ukazuje, že T buňky samičích NOD slezin proliferovaly s p277(Lys¹⁹) peptidem ve stejném množství jako s p277. Na kontrolní peptid p278 neexistovala žádná odpověď.

Shora uvedené výsledky byly potvrzeny použitím klonu C9, diabetogenního NOD T-buněčného klonu, o kterém bylo zjištěno, že odpovídá na lidský peptid p277 [Elias D., Reshef T., Birk O. S., van der Zee R., Walker M. D., Cohen I. R.: Vaccination against autoimmune mouše diabetes with

-14CZ 293784 B6 a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3088 až 3091 (1991).]. Bylo zjištěno, že C9 buňky proliferují na p277(Lys¹⁹) peptid stejnou úrovní jako na p277 peptid (obr. 4).

Příklad 10

Ošetření samičích NOD myší p277(Lys¹⁹)

Autoři předloženého vynálezu již dříve popsali, že pokročilá insulitida u samičích NOD myší starých 3 měsíce se může zastavit ošetřením myší jedinou injekcí lidského p277. U ošetřených myší došlo k nižšímu výskytu klinického zřejmého diabetů a smrti pocházející od silné hyperglykémie. Pro testování toho, jestli peptid p277(Lys¹⁹), který je vlastním myším p277 peptidem, bude také účinný, ošetřili jsme 3 měsíce staré myší NOD samičky 100 pg buď lidského p277, nebo p277(Lys¹⁹) v IFA.

Peptidy p277 nebo p277(Lys¹⁹) v koncentraci 2 mg/ml ve fosforečnanem pufrovaném solném roztoku (PBS) byly emulgovány se stejným objemem neúplného Freundova adjuvans (IFA). Skupinám 10 myších NOD samic ve stáří 3 měsíce bylo subkutánní injekcí podáno 0,1 ml (100 pg peptidů) emulze obsahující příslušný peptid. Kontrolním myším byla injekcí podána emulze PBS a IFA. Myším byla odebírána krev každé 4 týdny. Hladiny krevní glukózy byly stanovovány přístrojem Beckmann Glucose Analyser Π. Ve stáří 6 měsíců byla vyhodnocena hyperglykémie a smrt pocházející od diabetů. Myši byly považovány za diabetické, jestliže množství glukózy v jejich krvi bylo větší 11 mmol/1.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9. Ve stáří 6 měsíců bylo 90 % kontrolních myší zřetelně hyperglykemických a 60 % z nich zemřelo na diabetes. Naproti tomu ošetření buď peptidem p277, nebo p277(Lys¹⁹) zabránilo jako diabetů (40 a 50% výskyt), tak smrti (10 a 20% výskyt). Zdá se tedy, že myším vlastní peptid p277(Lys¹⁹) je při léčení pokročilé insulitidy tak účinný jako cizí p277.

Tabulka 9

Léčení diabetů p277 a p277(Lys¹⁹)

léčení ve 3 měsících	diabetes v 6 měsících (%)
hyperglykémie	úmrtnost
p277(Lys¹⁹)	50’	20’
p277	40’	10*
PBS	90’	60’

’ p<0,05

Tyto výsledky ukazují, že proliferační odpovědi NOD T buněk detegují použití lidské hsp60 molekuly a jejího p277 peptidů jsou ekvivalentní autoimunní odpovědi na myší hsp50 a myší p277(Lys¹⁹) sekvencí. Bylo to ukázáno pro diabetogenní C9 T buněčný klon, stejně jako pro spontánní odpověď vyvíjející se ve slezinách prediabetických myší. Navíc byl p277(Lys’⁹) stejně účinný jako p277 při léčení diabetů u NOD myší. Slezinné T buňky věkově a sexuálně spárovaných myší jiných kmenů nevykazovaly spontánní proliferační odpověď T buněk na p277 (neuvedeno).

Zjištění autoimunity na myší hsp60 sekvenci zacílenou diabetogenními T buňkami podporuje obecný předpoklad, že IDDM je způsobena autoimunním procesem.

-15CZ 293784 B6

Příklad 11

Léčení STZ-indukovaného diabetů p277(V)

Streptozotocin (STZ) je β-buněčný specifický toxin, kteiý způsobuje toxický diabetes ničením β-buněk během 24 až 48 h, jestliže se podá injekční dávka 200 mg/kg. Podán v malých podtoxických dávkách indukuje u geneticky vnímavé myši insulitidu vedoucí k diabetů. Zánětlivé procesy mohou trvat 20 až 30 dnů, podle dávky STZ. Obvyklý postup pro STZ-indukovaný diabetes je dávka 200 mg STZ na kg tělesné hmotnosti podávaná v 5 dávkách po 40 mg/kg 5 po sobě jdoucích dnů [Like A. A., Rossini A. A.: Streptozotocin-induced pancreaticinsulitis: new model of diabetes mellitus, Science 195. 415 až 417 (1976).]. Tento model je nazýván nízkodávkový STZ. Zjistili jsme, že jestliže celková dávka je snížena na 150 mg/kg (5 krát 30 mg/kg), diabetes se vyvine během 80 až 100 dnů. Tato pomalu postupující forma STZ-indukovaného diabetů možná lépe připomíná autoimunní diabetes u lidí a má stejné trvání jako preklinický stupeň spontánního diabetů u NOD myší [Castano L., Eisenbarth G. S.: Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouše, and rat, Annu. Rev. Immunol. 8, 647-79 (1990).]. Navíc jsou akutní toxické účinky sníženy, jak je sníženo dávkování.

Heat shock protein o molekulové hmotnosti 60 000 (hsp60) hraje úlohu jak u NOD [Elias D., Markovits D., Reshef T., van der Zee R. a Cohen I. R.: Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouše by a 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87.1576 až 1580 (1990).] tak u STZ-indukovaného [Elias D., Prigozin H., Polák N., Rapport M., Lohse A. W. Cohen I. R.: Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocin, Diabetes 43. 992 až 998 (1994).] diabetů. Dříve jsme ukázali, že jak protilátkové tak T buněčná proliferační odpověď na hsp60 se vyskytuje před nástupem zřejmého diabetů. T buněčné klony specifické na hsp60 byly odvozeny od prediabetických NOD myší a mohly by adoptivně přenášet insulitidu a hyperglykémii na mladé NOD [Elias D., Markovits D., Reshef T., van der Zee R. a Cohen I. R.: Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouše by a 65 kDa heat shock protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1576 až 1580 (1990).] nebo τγ/δ NOD myši. NOD diabetogenní T buněčné klony rozpoznávají peptid o délce 24 aminokyselin hsp60 sekvence 437 až 460, který nazýváme p277. STZ-indukovaný diabetes je také doprovázen anti-p277 T buněčnými odpověďmi v preklinickém stadiu.

Předcházející příklady ukázaly, že p277(Val⁶-Valⁿ) peptid chrání NOD myši. Předložený pokus testuje účinnost ošetření p277(V) na STZ-modelu v nízkých dávkách.

Myší samci (skupiny po 10) byli ošetřeni dávkou 30 mg/kg STZ, podávanou denně 5 dnů. O týden později bylo myším podáno 100 pg buď p277(V) v oleji, peptidu dekarboxylázy glutamové kyseliny (GADp34) popsané Kaufmanem a spol. [Kaufman D. L., Clare-Salzer M., Tian J., Forsthuber T., Ting G. S. P., Robinson P., Atkinson M. A., Sercarz E. E., Tobin A. J., LehmannP. V.: Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decaroxylase in murine insulin-dependent diabetes, Nátuře 366, 69 až 72 (1993)], které jsou zahrnuty v diabetes NOD myší, nebo olej samotný. Ošetření bylo opakováno 85. den. Stý den byla myším odebrána krev. Krev byla testována na hyperglykémii (koncentrace glukózy větší než 15 nmol/1). Výsledky jsou shrnuty na obrázku 5. Je vidět, že střední hladina glukózy v krvi skupin myší ošetřených GADp34 nebo neošetřených myší byla v rozmezí pro hyperglykémii. Naproti tomu střední hladina glukózy v krvi myší ošetřených p277(V) byla v normálním rozmezí. p277(V) je tedy účinný při léčení diabetů indukovaného STZ u myších C57BL/ksj samců a také spontánního diabetů vyvinutého u geneticky rozdílných myších NOD samiček. Použití p277(V) terapie není omezeno na diabetes jenom jedné příčiny nebo jenom jednoho genotypu nebo pohlaví.

Všechny odkazy, které jsou zde uvedeny, včetně článků nebo abstrakt časopisů, publikovaných nebo odpovídajících USA nebo cizích patentových přihlášek, vydaných USA nebo cizích patentů, nebo jakýchkoliv jiných odkazů, jsou zde celé zahrnuty jako odkaz, celé včetně dat,

-16CZ 293784 B6 tabulek, obrázků a textů uvedených v citovaných odkazech. Jako odkazy jsou zde zahrnuty také úplné obsahy odkazů citované ve zde uvedených odkazech.

Odkaz na známý stupeň způsobu, stupeň konvenčního způsobu, známé způsoby nebo konvenční způsoby není v žádném případě připuštěním toho, že jakýkoliv aspekt, popis nebo provedení podle předloženého vynálezu je popsán, uveden nebo navržen v oblasti techniky.

Předcházející popis specifických provedení plně odhalil obecnou podstatu vynálezu, který mohou jiní, aplikací znalostí z oblasti techniky (včetně obsahů odkazů, které jsou zde citovány), snadno modifikovat a/nebo přizpůsobit na různé aplikace, jako jsou specifická provedení, bez nepatřičného experimentování, aniž by se tím odchýlili od obecného konceptu předloženého vynálezu. Takováto přizpůsobení a modifikace jsou považována za ekvivalentní rozsahu a významu popsaných provedení, založených na zde uvedeném popisu a vysvětlení. Tomu je třeba rozumět tak, že frazeologie nebo terminologie zde existuje pro účely popisu, nikoliv jako omezení, takže terminologii nebo fraseologii předloženého spisu je třeba interpretovat odborníky z oblasti techniky z hlediska popisů a vysvětlení zde uvedených v kombinaci se znalostí odborníka z oblasti techniky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Analog peptidu p277 obecné sekvence identifikační číslo 2

6 11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Xi-Ala-Leu-Leu-Arg-Xr-Ile-Pro-

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X₃-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (sekv. id. č. 2), v níž X! i X₂ znamená skupinu Cys nebo Val a X₃ znamená skupinu Thr nebo Lys, ale Xi i X₂nemohou současně znamenat skupinu Cys, jestliže X₃ znamená Thr, a jeho soli a funkční deriváty.
2. Analog peptidu p277 podle nároku 1, který je vybrán z peptidu označeného p277(Val⁶), v němž X] znamená Val, X2 znamená Cys a X3 znamená Thr, p277(Valⁿ), v němž Xi znamená Cys, X2 znamená Val a X₃ znamená Thr, p277(Val⁶-Val¹¹), v němž jak Xi tak X2 znamená Val a X3 znamená Thr, peptidu p277(Lys¹⁹), v němž jak X3 tak X₂ znamená Cys a X₃ znamená Lys, p277(Val⁶-Lys¹⁹), v němž Xi znamená Val, X2 znamená Cys a X3 znamená Lys, p277(ValⁿLys¹⁹), v němž Xi znamená Cys, X2 znamená Val a X₃ znamená Lys a p277(Val^6,n-Lys¹⁹), v němž jak Xi tak X₂ znamená Val a X₃ znamená Lys.
3. Použití analogu peptidu p277 podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu prostředku pro stanovení diagnózy diabetes mellitus závislého na inzulínu, IDDM.
4. Způsob stanovení diagnózy přítomnosti nebo počátku IDDM u pacienta, vyznačující se tím, že se krev nebo moč pacienta testuje s analogem peptidu p277 podle nároku 1 nebo 2 na přítomnosti protilátek nebo T buněk, které jsou imunologicky reaktivní s lidským hspóO, přičemž výsledek ukazující na pozitivní přítomnost anti-hsp60 protilátek nebo T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, ukazuje vysokou pravděpodobnost přítomnosti nebo počátku IDDM.
5. Způsob stanovení diagnózy podle nároku 4, vyznačující se tím, že přítomnost anti-hsp60 protilátek je testována radioimunoanalýzou nebo testem ELISA.

-17CZ 293784 B6
6. Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti anti-hsp60 protilátek způsobem podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že obsahuje:

i) antigen, kterým je analog peptidů p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 2, a ii) označenou protilátku schopnou rozpoznávat ne-variabilní oblast uvedených anti-hsp60 protilátek, které mají být detegovány.
7. Způsob stanovení diagnózy podle nároku 4, vyznačující se tím, že se testuje přítomnost T buňky, která je imunoreaktivní s hsp60, testem proliferace T buněk, který zahrnuje následující stupně:

i) přípravu mononukleámí buněčné frakce obsahující T buňky ze vzorku krve získaného od vedeného pacienta, ii) přidání antigenu, který je vybrán z peptidů podle nároku 1, ktéto mononukleámí buněčné frakci, iii) inkubování této buněčné frakce v přítomnosti antigenu po vhodné časové období a za vhodných kultivačních podmínek, iv) přidání označeného nukleotidu k inkubované buněčné kultuře podle iii) ve vhodné době před koncem inkubační doby, aby se dosáhla inkorporace označeného nukleotidu do DNA proliferujících T buněk, a

v) stanovení množství proliferujících T buněk analýzou množství označeného nukleotidu, který je inkorporován do těchto T buněk.
8. Způsob stanovení diagnózy podle nároku 4, vyznačující se tím, že se testuje přítomnost T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, testem odpovědi T buněk na cytokin, který obsahuje následující stupně:

i) přípravu mononukleámí buněčné frakce obsahující T buňky ze vzorku krve získaného od uvedeného pacienta, ii) přidání antigenu, který je vybrán zpeptidů podle nároku 1, ktéto mononukleámí buněčné frakci, iii) inkubování této buněčné frakce v přítomnosti antigenu po vhodné časové období a za vhodných kultivačních podmínek a iv) změření přítomnosti cytokinu sekretovaného odpovídajícími lymfocyty do média, přičemž cytokinem je DFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α nebo TGFp.
9. Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti T buňky, které je imunoreaktivní s hspóO, způsobem podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje:

i) antigen, kterým je analog peptidů p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1, ii) označený nukleotid a iii) médium vhodné pro kultivaci lymfocytů.
10. Sestava pro stanovení diagnózy přítomnosti IDDM testováním přítomnosti T buňky, která je imunoreaktivní s hspóO, způsobem podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje:

i) antigen, kterým je analog peptidů p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1, ii) médium vhodné pro kultivaci lymfocytů a iii) testovací sestavu pro měření přítomnosti cytokinu sekretovaného odpovídajícími lymfocyty do média.
11. Přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM, vyznačující se tím, že obsahuje produkt T buňky, který je vybrán ze skupiny sestávající z: a) lidských T buněk, které vykazují

-18CZ 293784 B6 specifičnost na sekvenci p277 lidského hsp60, přičemž tyto buňky byly aktivovány inkubováním v přítomnosti peptidu p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1, b) lidských T buněk podle a), které byly ozářeny nebo jinak oslabeny, c) lidských T buněk podle a), které byly podrobeny ošetření hydrostatickým tlakem, ošetření chemickým zesíťovacím činidlem a/nebo ošetření cytoskeletálním zesíťovacím činidlem, d) fragmentů nebo povrchových proteinů T buněk podle a), b) nebo c); nebo e) peptidu obsahujícího v podstatě variabilní oblast receptoru podle a) specifickou pro uvedený protein nebo jeho soli, funkčního derivátu, prekurzoru nebo aktivní frakce.
12. Přípravek pro předcházení nebo léčení IDDM podle nároku 11, vyznačující se tím, že lidské T buňky podle a) znamenají autologní T buňky získané od IDDM pacienta, který má být léčen, a specifičnost T buněk byla vyvinuta in vitro kontaktem s analogem peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2.
13. Přípravek pro předcházení nebo léčení EDDM podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že lidské Tbuňky si vyvinuly in vitro specifičnost na analog peptidu p277 obecné sekv. id. č. 2 podle nároku 1.
14. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje analog peptidu p277 obecné sekvence id. č. 2 podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
15. Farmaceutický přípravek podle nároku 14, pro předcházení nebo léčení IDDM.
16. Farmaceutický přípravek podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se tím, že analog peptidu p277 znamená analog peptidu p277 podle nároku 2.
17. Použití analogu peptidu p277 podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu farmaceutického prostředku pro předcházení nebo léčení IDDM.